JP3483586B2 - Ｃ群ロタウイルス内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
Ｃ群ロタウイルス内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体Info
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- JP3483586B2 JP3483586B2 JP09955593A JP9955593A JP3483586B2 JP 3483586 B2 JP3483586 B2 JP 3483586B2 JP 09955593 A JP09955593 A JP 09955593A JP 9955593 A JP9955593 A JP 9955593A JP 3483586 B2 JP3483586 B2 JP 3483586B2
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト及び動物（ウシ及
びブタ）由来のＣ群ロタウイルス内殻共通抗原に対する
モノクローナル抗体の生成のための交雑細胞ライン及び
モノクローナル抗体試薬等に関する。
びブタ）由来のＣ群ロタウイルス内殻共通抗原に対する
モノクローナル抗体の生成のための交雑細胞ライン及び
モノクローナル抗体試薬等に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から、新生児、乳児及び年少児が、
下痢を主徴とする激しい下痢症にみまわれることがあ
り、その結果、全身の著しい衰弱と脱水症状により死亡
することさえある。このような下痢症の中では、冬期に
多発するウイルス性のものはその大部分が定型ロタウイ
ルスまたは非定型ロタウイルスによることが明らかにな
りつつある。これらのウイルスはレオウイルス科に属す
る二本鎖ＲＮＡウイルスで、ＲＮＡを二重構造のウイル
ス蛋白が取り囲んだ構造を持っている。また、これらの
ウイルスは日本だけでなく世界的に分布している病原ウ
イルスであるが、ヒトへの感染が確認されているのは、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ群ロタウイルスであり、日本ではＡ、Ｃ
群ロタウイルスが確認されている。動物ロタウイルスを
含めると、世界的にはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ群ロタウ
イルスが確認されているが、一般的なＡ群ロタウイルス
（定型ロタウイルスまたは狭義のロタウイルスと総称さ
れている）に対して、Ａ群ロタウイルス以外のＢ、Ｃ、
Ｄ、Ｅ、Ｆ群ロタウイルスについては非定型ロタウイル
スと総称され、Ａ群ロタウイルスとは共通抗原性を持た
ないことが知られている。
下痢を主徴とする激しい下痢症にみまわれることがあ
り、その結果、全身の著しい衰弱と脱水症状により死亡
することさえある。このような下痢症の中では、冬期に
多発するウイルス性のものはその大部分が定型ロタウイ
ルスまたは非定型ロタウイルスによることが明らかにな
りつつある。これらのウイルスはレオウイルス科に属す
る二本鎖ＲＮＡウイルスで、ＲＮＡを二重構造のウイル
ス蛋白が取り囲んだ構造を持っている。また、これらの
ウイルスは日本だけでなく世界的に分布している病原ウ
イルスであるが、ヒトへの感染が確認されているのは、
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ群ロタウイルスであり、日本ではＡ、Ｃ
群ロタウイルスが確認されている。動物ロタウイルスを
含めると、世界的にはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ群ロタウ
イルスが確認されているが、一般的なＡ群ロタウイルス
（定型ロタウイルスまたは狭義のロタウイルスと総称さ
れている）に対して、Ａ群ロタウイルス以外のＢ、Ｃ、
Ｄ、Ｅ、Ｆ群ロタウイルスについては非定型ロタウイル
スと総称され、Ａ群ロタウイルスとは共通抗原性を持た
ないことが知られている。
【０００３】我が国では、非定型ロタウイルスのうちＣ
群ロタウイルスのヒトへの感染が確認されている。Ｃ群
ロタウイルスはウシ及びブタにも感染例が認められてい
るが、ヒトＣ群ロタウイルスと動物（ウシ及びブタ）由
来のＣ群ロタウイルスでは抗原性に差があるため、ヒト
Ｃ群ロタウイルスを検出できる血清学的検査法を用いて
もウシ及びブタ由来のＣ群ロタウイルスは検出できない
可能性があった。動物（ウシ及びブタ）由来のＣ群ロタ
ウイルスがヒトに感染している可能性は否定できないの
で、Ｃ群ロタウイルス感染患者からＣ群ロタウイルスを
検出する場合には、ヒトだけでなく動物（ウシ及びブ
タ）由来のＣ群ロタウイルスの検出も行う必要がある。
また、獣医学領域においては下痢症のウシやブタからＣ
群ロタウイルスを検出する場合、動物由来のＣ群ロタウ
イルスを検出する必要がある。現在、ヒトＣ群ロタウイ
ルスの免疫学的検出法は、ヒトＣ群ロタウイルスを動物
に免疫して得られた抗血清を用いた免疫電子顕微鏡法
（ＩＥＭ）やヒトＣ群ロタウイルスの外殻蛋白に特異的
で、動物由来のＣ群ロタウイルスに対して特異性のない
モノクローナル抗体を用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）
（本発明者ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３０．１３０７−１３
１１，１９９２）、逆受身赤血球凝集反応法（ＲＰＨＡ
法）（本発明者ら、第３９回日本ウイルス学会演説抄
