JPH02266263A - 免疫測定法および免疫測定用具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、検体中の２種以上の抗原または抗体を同時に
検出することができる免疫測定法（イムノアッセイ）お
よびこれを実施するための免疫測定用具に関する。

〈従来の技術〉 免疫測定法は、検体中の特定の抗原または抗体の存在を
検出するものであり、各種疾病の診断に利用されている
。

近年、ガンの診断において、検体（血液）中に含まれる
ガンマ−カー　即ち、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＡＦＰ、ＣＥＡ
、フェリチン等の抗原を測定し、定量化することにより
、早期のガンの発見に役立てるという試みがなされてい
る。

検体中の抗原（ガンマ−カー）の量を測定する方法は、
可溶性の標識化された抗体と検体中の抗原（ガンマ−カ
ー）とを反応させ、さらに不溶化された抗体との複合物
を形成させ、該複合物の標識の酵素活性を調べることに
より行われる。

この場合、ガンマ−カーとなる抗原の種類は、複数に及
ぶため、各々の抗原毎に測定し、それらの結果を組み合
せて総合的に判断していた。

しかるに、このような従来法では、複数回の測定操作を
行うため、その操作に多大な労力をおよび長時間を要し
、また検体を多量に必要とし、コストが高いという欠点
がある。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明は、上述した従来技術の欠点に鑑みてなされたも
ので、その目的は、１回の操作で検体中の２種以上の抗
原または抗体の存在を検出することにより、測定に費や
す労力および時間を軽減し、また、測定に要する検体の
量を少な（することができる免疫測定法および免疫測定
用具を提供することにある。

く課題を解決するための手段〉 従来の免疫測定法では、複数種の抗原または抗体の検出
を行う場合、前記ガンマ−カーの検出に限らず、一般に
１種毎にその抗原または抗体を特定してその量を測定す
るのが常識であり、抗原または抗体の種類を特定せず、
複数種の抗原または抗体の総量のみを求めるという概念
はなかった。

しかるに、本発明者は、前記ガンマ−カーの検出に代表
される複数種の抗原または抗体の検出に際し、これらの
うちの全部または一部の総量のみを求めた場合でも、そ
のデータの利用価値は大きいことに着目し、これを簡易
、迅速に達成しうる方法について鋭意研究した結果、本
発明に至ったものである。

即ち、本発明は、検体中の２種以上の目的抗原または抗
体を検出するに際し、一つの検体中において各目的抗原
または抗体と結合しうる抗体または抗原との反応により
複合体を形成させて各目的抗原または抗体を少なくとも
１つの支持体に固相化するとともに、これらを標識化し
、この標識の標識活性に基づいて前記２種以上の目的抗
原または抗体を検出することを特徴とする免疫測定法で
ある。

また１３本発明は、測定対象物たる２種以上の目的抗原
と、これら各目的抗原と特異的に結合しうるリガンド化
された抗体と、該リガンド化抗体のリガンドと結合しう
る抗リガンド体が固相化された支持体と、標識化抗体と
を反応させて、支持体−リガンド化抗体−目的抗原−標
識化抗体の複合体を形成し、前記標識化抗体の標識活性
を測定することにより、前記２種以上の目的抗原の各々
または合計の抗原量を求めることを特徴とする免疫測定
法である。

また、本発明は、測定対象物たる２種以上の目的抗原と
、これらと競合する標識化抗原と、これら各目的抗原お
よび標識化抗原と特異的に結合しうるリガンド化された
抗体と、該リガンド化抗体のリガンドと結合しうる抗リ
ガンド体が固相化された支持体とを反応させて、支持体
−リガンド化抗体−目的抗原および支持体−リガンド化
抗体−標識化抗原の複合体を競合的に形成し、前記標識
化抗原の標識活性を測定することにより、前記２種以上
の目的抗原の各々または合計の抗原量を求めることを特
徴とする免疫測定法である。

また、本発明は、測定対象物たる２種以上の目的抗体と
、これら各目的抗体と特異的に結合しうるリガンド化さ
れた抗原と、該リガンド化抗原のリガンドと結合しうる
抗リガンド体が固相化された支持体と、前記各目的抗体
と結合しうる標識化抗体とを反応させて、支持体−リガ
ンド化抗原−目的抗体−標識化抗体の複合体を形成し、
前記標識化抗体の標識活性を測定することにより、前記
２種以上の目的抗体の各々または合計の抗体量を同時に
求めることを特徴とする免疫測定法である。

また、本発明は、測定対象物たる２種以上の目的抗原と
、これら各目的抗原と特異的に結合しうるリガンド化さ
れた抗体と、該リガンド化抗体のリガンドと結合しうる
抗リガンド体が固相化された２以上の支持体と、標識化
抗体とを反応させて、それぞれの支持体に対し、支持体
−リガンド化抗体−目的抗原−標識化抗体の複合体を形
成し、前記標識化抗体の標識活性を測定することにより
、前記２種以上の目的抗原の各々または合計の抗原量を
求めることを特徴とする免疫測定法である。

また、本発明は、測定対象物たる２種以上の目的抗原と
、これらと競合する標識化抗原と、これら各目的抗原お
よび標識化抗原と特異的に結合しうる・リガンド化され
た抗体と、該リガンド化抗体のリガンドと結合しうる抗
リガンド体が固相化された２以上の支持体とを反応させ
て、それぞれの支持体に対し、支持体−リガンド化抗体
−目的抗原および支持体−リガンド化抗体−標識化抗原
の複合体を競合的に形成し、前記標識化抗原の標識活性
を測定することにより、前記２種以上の目的抗原の各々
または合計の抗原量を求めることを特徴とする免疫測定
法である。

また、本発明は、測定対象物たる２種以上の目的抗体と
、これら各目的抗体と特異的に結合しうるリガンド化さ
れた抗原と、該リガンド化抗原のリガンドと結合しうる
抗リガンド体が固相化された２以上の支持体と、前記各
目的抗体と結合しうる標識化抗体とを反応させて、それ
ぞれの支持体に対し、支持体−リガンド化抗原−目的抗
体−標識化抗体の複合体を形成し、前記標識化抗体の標
識活性を測定することにより、前記２種以上の目的抗体
の各々または合計の抗体量を同時に求めることを特徴と
する免疫測定法である。

