FR2652163A1 - Procede de detection d'une substance biologique a l'aide de ligands. - Google Patents
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Abstract
Procédé de détection et/ou de dosage d'une substance biologique dans un liquide la contenant ou susceptible de la contenir. Ce procédé, dans lequel on utilise un premier ligand ayant une affinité pour un site de ladite substance biologique, et un second ligand, et dans lequel un des ligands est marqué avec un agent traceur, est caractérisé par le fait que le second ligand est un ligand ayant une affinité spécifique pour le complexe formé par le premier ligand fixé par affinité sur ladite substance biologique. Application notamment à la diminution ou à l'élimination de l'effet de zone dans le dosage de substances biologiques dont la concentration est susceptible de varier dans des proportions importantes.
Description
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La présente invention a pour objet un procédé de détection et/ou de dosage d'une substance biologique selon une méthode d'affinité, ainsi qu'un coffret ou trousse de détection ou de dosage permettant la mise
en oeuvre de ce procédé.
On sait que l'un des procédés les plus utilisés pour déterminer la présence ou doser, selon une méthode immunologique, les substances présentes dans un échantillon liquide, est la méthode dite "sandwich". Un premier anticorps, immobilisé sur un support solide, et reconnaissant un site antigénique (épitope) de la substance examinée, est mis en contact avec une solution contenant ladite substance ou susceptible de la contenir. Un second anticorps, marqué avec un agent traceur, et reconnaissant un épitope différent de celui qui est reconnu par le premier anticorps, est ajouté. On constate que lorsque les anticorps sont présents en quantité suffisante, les additions de la substance biologique et du deuxième anticorps peuvent être faites simultanément (méthode dite "simultanée"). Si la substance biologique recherchée est présente dans l'échantillon liquide étudié, on observe l'immobilisation du deuxième anticorps marqué grace à la formation du complexe anticorps I-substance
biologique-anticorps 2.
Mais, lorsque la substance biologique (que l'on peut considérer ici comme un antigène) est présente en quantités importantes, l'excès d'antigènes peut conduire à des situations o l'antigène se fixe d'une part sur l'anticorps 1 immobilisé, et d'autre part sur l'anticorps 2 marqué, en solution, de sorte que seule une faible proportion de l'anticorps 2 se trouve fixée sur le support. En fin de réaction, la phase solide est revêtue essentiellement de l'antigène seul tandis que l'anticorps 2 portant l'agent traceur est présent en solution sous la forme d'un complexe avec l'antigène. Ainsi, le signal détecté tend vers zéro pour
des concentrations très élevées en antigènes.
Ce phénomène, appelé effet de zone (en anglais: hook effect), est bien connu en immuno-chimie; voir par exemple D. Rodbard et al., Immunochemistry, Vol. 15, pp 77-82 (1978) et K.L. Hoffman et al.,
Clinical Chemistry, 30 (9), pp 1499-1501 (1984).
Pour éliminer cet effet de zone, on a préconisé l'augmentation de la concentration de l'un au moins des deux anticorps, ce
qui peut entrainer des défauts de spécificité.
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Une autre solution à ce problème est de mélanger l'anticorps marqué avec le même anticorps non marqué tout en augmentant la concentration globale du premier et du second anticorps. Cette méthode est efficace, mais elle présente l'inconvénient que seule une partie des complexes anticorps 1antigène-anticorps 2 sont marqués, ce qui entraîne
une réduction de la sensibilité du système de révélation.
On a maintenant découvert qu'il est possible d'éviter les inconvénients qui viennent d'utre exposés, en utilisant comme second anticorps, un anticorps capable de reconnaître spécifiquement la liaison
anticorps 1-antigène.
Cette méthode est également utilisable pour détecter ou doser des antigènes de faible poids moléculaire, ayant un nombre réduit
d'épitopes, ou des antigènes ayant un seul épitope.
Le procédé de l'invention peut également être utilisé, notamment selon la méthode simultanée, lorsque la concentration de l'antigène, dans l'échantillon examiné, est susceptible de varier dans des proportions importantes. On peut alors éliminer totalement ou fortement
l'effet de zone observé à forte concentration d'antigène.