録、１９９１）及びラテックス凝集反応法（ＬＡ法）
（本発明者ら、感染症学雑誌、第６６巻、第８号、１１
８２頁、１９９２年）が行われ、さらに、核酸電気泳動
法（ＰＡＧＥ）によるＲＮＡの泳動パターンによる検出
が行われている。
群ロタウイルスのヒトへの感染が確認されている。Ｃ群
ロタウイルスはウシ及びブタにも感染例が認められてい
るが、ヒトＣ群ロタウイルスと動物（ウシ及びブタ）由
来のＣ群ロタウイルスでは抗原性に差があるため、ヒト
Ｃ群ロタウイルスを検出できる血清学的検査法を用いて
もウシ及びブタ由来のＣ群ロタウイルスは検出できない
可能性があった。動物（ウシ及びブタ）由来のＣ群ロタ
ウイルスがヒトに感染している可能性は否定できないの
で、Ｃ群ロタウイルス感染患者からＣ群ロタウイルスを
検出する場合には、ヒトだけでなく動物（ウシ及びブ
タ）由来のＣ群ロタウイルスの検出も行う必要がある。
また、獣医学領域においては下痢症のウシやブタからＣ
群ロタウイルスを検出する場合、動物由来のＣ群ロタウ
イルスを検出する必要がある。現在、ヒトＣ群ロタウイ
ルスの免疫学的検出法は、ヒトＣ群ロタウイルスを動物
に免疫して得られた抗血清を用いた免疫電子顕微鏡法
（ＩＥＭ）やヒトＣ群ロタウイルスの外殻蛋白に特異的
で、動物由来のＣ群ロタウイルスに対して特異性のない
モノクローナル抗体を用いた酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）
（本発明者ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３０．１３０７−１３
１１，１９９２）、逆受身赤血球凝集反応法（ＲＰＨＡ
法）（本発明者ら、第３９回日本ウイルス学会演説抄
録、１９９１）及びラテックス凝集反応法（ＬＡ法）
（本発明者ら、感染症学雑誌、第６６巻、第８号、１１
８２頁、１９９２年）が行われ、さらに、核酸電気泳動
法（ＰＡＧＥ）によるＲＮＡの泳動パターンによる検出
が行われている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、Ｃ群ロタウイ
ルスに対する抗血清を用いた免疫学的検査法では、感度
及び特異性が劣り、安定的供給性を欠くため一般的な検
査法として確立しておらず、ヒトＣ群ロタウイルスのみ
に特異的なモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡでは
動物由来のＣ群ロタウイルスを検出することはできな
い。また、ＰＡＧＥによる検出も迅速、簡便に行うこと
ができない。ところが、現在までにヒト及び動物由来の
Ｃ群ロタウイルス内殻共通抗原に対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを作製した例は全く文献
未載である。
ルスに対する抗血清を用いた免疫学的検査法では、感度
及び特異性が劣り、安定的供給性を欠くため一般的な検
査法として確立しておらず、ヒトＣ群ロタウイルスのみ
に特異的なモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡでは
動物由来のＣ群ロタウイルスを検出することはできな
い。また、ＰＡＧＥによる検出も迅速、簡便に行うこと
ができない。ところが、現在までにヒト及び動物由来の
Ｃ群ロタウイルス内殻共通抗原に対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを作製した例は全く文献
未載である。
【０００５】そこで、本発明はヒト及び動物由来のＣ群
ロタウイルスの簡便な検査法の開発が種々の障害により
遅延している現状に鑑み、Ｃ群ロタウイルスの免疫学的
な知識をもとにヒト及び動物由来のＣ群ロタウイルスの
内殻共通抗原を見い出すこと、および、ヒト及び動物由
来のＣ群ロタウイルスの内殻共通抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を産生することを目的とする。また、本発明
の目的は、ヒト及び動物由来のＣ群ロタウイルス内殻共
通抗原に対するモノクローナル抗体試薬を用いることに
より、ヒト及び動物由来のＣ群ロタウイルスを迅速、簡
便に検出可能な検出法（ＬＡ法、ＲＰＨＡ法及びＥＬＩ
ＳＡ）に応用することである。
ロタウイルスの簡便な検査法の開発が種々の障害により
遅延している現状に鑑み、Ｃ群ロタウイルスの免疫学的
な知識をもとにヒト及び動物由来のＣ群ロタウイルスの
内殻共通抗原を見い出すこと、および、ヒト及び動物由
来のＣ群ロタウイルスの内殻共通抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を産生することを目的とする。また、本発明
の目的は、ヒト及び動物由来のＣ群ロタウイルス内殻共
通抗原に対するモノクローナル抗体試薬を用いることに
より、ヒト及び動物由来のＣ群ロタウイルスを迅速、簡
便に検出可能な検出法（ＬＡ法、ＲＰＨＡ法及びＥＬＩ
ＳＡ）に応用することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は次の
構成によって達成される。 すなわち、ヒト、ウシおよ
びブタの各Ｃ群ロタウイルス内殻蛋白抗原に対する親和
性が抗体特異性検討用の酵素抗体法による吸光度でいず
れも０．４を超えるモノクローナル抗体１３Ａ３の産生
ハイブリドーマ、生成されたモノクローナル抗体１３Ａ
３および該モノクローナル抗体１３Ａ３を用いたＬＡ
法、ＲＰＨＡ法及びＥＬＩＳＡ試薬である。 前記ハイ
ブリドーマはＸＡｇ６３マウス骨髄腫細胞とヒトＣ群ロ