また、本発明は、目的抗原または抗体の種類数に対応す
る数の支持体を有し、各支持体毎に異種の目的抗原また
は抗体が結合する免疫測定法であるのが好ましい。

そして、前記各支持体は、その支持体に結合した目的抗
原または抗体の種類を特定し得るようその性状が互いに
異なるものである免疫測定法であるのが好ましい。

このような免疫測定法において、前記リガンドがビオチ
ン、前記抗リガンド体がアビジンである免疫測定法であ
るのが好ましい。

また、前記標識が、酵素、放射性物質または蛍光物質で
ある免疫測定法であるのが好ましい。

また、本発明は、前記免疫測定法を実施するのに用いら
れる免疫測定用具であって、抗リガンド体が固相化され
た少な（とも１つの支持体と、各目的抗原または抗体と
特異的に結合しうるリガンド化抗体または抗原と、標識
化抗体または抗原とを含むことを特徴とする免疫測定用
具である。

また、本発明は、前記免疫測定法を実施するのに用いら
れる免疫測定用具であって、各目的抗原または抗体と特
異的に結合しうる抗体または抗原が固相化された少な（
とも１つの支持体と、標識化抗体または抗原とを含むこ
とを特徴とする免疫測定用具である。

〈実施例〉 以下、本発明の免疫測定法および免疫測定用具について
、添付図面を参照しつつ詳細に説明する。

第１図〜第７図の各図は、それぞれ本発明の免疫測定法
の手順の例を模式的に示す説明図である。

第１図に示す方法は、いわゆるサンドイツチ法を応用し
たもので、測定対象物たる抗原（以下、目的抗原という
）が、比較的高分子の抗原である場合に適用するのが好
ましい方法である。　以下、この方法の手順を説明する
。

［Ｉ−１］ 血液、血清のような検体中の２種類の目的抗原ＩＡおよ
びＩＢと、これらに特異的に結合しうる抗体（以下、リ
ガンド化抗体という）２Ａおよび２Ｂとをそれぞれ結合
させる。　なお、リガンド化抗体２Ａおよび２Ｂは、予
め同定されているものである。

これらのリガンド化抗体２Ａおよび２Ｂには、それぞれ
リガンド３が結合されている。

このリガンド３は、ビオチンであるのが好ましいが、他
に低分子ハブテン（例えば、Ｆ　Ｉ　ＴＣ）等でもよい
。

［Ｉ−２］ 目的抗原ＩＡ−リガンド化化体体Ａの複合体および目的
抗原ＩＢ−リガンド化化体体Ｂの複合体に、前記リガン
ド３と結合しうる抗リガンド体４が結合された支持体（
固相）５を加える。　これにより、リガンド３と抗リガ
ンド体４とが結合し、目的抗原ＩＡおよびＩＢが支持体
５に固定（固相化）される。

支持体５としては、ビーズ、チューブ、マイクロプレー
ト、メンブランフィルタ−等が可能であり、その中でも
特にビーズが好ましい。

このビーズの構成材料は、不溶性のものであり、例えば
ポリスチレン、ポリプロピレン、ガラス等が挙げられる
。　またビーズの直径は、３〜７ｍｎ＋程度のものが好
ましい。

支持体５の表面には、多数の抗リガンド体４が結合され
ている。　この抗リガンド体４は、アビジンであるのが
好ましいが、他に抗ハブテン抗体（例えば、抗ＦＩＴＣ
抗体）等でもよい。

このアビジンは、前述したリガンド３であるビオチンと
の強い結合能を有する。

なお、抗リガンド体４の量は、リガンド化抗体２Ａおよ
び２Ｂの量より多くしておくのが好ましい。

ここで、「リガンド化」とは、抗体（または抗原）等を
支持体に固定するための官能基を抗体（または抗原）等
に導入することをいい、「抗リガンド体」とは、前記官
能基と反応し結合しうる官能基を有する物をいう。

［１−３］ 上記［Ｉ−２］の操作により固相化された複合体（支持
体−リガンド化抗体−目的抗原）を洗浄により分離し、
目的抗原ＩＡおよびＩＢにそれぞれ結合しうる標識化抗
体６Ａおよび６Ｂを加えて反応させる。　これにより支
持体−リガンド化抗体−目的抗原−標識化抗体の複合体
が形成される。

標識化抗体６Ａおよび６Ｂには、それぞれ標識（ラベル
化剤）７Ａおよび７Ｂが付されている。　この標識７Ａ
および７Ｂとしては、例λば、アルカリフォスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素
、２８Ｉ、ａｓｐ等の放射性物質またはＦＩＴＣ、ロー
ダミン等の蛍光物質等を挙げることができる。

本発明においては、標識７Ａと標識７Ｂとは同一のもの
でも異なるものでもよ（、検出の目的等によって適宜決
定される。

標識７Ａと７Ｂとが異なるものである（区別性がある）
場合には、検体中の目的抗原ＩＡおよびｌＢのそれぞれ
を定量化（または存在の検出）することができるので、
目的抗原の種類毎のデータを収集するのに適している。

標識７Ａと７Ｂとが同一（区別性がない）のものである
場合には、目的抗原ＩＡおよびＩＢの合計量を定量化す
ることができる。　この場合でも、検体中のガンマ−カ
ーとなる目的抗原を検出するのには有効である。　即ち
、ガンマ−カーとなる抗原は複数種あり（例えば、ＰＡ
Ｐ、ＰＳＡ、ＣＥＡ）、このうちのいずれか一種でもそ
の存在が認められればガンの疑いが持たれるため、抗原
種の特定はできないとしても、−次測定として、ガンマ
−カーとなる数種の抗原の合計量を検出することができ
れば、早期のガンの発見に役立つのである。　そして、
この−次測定によりガンマ−カーの存在が検出されたな
らば、その抗原種を特定する二次測定を行い、さらに詳
細なデータを収集すればよい。