Le procédé de l'invention permet donc notamment de résoudre les problèmes posés par la baisse ou l'extinction du signal détecté pour de fortes concentrations d'antigène dans un dosage immunologique avec
incubation simultanée de l'anticorps fixé et de l'anticorps marque.
En outre, le procédé de l'invention peut être appliqué à des systèmes autres que ceux basés sur l'affinité antigène-anticorps, par
exemple à des sondes nucléiques.
La présente invention a donc pour objet un procédé de détection et/ou de dosage d'une substance biologique dans un liquide la contenant ou susceptible de la contenir, dans lequel on utilise un premier ligand ayant une affinité pour un site de ladite substance biologique, et un second ligand, et dans lequel un des ligands est marqué avec un agent traceur, caractérisé par le fait que le second ligand est un ligand ayant une affinité spécifique pour le complexe formé par le premier ligand fixé
par affinité sur ladite substance biologique.
Il va de soi que la substance biologique à détecter ou à doser doit posséder au moins un site spécifique (c'est-à-dire caractéristique de ladite substance), par exemple au moins un épitope spécifique, capable d'être reconnu par un ligand, de façon à pouvoir choisir le premier ligand parmi ceux qui ont une affinité pour ce site
spécifique ou pour un de ces sites spécifiques.
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Dans un mode de réalisation particulier, la substance biologique est une séquence nucléique, le premier ligand est une première sonde nucléique (qui peut être fixée sur un support solide) dont une partie est capable de s'hybrider avec un premier site de la séquence nucléique tandis que l'autre partie de la première sonde ne s'hybride pas avec la substance biologique, et le second ligand est une deuxième sonde nucléique (marquée avec un agent traceur) dont une partie est capable de s'hybrider avec un second site de la substance biologique seulement si l'autre partie de ladite deuxième sonde est capable de s'hybrider avec ladite autre partie de la première sonde, étant entendu que les deux sites de la substance biologique sont suffisamment voisins pour permettre l'hybridation effective desdites autres parties. L'agent traceur est par exemple un agent radioactif ou enzymatique, ou un antigène capable d'utre reconnu par un anticorps conjugué lui-même avec une enzyme ou un composé fluorescent ou
luminescent.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention de ce procédé, les premier et second ligands sont des anticorps, le premier anticorps reconnaissant un site antigénique caractéristique de la substance biologique et le second anticorps reconnaissant spécifiquement le complexe
immun formé par le premier anticorps fixé sur la substance biologique.
La présente invention a donc notamment pour objet un procédé de détection et/ou de dosage d'une substance biologique dans un échantillon liquide la contenant ou susceptible de la contenir, dans lequel on utilise un premier anticorps dirigé contre ladite substance biologique, et un second anticorps, caractérisé par le fait que le deuxième anticorps est un anticorps dirigé contre le complexe immun formé par le premier anticorps et
ladite substance biologique.
L'un des deux anticorps peut Ctre marqué par un agent
traceur, et l'autre anticorps peut être fixé sur une phase solide.
Selon un mode d'exécution particulier, l'un au moins des deux anticorps est un anticorps monoclonal. De préférence les deux anticorps
sont des anticorps monoclonaux.
Il est également possible d'ajouter le second anticorps avec un troisième anticorps marqué capable de reconnaître un épitope, de la substance biologique, différent de l'épitope reconnu par le premier anticorps. La détection se trouve ainsi améliorée, notamment pour les
faibles concentrations de la substance biologique.