タウイルスで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾細胞
との融合により形成させることができる。そして、前記
モノクローナル抗体１３Ａ３は（ａ）本質的にヒト由来
のすべてのＣ群ロタウイルスと反応するが、Ａ群ロタウ
イルスとは反応せず、（ｂ）ウシ及びブタ由来のＣ群ロ
タウイルスと反応し、（ｃ）ヒト、ウシ及びブタ由来の
各Ｃ群ロタウイルス内殻蛋白抗原と反応することを特徴
とするものである。
構成によって達成される。 すなわち、ヒト、ウシおよ
びブタの各Ｃ群ロタウイルス内殻蛋白抗原に対する親和
性が抗体特異性検討用の酵素抗体法による吸光度でいず
れも０．４を超えるモノクローナル抗体１３Ａ３の産生
ハイブリドーマ、生成されたモノクローナル抗体１３Ａ
３および該モノクローナル抗体１３Ａ３を用いたＬＡ
法、ＲＰＨＡ法及びＥＬＩＳＡ試薬である。 前記ハイ
ブリドーマはＸＡｇ６３マウス骨髄腫細胞とヒトＣ群ロ
タウイルスで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾細胞
との融合により形成させることができる。そして、前記
モノクローナル抗体１３Ａ３は（ａ）本質的にヒト由来
のすべてのＣ群ロタウイルスと反応するが、Ａ群ロタウ
イルスとは反応せず、（ｂ）ウシ及びブタ由来のＣ群ロ
タウイルスと反応し、（ｃ）ヒト、ウシ及びブタ由来の
各Ｃ群ロタウイルス内殻蛋白抗原と反応することを特徴
とするものである。
【０００７】
【作用】本発明は、広義には新規な交雑細胞ライン（ｈ
ｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）さらに詳しくはヒト
及び動物（ウシ及びブタ））由来のＣ群ロタウイルス内
殻共通抗原に対するモノクローナル抗体１３Ａ３の生成
のための交雑細胞ラインを作成するものである。 ま
ず、免疫原のＣ群ロタウイルスとして、例えば、ヒトＣ
群ロタウイルスに感染した患者の糞便から常法に従って
濃縮精製したヒトＣ群ロタウイルスを得ることができ
る。次に、こうして得られたヒトＣ群ロタウイルスを免
疫原として公知方法によりモノクローナル抗体１３Ａ３
を生成する交雑細胞の混合物を得る。得られた交雑細胞
混合物から、ヒト及び動物（ウシ及びブタ）由来のＣ群
ロタウイルスに共通な抗原部分を認識する抗体を産生す
る細胞株を選択するために、交雑細胞混合物の培養液に
ついて、動物（ウシ又はブタ）由来のＣ群ロタウイルス
内殻蛋白を抗原として用いたＥＬＩＳＡを行う。この動
物由来のＣ群ロタウイルス内殻蛋白は、例えば、培養可
能なウシＣ群ロタウイルスＳｈｉｎｔｏｋｕ株（Ｔｓｕ
ｎｅｍｉｔｓｕ，Ｈ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌ
ｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｙ，２９，２６０
９−２６１３，１９９１）又は、ブタＣ群ロタウイルス
Ｃｏｗｄｅｎ株（Ｓａｉｆ Ｌ．Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ，１２，１０５−１１１，１９８０）を常法により濃
縮生成し、さらに、このウイルス浮遊液に最終濃度１０
ｍＭのエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを添加し、室
温で１５分間放置した後、もう一度常法に従って精製す
ることにより得る。
ｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）さらに詳しくはヒト
及び動物（ウシ及びブタ））由来のＣ群ロタウイルス内
殻共通抗原に対するモノクローナル抗体１３Ａ３の生成
のための交雑細胞ラインを作成するものである。 ま
ず、免疫原のＣ群ロタウイルスとして、例えば、ヒトＣ
群ロタウイルスに感染した患者の糞便から常法に従って
濃縮精製したヒトＣ群ロタウイルスを得ることができ
る。次に、こうして得られたヒトＣ群ロタウイルスを免
疫原として公知方法によりモノクローナル抗体１３Ａ３
を生成する交雑細胞の混合物を得る。得られた交雑細胞
混合物から、ヒト及び動物（ウシ及びブタ）由来のＣ群
ロタウイルスに共通な抗原部分を認識する抗体を産生す
る細胞株を選択するために、交雑細胞混合物の培養液に
ついて、動物（ウシ又はブタ）由来のＣ群ロタウイルス
内殻蛋白を抗原として用いたＥＬＩＳＡを行う。この動
物由来のＣ群ロタウイルス内殻蛋白は、例えば、培養可
能なウシＣ群ロタウイルスＳｈｉｎｔｏｋｕ株（Ｔｓｕ
ｎｅｍｉｔｓｕ，Ｈ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌ
ｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｙ，２９，２６０
９−２６１３，１９９１）又は、ブタＣ群ロタウイルス
Ｃｏｗｄｅｎ株（Ｓａｉｆ Ｌ．Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ，１２，１０５−１１１，１９８０）を常法により濃
縮生成し、さらに、このウイルス浮遊液に最終濃度１０
ｍＭのエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを添加し、室
温で１５分間放置した後、もう一度常法に従って精製す
ることにより得る。
【０００８】 このようにして得られた内殻蛋白を抗原
としてＥＬＩＳＡを行って、交雑細胞混合物の中から、
ヒト及び動物（ウシ及びブタ）由来のＣ群ロタウイルス