なお、この操作および前記［１−１］における標識化抗
体６Ａ、６Ｂおよびリガンド化抗体２Ａ、２Ｂには、目
的抗原ＩＡおよびＩＢとそれぞれ結合する抗原決定基を
有するモノクローナル抗体を用いるのが好ましい。

［１−４］ 上記操作の後、未反応の標識化抗体を洗浄により除去し
、支持体５に結合した標識化抗体６Ａおよび６Ｂの標識
活性を測定する。　標識活性の測定方法は、前述した標
識の種類により異なり、いずれも従来の１種の目的抗原
の量を測定する場合の標識活性の測定方法を適宜応用し
て行えばよい。

例えば、標識が酵素である場合には、基質と発色剤（色
源体）またはｐＨ調整剤等を加え、標識酵素と基質との
反応により発色剤を発色させ、その発色の度合を肉眼に
よる観察または吸収極大（吸光度）の測定等の光学的測
定により判定する。　この場合において、標識酵素がペ
ルオキシダーゼであるときは、基質としてＨａＯ□、発
色剤としてＯ−フェニレンジアミン、ｐＨ調整剤として
クエン酸リン酸を用い、標識酵素がアルカリフォスファ
ターゼのときは、基質としてＰ−ニトロフェノールリン
酸等が用いられる。

また、標識が蛍光物質の場合には、その蛍光強度を測定
することにより標識活性を判定する。

また、標識が放射性物質の場合には、放射能のカウント
を測定することにより判定する。

標識７Ａと７Ｂとが同一物である場合には、その標識に
応じた上記いずれかの方法により判定し、標識７Ａと７
Ｂとが異なるものである場合には、上記［Ｉ−３］の操
作で得られた複合体を２つの試験管に分け、それぞれに
対し、標識に応じた上記のいずれかの方法により判定す
るのが好ましい。

このようにして得られた標識活性から目的抗原の量を求
める方法は、次の通りである。

既知量（，１１度）の標準物質を同様の方法および条件
で測定することにより予め検量線を作成し、該検量線と
検体について測定した標識活性の値から目的抗原ｌＡお
よびＩＢの抗原量（ＩＡ度）を求めることができる。　
この場合、前述したように、標識７Ａと７Ｂが同一か否
かにより目的抗原ＩＡおよびＩＢの合計量がまたは各々
の量が求まる。

なお、上記第１図に示す方法と異なり、リガンド３と抗
リガンド体４とを結合してリガンド化抗体２Ａおよび２
Ｂを支持体５に固相化した後、該固相化されたリガンド
化抗体２Ａおよび２Ｂと、目的抗原ＩＡおよびＩＢとを
反応させてもよく、またこれらを同時に行ってもよい。

また、目的抗原ＩＡおよびＩＢと、標識化抗体６Ａおよ
び６Ｂと、リガンド化抗体２Ａおよび２Ｂとを同時に、
または所定の順序で反応させてＡ系列Ｂ系列それぞれに
おけるリガンド化抗体−目的抗原−標識化抗体の複合体
を形成し、これらの複合体を、そのリガンド３と抗リガ
ンド体４との結合により支持体５に固相化してもよい。

第２図に示す方法は、いわゆる競合法を応用したもので
、目的抗原が比較的低分子量の抗原である場合に適用す
るのが好ましい方法である。　以下、この方法の手順を
説明する。　なお、説明にあたり、前記と同様の物質に
ついては同符号を用い、その説明は省略する。

［１１−１］ 検体中の２種類の目的抗原ＩＡおよびＩＢと、これらと
それぞれ同種の標識化抗原８Ａおよび８Ｂとを、これら
と結合しうるリガンド化抗体２Ａおよび２Ｂに、Ａ　ｆ
ｌ　Ｂ種それぞれで競合的に結合させる。

なお、標識化抗原８Ａおよび８Ｂには、前記と同様の標
識７Ａおよび７Ｂが付されている。

この場合にも、標識７Ａと７Ｂとは同一のものでも異な
るのでもよい。

［ＩＩ　−２］ 目的抗原ＩＡ−リガンド化化体体Ａ、 目的抗原ＩＢ−リガンド化化体体Ｂ、 標識化抗原８Ａ−リガンド化抗体２Ａおよび標識化抗原
８Ｂ−リガンド化抗体２Ｂの４種の複合体に、前記と同
様の抗リガンド体４が結合された支持体５を加える。　
これによりリガンド３と抗リガンド体４とが結合し、目
的抗原ＩＡ、１Ｂおよび標識化抗原８Ａ、８Ｂが支持体
５に固定（固相化）される。

［ＩＴ　−３］ 上記操作の後、未反応の抗体を洗浄により除去し、前記
と同様の方法で支持体５に結合した標識化抗原８Ａおよ
び８Ｂの標識活性を測定し、これに、基づいて目的抗原
の量（濃度）を求める。

検体中の目的抗原ｌＡの量が少なければ。

定量のリガンド化抗体２Ａに対し標識化抗原８Ａが多（
結合するためその標識活性は大となり、逆に目的抗原Ｉ
Ａの量が多ければ、標識化抗原８Ａの標識活性は小とな
る。　このことは、目的抗原ＩＢと標識化抗原８Ｂとの
関係においても同様である。

標識７Ａと７Ｂが同一のものである場合には目的抗原Ｉ
ＡおよびＩＢの合計量が求まり、標識７Ａと７Ｂとが異
なるものである（区別性がある）場合には、目的抗原Ｉ
ＡおよびＩＢのそれぞれの量を求めることができる。

なお、上記第２図に示す方法と異なり、リガンド３と抗
リガンド体４とを結合してリガンド化抗体２Ａおよび２
Ｂを支持体５に固相化した後、該固相化されたリガンド
化抗体２Ａおよび２Ｂに、目的抗原ＩＡおよびＩＢと標
識化抗原８Ａおよび８Ｂとを競合的に反応させてもよ（
、またこれらを同時に行ってもよい。

