JPS59501123A - 免疫分析法、それに使用する装置及びかかる装置の製法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 免疫分析法、それに使用する装置及び かかる装置の製法 技術分野 本発明は血清等の試料の免疫分析を実施する方法、かかる分析に使用する装置及 びかかる装置の製法に関する。

発明の背景 通常使用する従来の免疫分析はすべて、血清、髄液等の試料内の免疫複合体と反 応させるために固相基板にたんばく質を被覆する。かかる試料中にががる免疫複 合体が存在すると、試料を採取した患者がリューマチ性関節炎、腫瘍、肝炎、ウ ィルス性感染等のような状態であることを示す。以下に詳述するＥＬＩＳＡ試験 は、固相基板をたんばぐ質で皺覆し、特定の溶液で洗浄して、試製すべき血清又 は他の試料をたんばく質の上におき、たんばく質に試料中の免疫複合体を吸着さ せることを含む。たとえばホスファターゼのような酵素と結合した抗ひとＩｇＧ のような酵素でラベルした接種クロプリンを添加し、所望の時間放置°した後、 何回も予め決めた溶液で洗浄する。

次いで基質を添加すると反応してたんばく質と結合し、結合した免疫複合体の量 に依存して通常変色する。、−ニトロフェニルホスフェートの場合には着色は黄 色であるが、その他の基質の場合には色は異なシうる。一定の時間、たとえば３ ０分以上の後一般に定性分析しうるように色の変化が視覚的に観察しうるけれど も、分光光度割によれば目で見るより更に正確に判断できる。

免疫複合体を検出するその他のインビトロ分析には、抗ＩｇＧ　Ｉ＋２５のよう な放射性物質でラベルした抗血清を使用することにより免疫複合体の量を定量す るラジ（Ｒａｊｉ）セル放射性免疫分析が含まれる。過剰の放射性物質でラベル した抗血清を洗浄により除去した後、放射性物質と反応する免疫複合体の量をシ ンチレーション計数計の使用により確認しうる。ラジセル放射性免疫分析試験は 「イン・ビトロ・メソ゛ツズ・イン・セルーメデイエイテド・アンド・テユーマ ・イミューニテイ（工ＨＶｉｔｒＯＭｅｔｈａ＋ｊｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄ ｉａｔｅｄ　ａｎｄ　Ｔｕｍｏｒ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ月第５２章り節（ブルーム ・ビー（Ｂｌｏｏｍ、　Ｂ、　）及びレエイ・デイビド（Ｊ、　Ｄａｖｉｄ　） 編、１９７６年アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｊｃ　Ｐｒｅｓｓ）に記載 されている。

前述の各試験は試料との初期反応のためにたんばく質を必要とするので、固相基 板上に層を形成する物質が一層安価であれば免疫分析に使用する物質の価格は実 質的に減少し、最終価格が減少するのは明らかである。更に、放射性物質を使用 する場合には通常特別な許可が必要であり、特に取扱い及び使用中には多くの注 意を必要とする。更に、放射性物質は全く高価で危険である。

本発明の目的のうちには、免疫複合体を定量するための血清等の試料の免疫分析 を行°う新しい方法を提供すること、従来の分析に必要とするたんばく質よシか なり安価な物質を使用する方法を提供すること、信頼性がちり再現性のある結果 が得られる方法を提供すること、同様な試験に比べて容易にかつ単純に実施しう る方法を提供すること、容易に多量生産でき、分析時間をかなり減少させる装置 を提供すること、長期間貯蔵しうるよう々装置を提供すること、装置が効果的か つ能率的であるように製造する方法を提供すること、及び容易にかつ効果的に非 常に低価格で実施しうる方法を提供することが含まれる。

発明の製綿 ホリエチレングリコール及び、高分子ポリオール類、又はデギストラン又は、４ １Ｊ塩化ビニルのよう々他の物質は同相基板と結合して人間の血清等の試料中に 存在しうる免疫複合体を吸着する能力を有し、信頼性のある免疫分析に有効であ ることが発見された。かかる性質を有するポリマーをミクロ−タイター（ｍｉ　 ｃｒｏ−ｔｉ　ｔｅｒ）プレー１゛、試験管等のような固相基板に結合させた後 は、本発明の分析法に使用する工程１ｒ１．　ＥＬＩＳＡ分析の対応する工程と 同様でもよい。しかしながら、固相基板はポリマーが結合するものでなければな らないし、プラスチック、特にポリスチレン及びポリ塩化ビニル又は本発明に開 示されている物質と同様に作用する他の物質が基板に好捷しい物質であることが 見出された。

試料がポリマーと反応した後、ポリマーに吸着された免疫複合体と反応しうる抗 ひとＩｇＧ　−Ｉ　＋　２５のような放射性物質を使用してもよい。次いで過剰 の反応体を除去し、吸着された免疫複合体と反応した放射性物質の量をシンチレ ーション計数計又は分析しうる同様な方法で測定する。