内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体１３Ａ３を産
生する細胞株を選択する。こうして得られたヒト及び動
物由来のＣ群ロタウイルスに対するモノクローナル抗体
１３Ａ３の産生細胞をマウス腹水中で培養した後、回収
した腹水を精製することによりサブグラスＩｇＧのモノ
クローナル抗体１３Ａ３を得ることができる。このモノ
クローナル抗体１３Ａ３がＣ群ロタウイルス内殻蛋白と
結合することはＩＥＭによって確認される。 また、本
発明のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体１
３Ａ３を用いることにより、Ｃ群ロタウイルスを免疫し
て得られる抗血清、電子顕微鏡、電気泳動法等を用いず
にヒト及び動物（ウシ及びブタ）由来のＣ群ロタウイル
スを簡便な検査法で検出することが可能となる。
としてＥＬＩＳＡを行って、交雑細胞混合物の中から、
ヒト及び動物（ウシ及びブタ）由来のＣ群ロタウイルス
内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体１３Ａ３を産
生する細胞株を選択する。こうして得られたヒト及び動
物由来のＣ群ロタウイルスに対するモノクローナル抗体
１３Ａ３の産生細胞をマウス腹水中で培養した後、回収
した腹水を精製することによりサブグラスＩｇＧのモノ
クローナル抗体１３Ａ３を得ることができる。このモノ
クローナル抗体１３Ａ３がＣ群ロタウイルス内殻蛋白と
結合することはＩＥＭによって確認される。 また、本
発明のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体１
３Ａ３を用いることにより、Ｃ群ロタウイルスを免疫し
て得られる抗血清、電子顕微鏡、電気泳動法等を用いず
にヒト及び動物（ウシ及びブタ）由来のＣ群ロタウイル
スを簡便な検査法で検出することが可能となる。
【０００９】
【実施例】以下に、実施例により本発明をさらに具体的
に説明するが、これら本発明の範囲を制限するものでな
いことはいうまでもない。 実施例１ ヒト及び動物（ウシ及びブタ）由来のＣ群ロタウイルス
内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体の調整 （１）ヒトＣ群ロタウイルス液の調整 ＲＮＡ電気泳動法および電子顕微鏡法によってヒトＣ群
ロタウイルスが含まれていることが確認されている下痢
症患者糞便１．５ｇをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で
１０％乳剤にし、ダイフロン処理を行う。その後、これ
を８，０００ｒｐｍで２０分間遠心して上清をとり、こ
の上清を３０％シュークロース溶液に重層して、４０，
０００ｒｐｍ、６０分間遠心して沈渣をとる。この沈渣
を１．３８ｇ／ｍｌの濃度に調整した塩化セシウム溶液
を用いて３５，０００ｒｐｍ、一夜遠心を行い、生じた
ウイルスバンドを採取した。このウイルスバンドをＰＢ
Ｓを外液として透析した後、ウイルス粒子数を３．０×
１０9／ｍｌに調整してウイルス液とした。
に説明するが、これら本発明の範囲を制限するものでな
いことはいうまでもない。 実施例１ ヒト及び動物（ウシ及びブタ）由来のＣ群ロタウイルス
内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体の調整 （１）ヒトＣ群ロタウイルス液の調整 ＲＮＡ電気泳動法および電子顕微鏡法によってヒトＣ群
ロタウイルスが含まれていることが確認されている下痢
症患者糞便１．５ｇをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で
１０％乳剤にし、ダイフロン処理を行う。その後、これ
を８，０００ｒｐｍで２０分間遠心して上清をとり、こ
の上清を３０％シュークロース溶液に重層して、４０，
０００ｒｐｍ、６０分間遠心して沈渣をとる。この沈渣
を１．３８ｇ／ｍｌの濃度に調整した塩化セシウム溶液
を用いて３５，０００ｒｐｍ、一夜遠心を行い、生じた
ウイルスバンドを採取した。このウイルスバンドをＰＢ
Ｓを外液として透析した後、ウイルス粒子数を３．０×
１０9／ｍｌに調整してウイルス液とした。
【００１０】（２）マウスの免疫および細胞融合
得られたヒトＣ群ロタウイルスを等量のコンプリート・
フロイント・アジュバントと混合した後、５週齢のＢＡ
ＬＢ／ｃマウスに０．５ｍｌ皮下投与した。投与後、２
１日目にウイルス液のみを０．２５ｍｌ皮下投与し、３
日後にマウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾細胞をＲ
ＰＭＩ培地に懸濁し、ミエローマ細胞Ｘ−Ａｇ６３と
５：１の比で混合した後、ポリエチレングリコール４０
００（メルク社製）で細胞融合させ、さらにＳＦＭ−１
０１培地（日水製薬（株）製）に再懸濁した。その後、
３枚のマイクロプレートに１穴あたり５×１０5個の細
胞数で分注し、５％ＣＯ2濃度のインキュベーター中で
２週間培養して、コロニーを形成させた。
フロイント・アジュバントと混合した後、５週齢のＢＡ
ＬＢ／ｃマウスに０．５ｍｌ皮下投与した。投与後、２
１日目にウイルス液のみを０．２５ｍｌ皮下投与し、３
日後にマウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾細胞をＲ
ＰＭＩ培地に懸濁し、ミエローマ細胞Ｘ−Ａｇ６３と
５：１の比で混合した後、ポリエチレングリコール４０
００（メルク社製）で細胞融合させ、さらにＳＦＭ−１
０１培地（日水製薬（株）製）に再懸濁した。その後、
３枚のマイクロプレートに１穴あたり５×１０5個の細