第３図に示す方法は、測定対象物が抗体（以下、目的抗
体とい・う）である場合の方法である。　以下、この方
法の手順を説明する。　なお、説明にあたり、前記と同
様の物質については同符号を用い、その説明は省略する
。　この場合、必要に応じ、前記第１図に示す方法の説
明において、「抗原」と「抗体」とを適宜入れ換えて読
むものとする。

［１１１−１］ 検体中の２種類の目的抗体９Ａおよび９Ｂと、これらに
特異的に結合しうる抗原（以下、リガンド化抗原という
）■ＯＡおよびＩＯＢとをそれぞれ結合させる。

これらのリガンド化抗原１０ＡおよびＩＯＢには、それ
ぞれ前記と同様のリガンド３が結合されている。

［Ｈｌ　−２］ 目的抗体９Ａ−リガンド化抗原１０Ａの複合体および目
的抗体９Ｂ−リガンド化抗原１０Ｂの複合体に、前記と
同様の抗リガンド体４が結合された支持体５を加える。

　これにより、リガンド３と抗リガンド体４とが結合し
、目的抗体９Ａおよび９Ｂが支持体５に固定（固相化）
される。

［Ｉｌｌ　−３］ 上記［１１＋−２］の操作により固相化された複合物（
支持体−リガンド化抗原−目的抗体）を洗浄により分離
し、目的抗体９Ａおよび９Ｂにそれぞれ結合しうる標識
化抗体１１Ａおよび１１Ｂを加えて反応させる。　これ
により支持体−リガンド化抗原−目的抗体−標識化抗体
の複合体が形成される。

標識化抗体１１ＡおよびＩＩＢに付された標識７Ａおよ
び７Ｂは、前記と同様のものであリ、これらは同一のも
のでも異なるものでもよい。

［＋１−４］ 上記操作の後、未反応の標識化抗体を洗浄により除去し
、支持体５に結合した標識化抗体６Ａおよび６Ｂの標識
活性を測定し、これに基づいて目的抗体の量（濃度）を
求める。　標識活性の測定方法および標識活性からの目
的抗体量の求め方は前記と同様である。

なお、上記第３図に示す方法と異なり、リガンド３と抗
リガンド体４とを結合してリガンド化抗原１０Ａおよび
ＩＯＢを支持体５に固相化した後、該固相化されたリガ
ンド化抗原１０ＡおよびＩＯＢと、目的抗体９Ａおよび
９Ｂとを反応させてもよく、またこれらを同時に行って
もよい。

なお、前記第２図に示す方法と同様の方法（競合法の応
用）により、目的抗体９Ａおよび９Ｂの検出を行うこと
も可能である。

第４図〜第７図に示す方法は、いずれも、２以上の支持
体を用いた方法である。　以下、これらの方法の手順を
説明するが、前記と同様の事項についての説明および各
方法に共通する事項についての重複説明は省略する。

第４図に示す方法は、サンドイツチ法を応用した場合に
、おける２以上の支持体を用いた方法である。

［ＩＶ−１］ 検体中の目的抗原の種類数に応じた数（同数または比例
数等）の支持体、即ち、２種の目的抗原ｌＡおよびｌＡ
に対し、２つの支持体５Ａおよび５Ｂを用意し、この支
持体５Ａおよび５Ｂにそれぞれリガンド化抗体２Ａおよ
び２Ｂを予め固定（固相化）しておく。　この場合、リ
ガンド化抗体の固定は、前記と同様リガンド３と抗リガ
ンド体４との結合により行われ、そして、リガンド３と
抗リガンド体４は、支持体５Ａ側と５Ｂ側とでそれぞれ
同種のものを用いるため、リガンド化抗体２Ａの支持体
５Ａへの固定およびリガンド化抗体２Ｂの支持体５Ｂへ
の固定は、それぞれ別個に（独立に）行われる。

［ＩＶ−２］ 次に、支持体５Ａおよび５Ｂにそれぞれ固定されている
リガンド化抗体２Ａおよび２Ｂと、目的抗原ＩＡおよび
ＩＢとを反応させ、支持体５Ａ−リガンド化抗体２Ａ−
目的抗原ＩＡの複合体および支持体５Ｂ−リガンド化抗
体２Ｂ−目的抗原ＩＢの複合体を形成する。

［ＩＶ−３］ 得られた複合体を洗浄により分離し、目的抗原ＩＡおよ
びｌＢにそれぞれ結合しうる標識化抗体６Ａおよび６Ｂ
を加えて反応させる。　これにより支持体５Ａ−リガン
ド化抗体２Ａ−目的抗原ＩＡ−標識化抗体６Ａの複合体
および支持体５Ｂ−リガンド化抗体２Ｂ−目的抗原ＩＢ
−標識化抗体６Ｂの複合体が形成される。

［ＩＶ−４］ 上記操作の後、未反応の標識化抗体を洗浄により除去し
、支持体５Ａおよび５Ｂにそれぞれ結合した標識化抗体
６Ａおよび６Ｂの標識活性を測定し、これに基づいて目
的抗原の量（濃度）を求める。　標識活性の測定方法お
よび標識活性からの目的抗原量の求め方は前記と同様で
ある。

なお、標、識化抗体６Ａおよび６Ｂの標識７Ａと７Ｂと
が異なるものである場合には、目的抗原ＩＡおよびＩＢ
のそれぞれを定量化することができることについては、
前記と同様であるが、この方法の場合、支持体５Ａと５
Ｂとが互いに異なる性状（例えば、種類、材質、寸法、
外観形状、色彩、透明度または物性（導電性、磁性、非
磁性等）が異なる）のものを用いれば、各々の支持体に
結合された目的抗原の種類を特定することができるので
、標識７Ａと７Ｂとが同一のものであっても目的抗原ｌ
ＡおよびＩＢのそれぞれを定量化することができ好まし
い。