免疫分析に有用な本発明の装置は、タイタープレートの平坦な表面中の一連の壁 又は試験管の腔部のようなポリマーの層及び試験する試料を受承する手段を固相 基板で、好ましくはガラス製ではなくてプラスチック製であり、前記手段は免疫 複合体を吸着しうる液相の非たんばく質性、非イオン性ポリマーの被膜すなわち 層を有するものである。かかる装置を製造する方法は前述の分析法の最初の二、 三の工程と同様である。装置はまた、好壕しくは液相物質の層の蒸発を遅延させ るために７１Ｊマー及び試料を受承する手段をおおう層すなわちフィルムにより 保護する。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の装置を形成しかつ特に本発明の免疫分析に有用なプラスチッ ク製のミクロ−タイタープレートの上面平面図である。

第２図は、使用のために調製したミクロ−クイタープレートを示す、第１図の線 ２−２の拡大部分断面図である。

第６図は、本発明の免疫分析に有用な別の装置を含む試験管の拡大長軸方向断面 図である。

第４図は、第１図のタイタープレートの端部を含むような位置の第２図と同様な 断面図で、タイタープレートの壁部に付着した液体ホリマーの蒸発を防ぐか又は 遅らせる保護層を示す図である。

発明の詳細な説明 第１図のミクロタイタープレート（Ｐ）、又は第３図の試験管（Ｔ）のような試 料を受承するように形成されている固相基板を、リューマチ性関節炎、腫瘍、肝 炎、ウィルス性感冒等に苦しむ患者の血清試料中に存在するような免疫複合体、 たとえば抗原抗体の検出に使用するだめに本発明に従って処理する。プレート（ Ｐ）及び試験管（Ｔ）は各々好ましくはポリスチレン又はポリ塩化ビニルのよう な適するプラスチックである。プレート（Ｐ）には３２ｃｃ程度の容量の一連の たて穴（２０）が設けられているが、試験管（Ｔ）の容量は約５ｙＱｃｃ程度で もよい。血しよう又は脳髄液のような人間の血清の相肖数の試料及び所望の十分 な量の対照標準試料を試′験するためにプレー）　（Ｐ）のたて穴（２ｏ）中に 置く。プレー　）　（Ｐ）のたて穴はいかなる方法で設けてもよいが、ここでは 縦及び横の列の双方に分割し、各々特定のたて穴を示す適する糸となっている。

第１図に示す糸においては、縦の列のたて穴は１乃至１２の数字で表わし、横の 列のたて穴はＡ乃至Ｈの文字で表わし、試験する試料の結果について一層精確な 関係を示す。明らかなように第１図においては９６個の竪穴があるが、その数は 所望に応じて変化しつる。

本発明によれば、免疫複合体を吸着させ、プレート（力及び試験管（Ｔ）のプラ スチックを湿潤させうる非たん・ばく質性、非イオン性有機ポリマーの溶液を使 用する。好ましい非イオン性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＦｉＧ　） 、すなわちｐ−インオクチルフェニルエーテルである。

ｐｉＧの分子量は約２，０００乃至約２０，０００であるが、６．ｏｏ。

乃至ａ、　ｏ　ｏ　ｏが好捷しい。ＰＥＧ濃度が約５乃至約２０％、好ましくは ９％のＰＥＧ溶液をプレート（Ｐ）上に注ぐか浸漬して、各たて穴（２０）中に 付着させる。１２乃至２４時間後、過剰のＰＥＧをプレートから取り去ると、プ レートの各たて穴に付着するＰＥＧである第２図の層（２１）が残る。

第６図の試験管（Ｔ）の内側にＰＥ０層（３１）を被覆するには、試験管に−Ｐ ＥＧ溶液を注ぎ、典型的には１２乃至２４時間放置し、次いで過剰の溶液を振シ おとすような同様な作業を使用しうる。

分子量約２．ＯＤＤ乃至約２０，０００の、＋６１Ｊエチレングリコールポリマ ー又は付加物を本発明に使用しうろことも期待される。試験は、適当な湿潤及び 反応性を有する高分子物質が本発明に従って使用するのに適することを示す。

プレート上に伺着させた非イオン性ポリマーは、第４図の層すなわちフィルム（ ２２）のような保護手段により空気から保護すべきである。というのは、例３に 示すように、空気に長時間暴露すると、溶媒が蒸発してＰＥＧが粉末となり、以 下に記載するように血清を添加した時に洗い流されてしまう可能性がある。

