JPH04232856A - リガンドのイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的反応性種のジ
カルボン酸酸化生成物ならびに臨床化学上の上記ジカル
ボン酸酸化生成物の使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】天然の免疫学的反応を利用するイムノア
ッセイは、臨床化学における分析技術として広範な使用
が見いだされてきた。反応の特異性のために、例えば、
抗体、治療薬、麻酔薬、酵素、ホルモンおよびタンパク
質などを含む生物学的被検体（本明細書ではリガンドと
称する）を定量する上で、イムノアッセイは特に有利で
ある。

【０００３】競合バインディングアッセイでは、標識リ
ガンド類似体（本明細書ではリガンド類似体として称さ
れることが多い）が、一定量の適当なバインディング物
質（本明細書ではレセプターと称する）との反応に関し
て、未標識リガンドとの競争状態におかれる。リガンド
の未知濃度は、結合リガンド類似体もしくは未結合（す
なわち、遊離）リガンド類似体のどちらかを測定したシ
グナルにより決定できる。上記反応は以下のように進行
する。

【０００４】

【化１】

【０００５】末端単糖類残基上のビシナルジオールを有
する炭水化物残基を含有するステロイド類のようなハプ
テン類についての標識リガンド類似体の製造法への伝統
的な試みは、ステロイドの末端単糖類残基のジアルデヒ
ドへの酸化に続いて酵素標識のアミノ残基に対する付着
を伴う。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】課題は、上述の試みが
、イムノアッセイにおいて十分な酵素標識リガンド類似
体を生じないことにある。このようなアッセイでは、か
なりの量の上記類似体が抗体により結合されない。ジコ
キシゲニン（ジゴキシンのステロイド成分）を機能化す
る試みは、抗体によるこのような機能化された物質の認
識が限定されるので成功することが限られていた。標識
と容易に結合され、そしてステロイドに対する抗体によ
り認識される機能化ステロイド誘導体を入手することが
望まれるであろう。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ビシナルジオ
ールを有する免疫学的反応性の単糖類もしくは多糖類の
ジカルボン酸酸化生成物を含有するリガンド類似体であ
って、前記酸化生成物に標識もしくは支持体をアミド結
合もしくはチオエステル結合を介して付着したリガンド
類似体を提供することにより上記課題を解決する。下記
構造は、上記リガンド類似体の代表例である。

【０００８】

【化２】

【０００９】Ｒは、ビシナルジオール基、カルボン酸基
、第１級アミノ基およびスルフヒドリル基を欠く免疫学
的反応性基であり；Ｚは、ビシナルジオール基を含む炭
素原子の酸化により形成されるジカルボン酸を有する糖
環の残存原子類を示し；Ｚ′は、糖環を完成するのに必
要な原子類を示し；そしてｎは、０から２，５００まで
の整数であり、Ｒ２　およびＲ３　は、各々独立してａ
）−ＯＲ４　，ＳＲ４　，−ＮＲ４　Ｒ５　；またはｂ
）アミノ基もしくはスルフヒドリル基を介してカルボキ
シル基へ結合される標識もしくは支持体の残基であって
、それが付着されるとアミド結合基（−ＮＨＣＯ−）も
しくはチオエステル結合基（−ＳＣＯ−）を形成する残
基、を示し；Ｒ４　およびＲ５　は、各々独立して水素
、炭素原子数１〜６個の低級アルキル、もしくは炭素原
子数６〜１０個のアリールより選ばれ；供給されるＲ２
　およびＲ３　の少なくとも１つは、標識もしくは支持
体の残基を含み、そして単糖類単位間の結合は、αもし
くはβグリコシド結合である。

【００１０】また、本発明は、下記の工程を含んでなる
本発明のリガンド類似体を製造する方法を提供する。 （ａ）免疫学的反応性被検体（リガンド）と特異的にバ
インディングできる基および末端糖基上に位置する２つ
のビシナルジオールを有する単糖類もしくは多糖類を供
給する工程； （ｂ）水混和性有機溶媒を含む水性溶液中で上記末端糖
のビシナルジオール部分を過ヨウ素酸および三酸化クロ
ムの混合物で酸化してジカルボン酸生成物を生成する工
程；ならびに （ｃ）ジカルボン酸生成物を、アミノ基もしくはスルフ
ヒドリル基を含有する標識もしくは支持体と縮合する工
程。上記支持体は、ポリマー粒子もしくはポリマー膜が
好ましい。

【００１１】この連結基は、標識もしくは支持体に固有
のものであるか、工程（ｃ）の縮合を促進するために標
識もしくは支持体上に特別に提供される、標識もしくは
支持体上のより長い連結基の一部分でありうることも理
解されている。また、カルボン酸基を、酸ハロゲン化物
、酸無水物もしくはエステルのような反応性等価体へ転
化して、縮合工程を促進できること、さらに別法として
連結基を最初にジカルボン酸酸化生成物に付着し、次い
で標識もしくは支持体に付着できることも理解されてい
る。