胞数で分注し、５％ＣＯ2濃度のインキュベーター中で
２週間培養して、コロニーを形成させた。
【００１１】（３）抗ヒトＣ群ロタウイルス抗体生産株
の樹立 コロニーを形成したウエルの上清について、スクリーニ
ング用ＥＬＩＳＡにより以下のように特異性を検討し
た。すなわち、前記ヒトＣ群ロタウイルス液の調整法の
うち３０％シュークロース溶液に重層し遠心後、、沈渣
をとるところまでを同様に行い、その後、ｐＨ７．５ト
リス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）１５ｍｌに懸濁し、マイ
クロプレートに１穴あたり５０μｌの懸濁液を分注し
た。その後、室温で６０分間吸着させ、１％ウシ血清ア
ルブミン添加ＴＢＳでブロッキング後、各穴にコロニー
形成ウエルの培養上清液５０μｌを添加して室温で１時
間反応させた。そして、これにアルカリフォスファター
ゼ標識ヤギ抗マウス抗体液を添加し、室温に１時間放置
した後、フォスファターゼ基質溶液を添加し、吸光度の
高い培養上清液の細胞から抗ヒトＣ群ロタウイルス抗体
生産株を樹立した。
の樹立 コロニーを形成したウエルの上清について、スクリーニ
ング用ＥＬＩＳＡにより以下のように特異性を検討し
た。すなわち、前記ヒトＣ群ロタウイルス液の調整法の
うち３０％シュークロース溶液に重層し遠心後、、沈渣
をとるところまでを同様に行い、その後、ｐＨ７．５ト
リス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）１５ｍｌに懸濁し、マイ
クロプレートに１穴あたり５０μｌの懸濁液を分注し
た。その後、室温で６０分間吸着させ、１％ウシ血清ア
ルブミン添加ＴＢＳでブロッキング後、各穴にコロニー
形成ウエルの培養上清液５０μｌを添加して室温で１時
間反応させた。そして、これにアルカリフォスファター
ゼ標識ヤギ抗マウス抗体液を添加し、室温に１時間放置
した後、フォスファターゼ基質溶液を添加し、吸光度の
高い培養上清液の細胞から抗ヒトＣ群ロタウイルス抗体
生産株を樹立した。
【００１２】（４）ヒト、ウシＣ群ロタウイルス及びブ
タＣ群ロタウイルスに共通の内殻抗原に特異的なモノク
ローナル抗体生産株の樹立 さらに、ウシＣ群ロタウイルスＳｈｉｎｔｏｋｕ株培養
上清液５００ｍｌおよびブタＣ群ロタウイルスＣｏｗｄ
ｅｎ株培養上清液５００ｍｌを前記ヒトＣ群ロタウイル
ス液調整法と同様の塩化セシウム密度勾配遠心法で濃
縮、精製した後、透析して得たウイルス液をさらに１０
ｍＭエチレンジアミン４酢酸ナトリウムで室温で１５分
間処理した。その後、４０，０００ｒｐｍ、６０分間遠
心して沈渣をとり、この沈渣をＰＢＳ１．５ｍｌで懸濁
して一重殻ウイルスを得る。一重殻ウイルスをマイクロ
プレートの各穴に５０μｌ添加し、室温で６０分間吸着
させて抗原吸着マイクロプレートを得る。次に、この抗
原吸着マイクロプレートを用いて上記と同様に抗ヒトＣ
群ロタウイルス抗体生産株の培養上清液を反応させ、ス
クリーニング用ＥＬＩＳＡによりウシＣ群ロタウイルス
内殻蛋白およびブタＣ群ロタウイルス内殻蛋白に対して
も特異性を持つモノクローナル抗体生産株を選択するこ
とによって、ヒトＣ群ロタウイルス、ウシＣ群ロタウイ
ルス及びブタＣ群ロタウイルスに共通の内殻抗原に特異
的なモノクローナル抗体生産株を樹立した。各モノクロ
ナール抗体の反応性は表１に示す。表１から明らかな通
り、最終的に樹立した細胞株は１３Ａ３株であった。こ
の１３Ａ３株は平成５年４月２０日付けで工業技術院生
命工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３６０９として寄
託している。
タＣ群ロタウイルスに共通の内殻抗原に特異的なモノク
ローナル抗体生産株の樹立 さらに、ウシＣ群ロタウイルスＳｈｉｎｔｏｋｕ株培養
上清液５００ｍｌおよびブタＣ群ロタウイルスＣｏｗｄ
ｅｎ株培養上清液５００ｍｌを前記ヒトＣ群ロタウイル
ス液調整法と同様の塩化セシウム密度勾配遠心法で濃
縮、精製した後、透析して得たウイルス液をさらに１０
ｍＭエチレンジアミン４酢酸ナトリウムで室温で１５分
間処理した。その後、４０，０００ｒｐｍ、６０分間遠
心して沈渣をとり、この沈渣をＰＢＳ１．５ｍｌで懸濁
して一重殻ウイルスを得る。一重殻ウイルスをマイクロ
プレートの各穴に５０μｌ添加し、室温で６０分間吸着
させて抗原吸着マイクロプレートを得る。次に、この抗
原吸着マイクロプレートを用いて上記と同様に抗ヒトＣ
群ロタウイルス抗体生産株の培養上清液を反応させ、ス
クリーニング用ＥＬＩＳＡによりウシＣ群ロタウイルス
内殻蛋白およびブタＣ群ロタウイルス内殻蛋白に対して
も特異性を持つモノクローナル抗体生産株を選択するこ
とによって、ヒトＣ群ロタウイルス、ウシＣ群ロタウイ
ルス及びブタＣ群ロタウイルスに共通の内殻抗原に特異
的なモノクローナル抗体生産株を樹立した。各モノクロ
ナール抗体の反応性は表１に示す。表１から明らかな通
り、最終的に樹立した細胞株は１３Ａ３株であった。こ
の１３Ａ３株は平成５年４月２０日付けで工業技術院生
命工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３６０９として寄
託している。
【００１３】
【表１】
【００１４】（５）ヒトＣ群ロタウイルス、ウシＣ群ロ
タウイルス及びブタＣ群ロタウイルスに共通の内殻抗原
に特異的なモノクローナル抗体の産生 ハイブリドーマ１３Ａ３株１０８個をプリスタン処理Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内接種し、１０日後、腹水を採