最も好１しくけ、免疫を含む血清とＰＥＧを反応させる前に緩衝溶液でプレート （Ｐ）のたて穴からＰＥＧ溶液を洗い流すことが望ましい。典型的には、以下の 第１表に示すようなｐＨが約Ｚ６の炭酸塩−炭酸水素塩緩衝溶液を使用Ｎａ２Ｃ Ｏｓ　１．！ＩＭ’ ＮａＨＣＯ３２，９？ Ｈ２０１４ 第２表のリン酸塩緩衝溶液のようなｐＨが約７４のその他の緩衝系も使用しうる 。

ＫＨ２ＰＯ４０，２ｆ Ｎａ２ＨＰＯ３１２Ｈ２０２，９１ｉ’各々の場合、適量のＰＦ２Ｇを緩衝溶液 に添加しうる。緩衝系ではないＰＥＧの水溶液を添加する場合には、緩衝溶液は 血清と共に添加してもよい。クイタープレート又は試験管等はプラスチックでな ければならないことが見出された。というのは、さもなければ本発明に有用な非 イオン性ポリマーがガラス製のタイタープレート又は試験管には十分付着できな いからである。

血清及、び分析の残留物を同様にして、たんばく質を抗原として使用する、本明 細書に記載する標準ＥＬ工’ＳＡ分析に適用した。かかる方法はピッドウェル（ Ｂｉｄｗｅｌｌ）及びバー　トレン１□　（Ｂａ、ｒｔｌｅｔｔ　）による［ザ ・エンザイム・リンクド・イミュノソーベント・アセイ（Ｔｈｅ、　Ｅｎｚｙｍ ｅＬｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　）　（ＥＬＩＳＡ 　）　Ｊと題する１９７９年の木に記載されている。この本の第６図は、以下の ように実施するように記載されている抗体分析の間接的方法の図である。

１　関連した抗原を固相に結合させて洗浄する。

２　希釈した血清試料を添加し、温飯して洗浄する。

ろ　酵素ラベルした接種グロブリンを添加し、反応させてα、浄を繰返す。この 第二の抗体にラベルした抗原に次いでラベルしていない接種グロブリンも使用す る。

４　酵素基質を添加する。基質の分解により色が変化する。色の変化の量及び速 度は工程２の血清試料中の抗体の量と関連している。） タイタープレー　１−　（Ｐ）を処理してＰＥＧ層（２１）を形成した後、試験 すべきひと血清又は対照標準血清又は対照標準溶液を適量、たとえばＰＥＧ層（ ２１）に吸着させるためにタイタープレートのたて穴（２０）中に置く。たとえ ば目盛付ピ×ソトにより５０μｔの血清を適当なたて穴（２０）に添加し、３７ ℃において１時間以上、それより低い温度、たとえば６７℃より４℃低い温度に おいて２時間捷で放置する。

次−いで、前述の、免疫複合体の吸着した層（２１）を好ましくは６回、ケン化 度の低いリン酸塩溶液、たとえばミズーリ州セントルイス（Ｓｔ、　Ｌｏｕｊｓ ’　）のシグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａＡ　）から入手しうる 標準洗浄剤である「トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０」０５ｍ１を第２表のリン 酸塩緩衝溶液に添加した溶液で洗浄する。もちろん他の同等の洗浄剤も使用しう る。好ましくは６回洗浄する。１回、２回、６回及び４回洗浄した試験によれば 、６回の洗浄が望ましく、４回目の洗浄は試験の精度に感知しうる程度の改良は 生じないことが示された。

洗浄の後、抗ＩｇＧ　１１２５の使用を含む従来の放射性法によりＰＥＧに結合 した免疫複合体の量を定量しうる。過剰の放射性物質を洗浄し、反応した免疫複 合体の量をシンチレーション計数計により測定して放射性物質の存在及び量を定 量してもよい。しかしながら、文献の多くの個所及び本明細書中前述の酵素結合 免疫吸着分析、すなわちＥｌ−ＩＳＡ試験を行うことにより、たんばく質の使用 を含む従来の試験に比べて放射性物質を使用しなくて済み、かつ結果が迅速に得 られることが発見された。従来の試験は免疫複合体の定量のためにたんばく質の みを使用し、非たんばく質性、非イオン性有機ポリマーは使用しなかった。かく して、本発明はシグマ・ケミカルから従来入手しうる製品である酵素と結合した 抗ひとＩｇＧの添加を含む。酵素を添加した後、層を３７℃において２時間よシ 短い時間放置し、その後第２表のリン酸塩緩衝洗浄剤溶液又はこのリン酸塩溶液 に９％のＰＥＧを添加した溶液で約４回洗浄する。

選択した酵素がホスファターゼの場合には、基質は好ｉｆ、くけｐ−ニトロフェ ニルホスフエート−ｃｈｖ、ｍ度は１　ｍｇ　／　ｗ程度であるが、次いて第６ 表の基質溶液２００ｔｉ　ｌ−をプレートの各たて穴に添加する。選択した酵素 がｇルオキシ夛−ゼの場合には、基質はフェニレンジアミンホスフェートと少量 のｕ２ｏ２である。選択した酵素がβ−ガラクトシダー七の場合には、基質はガ ラクトシドである。他の種類の抗体結合酵素の場合にはもちろん適当な基板を使 用すべきである。適する基板の選択は、免疫分析研究の当業者の権限範囲内であ る。