第５図に示す方法は、２以上の支持体を用いた方法であ
って、各支持体毎にリガンドおよび抗リガンド体の種類
が異なる場合の方法である。

［Ｖ−１］ 検体中の２種の目的抗原ＩＡおよびＩＢと、これらに特
異的に結合しうるリガンド化抗体２Ａおよび２Ｂとをそ
れぞれ結合させる。

この場合、リガンド化抗体２Ａのリガンド３Ａと、リガ
ンド化抗体２Ｂのリガンド３Ｂとは、異なるものである
。

［Ｖ−２］ 目的抗原ＩＡ−リガンド化化体体Ａの複合体および目的
抗原ＩＢ−リガンド化化体体Ｂの複合体に、抗リガンド
体４Ａが結合された支持体５Ａおよび抗リガンド体４Ｂ
が結合された支持体５Ｂを加え、目的抗原ＩＡおよびＩ
Ｂを支持体５Ａおよび５Ｂにそれぞれ固定（固相化）す
る。

この場合、抗リガンド体４Ａはリガンド３Ａと、抗リガ
ンド体Ｂはリガンド３Ｂとそれぞれ結合しうるものであ
り、これらは異なるものである。　例えば、リガンド３
Ａおよび抗リガンド体４Ａはそれぞれビオチンおよびア
ビジン、リガンド３Ｂおよび抗リガンド体４Ｂはそれぞ
れ低分子ハブテンおよび抗ハブテン抗体である。

これにより、支持体５Ａ−リガンド化抗体２Ａ−目的抗
原ＩＡの複合体および支持体５Ｂ−リガンド化抗体２Ｂ
−目的抗原ＩＢの複合体が形成され、しかもこれらは単
一の操作で行うことができ、前記［ＩＶ−１］のごとき
、Ａ系列とＢ系列とをそれぞれ別個に行う必要がない。

［Ｖ−３］ 以後は、前記［ＩＶ−３］および［１Ｖ−４］と同様で
ある。

第６図に示す方法は、競合法を応用した場合における２
以上の支持体を用いた方法である。

［ＶＩ−１］ 検体中の２種類の目的抗原ＩＡおよびＩＢと、これらと
それぞれ同種の標識化抗原８Ａおよび８Ｂとを、これら
と結合しうるリガンド化抗体２Ａおよび２Ｂに、Ａ　ｌ
ｉ　８種それぞれで競合的に結合させる。

なお、図示の例では、リガンド化抗体２△のリガンド３
Ａと、リガンド化抗体２Ｂのリガンド３Ｂとは異なるも
のである。

［ＶＩ−２］ 目的抗原ＩＡ−リガンド化化体体Ａ、 目的抗原ＩＢ−リガンド化化体体Ｂ、 標識化抗原８Ａ−リガンド化抗体２Ａおよび標識化抗原
８Ｂ−リガンド化抗体２Ｂの４種の複合体に、抗リガン
ド体４Ａが結合された支持体５Ａおよび抗リガンド体４
Ｂが結合された支持体５Ｂを加える。　これにより、目
的抗原ＩＡおよび標識化抗原８Ａが支持体５Ａに、目的
抗原ＩＢおよび標識化抗原８Ｂが支持体５Ｂにそれぞれ
固定（固相化）される。

［ｖｒ−３］ 上記操作の後、未反応の抗体を洗浄により除去し、前記
と同様の方法により、支持体５Ａおよび５Ｂに結合した
標識化抗原８Ａおよび８Ｂの標識活性を測定し、これに
基づいて目的抗原の量（ａ度）を求める。

第７図に示す方法は、測定対象物が抗体（目的抗体）で
ある場合における２以上の支持体を用いた方法である。

　なお、必要に応じ、前記第４図に示す方法の説明にお
いて、「抗原」と「抗体」とを適宜入れ換えて読むもの
とする。

［Ｖｌｌ−１］ 検体中の２種類の目的抗体９Ａおよび９Ｂと、これらに
特異的に結合しうるリガンド化抗原１０ＡおよびＩ　Ｏ
’Ｂとをそれぞれ結合させる。

この場合、リガンド化抗原１０Ａのリガンド３Ａと、リ
ガンド化抗原１０Ｂのリガンド３Ｂとは、異なるもので
ある。

［Ｖｍ　−２］ 目的抗体９Ａ−リガンド化抗原１０Ａの複合体および目
的抗体９Ｂ−リガンド化抗原１０Ｂの複合体に、抗リガ
ンド体４Ａが結合された支持体５Ａおよび抗リガンド体
４Ｂが結合された支持体５Ｂを加え、目的抗体９Ａおよ
び９Ｂを支持体５Ａ：！３よび５Ｂにそれぞれ固定（固
相化）する。

これにより、支持体５Ａ−リガンド化抗原１０Ａ−目的
抗体９Ａの複合体および支持体５Ｂ−リガンド化抗原１
０Ｂ−目的抗体９Ｂの複合体が形成される。

［■−３］ 以後は、前記［ＩＶ−３１および［ＩＶ−４］と同様で
ある。

なお、前記第６図に示す方法と同様の方法（競合法の応
用）により、目的抗体９Ａおよび９Ｂの検出を行うこと
も可能である。

また、前記競合法の応用（第６図）および目的抗体の検
出（第７図）においても、前記第４図に示す方法のごと
（、リガンド３と抗リガンド体４をＡ系列とＢ系列とで
それぞれ同種のものを用いて行うことが可能である。

上述したような免疫測定法は、次のような免疫測定用具
により実施することができる。

目的抗原検出用の免疫測定用具としては、■　・支持体
５（抗リガンド体４付） ・リガンド化抗体２Ａ（リガンド３付）・リガンド化抗
体２Ｂ（リガンド３付）・標識化抗体６Ａ（標識７Ａ付
） ・標識化抗体６Ｂ（標識７Ｂ付） で構成されているもの、 ■　・支持体５（抗リガンド体４付） ・リガンド化抗体２Ａ（リガンド３付）・リガンド化抗
体２Ｂ（リガンド３付）・標識化抗原８Ａ（標識７Ａ付
） ・標識化抗原８Ｂ（標識７Ｂ付） で構成されているもの。