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La substance biologique peut être choisie notamment parmi les protéines possédant un épitope unique, les haptènes, les oligosaccharides, les oligopeptides, ainsi que toute substance biologique dont la concentration dans l'échantillon est susceptible de varier dans des proportions importantes. Selon un mode d'exécution particulier, lorsque le premier anticorps est fixé sur un support solide et le second anticorps est marqué avec un agent traceur, on met en contact l'échantillon liquide avec ledit premier anticorps et avec ledit second anticorps, et après des temps d'incubation convenables, on sépare la phase liquide du support solide et on détermine la présence et/ou la quantité de la substance biologique dans ledit échantillon liquide par détermination de la présence et/ou de la quantité d'agent traceur fixé sur le support solide. Ce procédé peut notamment être mis en oeuvre selon la méthode simultanée, c'est-à-dire que l'on met en contact l'échantillon liquide à la fois avec les premier et deuxième anticorps simultanément, sans incubation intermédiaire, de façon à
n'effectuer qu'une seule incubation.
Selon un autre mode dtexécution, le procédé de détection ou de dosage de l'invention peut être mis en oeuvre en solution, c'est-à-dire sans phase solide, en utilisant le fait que, dans le complexe anticorps 1-antigèneanticorps 2, les deux anticorps sont très proches l'un de l'autre, puisque le second anticorps reconnatt la zone de liaison entre
l'anticorps I et l'antigène.
Ce mode de réalisation particulier par voie liquide, c'est-à-dire sans anticorps fixé sur une phase solide, est caractérisé par le fait que les deux anticorps sont marqués chacun par un agent traceur, et que les agents traceurs des deux anticorps sont interactifs. Par exemple, l'un des agents traceurs est un composé fluorescent et l'autre agent traceur est un composé capable d'éteindre la fluorescence. Ou bien l'un des anticorps est marqué par une enzyme qui catalyse une réaction impliquant une substance liée à l'autre anticorps. Ou bien encore, les deux marqueurs constituent ensemble un système multi-enzymatique capable de produire un
signal lumineux.
De tels agents traceurs interactifs sont connus; voir par exemple "Immunoassays in the Clinical Laboratory", Nakumura, Dito, Tucker
Editeurs, Alain R. Liss Inc. New York, 1978, pages 211 - 226.
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Les premiers anticorps utilisables pour la mise en oeuvre du procédé de la présente invention sont préparés selon les méthodes usuelles, par immunisation d'animaux vertébrés avec la substance biologique considérée. Si la substance biologique est un haptène, l'agent d'immunisation est un conjugué de l'haptène avec une protéine. Les anticorps obtenus peuvent être purifiés par exemple par chromatographie d'affinité. De préférence, on transforme les cellules productrices d'anticorps des animaux immunisés en hybridomes, selon les méthodes connues, puis on clone les cellules hybrides produisant les anticorps
intéressants.
Pour préparer le second anticorps, on immunise selon les techniques habituelles des animaux avec le complexe substance biologique-premier anticorps (le premier anticorps étant de préférence monoclonal). On a constaté que les animaux ainsi immunisés produisent une certaine proportion d'anticorps qui reconnaissent le complexe utilisé pour l'immunisation, mais qui ne reconnaissent de façon appréciable ni la substance biologique seule, ni le premier anticorps seul. De préférence, le second anticorps (anti-complexe) est un anticorps monoclonal obtenu par
exemple selon la techniques des hybridomes.
Le marquage des anticorps avec un agent traceur (radioactif, fluorescent, enzymatique ou autre) est effectué selon les techniques
connues. De même, la révélation du marqueur est effectuée de façon connue.
La fixation des anticorps sur un support solide est également connue. Les supports solides sont par exemple des plaques de microtitration, des tubes, des billes ou des barrettes de polystyrène, des microbilles de latex, etc... La fixation sur le support est faite par adsorption, par covalence, ou par l'intermédiaire d'un anticorps (lui-même fixé directement sur le support) reconnaissant un déterminant antigénique isotypique du premier anticorps. L'anticorps intermédiaire provient bien entendu d'une autre espèce animale que celle qui a servi à obtenir le
premier anticorps.
L'invention a également pour objet un coffret ou trousse de détection, selon le procédé décrit précédemment, d'une substance biologique, caractérisé par le fait qu'il contient, outre des tampons et éventuellement des supports solides appropriés, au moins lesdits premier et second ligands tels que définis précédemment. Le coffret ou trousse de détection paut contenir en outre un agent de révélation de la présence de
l'agent traceur.