前述の工程の後の次の反応はｐＨ９，８において第６表の溶液に添加した酵素に 特異な基質の添加による着色剤との反応である。

ＭｇＣ４２・６Ｈ２０６Ｈ２Ｏ１０ ０Ｔ１　ｓｏｏｍｚ 室温でおこる着色剤との反応により、生ずるとすれば約３０分Ｊコノ、内に色の 変化が生ずる。反応による色の変化はプレートに結合した免疫複合体の量に依存 する。無色乃至非常に淡い黄色の場合には免疫複合体は有意量より少ないことｍ １表わす。濃い黄色の場合にはかなり多量の免疫複合体が存在することを示す。

ＥＬＩＥＩＡ試験の結果を確認するのに通常使用する種類の分光光度計は一般に 人間の目より信頼性がある。かかる分光光度計はリン酸塩で洗浄した基質につい ては４０５ｎｍの吸収を示す。典型的には、かかる基質は通常の血清の場合０． ０６００．Ｄ、以下を示す。逆に、６６℃に３０分間加熱して熱により凝結した びとγ−グロブリンは０．０６０’　Ｏ，Ｄ、以上を示す。

市販のポリエチレングリコールすなわちＰＥＧは、デキストラン又はポリ塩化ビ ニルのようなプレート（Ｐ）又は試験管（Ｔ）及び免疫複合体の双方と反応して 物理的に相溶しうる非イオン性有機ポリマーより有効であると思われる。

というのは後者の方がｈｏ　ＩＪエチレングリコールより効果的ではなくかつ選 択的ではないからである。免疫複合体との相互作用は、ラムプリング・エム・ダ ブリュー（Ｒａｍｐｐｉｎｇ、　Ｍ、　Ｗ、）によりバイオケミカル・ジャーナ ル（Ｂｉｏｃｈｅｍｊｃａｌ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　）　（１９７４年）において 示唆された免疫沈降特性に基いて、ＰＥＧのドメインから複合体が立体的に除外 されることによることが決定的ではないけれども理論づけられる。ポリマーは溶 液中で可動であるというよりｄＪしろ固相基板上で動かないので、本明糺書中で 観堅された結果を説明するのに立体障害の理論は出現せず、本発明の発見は予期 せぬものである。いずれにしても、本明細書で調製した固相基板へ免疫複合体を 吸着させるためにＰＥＧ又はその他の本発明の、ｌ−？　＋）マーを使用するこ とは示唆されても試みられてもいなかった。

ポリマーと固相基板との反応、次いで血清の添加の他に、ポリマーと血清との混 合及び、基板及び血清の双方との反応のために同相基板上に、ｌ−？　＋）マー を付着させることも可能であると思われる。第１表又は第２表のような緩衝剤の 溶液の添加も望捷しい。前述のように進行し、次いで洗浄及び試験を行う。

更に、インビトロで生成した免疫複合体の定量は、嫌疑をかけられた患者の状態 の有無を調べるために本発明に従って使用しうる。かかる反応を用いずに試験す る同一の血清試料を試験管中で嫌疑をかけられた抗原と反応させると免疫複合体 が一生成しうる。たとえば、肝炎の抗体を調べるためには、血清試料を試験管中 で穏かに震盪しながらたとえば６７℃において１時間肝炎ウィルスと反応させる 。その結果得られたものは、ウィルスと反応させていない血清である別の試料と 共に本発明の試験の−試料として使用する。次いで、肝炎ウィルスと反応させた 試料が免疫複合体の存在に関して高い読みを示した場合には（通常の血清はずっ と低い読みを示すが免疫複合体の存在を示す）、免疫複合体の存在の結果として 肝炎に特異性の抗体が生成していることを示す。その他の特定の病気による状態 の存在を調べるためには、かかる病気の結果化ずる細菌を血清試料と反応させ、 かくして反応きせた血清の試験と通常の血清の試験との結果を比較することによ り、免疫複合体の存在がかかる細菌によるか否かが判明する。リウマチ性関節炎 にかかつているか否かを示す試験においては、患者の血清試料を、免疫複合体を 形成する抗原として作用するひと免疫グロブリンＧ（工ｇＧ）と反応させる。か くして反応させた試料を通常の血清試料と共に調べると、ＩｇＧと反応させた試 料の読みは比較的高く、通常の（未反応の）試料の読みはかなシ低く、免疫複合 体の存在はＩｇＧの抗体にょシ生成したことが判明する。同様にして、体紅斑性 狼迫、すなわちＳ］ｙＥにかかつているか否かを調べるためにはＤＮＡを血清試 料に添加する。一方の血清試料に適当なウィルス、細菌、又はその他の抗原を添 加し、同時に通常の（未反応の）血清試料を調べることにょ９その他の嫌疑をか けられた状態に関しても同様に判明する。