取し、プロテインＡカラムを用いて濃縮、精製してサブ
クラスＩｇＧのモノクローナル抗体とした。このモノク
ローナル抗体がヒトＣ群ロタウイルス愛媛株（大瀬戸光
明ら、「医学のあゆみ」医歯薬出版（株）発行）１３６
巻、第３号、２２３−２２４頁、１９８６年）、ウシＣ
群ロタウイルスＳｈｉｎｔｏｋｕ株及びブタＣ群ロタウ
イルスＣｏｗｄｅｎ株の内殻抗原と反応することは、Ｉ
ＥＭによって確認した。
タウイルス及びブタＣ群ロタウイルスに共通の内殻抗原
に特異的なモノクローナル抗体の産生 ハイブリドーマ１３Ａ３株１０８個をプリスタン処理Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内接種し、１０日後、腹水を採
取し、プロテインＡカラムを用いて濃縮、精製してサブ
クラスＩｇＧのモノクローナル抗体とした。このモノク
ローナル抗体がヒトＣ群ロタウイルス愛媛株（大瀬戸光
明ら、「医学のあゆみ」医歯薬出版（株）発行）１３６
巻、第３号、２２３−２２４頁、１９８６年）、ウシＣ
群ロタウイルスＳｈｉｎｔｏｋｕ株及びブタＣ群ロタウ
イルスＣｏｗｄｅｎ株の内殻抗原と反応することは、Ｉ
ＥＭによって確認した。
【００１５】実施例２
ヒト及び動物（ウシ及びブタ）由来のＣ群ロタウイルス
内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体感作ラテック
ス凝集反応試薬の調整及びラテックス凝集反応法 ０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）（トリス緩衝液）
に、ラテックス粒子（武田薬品工業（株）製、粒径０．
３５μｌ）を粒子濃度が０．５％になるように懸濁し、
トリス緩衝液で１２００μｇ／ｍｌの濃度に調整した前
記実施例１で得たモノクローナル抗体１３Ａ３を等量混
合し、３７℃で１時間、振とうしつつ感作した。次い
で、トリス緩衝液で２回洗浄し、１％正常ウサギ血清を
添加したトリス緩衝液９９容にけん濁してモノクローナ
ル抗体感作ラテックス試薬を調整した。なお、対照用感
作ラテックス粒子は、モノクローナル抗体の代わりに、
正常マウスＩｇＧを同様にラテックス粒子に感作して使
用した。
内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体感作ラテック
ス凝集反応試薬の調整及びラテックス凝集反応法 ０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）（トリス緩衝液）
に、ラテックス粒子（武田薬品工業（株）製、粒径０．
３５μｌ）を粒子濃度が０．５％になるように懸濁し、
トリス緩衝液で１２００μｇ／ｍｌの濃度に調整した前
記実施例１で得たモノクローナル抗体１３Ａ３を等量混
合し、３７℃で１時間、振とうしつつ感作した。次い
で、トリス緩衝液で２回洗浄し、１％正常ウサギ血清を
添加したトリス緩衝液９９容にけん濁してモノクローナ
ル抗体感作ラテックス試薬を調整した。なお、対照用感
作ラテックス粒子は、モノクローナル抗体の代わりに、
正常マウスＩｇＧを同様にラテックス粒子に感作して使
用した。
【００１６】ラテックス凝集反応は、下記のようにスラ
イド凝集反応法で実施した。被検患者又は動物（ウシ又
はブタ）の糞便をＰＢＳで１０％乳剤とし、６，０００
ｒｐｍで１０分間遠心し、上清１０μｌをスライド上の
２カ所に滴下し、モノクローナル抗体１３Ａ３または対
照用感作ラテックス粒子を添加した。添加後、２分間ス
ライドを振とうさせて混合し、凝集の有無を観察する。
モノクローナル抗体感作ラテックス粒子のみに凝集が観
察された場合、Ｃ群ロタウイルス陽性とする。本法をＩ
ＥＭ及び核酸電気泳動法（ＰＡＧＥ）と比較した結果は
表２の通りであり、本法とＩＥＭ及びＰＡＧＥの一致率
は１００％であった。
イド凝集反応法で実施した。被検患者又は動物（ウシ又
はブタ）の糞便をＰＢＳで１０％乳剤とし、６，０００
ｒｐｍで１０分間遠心し、上清１０μｌをスライド上の
２カ所に滴下し、モノクローナル抗体１３Ａ３または対
照用感作ラテックス粒子を添加した。添加後、２分間ス
ライドを振とうさせて混合し、凝集の有無を観察する。
モノクローナル抗体感作ラテックス粒子のみに凝集が観
察された場合、Ｃ群ロタウイルス陽性とする。本法をＩ
ＥＭ及び核酸電気泳動法（ＰＡＧＥ）と比較した結果は
表２の通りであり、本法とＩＥＭ及びＰＡＧＥの一致率
は１００％であった。
【００１７】実施例３
ヒト及び動物（ウシ及びブタ）由来のＣ群ロタウイルス
内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体感作ヒツジ赤
血球試薬の調整及び逆受身赤血球凝集反応法 グルタルアルデヒド固定ヒツジ赤血球をタンニン酸処理
後、モノクローナル抗体１３Ａ３を感作し、感作血球を
作製した。なお、対照用感作血球としては、モノクロナ
ール抗体の代わりに、正常マウスＩｇＧを同様に処理済
血球に感作して使用した。患者糞便の１０％乳剤を６，
０００ｒｐｍ、１０分遠心した上清をグリタルアルデヒ
ド固定血球で吸収し、Ｖ底９６穴プレートを用いて２倍
段階希釈した２系列を用意し、第１系列には感作血球
を、第２系列には対照感作血球を添加、室温に１時間静
置後、判定した。第１系列、第２系列において凝集の確
認された最終希釈倍数をそれぞれＲＰＨＡ価、対照凝集
価とし、ＲＰＨＡ価が対照凝集価の値より４倍以上高か
った場合、Ｃ群ロタウイルス陽性とした。本法をＩＥＭ
および核酸電気泳動法（ＰＡＧＥ）と比較し結果は表２
の通りであり、本法とＩＥＭ及びＰＡＧＥの一致率は１
００％であった。
