JPH01224666A - 免疫複合体の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な免疫複合体（Ｉｍｍｕｎｅ　Ｃｏｍｐ
ｌｅｘ、以下ｒ（（：ｊと略称する。）の免疫学的測定
法に関するものである。

〔従来の技術〕

全身性紅斑性狼１ｉ（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ（Ｒ
Ａ）などの膠原病においては、その流血中にＩＣが高車
に検出され、臨床的意義などについて詳しく検討されて
いるが、近年では悪性腫瘍や血液疾患などのｇ原病以外
の池の多くの疾５患においても工Ｃが高率に認められ、
その臨床的意義、病態に占める役割などについて解析さ
れつつある。

生体内に浸入あるいは出現した抗原は、抗体と結合して
ＩＣを形成するが、一般には網内系細胞によって速やか
に除去されてしまう。しかし、ＩＣが大量に発生したり
、網内系細胞によって処理されない性状になると、ＩＣ
は組織に沈着し、その障害を引き起こす。

従ってＩＣの血中流度測定値は、これらの疾患の診断の
てがかりを与える情報であり、またその濃度の推移は病
態の変化を把握するうえで、また治療の指標として価値
の高い情報となる。

近年、血中に微量に存在するこのＩＣを定量的に測定す
る方法が数多く開発され、その数はゆうに３０種類を越
えている。各種の測定法をその測定原理により大別する
と ■ＩＣが補体を活性化する性質を利用した方法（Ｃ１９
固相法など）。

■ＩＣの物理化学的な性質を利用し、ＩＣを測定する方
法（ポリエチレングリコール法など）。

■細胞のレセプター（ＦＥＷ体レセプターやＦｃレセプ
ター）にＩＣが結合する性質を利用した方法（Ｒａｊｉ
［飽性なと）。

などである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ＩＣの測定方法として、このように多数の方法があるが
、各測定法による測定値には必ずしも良好な相関が得ら
れているわけではない。この理由としては、感度や再現
性といった技術的な問題以外にも、各測定法に特有な被
検血清による干渉作用が存在することや、検出するＩＣ
の多様性に問題があると言われている。

しかしながらこの中でもＣ１ｑを利用した方法は、自己
免疫疾患においてみられる（■織障害の多くが捕体拮合
性ＩＣにより惹起されることを考える時、臨床的には有
用な方法であると考えられる。原理的には古典経路（ｃ
ｌａｓｓｉｃａｌ　ｐａｔｈｗａｙ）を介して補体を活
性化するＩＣに最初に結合する補体成分がｃｔｑである
ことを応用した方法で、Ｃ１ｑ　５ｏｌｉｄ−ｐｈａｓ
ｅ　ａｓｓａｙ　（ＣＳ　Ｐ法）、Ｃ１ｑ　ｄｅｖｉａ
ｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　（ＣＤ　Ｔ法）　、Ｃ１ｑ　　ｂ
ｉｎｄｉｎｇ　ａｓ−ｓａｙ　（ＣＢ　Ａ法）などが代
表的な方法である。これらの中で特異性、操作の簡便性
などからＣ５Ｐ−ＥＩＡ（ＣＳＰ−ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍ
ｍｕｎｏ　ａｓｓａｙ）？Ａが、現在広く用いられてい
る。

この方法は、まず固相（プレートまたはチューブ）にＣ
１ｑを固定化する。その陵、ＥＤＴＡ処理によりＩＣ結
合の内因性の補体をはずした試料（血清）を加え、ＩＣ
を捕捉させる。続いて洗浄後、酵素標識抗ヒトエｇＧ抗
体と反応させ、ＩＣ中のヒトＩｇＧ成分に結合させる。

更に洗浄後、この結合した酵＃標識ＩｇＧ抗体の酵素社
を、基質との反応による発色反応により比色定量するこ
とでＩＣを測るものである。この方法は、他方に比べて
比較的優れた方法ではあるが、以下に述べるような問題
点を有している。

Ｃ１ｑを固定化する際、そのＣ１ｑ溶１θ中に夾雑物と
してＩｇＧが混入していた場合、そのＩｇＧも固定化さ
れる。そして最終的にインジケーターとして用いる酵素
標識ＩｇＧ抗体は、Ｉ’Ｃ中のＩｇＧ成分に結合すると
ともに、固定化されたＩｇＧにも結合する。その結果、
固定化されたＩｇＧの分だけ発色反応は底上げされ、そ
のことによりこの測定系のダイナミックレンジは狭くな
り、ひいてはＩＣの検出幅が狭くなる。またこの事は、
この測定系の感度低下をまねく。

ちなみに、タンパク質化学的検定法（ＳＤＳ−ポリアク
リル７ミド電気泳動法、ディスク電気泳動法、免疫電気
泳動法など）により、単一な標品として検定されても、
Ｃ８Ｐ法においては、タンパク貢化学的検定法では検出
されないレベルの夾雑物ＩｇＧの影響が無視できないこ
とが多い。尚、現在一般に用いられているＣ１ｑ精製法
では上記程度のＩｇＧが混入してくる可能性が高い。