２　＋）で−と反応させた固相基板の効力及び免疫複合体に関する血清の試験を 以下の例により示す。

実施例　１ 第１図のプレー）　（Ｐ）に対応するタイタープレートを使用した。約６０００ の分子量を有する９　％　ＰＥＧを含む表１の炭酸塩−炭酸水素塩緩衝溶液をた て穴（２ｏ）に添加し、プレートを６７℃で１２時間放置し、過剰溶液を除去し てたて穴（２０）中に第２図の層（２１）を形成した。次に、病院の種々の患者 から得られたひとの血清の複製サンプルをプレートの９６のたて穴の内７２のた て穴に導入した。

更に、免疫複合体のないと考えられる赤ん坊の血清の負の対照例を２１のたて穴 に入れ、一方リューマチ性関節炎と診断された患者からの血清よυ成る４つの正 の対照例を４つのたて穴に入れた。また、ホスファター上９素でラベルした抗ひ と工ｇＧ抗原から成る基質の機能をテストするだめの比較例を１つのたて穴に入 れた。血清とサンプルを添加後、プレートを３７℃で１時間放置し、場合により 血清サンプルの免疫複合体をＰＥ０層と反応させた。次に、たて穴の各々をトウ ィーン２０洗浄剤０５−を添加した表２のリン酸塩緩衝液で６度洗浄した。

洗浄後、ホスファターゼ酵素でラベルした抗ひと１ｇＧ免疫クロプリンをたて穴 に添加し、６７℃で２時間温飯した。温飯後、過剰の抗血清を除去し、プレート をトウィーン２０洗浄剤を含む表２のリン酸塩緩衝液で６度洗浄した。

洗浄後、ｐ−ニトロフェニルホスフェ−）を添加した表６のジェタノールアミン 溶液を各たで穴に添加し、必要に応じて反応を起こさせた。３７℃で６０分経過 後、各たて穴の反応層の色を分光光度計で測定し、４０５ｎｍでうＸルした抗ひ と１ｇＧ抗血清を含むたて穴は２０の読みを示し、一方２１の通常の又は負の対 照例の内２１−１：０００１乃至０．０７の読みを示し、２つは００００の読み であった。才だ、１つの通常サンプルと考えられるものは０７９６の読みであり 、これは免疫複合型不整合を示唆する。残りのテストの読みは０．０２乃至０５ ７５であり、複製試料に対する読みの差は固相プラスチック基板上のタンパク質 被膜、ＥＬＩＳＡ分析又はラジセルラジオイムノアツセイの使用に関する本発明 者の経験の範囲内で複製試料での差に近似していた。従って、上記のテストはそ れぞれプラノチックと反応する層としてタンパク質を使用するラジオイムノアッ セイ及びＥＬＩＳＡ分析の信頼性と等しい。

実施例　２ 第１図のプレートＰに対応するタイタープレートを第２図のＰＥ０層２１を形成 すべ〈実施例１と同様に処理した。従って、病院より得られたろ２のひと血清試 料をり入れた。９つの負の対照例、２つの正の対照例及び１つの基質対照例を利 用した。実施例１と同様の手続をくり返し、同様に形成した色の試験を行なった 。

負の対照例の全ては０００の読みであシ、一方２つの正の対照例は各々０７８と ０６２であった。基質対照例は濃い黄色を示し、読みは０．８８８１であった。

対照側以外の最も高い読みは、実際に病気であった患者に対する０７６９であっ た。６５のサンプルは００６０よシも小さい読みであった。この数字は複製試料 が００６０より小さい読みを示し、他方は００６０よυわずかに大きい読みを示 す事実により説明される。残、りの読みの内、８つは０．０６０と０１００の間 にあり、７つは０１０１と０．２００との間にあり、６つは０２０１と０６００ との間にあり、２つは０ろｏｌと０４００との間にあり、一方２つの複製物の読 みは上述のように０．４０１以上、即ぢ０５１９と０７３７であった。また、複 製試料の読みの変動は、固相プラスチック基板上のタンパク質、及びＥＬＩＳＡ 分析又はラジセルランオイムノアソセイ分析を使用するときに複製試料で示され る読みに関して、発明者の経験に近い。