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Avec le procédé de l'invention, l'effet de zone aux fortes concentrations est suffisamment faible pour ne pas donner des résultats faussement négatifs. Ce faible effet de zone est susceptible de limiter les possibilités de quantification rigoureuse aux fortes concentrations d'antigène. Mais le résultat trouvé étant dans ce cas voisin du signal maximum, il suffit alors de diluer l'antigène jusqu'à des concentrations (qui peuvent être déterminées à l'avance) o le signal est facilement interprétable, pour pouvoir ensuite effectuer, toujours selon le procédé de
l'invention, un dosage correct.
Parmi les substances biologiques susceptibles d'âtre présentes en quantités très variables dans les échantillons biologiques, on citera par exemple l'hormone chorionogonadotrophine (hCG). L'hormone hCG comporte deux sous-unités, alpha et bêta. Seule la sous-unité bêta porte une spécificité antigénique. La sous-unité alpha est commune à plusieurs
hormones (FSH, LH, TSH,...).
On sait que la concentration de cette hormone s'élève rapidement après la fécondation, ce qui constitue un indicateur sensible
d'une grossesse débutante.
Une des difficultés du dosage de cette hormone, par les méthodes immunochimiques, réside donc dans la très grande gamme de concentrations sérique ou urinaire qu'il est possible de rencontrer. Le risque qu'un effet de zone vienne perturber la détermination de cette hormone emp che donc, en pratique, l'utilisation de la méthode classique "sandwich simultanée. Cet effet n'est pas à redouter lorsqu'on utilise le
procédé de l'invention.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois
la limiter.
Exemple 1: Obtention d'anticorps et essais de détection de l'hCG: Stade 1: Obtention d'anticorps monoclonaux dirigés contre l'hCG. L'antigène utilisé est l'hCG commercialisé par DIOSYNTH (Pays Bas), référence 8856 01, contenant 3020 U/mg de poids sec. La pureté de la
préparation a été contr8lée par électrophorèse en gel d'acrylamide.
On rappelle qu'une unité d'hCG correspond à 3 000 pg d'hCG.
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Immunisation: On immunise des souris Balb/c par injection par voie intrapéritonéale avec 30 U d'hCG, par injection et par souris. La première injection est réalisé avec de l'adjuvant complet de Freund, les
autres injections à 4-8 semaines d'intervalle avec de l'adjuvant incomplet.
Un dernier rappel est effectué 3 jours avant la fusion, avec 30 U d'HcG en tampon physiologique, par voie intraveineuse. Après ce rappel, on prélève
la rate des souris immunisées et on recueille les splénocytes.
On procède alors à une opération de fusion des cellules spléniques avec des cellules de la lignée myélomateuse SP2/O-Agl4 (Nature,
276, 269-270, 1978).
Après sélection des cellules hybrides viables sécrétant des anticorps anti-hCG (repérés par test ELISA) et clonage selon les méthodes usuelles, on a obtenu des lignées de cellules hybrides sécrétant des
anticorps monoclonaux reconnaissant l'hCG.
Ces anticorps reconnaissent soit la chaîne alpha, soit la
chaîne bêta, soit les chaînes alpha et beta de lthCG.
Les anticorps monoclonaux ont été produits à la fin du stade 1 sur ascites de souris et purifiés par chromatographie sur échangeur d'ions (DEAE Trisacryl, commercialisé par IBF réf. 250-771), avec élution par une solution aqueuse d'un gradient de phosphate de sodium. La concentration en phosphate de sodium du tampon d'élution est voisine de 15 mm. Stade 2: Obtention d'anticorps monoclonaux dirigés contre
la zone de liaison d'un anticorps monoclonal anti-chaîne beta de l'hCG.
On prépare un complexe immun avec l'un des anticorps monoclonaux antichaîne bêta de l'hCG, obtenu au stade précédent (appelé
ci-après anticorps anti-bêta) et l'hCG, par mélange équimolaire.