〔問題点を解決する手段〕 本発明者は、かかる事情を１みてＣ３Ｐ−ＥＩＡ法の利
点をそのまま生かし、なおかつ同法の欠点を解消すべく
鋭意考察の結果、ＩＣにはＣ１ｑ結合部位が複数（最低
２ケ所）以上存在するというＩＣの特徴に着眼し、Ｃ１
ｑ及び酵素様ｊｌＩＣ１ｑ　（インジケーター）でサン
゛ドウィッチするという、＃素標識ＩｇＧ抗体を用いな
い全く新規なＣ１ｑサンドウイツチ（Ｃ３Ｐ−ＥＸＡ）
法を考案するに至った。これにより現在のＣ３Ｐ−ＥＩ
Ａ法の酵素標識ＩｇＧ抗体使用による問題点が、この酵
素標ｍｃ１ｑ使用に切替えることにより解消可能と推定
された。そこで鋭意研究の結果、本測定法が可能である
事を確認し本発明に至った。

即ち、本発明は、まず固相（プレートまたはチューブ）
にＣ１ｑを固定化する。そしてＥＤＴＡ処理により、Ｉ
Ｃ結合の内因性の補体をはずした試料（血清）を加え、
ＩＣを捕捉させる。続いて洗浄後、物質標識Ｃ１ｑと反
応させ、ＩＣ中のヒトＩｇＧ成分に結合させる。

更に洗浄後、この結合した物質標識Ｃ１ｑの物質を定量
することでＩＣを測るものである。

次に本発明を調製例および実施例によってさらに説明す
るが、本発明はその要旨を越えない限り、これによって
限定されるものではない。

古−Ｉ　ＣＩの− 本発明の固相化Ｃ１ｑおよび物′！！ｉ標識Ｃ１ｑのＣ
１ｑの原料としてはヒトなどの動物血清が用いられる。

この製造法にはいくつかの方法が知られているが、その
中でも米増等の方法（Ｋ、Ｙｏｎｅ＋＊ａｓｕ　ａｎｄ
　Ｒ，Ｍ、５ｔｒｏｕｄ　：　Ｊｏｕｒｎ−ａｌ　ｏｆ
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０６，３０４−．１９７１
）が最も収量よく、しかも短時間に精製できる。不法で
は更にこの精製法を改良しＣ１ｑを得た。

ζＰ′２　　ベルオ　ぐダーゼ、　Ｃ１の　。

１、Ｊ、Ｓｉｍｐｓｏｎ等の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　ＩｍｗｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ、６７
．１６７−１７２，１９１１４）により、ｃｔｑにペル
オキシダーゼを標識した。尚、架橋法は不法の遇ヨーソ
酸法にこだわらず、グルタルアルデヒド法あるいはマレ
イミド法にてもよい。

９６六マイクロプレート（ポリスチレン製）に調製例１
によりれ１製したＣ１ｑを、ＰＢＳで１０μｇ／−の濃
度に調製したものを２００μｇづつ加え、４°Ｃで一晩
放置し、コーティングした。

次にＣ１９）αを吸引廃棄した後、各ウェルをＰＢＳで
３回洗ｉ％シた。その後２％ＢＳＡ含有ＰＢＳを２５０
μｇ分注し、室温で２時間放置することによりブロッキ
ングした。

更に液を廃棄し、ＰＢＳで３回洗浄したのち、模擬的な
ＩＣであるＡＨＧ　（＾ｇｇｒｅｇａｔａｄ　ｈｕｍａ
ｎ　ＩｇＧ）の希釈系列を１５０μｇづつ各ウェルに分
注し、室温で３時間放置した。

反応液を吸引廃棄し、ＰＢＳで３回洗浄したのち、ペル
オキシダーゼ標識Ｃ１ｑを１５０μｇづつ各ウェルに分
注し、４℃で一晩放置した。

反応液を吸引廃棄し、ＰＢＳで３回洗浄後、２，２゜−
アジノージ−〔３−エチルベンツチアゾリンスルホン酸
（６））；ＡＢＴＳ　（ベーリンガー　マンハイム社製
）および過酸化水素を含む基貢溶）αを加え、室温で９
０分間反応させ、ＥＩＡ−ＲＥＡＤＥＲＧ：ｍＴＯＤ４
１１の吸光度を自動測定した（図１）。

この結果、この測定系はＡＨＧに対して良好な反応性を
示した。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本性は全く新規なＩＣ測定
法であり、この測定によるＩＣの測定が可能であること
を示した。

【図面の簡単な説明】

添付の第１図は、本発明を説明するための図である。 手続補正書（方式） 昭和６３年６月２６日差田 昭和６３年６月２５日

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト体液中の免疫複合体を免疫学的測定法により
   測定する方法において、試料中の免疫複合体に対して特
   異的に結合させる標識試薬として物質標識Ｃ１ｑを用い
   ることを特徴とする免疫複合体の測定法。
2. （２）固相化したＣ１ｑと試料を反応させることにより
   免疫複合体を補捉させ、続いて物質標識Ｃ１ｑをさらに
   免疫複合体に結合させ、その結合標識量を測定して免疫
   複合体を検出、定量することを特徴とする特許請求範囲
   の範囲第１項記載の方法。
3. （３）Ｃ１ｑがヒト、ウサギ、ウシ、ウマ、ラット、マ
   ウス、モルモット、カエル、ヤギ等種々の動物由来のも
   のである固相化Ｃ１ｑ及び物質標識Ｃ１ｑをもちいるこ
   とを特徴とする特許請求範囲第一項記載の方法。
4. （４）物質が酵素、放射性物質、補酵素、酵素の基質、
   細胞機能調節物質、色素、電子授受物質または金属を含
   む化合物ないしは組成物である物質標識Ｃ１ｑをもちい
   ることを特徴とする特許請求範囲第一項記載の方法。