シ下の実施例はｈｏ　ＩＪママ−液状又は湿潤条件を維持する必要性を示す。

実施例　６ 第１図のプレート（Ｐ）に対応するタイタープレートラ実施例１のように処理し て第２図のＰＥＧ層（２１）を形成した。

プレートは３７℃で４日間保護しないで放置した。熱凝集ひとガンマグロブリン の試験サンプルにプレートを使用しようとすると、緩衝液が蒸発し、プレート上 に粉末の層（明らかにＰＥＧ　）を残すことが見い出された。試験液をたて穴に 入れるときに、この粉末のほとんどが洗い出され、たて穴に添加した血清が粉末 を洗い出し、またプレートが試験の更に別の工程で使用することができなくなる ことが分った。

実施例１及び２に先立って行なった以下の実施例は、本発明に従い実施例１及び ２の正の対照例として熱凝集ひとガンマグロブリンを使用する試験の比較結果を 示す。

実施例　４ 第１図のプレート（Ｐ）に対応するタイタープレートを実施例１と同様に処理し て第２図のＰＥＧ層を形成し、ひと血清を３０分間６６℃で加熱して熱凝集ひと ガンマグロブリンを得た。プレートを、０．５７！のトウイーン２０を添加した 表２の溶液で洗浄した。第２図の２つのたて穴（２０）を、１：４の比で水で希 釈した熱凝集ガンマグロブリンで満し、一方洗浄液の’Ｉ′：４溶、液を他の２ つのたて穴に添加した。プレートを時々震盪′しながら、３７℃に維持し、先に 使用した洗浄液で２度洗浄した。４つのたて穴の各々に、ホスファターゼ酵素と 結合した抗ひとＩｇＧの１：２００希釈液を添加し、１時間温飯した。プレート は同一の洗浄液で２度洗浄し、表６の基質溶液中に１１ｎ！。

当り１ｍｌの量のｐ−ニトロホスフェート基質を添加した。

４０分後、たて穴を目で調べ、洗浄液を含むたて穴が無色透明であり、はじめに ひとガンマグロブリンを含むたて穴が透明であるが濃い黄色であることが分った 。

第１図のプレート（Ｐ）に対応するタイタープレートラ実施例１と同様に処理し て第２図のＰＥＧ層（２１）を形成し、ひと血清を実施例４のように加熱して、 ひとガンマグロブリンを得た。以下の表４のように種々の希釈度の試料を調製し 、実施例１及び２のように基質の色を分光光度計で測定′した以外は実施例４と 同様に試験した。４０５ｎｍの吸収における読みを表４に掲げる。

表　４ 希　釈　度　分光光度計の読み １：ｓ　Ｏ，３６０ １：１６　０２９９ １：５２　０．１９２ １：６４　０．１０１ １：ｊ２８　０．０４８ １：２５６　０．００６ １：５１２　’　０．０００ １：１０２４　［１，［ｌＯ（］ 縦座標として十進法の読みを示し、横座標として幾何学的基準に基づき希釈度の ファクターを示し、即ち、連続した希釈度を一定の間隔で配置することにょシ上 記の読みをプロットすると、１：８〜１　：　１２’８の希釈度で直線が得られ た。１：２５６希釈度に対する読みは、直線を延長すると直線の上に現われ、１ ：５１２及び１：１０２４希釈度の読みは横座標に現われた。この直線は信頼性 のあるＥＴ、ＩＳＡ試験に典型的なものであるので、本発明の試験の信頼性は示 されたものと考えられる。

実施例　６ プレート（Ｐ）に対応するタイタープレートのたて穴を分子量６０００のＰＫｏ 　９％溶液で被覆し、実施例５のように洗浄した。一連のサンプルを実施例４の ように調製した熱凝集カンマグロブリンから調製し、このサンプルから上記表４ の希釈度を有する水溶液を調製した。本方法の感度を試験するために、ひと血清 を、繰り返し凍結融解して、凝集ガンマグロブリンを生成し、別の一連のサンプ ルを実施例５のように水溶液で同様に希釈した。各サンプルの２００μＬをプレ ートのたで穴に添加し、９０分室温で温飯した。プレートは０．５−のトウィー ン２０を加えた表２の溶液で′２度洗浄した。ホスファターゼ酵素と結合し、１ 　二５００で希釈した抗ひとＩｇＧの２００μｔを各たて穴に入れ、９０分濡装 し、次に上記洗浄液で２度洗浄した。基質を各たて穴に添加し、即ち表６のｐ− ニトロフェニルホスフエートの基’Ｊ１ｍ液２００μＡを４０分間反応させ、３ ＮＮａＯＨ溶液で急冷した。