La solution de complexe immun ainsi obtenue est utilisée comme immunogène pour immuniser des souris Balb C, selon la méthode décrite précédemment. On prépare des cellules hybrides comme précédemment et on sélectionne les cellules sécrétant des anticorps qui reconnaissent en ELISA
le complexe immun utilisé pour l'immunisation.
On sélectionne finalement les clones produisant les anticorps spécifiques du complexe immun, qui ne reconnaissent pas l'hCG (c'est-à-dire qu'ils ne reconnaissent ni la chaîne alpha ni la chaîne beta) et qui ne reconnaissent pas non plus l'anticorps monoclonal anti-beta ayant servi à
préparer le complexe immun utilisé comme agent d'immunisation.
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On a retenu pour la suite des expériences, trois anticorps monoclonaux spécifiques ayant une bonne affinité spécifique pour le
complexe immun.
Ces anticorps sont appelés ci-après anti-complexe 1, anti-complexe 2 et anti-complexe 3, respectivement. Ces anticorps sont purifiés comme au stade 1. Ils sont ensuite marqués soit par la phosphatase alcaline, soit par la peroxydase de raifort, selon la méthode décrite par NAKANE (réf. Journal of Eistoch and
Cytochem., 1974, Vol 22, N 12, pages 1084 - 1091).
Stade 3: Essai de détection de l'hCG.
L'anticorps anti-bata est fixé par adsorption sur une plaque
de microtitration.
On utilise comme deuxième anticorps l'anticorps anti-complexe 1 conjugué à la phosphatase alcaline, sous la forme d'une solution aqueuse
contenant du phosphate de sodium et du sérum de cheval.
Les essais sont effectués sur des solutions à diverses
concentrations d'hCG (de O à 500 pg/ml).
Les réactifs sont incubés simultanément pendant une heure.
Après lavage de la plaque, le substrat de la phosphatase alcaline, c'està-dire le PNPP (para nitrophényl phosphate) a été ajouté à raison de 0,2 mg par puits, et au bout d'une heure, les densités optiques ont été mesurées. Les résultats sont résumés dans le tableau I suivant:
TABLEAU 1
Concentration en hCG O 10 50 100 250 500 en pg/ml Densité optique à 0,000 0,094 0,154 0,2&1 0,455 0,617 405 nm Les résultats du tableau I montrent qu'il n'y a pas d'effet
de zone pour des concentration en hCG comprises entre O et 500 pg/ml.
On a refait la même expérience, mais en remplaçant l'anticorps anti-bêta par un anticorps monoclonal anti-alpha obtenu au
stade 1.
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Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 2 suivant:
TABLEAU 2
Concentration en hCG O 10 50 100 250 500 en pgfml Densité optique à 0,044 0,032 0,024 0,024 0,026 0,029 405 nm
Les résultats du tableau 2 montrent que l'anticorps anti-
complexe I ne reconnaît pas la zone de liaison de l'hCG avec l'anticorps anti-alpha. Exemple 2: On a procédé à des expériences similaires à celles décrites à l'exemple 1, stade 3 en utilisant comme anticorps immobilisé l'anti-bêta et comme second anticorps l'anti-complexe 1, marqué
à la phosphatase alcaline.
On a comparé les résultats avec ceux obtenus dans un test "sandwich" classique, avec comme second anticorps, un anticorps monoclonal
anti-alpha obtenu à l'exemple 1, stade 1.
Les densités optiques obtenues dans les deux cas sont mentionnées dans le tableau 3 suivant:
TABLEAU 3
gamme d'hCG O 0,01 0,1 1 10 100 1000 en pg/ml
à O - à--- - - - - - - - - - - - - - - - - - -
anti-complexe I 0,000 0,060 0,263 1,391 2,212 2,202 2,055 anti-alpha 0, 012 0,041 1,291 2,574 2,524 1,295 0,261 Les résultats du tableau 3 montrent que l'effet de diminution du signal à forte concentration en antigènes est négligeable pour l'anticorps anti-complexe 1, alors qu'il est très marqué pour l'anticorps anti-alpha.