内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体感作ヒツジ赤
血球試薬の調整及び逆受身赤血球凝集反応法 グルタルアルデヒド固定ヒツジ赤血球をタンニン酸処理
後、モノクローナル抗体１３Ａ３を感作し、感作血球を
作製した。なお、対照用感作血球としては、モノクロナ
ール抗体の代わりに、正常マウスＩｇＧを同様に処理済
血球に感作して使用した。患者糞便の１０％乳剤を６，
０００ｒｐｍ、１０分遠心した上清をグリタルアルデヒ
ド固定血球で吸収し、Ｖ底９６穴プレートを用いて２倍
段階希釈した２系列を用意し、第１系列には感作血球
を、第２系列には対照感作血球を添加、室温に１時間静
置後、判定した。第１系列、第２系列において凝集の確
認された最終希釈倍数をそれぞれＲＰＨＡ価、対照凝集
価とし、ＲＰＨＡ価が対照凝集価の値より４倍以上高か
った場合、Ｃ群ロタウイルス陽性とした。本法をＩＥＭ
および核酸電気泳動法（ＰＡＧＥ）と比較し結果は表２
の通りであり、本法とＩＥＭ及びＰＡＧＥの一致率は１
００％であった。
【００１８】実施例４
ヒト及び動物（ウシ及びブタ）由来のＣ群ロタウイルス
内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体を用いた酵素
抗体法 モノクローナル抗体１３Ａ３を９６穴マイクロプレート
に分注後、４℃で一夜固相化し、室温３０分ブロッキン
グ後、患者の糞便の１０％乳剤を６，０００ｒｐｍ、１
０分遠心した上清を加え、室温で１時間反応させた。２
回洗浄後、ビオチン標識した検出用モノクローナル抗体
１３Ａ３を添加し、室温で１時間反応させ、３回洗浄
後、さらに、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
を、室温で１０分反応させた。４回洗浄後、０．０４％
３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジンを添加
し、１０分後、１Ｍリン酸を加え反応を停止させ、４５
０ｎｍでの吸光度を測定し、カットオフ値０．１３以上
を示す検体をＣ群ロタウイルス陽性と判定した。本法を
ＩＥＭ及び核酸電気泳動法（ＰＡＧＥ）と比較した結果
は表２の通りであり、本法とＩＥＭ及びＰＡＧＥの一致
率は１００％であった。
内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体を用いた酵素
抗体法 モノクローナル抗体１３Ａ３を９６穴マイクロプレート
に分注後、４℃で一夜固相化し、室温３０分ブロッキン
グ後、患者の糞便の１０％乳剤を６，０００ｒｐｍ、１
０分遠心した上清を加え、室温で１時間反応させた。２
回洗浄後、ビオチン標識した検出用モノクローナル抗体
１３Ａ３を添加し、室温で１時間反応させ、３回洗浄
後、さらに、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
を、室温で１０分反応させた。４回洗浄後、０．０４％
３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジンを添加
し、１０分後、１Ｍリン酸を加え反応を停止させ、４５
０ｎｍでの吸光度を測定し、カットオフ値０．１３以上
を示す検体をＣ群ロタウイルス陽性と判定した。本法を
ＩＥＭ及び核酸電気泳動法（ＰＡＧＥ）と比較した結果
は表２の通りであり、本法とＩＥＭ及びＰＡＧＥの一致
率は１００％であった。
【００１９】
【表２】
【００２０】上記の実施例に述べたのようにヒト及び動
物（ウシ又はブタ）由来のＣ群ロタウイルス内殻共通抗
原に対するモノクローナル抗体を用いることにより下痢
症患者糞便又は動物（ウシ又はブタ）の糞便からヒト及
び動物（ウシ又はブタ）由来のＣ群ロタウイルスを迅速
で簡便に検出することが可能となった。また、全てのロ
タウイルスは二重殻構造を持つため、糞便等の検査材料
を凍結保存中にウイルスの外殻構造が損なわれていくこ
とが知られているが、本発明の上記実施例で説明したモ
ノクローナル抗体は外殻構造の損なわれたＣ群ロタウイ
ルスでも検査可能であるため、保存状態の劣悪な検査材
料でも検査が可能となる。
物（ウシ又はブタ）由来のＣ群ロタウイルス内殻共通抗
原に対するモノクローナル抗体を用いることにより下痢
症患者糞便又は動物（ウシ又はブタ）の糞便からヒト及
び動物（ウシ又はブタ）由来のＣ群ロタウイルスを迅速
で簡便に検出することが可能となった。また、全てのロ
タウイルスは二重殻構造を持つため、糞便等の検査材料
を凍結保存中にウイルスの外殻構造が損なわれていくこ
とが知られているが、本発明の上記実施例で説明したモ
ノクローナル抗体は外殻構造の損なわれたＣ群ロタウイ
ルスでも検査可能であるため、保存状態の劣悪な検査材
料でも検査が可能となる。
【００２１】
【発明の効果】本発明によれば、ヒト、ウシ又はブタ由
来のＣ群ロタウイルス内殻共通抗原に対するモノクロー
ナル抗体１３Ａ３の入手が可能となり、また、モノクロ
ナール抗体生産株を培養することにより、上記モノクロ
ナール抗体１３Ａ３を大量にかつ、高純度に入手するこ
とが可能となった。 さらに、モノクローナル抗体１３
Ａ３を用いることにより下痢症患者糞便又は動物（ウシ
又はブタ）の糞便からヒト、ウシ又はブタ由来のＣ群ロ
タウイルスを迅速で簡便に検出することが可能となっ
た。
来のＣ群ロタウイルス内殻共通抗原に対するモノクロー
ナル抗体１３Ａ３の入手が可能となり、また、モノクロ
ナール抗体生産株を培養することにより、上記モノクロ
ナール抗体１３Ａ３を大量にかつ、高純度に入手するこ
とが可能となった。 さらに、モノクローナル抗体１３
Ａ３を用いることにより下痢症患者糞便又は動物（ウシ