以下の弄４は目により観察した結果を示す。この結果は、分光光度計はど正確で はないが、試験の感度を示す（（主）＋十は濃い色を示す。

十／−は薄い色を示す。

−は無色透明溶液を示す。

以下の実施例は分子量２０．０００と６０００のポリエチレングリコールを比較 するだめのものである。

実施例　７ 分子量２０．　ＯＯＯのＰＥＧ　１０％溶液を第１図のプレート（Ｐ）に対応す る１つのプレートに被覆し、一方分子量６０００のＰＥ０１０％溶液を同様のプ レートに被覆した。各プレートをトウィーン２０を添加した表２のボスフェート 溶液で洗浄した。正常のひと血清を実施例４におけるように加熱し、過剰の血清 を遠心により除去し、残シから以下の表６に示した希釈度を有する複製サンプル を作製した。種々の希釈度のサンプルを谷プレートに添加し、ろＡ時間室温で放 置し、次に震盪し、ケン化したホスフェート溶液で２度洗浄した。酵素と結合し た抗ひとＩｇＧの１：２００溶液を各たて穴に入れ、プレートを１０〜１５分マ イクロミキサー中で震盪し、３０分３７℃で及び１′ｉ７２時間室温で湯量した 。各プレートを軽度にケン化したホス７−Ｉ−−）溶液ｆ洗浄Ｌ、２００μＬの ｐ−ニトヮフェニルホスフエート基質を実施例４のように各たて穴に添加した。

２０分後、サンプルを含むたて穴を視覚測定した。

その結果を表６に示す。

１：４’０９．６　−　− （注）十十＋は最大の強度を示す。

十十は濃い色を示す。

十／−は薄い色を示す。

−は無色透明を示す。

上記試験から、６０００のｐｐｏがよシ効果的に免疫複合体と尺応するようであ る。

ここで示した以外の本発明の実施態様も利用でき、本発明の範囲を逸脱すること なく、種々の変更を行なうことができる。

手続補正書（方式） １　事件の表示 国際出願番号　ＰＣ”ｒ／ＵＳｇ３１００４６６２　発明の名称 免疫分析法、それに使用する装置及びかかる装置の製法３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　バイオスター・メディカル・プロダクツ・住　所　東京都千代田区永田 町１丁目１１１ｔ２８号・６　補正の対象 特許沫第１８４条の５第１項の規定による書面中特許出願人Ｉ）　欄、願書翻訳 文の第■及び第■欄、タイプ印書により浄書し国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　血清等の試料を免疫分析し、免疫複合体を決定する方法であって、 分析試料を受承する装置を有する固相プラスチック基板を処理して、前記装置上 に、前記基板と接着しかつ前記試料中に存在する免疫複合体を吸収することので きる非たんばく質性非イオン性ホＩＪマーの層を形成し、 分析試料を前記受承装置上に置き、 前記ホリマ一層に前記試料中の免疫複合体を吸収させ、そして 前記層に存在する免疫複合体の量を指示するように、該層を処理する、 ことを含む方法。 ２、請求の範囲第１項に記載の方法において、前記ホリ−７−カ＄　リエチレン クリコール、デキストラニ／又はポリ塩化ビニルであることを特徴とする方法。 ３　請求の範囲第１項に記載の方法において、前記非イオン性ポリマーが分子量 が約２０００〜２Ｑ、０．０１］のポリエチレングリコールであることを特徴と する方法。 ４、　請求の範囲第１項に記載の方法において、前記ホリマーが高分子ホリオー ルであることを特徴とする方法。 ５、　請求の範囲第１項に記載の方法において、前記層で吸収される免疫複合体 の量にほぼ比例する色の変化を生じさせるように前記指示処理を行ない、そして 視覚又は分光光度装置により、形成した色を測定する ことを特徴とする方法。 ６　請求の範囲第５項に記載の方法において、記ポリマー層を形成し、 前記７１纏ツマ一層で前記試料の免疫複合体を吸収させ前記層の一定時間の放置 後、該層を緩衝液で複数回酵素と結合した前記層ひとＩｇＧと反応性の基質を添 加し、前記層中の免疫複合体と反応する、酵素と結合　、。 角 した前記層ひとＩｇＧの量に比例する色変化を生じさせ、そして　〜　゛ 分光光度計により前記層中の色変化を測定する、ことを特徴とする方法。 ７　請求の範囲第１項に記載の方法において、前記指示処理が放射性薬剤を含み 、かつ前記層によシ吸収される免疫複合体の量にほぼ比例する放射性強度を生じ させ、そして 存在する放射性の量を測定する、 ことを特徴とする特許 ８　請求の範囲第１項に記載の方法において、第１の試料と本質的に同一の第２ の試料を、懸濁条件下でウィルス又は細菌で処理し、そして前記第１の試料と同 時に第２の試料を免疫分析する、ことを特徴とする方法。 ９　血清等の試料を免疫分析して、免役複合体を検知する方法において、 少なくとも１つめ受承装置を有する同相プラスチック基板の一つの受承装置であ って、該受承装置が該受承装置に接着しかつ試料から免疫複合体を吸収すること のできる非たんばく質性、非イオン性ｇ　ＩＪママ一層を有するものの上に、前 記試料を置き、分析試料を前記受承装置上に置き、 前記ポリマー層にかかる免疫複合体を吸着させ、そして 前記層中の免疫複合体の量を指示するように、前記層を処理する、 ことを特徴とする方法。 １０　請求の範囲第９項に記載の方法において、前記、＋ＯＩＪマーカポリエチ レングリコール、デキストラン又はポリ塩化ビニルであることを特徴とする方法 。 １１、請求の範囲第９項に記載の方法において、前記非イオン性ポリマーが分子 量約２０００〜２０，０００のポリエチレングリコールであることを特徴とする 方法。 １２、請求の範囲第９項に記載の方法において、前記ポリマーが高分子ポリオー ルであることを特徴とする方法。 １３　請求の範囲第９項に記載の方法において、前記指示処理が前記層により吸 収される免疫複合体の量にほぼ比例する色の変化を生じさせ、そして生じた色を 測定する、 ことを特徴とする方法。 １４　請求の範囲第１３項に記載の方法において、前記基板を緩衝溶液で複数回 洗浄して、該基板上に前記ポリマーを生成させ、 酵素と結合した抗ひとＩｇＧを前記層に添加しがっ該層を一定時間放置し、 前記層の一定時間の放置後、該層を緩衝液を複数回洗浄し、 酵素結合抗ひとＩｇＧと反応性の基質を添加して、前記層中の免疫複合体と反応 した酵素結合抗ひと工ｇＧの量に比例する色変化を生じさせ、そして前記層中の 色変化を分光光度計で測定する、ことを特徴とする方法。 １５　請求の範囲第９項に記載の方法において、前記指示処理が放射性薬剤を含 み、かつ前記層で吸収される免疫複合体の量にほぼ比例する放射線強度を生じさ せ、そして 存在する放射線量を測定する、 ことを特徴とする方法。 １６、請求の範囲第９項に記載の方法において、前記第１の試料と本質的に同一 の第２の試料を懸濁状のウィルス又は細菌で処理し、そして前記第１の試料と同 時に前記第２の試料を免疫分析する、 ことを特徴とする方法。 １Ｚ　試料の免疫分析を行ない、免疫複合体の存在を測定するのに有用な装置で あって、 被覆層及び分析試料を受承する部材を有する、固相プラスチック基板、及び 前記受承部材上にあって、前記基板と接着しかつ試料中に存在する免疫複合体を 吸収できる、液相の非た、　んばく質性、非イオン性ポリマーの層、を含む装置 。 １８　請求の範囲第１７項に記載の装置において、前記ボ＋）　マー　カ＄リエ チレングリコール、テキストラン又はポリ塩化ビニルであることを特徴とする装 置。 １９　請求の範囲第１７項に記載の装置において、前記非イオン性ポリマーが分 子量約２０００〜２０，０００のプロピレングリコールであることを特徴とする 方法。 ２、特許請求の範囲第１７項に記載の装置において、前記ポリマーが高分子ポリ オールであることを特徴゛とする装置。 ２１、請求の範囲第１７項に記載の装置において、前記固相基板が本質的な平坦 な表面上に一連のたて穴を有するプラスチックであることを特徴とする装置。 ２２、請求の範囲第１７項に記載の装置において、前記プラスチックがホリスチ レン又はポリ塩化ビニルであることを特徴とする装置。 相基板が中空内部を有するプラスチック管であることを特徴とする装置。 ２、特許請求の範囲第１７項に記載の装置において、該装置が前記受承部材のだ めの保護部材を有することを特徴とする装置。 ２５、試料の免疫分析を行い、免疫複合体の存在を測定するのに有用な装置を形 成する方法にして、分析試料の受承する少なくとも一つの部材を有する、固相プ ラスチック基板の各受承部材中に非たんばく質性、非イオン性ポリマーの層を置 き、前記ポリマーが前記基板に接着性でかつ前記試料中の免疫複合体を吸２６　 請求の範囲第２５項に記載の方法において、前記ポＩＪ　？−がポリエチレング リコール、テキストラン又はポリ塩化ビニルであることを特徴とする方法。 ２７　請求の範囲第２５項に記載の方法において、前記非イオン性、＋Ｏ＋）マ ーが分子量約２０００〜２０．０００のプロピレングリコールであることを特徴 とする方法。 ２８　請求の範囲第２５項に記載の方法において、前記ポリマーが高分子ホリオ ールであることを特徴とする特法。 ２、特許請求の範囲第２５項に記載の方法において、前記固相基板が本質的に平 坦な表面に一連のたて穴を有するプラスチックであることを特徴とする方法。 ３０請求の範囲第２５項に記載の方法において、前記固相基板が中空内部を有す るプラスチック管であることを特徴とする方法。 ３１、請求の範囲第２５項に記載の方法において、前記プラスチックがｈｏ　Ｉ Ｊスチレン又はポリ塩化ビニルであることを特徴とする方法。