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Exemple 3: Des essais analogues ont été réalisés avec des anticorps marqués à la peroxydase selon le protocole d'incubation simultanée des réactifs suivants: - Anticorps immobilisé: anti-bEta - Antigène: hCG Deuxième anticorps, marqué à la peroxydase: anti-complexe 1 ou anti-alpha. Après incubation pendant une heure à 37 C, on lave la plaque de microtitration puis on ajoute le substrat OPD (ortho phénylène diamine) et on laisse incuber pendant 5 minutes. On procède ensuite à la lecture des
densités optiques à la longueur d'ondes &92 nm.
Les résultats sont résumés dans le tableau 4 suivant:
TABLEAU 4
hCG O 0,01 0,1 1 10 100 1000 en pg/ml anti-complexe I/ 0,000 0,145 0,380 1,334 1,149 1,126 0,962 peroxydase anti-alpha/ 0,000 0,825 1,338 1,405 0, 753 0,082 0,000 peroxydase Les résultats du tableau 4 montrent que la décroissance de densité optique à forte concentration est très faible avec l'anti-complexe 1 alors que la densité optique devient nulle à forte concentration (1
mg/ml) pour le test "sandwich" utilisant un anticorps anti-alpha.
Exemple 4: Les essais sont réalisés avec les trois anticorps anticomplexe obtenus à l'exemple 1, stade 3, conjugués à la peroxydase. Le protocole d'incubation est le suivant: - anticorps anti-bEta fixé sur la plaque de microtitration par adsorption. -Il- 2652163 - incubation simultanée pendant une heure à 37 C de l'antigène hCG et de l'anticorps anti-complexe marqué à la peroxydase, ou de l'anticorps anti-alpha marqué à la peroxydase, ou d'un mélange 75:25 (en masse)
d'anti-complexe et d'anti-alpha.
- Après lavage de la plaque, on ajoute le substrat (OPD). - Après 15 minutes d'incubation et blocage de la réaction par addition d'une solution IN d'acide sulfurique, on procède à la lecture des
densités optiques à 492 nm.
La gamme d'étalonnage d'hCG s'étend de 0 à 200.000 U/1. Elle
est préparée par dilutions à partir d'un étalon standard à 10.000U/ml.
Les résultats sont représentés sur la figure unique annexée, sous la forme d'un graphique, avec en abscisses le logarithme de la concentration en hCG (en unités par litre) et en ordonnées la densité
optique (DO).
On voit sur la figure que dans le test "sandwich" utilisant l'anticorps anti-alpha, la densité optique décroît fortement pour les
concentrations élevées en antigène.
Avec les anticorps anti-complexe 1 et anti-complexe 2, de meme qu'avec les mélanges anti-complexe 1fanti-alpha et anti-complexe 2/
anti-alpha, il n'y a pas de baisse du signal à forte concentration en hCG.
On voit également sur la figure 1 que le mélange d'un anticorps anticomplexe et de l'anti-alpha permet d'améliorer la
sensibilité à faible concentration d'antigène.
Exemple 5: Des dosages réels ont été réalisés sur 60 sérums dont les valeurs étaient comprises entre O et 5.000 U/1. On a comparé les résultats obtenus avec les réactifs utilisés dans l'exemple & et un réactif commercial vendu par la Société HYBRITECE (coffret Tandem hCG
réf. 41 784 70).
Le réactif commercial contient des anticorps monoclonaux anti-alpha- et anti-bàta-hCG. Avec les anticorps de ce réactif commercial,
on réalise donc un test "sandwich" classique.
Les droites de corrélation des 60 sérums sont portés dans le tableau 5, avec y représentant les résultats obtenus avec l'anticorps anti-buta fixé sur la phase solide et les conjugués anti-alpha, anti-complexe, ou les mélanges anti-alpha/anti-complexe, et x représentant
les résultats obtenus avec le réactif commercial.
Les proportions des mélanges d'anticorps sont les memes qu'à
l'exemple 4.
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Les résultats sont résumés dans le tableau 5 suivant, dans
lequel on désigne par "conjuguée l'anticorps marqué à la peroxydase.
TABLEAU 5
Conjugué Droite de régression Coefficient de corrélation Anti-alpha
àà
Conjugué anti-alpha y = 0,165x + 290 r = 0,30 =__==__= __-- === _==== ==== ==__-- - --- = = == _ =c _ _= = Anti-complexe Conjugué anti-complexe 2 y = 0,855x + 26 r = 0,95 Conjugué anti-complexe 2 + conjugué anti-alpha y = 1,091x + 26 r = 0,98 Conjugué anti-complexe 3 y = 0,702x + 17 r = 0, 94 Conjugué anti-complexe 3 + conjugué anti-alpha y = 1,006x + 15 r = 0, 98 Les résultats indiqués dans le tableau 5 montrent que, du fait des teneurs élevées en hCG de certains sérums, le conjugué anti-alpha conduit à une mauvaise corrélation. L'utilisation de mélanges de conjugués anti- alpha et anti-complexe améliore la précision de la détermination et
conduit à de très bonnes corrélations avec le réactif de référence.
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Claims (13)
1. Procédé de détection et/ou de dosage d'une substance biologique dans un liquide la contenant ou susceptible de la contenir, dans lequel on utilise un premier ligand ayant une affinité pour un site de ladite substance biologique, et un second ligand, et dans lequel un des ligands est marqué avec un agent traceur, caractérisé par le fait que le second ligand est un ligand ayant une affinité spécifique pour le complexe formé par le premier ligand fixé par affinité sur ladite substance biologique.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que lesdits premier et second ligands sont respectivement un premier et un second anticorps, et que le second anticorps reconnaît spécifiquement le complexe immun formé par le premier anticorps et ladite substance biologique.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait
qu'au moins un des deux anticorps est un anticorps monoclonal.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 et 3,
caractérisé par le fait que ladite substance biologique est choisie parmi les protéines possédant un épitope unique, les haptènes, les oligosaccharides, les oligopeptides et les substances biologiques dont la concentration dans ledit échantillon est susceptible de varier dans des
proportions importantes.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4,
caractérisé par le fait que ledit premier anticorps est fixé sur un support
solide et ledit second anticorps est marqué avec un agent traceur.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'on met en contact ledit échantillon liquide avec ledit premier anticorps et avec ledit second anticorps, et qu'après des temps d'incubation convenables, on sépare la phase liquide du support solide et on évalue la présence et/ou la quantité de la substance biologique dans ledit échantillon liquide par détermination de la présence et/ou de la
quantité d'agents traceur fixée sur le support solide.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l'on met en contact ledit échantillon liquide à la fois avec les premier et deuxième anticorps simultanément, de façon à n'effectuer qu'une
seule incubation.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 7,
caractérisé par le fait que ladite substance biologique est l'hormone
chorionogonadotrophine (hCG).
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9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait
que le premier anticorps est dirigé contre la chaîne bêta de l'hCG.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9,
caractérisé par le fait que l'on utilise le second anticorps avec un troisième anticorps marqué capable de reconnaître un épitope, de ladite substance biologique, autre que l'épitope reconnu par ledit premier anticorps.
11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la substance biologique est une séquence nucléique, le premier ligand est une première sonde nucléique dont une partie est capable de s'hybrider avec un premier site de la séquence nucléique tandis que l'autre partie de la première sonde ne s'hybride pas avec la substance biologique, et le second ligand est une deuxième sonde nucléique (marquée avec un agent traceur) dont une partie est capable de sthybrider avec un second site de la substance biologique seulement si l'autre partie de ladite deuxième sonde est capable de s'hybrider avec ladite autre partie de la première sonde, étant entendu que les deux sites de la substance biologique sont suffisamment voisins pour permettre l'hybridation effective desdites autres parties.
12. Coffret ou trousse de détection et/ou de dosage, selon le
procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, d'une substance
biologique, caractérisé par le fait qu'il contient, outre des tampons et éventuellement des supports appropriés, au moins lesdits premier et second ligands.
13. Coffret ou trousse de détection selon la revendication 12, caractérisé par le fait qu'il comprend en outre un agent de révélation
de la présence de l'agent traceur.
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