■　・支持体５Ａ（抗リガンド体４付）・支持体５Ｂ（
抗リガンド体４付） ・リガンド化抗体２Ａ（リガンド３付）・リガンド化抗
体２Ｂ（リガンド３付）・標識化抗体６Ａ（標識７Ａ付
） ・標識化抗体６Ｂ（標識７Ｂ付） で構成されているもの、 ■　・支持体５Ａ（抗すガンド体４Ａ付）・支持体５Ｂ
（抗リガンド体４Ｂ付） ・リガンド化抗体２Ａ（リガンド３Ａ付）・リガンド化
抗体２Ｂ（リガンド３Ｂ付）・標識化抗体６Ａ（標識７
Ａ付） ・標識化抗体６Ｂ（標識７Ｂ付） で構成されているもの、 ■　・支持体５Ａ（抗リガンド体４付）・支持体５Ｂ（
抗リガンド体４付） ・リガンド化抗体２Ａ（リガンド３Ａ付）・リガンド化
抗体２Ｂ（リガンド３Ｂ付）・標識化抗原８Ａ（標識７
Ａ付） ・標識化抗原８Ｂ（標識７Ｂ付） で構成されているもの、 ■　・支持体５Ａ（抗すガンド体４Ａ付）・支持体５Ｂ
（抗リガンド体４Ｂ付） ・リガンド化抗体２Ａ（リガンド３Ａ付）・リガンド化
抗体２Ｂ（リガンド３付Ｂ）・標識化抗原８Ａ（欅識７
Ａ付） ・標識化抗原８Ｂ（標識７Ｂ付） で構成されているもの等が挙げられる。

また、目的抗体検出用の免疫測定用具としては、 ■　・支持体５（抗リガンド体４付） ・リガンド化抗原１０Ａ（リガンド３付）・リガンド化
抗原１０Ｂ（リガンド３付）・標識化抗体１１Ａ（標識
７Ａ付） ・標識化抗体１１Ｂ（標識７Ｂ付） で構成されているもの、 ■　・支持体５（抗リガンド体４付） ・リガンド化抗原１０Ａ（リガンド３付）・リガンド化
抗原１０Ｂ（リガンド３付）・標識化抗体Ａ（目的抗体
Ａと競合） ・標識化抗体Ｂ（目的抗体Ｂと競合） で構成されているもの、 ■　・支持体５Ａ（抗リガンド体４付）・支持体５Ｂ（
抗リガンド体４付） ・リガンド化抗原１０Ａ（リガンド３付）・リガンド化
抗原１０Ｂ（リガンド３付）・標識化抗体１１Ａ（標識
７Ａ付） ・標識化抗体１１Ｂ（標識７Ｂ付） で手Ｍ成されているもの、 ［相］　・支持体５Ａ（抗リガンド体４Ａ付）・支持体
５Ｂ（抗リガンド体４Ｂ付） ・リガンド化抗原１０Ａ（リガンド３Ａ付） ・リガンド化抗原１０Ｂ（リガンド３Ｂ付） ・標識化抗体１１Ａ（標識７Ａ付） ・標識化抗体１１Ｂ（標識７Ｂ付） で構成されているもの。

■　・支持体５Ａ（抗リガンド体４付）・支持体５Ｂ（
抗リガンド体４付） ・リガンド化抗原１０Ａ（リガンド３付）・リガンド化
抗１１０Ｂ（リガンド３付）・標識化抗体Ａ（目的抗体
Ａと競合） ・標識化抗体Ｂ（目的抗体Ｂと競合） で構成されているもの、 ■　・支持体５Ａ（抗リガンド体４Ａ付）・支持体５Ｂ
（抗リガンド体４Ｂ付） ・リガンド化抗原１０Ａ（リガンド３Ａ付） リガンド化抗原１０Ｂ（リガンド３Ｂ 付） ・標識化抗体Ａ（目的抗体Ａと競合） ・標識化抗体Ｂ（目的抗体Ｂと競合） で構成されているもの等が挙げられる。

なお、上記免疫測定用具■〜０において、支持体に予め
リガンド化抗体またはリガンド化抗原が固相化されたも
のでもよい。

このような各免疫測定用具■〜■の条件を下記表１にま
とめる。

表 このような各免疫測定用具におけるリガンド化抗体、リ
ガンド化抗原、標識化抗体および標識化抗原は、液体中
に保存されていてもよいが、保存性に優れ、また、コン
パクトで取り扱いに便利であるという点から、乾燥状態
、特に凍結乾燥さ、れた状態であるのが好ましい。　こ
の場合、これらの乾燥物に液体である検体を加えること
により、乾燥物は湿潤（吸水）して元の状態にもどり、
所望の反応を生じる。

また、前記各免疫測定用具の構成要素は、その全てを１
まとめにしておくこと、所定の構成要素毎にまとめてお
くこと、または各構成要素を別個にしてお（ことが可能
である。

例えば、免疫測定用具■、■、■および［相］の場合に
は、その全ての構成要素を１まとめに収納しておくこと
ができ、また、免疫測定用具■、■、■および０の場合
には、標識化抗原または抗体とリガンド化抗体または抗
原とが分離されていれば、各構成要素を任意に組み合わ
せて収納しておくことができる。

なお、上述のような免疫測定用具においては、例えば、
酵素基質、発色剤のような他の１成要素が含まれていて
もよい。

以上、Ａ種、Ｂ種の２種の目的抗原または抗体を定量す
る場合について説明したが、本発明では、３種以上の目
的抗原または抗体の量を同時に測定することも可、能で
あり、この場合にも、上記各側に順じて行えばよい。

以上、本発明の免疫測定法および免疫測定用具につき、
数例を挙げて説明したが、本発明は、これらに限定され
るものではなく、上記各側に所定の操作を付加したもの
、またはその他種々の変形例、応用例が可能である。

また、本発明は、ガンマ−カーの検出に適用するのが有
用性が太き（好ましいが、これに限定されるものではな
く、その他、例えばホルモン、各種ウィルス抗体の検出
等にも適用することができる。

〈実験例〉 以下、本発明の具体的な実験例を挙げて説明する。

（実験例１） 機知の方、法により、アビジン（抗リガンド体）をポリ
スチレンビーズ（支持体）に固相化し、一方、ビオチン
（リガンド）をヤギ由来抗ラビットＩｇＧおよびヤギ由
来抗マウスＩｇＧにそれぞれ結合させた。

また、機知の方法により、ウマ由来抗ラビットｒｇＧお
よびウマ由来抗マウスＩｇＧにそれぞれ西洋ワサビ由来
ペルオキシダーゼ（標識）を結合させた。

なお、これらの反応は、すべて室温で行った。

下記表２中に示す各濃度のマウスＩｇＧおよび／または
ラビットＩｇＧを含む検体１００μｉと、０．６％牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）をＰＢＳ中に溶解したビオチン
化抗ラビットＩｇＧとビオチン化抗マウスＩｇＧを含む
溶液２００μρと、アビジン化したポリスチレンビーズ
（直径０．２５インチ）とを加え、１８０　ｒｐｍで回
転して撹拌し、３０分間反応させた。

この反応後、蒸留水４ｍｊで３回／ＩＣ浄し、これに西
洋ワサビ由来ベルオキシターゼ標識抗ラビットＩｇＧお
よび西洋ワサビ由来ベルオキシターゼ標識抗マウスＩｇ
Ｇを含む０．６％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を３００μ℃を加
え、１８０　ｒｐｍで回転し３０分間反応させた。

この反応後、４ｍｊの蒸留水で３回洗浄し、これに０．
０３％Ｈ２０□　（基質）および３ｍｇ／ｍｊ　Ｏ−フ
ェニレンジアミン（発色剤）を含むクエン酸リン酸緩衝
液（ｐＨ４、０）を３００μ２加え、３０分間反応させ
、ＩｍｊのＩＮ硫酸を加えてこの反応を停止させ、分光
光度計（日立製作所社製）を用いて波長４９２ｎｍの吸
光度を測定した。

その結果を表２および第８図に示す。　なお、表２およ
び第８図中のマウスＩｇＧ＋ラビットＩｇＧの濃度は、
マウスＩｇＧの検体中にラビットＩｇＧ０．６２μｇ　
／ｍｌを加えたものを示す。

この結果かられかるように、各々の測定において、ｌｆ
ｔのみの抗原が含まれる場合も、２種の抗原が含まれる
場合も、共に感度よく抗原が検出された。

表　　　２ 傘二〇二２の平均値 （実験例２） 第２図に示す方法（競合法）により上記実験例１とほぼ
同様の条件で実験を行い、吸光度の測定を行った。

なお、目的抗原と競合する標識化抗原には、ベルオキシ
ダービ（標識）が結合されたプロゲステロンおよびアル
カリホスファターゼ（標識）が結合されたエストラジオ
ールを用いた。

（実験例３） 第４図に示す方法（２個の支持体）により上記実験例１
とほぼ同様の条件で実験を行い、吸光度の測定を行った
。

なお、用いた支持体は、いずれもアビジン化したポリス
チレンビーズであり、各々の直径は、０．２５インチお
よび０．５インチとした。

（実験例４） 第５図に示す方法（２個の支持体）により上記実験例１
とほぼ同様の条件で実験を行い、吸光度の測定を行った
。

なお、用いた支持体は、マーキングにより区別性を有す
る２個のポリスチレンビーズ（各々直径０．２５インチ
）であり、その一方にはアビジン、他方には抗ハブテン
抗体を結合したものである。

（実験例５） 第６図に示す方法（競合法）により上記実験例１とほぼ
同様の条件で実験を行い、吸光度の測定を行った。

なお、目的抗原と競合する標識化抗原にはペルオキシダ
ーゼ（標識）が結合されたプロゲステロンおよびアルカ
リホスファターゼ（標識）が結合されたエストラジオー
ルを用いた。

また、支持体は、実験例４と同様のものを用いた。

（実験例６） 第３図に示す方法（抗体の検出）により上記実験例１と
ほぼ同様の条件で目的抗体を検出する実験を行い、吸光
度の測定を行った。

なお、目的抗体としてＨＢｓ抗体およびＨＢｅ抗体、リ
ガンド化抗原としてＨＢｓ抗原およびＨＢｅ抗原を用い
た。

（実験例７） 第７図に示す方法（２個の支持体）により上記実験例１
とほぼ同様の条件で目的抗体を検出する実験を行い、吸
光度の測定を行った。

目的抗体およびリガンド化抗原については実験例６と同
様のものを、支持体については実験例４と同様のものを
用いた。

これら各実験例２〜７についても、上記実験例１と同様
、感度よく抗原または抗体が検出された。

〈発明の効果〉 本発明の免疫測定法および免疫測定用具によれば、１回
の操作で検体中の２種以上の抗原または抗体を検出する
ことができ、よって測定に費やす労力および時間を軽減
し、また測定に要する検体の量を少な（することができ
る。

また、本発明をガンマ−カーの検出、特にその−次測定
に利用する場合には、１回または少数回の操作で判定す
ることができるため、早期のガンの発見に貢献すること
大である。

また、本発明において、互いに性状が異なる２以上の支
持体を用いた場合には、同一の標識を用いたとしても、
各目的抗原または抗体のそれぞれを定量化することがで
きる。

４．４Ａ、４Ｂ・・・抗リガンド体 ５．５Ａ、５Ｂ・・・支持体 ６Ａ、６Ｂ・・・標識化抗体 ７Ａ、７Ｂ・・・標識 ８Ａ、８Ｂ・・・標識化抗原 ９Ａ、９Ｂ・・・目的抗体 １０Ａ、１０Ｂ・・・リガンド化抗原 １１Ａ、ｌＩＢ・・・標識化抗体

【図面の簡単な説明】

第１図〜第７図は、それぞれ本発明の免疫測定法の手順
の例を模式的に示す説明図である。 第８図は、実験例における検体中の抗原の濃度と吸光度
との関係を示すグラフである。 符号の説明 ｌＡ、ＩＢ・・・目的抗原 ２Ａ、２Ｂ・・・リガンド化抗体 ３．３Ａ、３Ｂ・・・リガンド ＦＩＧ、１ ３．４ ＦＩＧ、６ ５Ａ Ｂ ＦＩＧ、８ マウス１９Ｇ（−０−）、ラヒ゛ットＴｇＧ（−、−ム
−−）マワス１９Ｇ＋うご９Ｆ１９Ｇ　　＜＝−４−−
’）４几漕、の４冒Ｉ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）検体中の２種以上の目的抗原または抗体を検出す
   るに際し、一つの検体中において各目的抗原または抗体
   と結合しうる抗体または抗原との反応により複合体を形
   成させて各目的抗原または抗体を少なくとも１つの支持
   体に固相化するとともに、これらを標識化し、この標識
   の標識活性に基づいて前記２種以上の目的抗原または抗
   体を検出することを特徴とする免疫測定法。
2. （２）測定対象物たる２種以上の目的抗原と、これら各
   目的抗原と特異的に結合しうるリガンド化された抗体と
   、該リガンド化抗体のリガンドと結合しうる抗リガンド
   体が固相化された支持体と、標識化抗体とを反応させて
   、支持体−リガンド化抗体−目的抗原−標識化抗体の複
   合体を形成し、前記標識化抗体の標識活性を測定するこ
   とにより、前記２種以上の目的抗原の各々または合計の
   抗原量を求めることを特徴とする免疫測定法。
3. （３）測定対象物たる２種以上の目的抗原と、これらと
   競合する標識化抗原と、これら各目的抗原および標識化
   抗原と特異的に結合しうるリガンド化された抗体と、該
   リガンド化抗体のリガンドと結合しうる抗リガンド体が
   固相化された支持体とを反応させて、支持体−リガンド
   化抗体−目的抗原および支持体−リガンド化抗体−標識
   化抗原の複合体を競合的に形成し、前記標識化抗原の標
   識活性を測定することにより、前記２種以上の目的抗原
   の各々または合計の抗原量を求めることを特徴とする免
   疫測定法。
4. （４）測定対象物たる２種以上の目的抗体と、これら各
   目的抗体と特異的に結合しうるリガンド化された抗原と
   、該リガンド化抗原のリガンドと結合しうる抗リガンド
   体が固相化された支持体と、前記各目的抗体と結合しう
   る標識化抗体とを反応させて、支持体−リガンド化抗原
   −目的抗体−標識化抗体の複合体を形成し、前記標識化
   抗体の標識活性を測定することにより、前記２種以上の
   目的抗体の各々または合計の抗体量を同時に求めること
   を特徴とする免疫測定法。
5. （５）測定対象物たる２種以上の目的抗原と、これら各
   目的抗原と特異的に結合しうるリガンド化された抗体と
   、該リガンド化抗体のリガンドと結合しうる抗リガンド
   体が固相化された２以上の支持体と、標識化抗体とを反
   応させて、それぞれの支持体に対し、支持体−リガンド
   化抗体−目的抗原−標識化抗体の複合体を形成し、前記
   標識化抗体の標識活性を測定することにより、前記２種
   以上の目的抗原の各々または合計の抗原量を求めること
   を特徴とする免疫測定法。
6. （６）測定対象物たる２種以上の目的抗原と、これらと
   競合する標識化抗原と、これら各目的抗原および標識化
   抗原と特異的に結合しうるリガンド化された抗体と、該
   リガンド化抗体のリガンドと結合しうる抗リガンド体が
   固相化された２以上の支持体とを反応させて、それぞれ
   の支持体に対し、支持体−リガンド化抗体−目的抗原お
   よび支持体−リガンド化抗体−標識化抗原の複合体を競
   合的に形成し、前記標識化抗原の標識活性を測定するこ
   とにより、前記２種以上の目的抗原の各々または合計の
   抗原量を求めることを特徴とする免疫測定法。
7. （７）測定対象物たる２種以上の目的抗体と、これら各
   目的抗体と特異的に結合しうるリガンド化された抗原と
   、該リガンド化抗原のリガンドと結合しうる抗リガンド
   体が固相化された２以上の支持体と、前記各目的抗体と
   結合しうる標識化抗体とを反応させて、それぞれの支持
   体に対し、支持体−リガンド化抗原−目的抗体−標識化
   抗体の複合体を形成し、前記標識化抗体の標識活性を測
   定することにより、前記２種以上の目的抗体の各々また
   は合計の抗体量を同時に求めることを特徴とする免疫測
   定法。
8. （８）目的抗原または抗体の種類数に対応する数の支持
   体を有し、各支持体毎に異種の目的抗原または抗体が結
   合する請求項５〜７のいずれかに記載の免疫測定法。
9. （９）前記各支持体は、その支持体に結合した目的抗原
   または抗体の種類を特定し得るようその性状が互いに異
   なるものである請求項８に記載の免疫測定法。
10. （１０）前記リガンドがビオチン、前記抗リガンド体が
    アビジンである請求項２〜９のいずれかに記載の免疫測
    定法。
11. （１１）前記標識が、酵素、放射性物質または蛍光物質
    である請求項１〜１０のいずれかに記載の免疫測定法。
12. （１２）請求項１〜１１のいずれかに記載の免疫測定法
    を実施するのに用いられる免疫測定用具であって、抗リ
    ガンド体が固相化された少なくとも１つの支持体と、各
    目的抗原または抗体と特異的に結合しうるリガンド化抗
    体または抗原と、標識化抗体または抗原とを含むことを
    特徴とする免疫測定用具。
13. （１３）請求項１に記載の免疫測定法を実施するのに用
    いられる免疫測定用具であって、各目的抗原または抗体
    と特異的に結合しうる抗体または抗原が固相化された少
    なくとも１つの支持体と、標識化抗体または抗原とを含
    むことを特徴とする免疫測定用具。