又はブタ）の糞便からヒト、ウシ又はブタ由来のＣ群ロ
タウイルスを迅速で簡便に検出することが可能となっ
た。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(56)参考文献 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.
（1991）Ｖｏｌ．29，Ｎｏ．９，ｐ.
2051−2055
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（1991）Ｖｏｌ.
184，Ｎｏ．２，ｐ．752−757
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 5/10
C07K 16/10
G01N 33/569
G01N 33/577
C12P 21/08
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 ヒト、ウシおよびブタの各Ｃ群ロタウイ
ルス内殻蛋白抗原に対する親和性が抗体特異性検討用の
酵素抗体法による吸光度でいずれも０．４を超えるモノ
クローナル抗体１３Ａ３の産生ハイブリドーマ。 - 【請求項２】 ＸＡｇ６３マウス骨髄腫細胞とヒトＣ群
ロタウイルスで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾細
胞との融合により形成された請求項１記載のハイブリド
ーマ。 - 【請求項３】 ヒト、ウシおよびブタの各Ｃ群ロタウイ
ルス内殻蛋白抗原に対する親和性が抗体特異性検討用の
酵素抗体法による吸光度でいずれも０．４を超えるモノ
クローナル抗体１３Ａ３からなるモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 （ａ）本質的にヒト由来のすべてのＣ群
ロタウイルスと反応するが、Ａ群ロタウイルスとは反応
せず、 （ｂ）ウシ及びブタ由来のＣ群ロタウイルスと反応し、 （ｃ）ヒト、ウシ及びブタ由来の各Ｃ群ロタウイルス内
殻蛋白抗原と反応する ことを特徴とする請求項３記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 抗体サブクラスがＩｇＧである請求項３
または４記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項６】 請求項３、４または５記載のモノクロー
ナル抗体を使った検出試薬が、ヒト、ウシ及びブタ由来
の各Ｃ群ロタウイルスを検出するための （ａ）酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）、 （ｂ）逆受身赤血球凝集反応法（ＲＰＨＡ法）、 （ｃ）ラテックス凝集反応法（ＬＡ法） に使用可能なことを特徴とする検出試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09955593A JP3483586B2 (ja) | 1993-04-26 | 1993-04-26 | Ｃ群ロタウイルス内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09955593A JP3483586B2 (ja) | 1993-04-26 | 1993-04-26 | Ｃ群ロタウイルス内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06303970A JPH06303970A (ja) | 1994-11-01 |
| JP3483586B2 true JP3483586B2 (ja) | 2004-01-06 |
Family
ID=14250412
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09955593A Expired - Fee Related JP3483586B2 (ja) | 1993-04-26 | 1993-04-26 | Ｃ群ロタウイルス内殻共通抗原に対するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3483586B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107287167B (zh) * | 2017-06-22 | 2018-06-08 | 四川迈克生物新材料技术有限公司 | 可分泌鼠抗a群轮状病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体 |
| CN116355079B (zh) * | 2022-08-19 | 2023-12-26 | 上海迈科康生物科技有限公司 | 检测重组人轮状病毒vp8抗原（vp8 p[8]）的单克隆抗体及其应用 |
-
1993
- 1993-04-26 JP JP09955593A patent/JP3483586B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．９，ｐ．２０５１−２０５５ |
| Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）Ｖｏｌ．１８４，Ｎｏ．２，ｐ．７５２−７５７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06303970A (ja) | 1994-11-01 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |