JPS6022662A - 抗体、抗原または抗体:抗原複合体分析用試薬 - Google Patents

抗体、抗原または抗体:抗原複合体分析用試薬

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JPS6022662A
JPS6022662A JP59120050A JP12005084A JPS6022662A JP S6022662 A JPS6022662 A JP S6022662A JP 59120050 A JP59120050 A JP 59120050A JP 12005084 A JP12005084 A JP 12005084A JP S6022662 A JPS6022662 A JP S6022662A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体試料とくに尿や血清のような生物学的液体
試料中の抗体、抗原フエらびに抗体:抗原複合体を定量
するための試薬に関するものである。
以下、簡単のために以後AbXAgおよびAb:Ag複
合体という記号をそれぞれ抗体、抗原および抗体:抗原
複合体の意味に使う。
よく知られているように生物学的液体中のAb 。
AgおよびAb:Ag複合体の定量は重要である。例え
ば多くの病気はこのAb:Ag複合体が循環系に存在す
ることによって特徴づけられている。Agはバクテリア
またはビールスの存在によるたん白質あるいは人体組織
またはガン細胞から放出されたたん白質を含む多種類の
たん白質のどれかである。
Abは、もちろん特定のAgに対して特異性をもつもの
であり、それしそれはリンパ系によって合成される。T
gG類の免疫グロブリンが大部分である。
血液中のAb:Ag複合体を検出し、分離しそしてその
特性づけをすることは価値ある情報を提供し、そして例
えば病気の診断に使われる。
Ag、AbおよびAb:Ag複合体の検出ならびに定量
そして特にAgの性質と量を決定するための公知の技術
は数多くある。これらの定量技術は「免疫検定法」と呼
ばれている。
自然に生成する物質である補体(complement
、 )の特定の成分であるc、tqは、Ab:Ag複合
体とは結合する性質をもっているが遊離のA、g また
は遊離のAb と結合する性質はもたないということが
ある時代に知られた。この性質なAb:Ag複合体の検
出にある特殊な方法で使うという提案がかつてあったが
、それは定量法またに絶体量の決定のできる方法でしま
なく、AblAgおよびAb:Ag複合体の分析にC]
、qを有力、有用な試薬として使うことは末だかつて実
現されていない。
本発明者を工、溶解した形にあるC1qはAb、Agお
よび(または) Ab :Ag複合体を含む分析法にお
いて実際適用範囲の広い試薬となることおよびそれを使
うと例えば免疫検定手法を簡易にし、そしてより精確装
することを見出した。
C1q V’i天然の循環するたん白質であり、その分
離や精製の方法は公知である。それは通常ヒト、ウサギ
またはウシの血清から得られるが、その手法は“ユウグ
ロブリン(euglobulin )沈でんパとして知
られている。[J、Immunol、、 106+ 6
04〜41ろ(1971)] 本発明はこのclqを不溶性化し分析試薬としての適用
範囲をさらに広げるものである。この不溶性化は水性液
体に不溶性の固体相基質に共有結合させるか、または吸
着させて行う。このような固体相基質の1例はラテック
スである。
C1qを同体相基質に直接的にかまたは間接的に共有結
合させるには、たん白質を不溶性の基質に共有結合させ
るために知られているそして使われている一般的方法を
使うことができる。この固体相基質は結合反応のために
アミン基またげ、カルボキシル基のような反応性基を1
つまたは2つもっていなければならない。適当な固体相
基質には凝集した免疫グロブリンのような自然に生成す
る物質とアミノ化されたアガロース(agarose 
)のような合成物質とがある。ある場合にばCIQを直
接固体相に共有結合さぜたりあるいは吸着さぜたりする
ことができる。それは例えば固体相がナイロン、アガロ
ース、セルロース、アクリルアミトモしくはアクリルポ
リマー、ポリスチレンまたは種種のガラス製品である場
合である。しかしながらグルタルアルデヒドのような架
橋物質を使ってC1qを固体相に結合させることが好ま
しい。本発明に使う好ましい試薬はC1qをグルタルア
ルデヒド橋によってアミン化されたアがロースに共有結
合させたものである。
C1,qを合成固体相基質上に吸着させることによって
不溶性化する場合には、これは例えばC1qの溶液を固
体相と接触させることによって行なわれる。
本発明による試薬は粒状または顆粒状例えばアミン化ア
ガロースのビーズ上にC1qのコーチングをもっている
ようなものが一般に好ましい。しかしある種の目的例え
ば連続流れ式分析には、チューブの少なくとも内面の1
部上にコーチングとして試薬を形造ることが好都合であ
る。そうするとチューブを通る反応物が試薬のコーチン
グに接触するようになる。
本発明による不溶性化したC1q試薬は生物学的分析に
非常に数多くの用途をもって(・る。その根本は、すべ
てのこれらの用途がこの試薬がAb:Ag複合体と結合
し、そして遊離のAI)と遊離のAgには結合しないと
いう能力に依存するのである。
この能力によって遊離のAbおよび遊離のAgとの混合
物からAb:Ag複合体を分離するためにこの試薬を使
うことが可能になるのである。
この試薬は生物学的液体の連続流れ式分析に使って特別
の利点がある。そして本発明はこのような用途を含むも
のである。
本発明がさらに充分に理解されるように、この試薬を利
用する様様の試験法をここに記載する。
1、 分離法 生物学的(またはその他の)液体からAb二Agi合体
を分離する方法はその液体を不溶性化したC1qと接触
させることである。液体中の複合体は不溶性化したC1
qに結合するようになるが、これに反してAbまたばA
gのようなそこに共存する他の物質は結合しない(ある
いは少しは結合しても決して有意な程度にまでは結合す
ることばない)。
従って、不溶性化したC1qを混合物から分離すること
により、C1qに結合しているAb:AglJ合体の分
離ができる。次に所望により、適当な塩濃度または−の
適当な緩衝液で洗浄することによって不溶性化したC1
qから複合体を分離することができる。この方法で比較
的濃縮された複合体の溶液を得ることができるのである
この方法は不溶性化したC1ciを含むカラムを用いて
イvl宜的にソ′、17!jする。二とかでどろ、/−
ki : t、p、彷イi体?含む血清また(工その他
の試イ′−1をカラムを通すとカラム中のC1qに結合
して複合体が保持される。
複合体を次に溶出する。代表的な1つの方法ではC1q
がグルタルアルデヒドと共に結合しているアミン化され
たアガロースのビーズかう成るマイクロ−カラムが用い
られる。血清をこのカラムに通し、保持されたAb:A
gjO合体を続いて例えばチオシアン酸アンモニウムの
濃度を1Mから6Mへ増加させながら使って溶出する。
カラムを使う代わりとして、不溶性化したC1qを被検
液体と簡単に例えばフラスコの中で混ぜ、それから次に
遠心分離またはろ過によって分離することもできる。
本発明の分離法はAb:Ag複合体ばかりでなく、間接
的に特殊のAbまたはA、gを溶液から分離するのにも
有用である。例えばある溶液から抗原Ag′を分離しよ
うと欲する場合には、それに対して特異的な抗体Ab’
を過剰にカニえてAb’ : Ag’複合体を作り、次
にこの複合体を本発明の試薬を使って分W91ろことカ
ニでごろ、、(、L/シ初の浴数力゛/・、/・7行合
体を含んで(・るならは、QM FH[:’JなLL体
八へ、′を肌・える前に通常予備処理によってこの複合
体を先ず分離して除かねばならない。
このような本発明の分離法の特に特徴とするところは、
これらの分離法が非常に効果的であるので、非常にうす
いAb:Ag複合体の溶液からこの複合体を集めたり濃
縮したりすることができることである。血清やその他の
生物学的液体中で複合体が非常に低濃度で存在すること
はまれではないから、上記のことは非常に重要な利点で
あり、そしてそのような複合体を分離することは既知の
方法ではきわめて困難なことである。
2、分離的検出および定量 (a) この試験は前記のように不溶性化したC1qに
接触させることによって生物学的液体がらAb:Ag複
合体を選択的に除去し、その後複合体な検出することを
含む。
例えば血清試料を、その中にあるAb:Ag複合体を不
溶性化したC1qに結合すせることによって除去するよ
うに取扱う。このように結合した複合体はC1qから遊
離されそして例えば可溶性のC1qを使って検出される
。すなわち赤血球(または免疫ブロクリンでコーチング
された粒子)が可溶性C1q K接触すると凝集反応が
起り始める。しかし溶液中にAb:Ag複合体も存在す
るときには、この複合体は比較的すみやかにC1qと反
応−し、そしてC1,1は溶液中でAb:Ag複合体に
結合し、その結果コーチングされた粒子(または赤血球
)の凝集反応は起らなくなる。このようにして液中のA
b:Ag複合体の存在は例えは血清を(可溶性) C?
lqと接?、i!ごぜそ1−て免疫クロフ゛リンでコー
チングされlこ粒子と接触させることによって検出する
ことができる。凝集反応が観察されたならば、その血清
はAb:Ag複合体を全く含んでいないのである。
(b) この試験は試料中の特別のA+)またはAgの
存在を検出するのにもまた有用である。例えば特定の抗
原Ag′を試験する場合には、先ず血清に適当なそれに
対して特異的な抗体Ab’を加え、それからこの混合物
をその中にある複合体を分離するように本発明の試薬と
接触させる。このような複合体が少しでもあれば、それ
は上記(a)で述べたようにして検出することができる
。血清が始めから他のAb:Ag複合体を含んでいるな
らば、このような複合体はAb’を加える前に除去する
ことができる。
(c)別の検出法では限られた量のciqに対して2種
類のAb:Ag複合体の間の競合が含まれる。すなわち
、たとえば過剰のラベル付きAb:Ag複合体を限られ
た量の不溶性化したC]、qK加えると、そのときはす
べてのC1qは複合体に結合して(〜ま5゜も1−その
とぎラベル付と松自イ4のり1冗1.l−らにレベル付
きでないAb:Ag?J(合体を含む血?rI試月を加
えるならは、ラベル付き複合体とラベル付きでない複合
体が限られた量のc]−qに対してそのモル数に応じて
競合することになる。平衡に達した後にC1qがそれに
結合した複合体といつ、しよに除かれるならば、残った
溶液中にラベル付きの複合体が存在する(または特に最
低量に存在する)ことはこの血清試料はAb:Ag複合
体を含んでいたことを示す。この方法は血清試料中の複
合体の量を測定するように定量的に操作することができ
る。
この技術もまた上述のように特別のAg またはAbの
存在検出のために一般的に使うことができる。
(d、) ことに特定のAgまたはAbを検出するさら
に別の方法(これは定量的に操作できる)は次のとおり
である。例えば血清の試料が特定の抗原Ag′を含んで
いるかどうかを確証しようと欲するときには、それに対
して特異的な抗体Ab’を作り、そして例えば酵素でそ
れにラベル旬けをする。次にこのラベル付きのAb’を
不溶性化したC1qと混合し、そしてそれに血清試料を
加える。次に不溶性化したC]、qは(付着しているA
b’ : Ag’複合体とともに)分離されそして残っ
た液はその中にあるラベル付きAb’の存在(またはそ
の量)をテストされる。これが始めに加えた量よりも少
ない場合には、血清試料中にはそれに対して特異的な抗
原Ag/が存在したに違いない。
1例を挙げると、血清中に特定の抗原たとえはIgEが
存在するかどうかは次のようにして知ることができる。
カタラーゼでラベル付けされた抗■gE抗体ヲ、テスト
するべきサンプル中に存在するIgEと複合体を形成す
るのに必要とされる量よりも過剰に、不溶性化したC1
q (たとえばアガロース・ビーズ)に添加する。それ
に血清サンプルを加え、混合物をインキュベ−1・する
。不溶性化C1qを(形成された工gEと抗IgEとの
複合体も−しよに)分離除去してから、残留液体の残留
酵素活性を測定する。もしも血清サンプル中にIgEが
存在すれば、この残留酵素活性レフ、添加された抗Ig
E抗体の初めの活性よりも低くフよる。というのは、抗
IgE抗体の1部は血清中のIgEと複合体を形成して
不溶性化C1qと共に除去されるからである。
この一般的な手順のもう1つの例として抗原モルヒネの
検出法を速さる。この手順においてはモルヒネは酵素た
とえばアミラーゼによってラベル付けさ第1る。特異的
な抗原ルヒネ洸体Ab″を調製して、モルヒネの存在を
テストするべきたとえば血清またしま尿の試料と混ぜる
もしいくらかでもモルヒネが存在すればそれはA、b“
と複合体を形成する。ついで酵素でラベル付けされたモ
ルヒネを加えると、それは血清または尿中のモルヒネ濃
度に比例してAl)“と複合体を形成する。
それに不溶性化したC1qを添加して、Ab″と血清中
のモルヒネとの曲において、ならびにAb“とラベル付
けされたモルヒネとの間において形成された複合体を吸
着させる。ついで不溶性化C1qを(複合体と共に)溶
液から除去する。溶液中にラベル付けされたモルヒネが
残留するので、その酵素活性を測定することによって最
初の血清サンプルがモルヒネを含有していたかどうか、
さらに含有しCいた場合はとれだけの量のモルヒネが存
在していたかを決定することができる。
上述の例はモルヒネにのみ言及したが、同じ手順がその
他の抗原の検出にも使用し得ること、さらにそれが抗体
の検出しも準用し得ることは理解されるであろう。ラベ
ル付けは必ずしも酵素・によるものでなくてよい。
(e)本発明の試薬はまたネフエロメータによる免疫検
定(nephelome t r l C1m1llu
fl’0aSSayS ) において有用であり、とり
わけそのような検定の感度向上に役立つ。とりわけ、不
溶性化したC1Qの使用は、定量きるべき抗原によって
吸着された後のAbの残留活性を測定するためのネフエ
ロメータ使用による抑制免疫検定の手順を非常に容易な
ものとした。たとえばC1−1冶たん白質(foeto
protein )を測定するだめの手順においては、
まず血清を抗α1−胎たん白質抗血清と混ぜる。形成さ
れたAb:Ag複合体は非常に濃度が低くてそれらを遠
心分離によって分離除去することはできないから、それ
ら複合体を溶液から除去するために不治性化C1qを加
えてそれらと結合させる。ついで、浴液中に残留遊離し
ているAbをα、−胎たん白質と混 ゛ぜて、Abの残
留濃度に依存する溶液の粒子密度をネフエロメトリーに
よって測定する。
6. 特性確認(cbaracterisation 
)不溶性化したC1qの使用を包含する先に微速された
手順の多くがAb 、 A15またはAb:Ag複合体
の特性確認において有用な予備手続であることは理解さ
れるだろう。これらの手順のあるものは直接的に特定の
AgまたはAbを同定することを可能にする。たとえば
、特定のAbの存在が予想される場合にそれに対して特
異的なAgを加えてAb:Ag複合体の存在を検出する
ことによって前記Agの存在が確認される場合の手順で
ある。前述の記載から明らかなように、本発明の試薬は
Ab、AgおよびAb:Ag複合体の特性確認に非常に
有用である。
一般的にいえば、八gの同定(すなわち特性確認)はさ
まざまの手順、たとえば核酸の存在を検出するだめの分
光測定法、ビールスを同定するための電子顕微鏡法およ
びビールスまたは組織抗原に対して特異的な抗血清によ
る免疫螢光法(immunofluorescence
 )、によって達成される。
最後に挙げた手順は結合されたAb:Ag複合体な包含
する不溶性化CIQ (たとえばアガロース・ビーズ)
と共に使用し得る。換言すれば、複合体を最初に除去す
る必要はない。
ある特別の目的のためには不溶1牛化(: l 14を
ラベル付けすることが便利であり、これはたとえばT1
25 または螢光または補酵素(NADH)によるラベ
ル付り“によって達成し得る。
不溶性化されたCJ、qはAb:Ag複合体と結合する
ばかりでなく凝集免疫グロブリンとも結合する。
当業者には明らかなことであるが、上述の手順を遂行す
る場合にこの事実を銘記すべきことは言うまでもない。
凝集免疫グロブリンはたとえは放射性よう素原子または
フルオロクロムによってラベル付けすることができ、そ
のようにして上記の分析手順においてラベル付けされた
Ab:Ag複合体の代りに使用し得る。
本発明をより深く理解するために、本発明のa種の観点
を例示する次の実施例を示す。
例 1 C1qの固相へのカンプリング。
グルタルアルデヒド25%の水性溶液1mlを−8,5
の炭酸塩緩衝液5m(?中の予め塩溶液で膨潤させたア
ミン化されたアがロース(AH−セファロース)5ml
に加える。混合物を15分間室温でかきまぜ次に炭酸塩
緩衝液100mgで洗う。混合物を遠心分離し上澄みを
傾斜し、さらに炭酸塩緩衝液5mlを固体に加える。連
続的に振とうしながら、精製したCIQ 1.25 m
eと十分なグリシンをこれでグリシン中の最終の0.2
モル溶液になるように加える。振とうを10〜12時間
続け、固相を次に遠心分離し生理的塩水で洗う。
例 2 ラベル付けしたC1qのM )Zt。
PH7,4の50mモルのりん酸塩緩fLW200mi
をC1q 10’ Otlg に刀nえる。
混合物を20μlのアリコートに分割し 112510
μC続いてクロルアミン−T5i]゛μgを各アリニー
!・に加える。酸化を60秒秒間性させ、反応を塩50
μy含有しているメタ亜硫酸水素ナトリウム水溶液50
μlを加えて終結させる。次にセファデックスG25の
カラムに上記の混合物を通して所望のラベル付けされた
材料を上記のりん酸塩緩衝液で溶離してラベル伺けした
C1qをT125から分離する。
溶離画分をγ−活性で分析し、活性e−りをもつ両分を
一緒に集め、必要なときまで栓をして冷凍する。
例 ろ [F]− AH−セファロース−4B C1q C、IuSlh、d15r−4およびり、H,しi、r
l j+の方法(J 、 Im+nt+++r辻。
第111巻、第661頁、197ろ)の後、ヒト血清か
ら、低いイオン濃度およびPHでの真性グロブリンの沈
殿とヒl−I−f5c、−セファロース」ニー\の免疫
吸収(Imunoabsorption )とにより和
製しム−C1qを製造する。AH−セファロース−4B
はPI−18,5の炭酸塩緩衝$ 5 ml中、洗浄ケ
ゞル5m/!にグルタルアルデヒドの25%水溶液1m
gを添加することにより活性化したグルタルアルデヒド
である。
この添加後直ちに黄色色調が現われる。反応を室温で1
5分間行い、混合物を遠心分離し、上澄み液をデカンテ
ーションして除き、固形物を再洗算し、遠心分離し、そ
して最後に炭酸塩緩衝液5−゛罰中に懸濁する。精製し
たC1qO,2m+7を活性化セファロースl me中
に添加する。混合物を室温で10分間インキュベートし
、そして次にグリシン緩衝液2Qmlで5回洗浄する。
混合物を次にptl 8.5の0.2モルダリシン緩衝
液により4°Cでさらに16時間インキュベートシて存
在する未反応のグルタルアルデヒド基をブロックする。
デルを再び上澄み液から分離し、そしてグリシン緩衝液
中に再び眉17蜀する。
例 4 免疫複合体(Immune Complex )の決定
例6で製造したセファロース粒子の直径は約220μで
あり、顕微鏡を通して見ることができる。ヒトIgGで
コーティングした直径0.8μのラテックス粒子をこれ
に混合すると、セファロース粒子の表面は白くそしてき
めが粗くなる。セファロースを最初に免疫複合体を含む
血清と混合すると、免疫複合体はセファロース表面上の
C1qと優先的に結合し、ラテックス粒子との結合をブ
ロックする。次にセファロース表面はなめらかにろえる
ようになる。試験は液滴上で行うことができるので、非
常に低いC°↓度の免疫複合体も非常に小さい試料中で
測定できる。
多量の場合には、セファロースを遠屯1分離し、ビーズ
を洗いそして次にpH値を小さくすることにより、溶液
から免役複合体を分離することができる。
例 5 たん白質−ヒト血清アルブミンの定量分析ヒト血清アル
ブミン(H8A)を含む適当に希釈した血清中に125
■でラベル付けした抗ヒトアルブミン抗体の過剰量を添
加[−5、そして混合物を4°Cで一夜または67℃で
1時間インキュベー1・する。
次にこの混合物にpH7,2の1乙5モルリン酸塩緩衝
液中、50%φセファロースーC1q懸7蜀液0.5m
l中の結合部位を完全に飽和するため、抗ヒトトランス
フェリン−ヒトトランスフェリン(59Feでラベル付
け)免疫複合体十分量、を添加する。アルブミン−抗ア
ルブミン1251免疫複合体/ 59Feトランスフェ
リン−抗トランスフェリン免疫複合体混合物を次にセフ
ァロース−C]、’ q懸濁液Q、5m6中に加え、6
7°Cで1時間インキュベートする。
セファロース−C1q上の上澄み液をデカンテーション
して除き、ビーズをリン酸塩緩衝液で2回読ロントする
ことができる。引続いてのアルブミン濃度は次にこの応
答曲線から評価することができる。この方法は測定すべ
き物質とその抗体とにより形成した大部分の免疫複合体
を低濃度で検出するのに敏感な技術を提供する。他方で
は、アルブミン−抗アルブミンの一定量中で59Fe 
)ランスフェリンの活性を測定することにより、この方
法はトランスフェリンを定量°するために使用すること
ができろう
【図面の簡単な説明】
第1図は例5において得られたデータについて、放射能
(計数7分)を縦軸とし、アルフ゛ミンー抗アルブミン
量(μt)を横軸として両者の関係を示す、線図的説明
図である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 水性液体に溶けない固体相基質に共有結合したかまたは
    吸着した、抗体:抗原複合体とは結合するが、遊離の抗
    体または抗原とは結合しない性質をもつ補体の1成分(
    C1q )を含んで成る、液体試料中の抗体、抗原また
    は抗体:抗原複合体を定量するだめの試薬。
JP59120050A 1974-05-20 1984-06-13 抗体、抗原または抗体:抗原複合体分析用試薬 Granted JPS6022662A (ja)

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