【００１２】以下、本発明を具体的に説明する。過ヨウ
素酸および三酸化クロムの組み合わせは、他の第１級お
よび第２級のアルコール類ならびにケトン類の存在下で
ビシナルジオールを有する化合物類からカルボン酸への
選択的な酸化に利用されてきた。この試薬系を用いると
、酸化はビシナルジオール部位以外のいずれの部位でも
生じない。治療的に有用なステロイド、例えばジゴキシ
ン、ジギトキシンおよびウワバインは、それらの末端糖
環にビシナルジオールを有する。

【００１３】ステロイド、もしくは他の生物学的に有用
な基、例えば免疫学的反応性基を含む単糖類および三糖
類をはじめとする単糖類ならびに多糖類は、水性ジオキ
サン中過ヨウ素酸および三酸化クロムの混合物により、
末端糖のビシナルジオール部位が酸化されてカルボン酸
誘導体を与える。過ヨウ素酸および三酸化クロムの混合
物は４／１〜１／１の範囲内のモル濃度比であり、好ま
しくは２／１のモル濃度比である。

【００１４】本方法に伴う酸化工程は、ジオキサン、メ
タノール、ＤＭＦ、エタノール、プロパノール、イソプ
ロパノールおよびアセトンなどを初めとするいずれかの
混和性有機溶媒を含むいずれかの水性混合物中で実施さ
れうる。ジオキサン、アセトンおよびＤＭＦが好ましい
。

【００１５】単糖類単位を連結する結合がグリコシド結
合であるかぎり、多糖鎖は当該技術分野で既知であるよ
うな直鎖もしくは分枝鎖であってもよい。この結合はα
もしくはβであってもよく、そして直鎖配列中の１，２
、１，３、１，４もしくは１，６の結合を介して反応性
単位を連結することができ、またはポリマー中の分枝点
に存在するそれらの単位間で連結することができる（Ｐ
ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，Ａ．Ｗｈｉｔｅ他、６ｔｈ　Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−
Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ，３３ペー
ジ）　。ポリマーを構成する糖単位は一般的にＤ−グル
コースより誘導されるとはいえ、低級アルキル、ヒドロ
キシ、ヒドロキシメチル、低級アルコキシ、低級アシル
オキシおよび低級アルカナミドを初めとする置換基を含
有することが既知である他の単糖類より糖単位を誘導で
き、具体的な単位としては、Ｄ−マンノース、Ｄ−およ
びＬ−ガラクトース、Ｄ−キシロースならびにＬ−アラ
ビノースより誘導される単位類が挙げられる。また、他
の単位は、多糖類の構成成分、例えばＤ−グルクロン酸
、Ｄ−ガラクツロン酸およびＤ−マンヌロン酸として存
在する。非常に多くの多糖類が述べられてきており、従
って多様な変形が可能である。

【００１６】具体的な糖類、例えばステロイド類（ジゴ
キシン、ジギトキシンおよびウワバイン）は、上記方法
により酸化されてモノカルボン酸およびジカルボン酸を
含む混合物を与えた。

【００１７】

【化３】

【００１８】ビシナルジオール基が、第２工程の酸化に
おいて望ましくなく関与するであろうから、多くの免疫
学的反応性試薬類が反応するようなビシナルジオール基
、カルボン酸基（もしくはそれらの等価物）、第１級ア
ミノ基もしくはスルフヒドリル基を、免疫学的反応性基
（Ｒ）は含むことができない。上記以外の名称の基も、
カルボキシル基を介して標識もしくは支持体のような有
用な基を付着するのに用いられるその後の誘導化（縮合
）反応に際して、自己架橋を含む他の望ましくない縮合
反応に関与するであろう。

【００１９】有用なＲ基の具体例としては、ハプテン類
、ホルモン類、ビタミン類、アルカロイド類、脂質類、
およびステロイド類（ジゴキシン、ジギトキシンおよび
ウワバインのステロイド残基を含む）の残基、ならびに
他の単糖類もしくは多糖類が挙げられる。Ｒは、対応す
るレセプター化合物（天然もしくは合成）との免疫学的
反応に関与できる生理学的流体類（細胞抽出液および組
織抽出液）の成分または化学的化合物であることもでき
る。上記レセプターは、免疫学的反応に際してＲ（免疫
学的反応性基）に対する反応性部位を有する化学的化合
物もしくは生物学的化合物である。免疫学的反応性基と
は、抗原−抗体反応に関与するいずれかの基を意味する
。

【００２０】Ｒ基は「免疫学的反応性」基であるが、糖
基も免疫学的反応性種として機能できる。従って、ある
用法ではＲ基の免疫学的活性が優先し、他の用法では糖
基の免疫学的活性が優先しそして更に他の用法では、両
基の免疫学的活性が望まれる。ジゴキシンアッセイおよ
びジギトキシンアッセイの場合には、上述中免疫学的反
応性がステロイド基および糖基の組み合わせから誘導さ
れる、後者の状態が望ましい。

【００２１】構造Ｉの範囲内の有用な標識リガンド類似
体は、構造ＩａおよびＩｂにより示される。

【００２２】

【化４】

【００２３】Ｒ，Ｒ２　，Ｒ３　およびｎは、上記定義
のとおりであり、そしてＲ１　は、各々独立して水素、
低級アルキル、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、低
級アルカナミド、ヒドロキシもしくはヒドロキシメチル
である。

【００２４】

【化５】

【００２５】Ｒ，Ｒ１　，Ｒ２　およびＲ３　は、構造
Ｉａについて定義したとおりであり、そしてｎは、０か
ら３までである。Ｒ２　および／またはＲ３　で示され
る標識は、構造Ｉ，ＩａおよびＩｂのリガンド類似体の
検出を促進する。標識は、それ自体、可視色素部分、螢
光色素部分もしくは放射活性物質のように検出可能であ
りうる。標識は、二次反応により検出可能にされうる基
、例えば酸もしくは塩基での処理により可視化されうる
ロイコ染料であることもできる。標識は、個別に検出可
能な種を生成させる中間体もしくは触媒であることもで
きる。例えば、ある酵素標識は、過酸化物の生成を触媒
して、その過酸化物によるロイコ染料の二次酸化で可視
色素を生成する。

【００２６】構造Ｉの酸基と化合して必須のアミド基も
しくはチオエステル基を形成する連結基上の末端のアミ
ノ基もしくはスルフヒドリル基を保持しながら、標識も
しくは支持体は、連結基へ付着されうる〔工程（ｃ）の
標識リガンド製造方法を参照されたい〕か、または連結
基へ化学的に付加されうる。

【００２７】連結基は、ジカルボン酸生成物もしくは誘
導体へ付着されるポリマービーズ、繊維、薄膜もしくは
シートのような支持体または基板でありうる。ある特に
有用な支持体もしくは支持ポリマー連結基は、付加重合
性ビニル（アクリルを含む）モノマーのポリマー粒子で
ある。

【００２８】一般にポリマー粒子は、０．０１マイクロ
メートルを越える平均粒度を有する水不溶性ラテックス
粒子である。好ましくは、上記ポリマー粒子は、０．０
１〜１０マイクロメートル、より好ましくは０．３〜３
マイクロメートルの範囲内の平均粒度を有する。好まし
いポリマー類は、次式（ＩＩＩ）

【００２９】

【化６】

【００３０】（上式中、−Ａ−は、疎水性エチレン系不
飽和モノマー１種以上から誘導される反復単位を表わし
、−Ｂ−は、必須の反応性基であって、その基を介して
ポリマー粒子を付加してリガンド類似体を形成すること
ができる基、を有するエチレン系不飽和モノマー１種以
上から誘導される反復単位を表し、−Ｄ−は、−Ａ−も
しくは−Ｂ−により表わされるものとは別のエチレン系
不飽和モノマー１種以上から誘導される反復単位を表わ
す）で示すことができる。

【００３１】式（ＩＩＩ）中、ｘは０〜９９．９モルパ
ーセントでありｙは０．１〜１００モルパーセントであ
り、そしてｚは０〜２０モルパーセントである。好まし
くはｘは４５〜９９．５モルパーセントであり、ｙは０
．５〜５０モルパーセントであり、そしてｚは０〜約１
０モルパーセントである。式（ＩＩＩ）に従うポリマー
ビーズは、ヨーロッパ特許出願公開第０　　３０８　　
２３３Ａ号、同０　　３２３　　６９２Ａ号、同０　　
２８０　　５５６Ａ号、および同０　　３０２　　７１
５Ａ号明細書ならびに特開平１−５４２５８号および同
１−５４２５９号公報に公表されており、これらの各々
は、明らかに、引用することにより本明細書の内容とな
る。

【００３２】上記−Ａ−反復単位が選ばれるモノマー類
は疎水性であり、そして水に不溶性のホモポリマー類を
形成する。好ましくは、これらのモノマー類は芳香族基
を有する。限定されるものではないが、代表的な疎水性
モノマー類としては、スチレンおよびスチレン誘導体類
（例えば、４−ビニルトルエン、２，５−ジ−メチルス
チレン、４−ｔ−ブチルスチレン、２−クロロスチレン
および当該技術分野で既知の他のもの）、アクリル酸な
らびにメタクリル酸のエステル類およびアミド類（例え
ば、ｎ−ブチルアクリレート、プロピルメタクリレート
、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチル
メタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、
Ｎ−フェニルアクリルアミドおよび当該技術分野で既知
の他のもの）、アクリロニトリルならびにビニルアセテ
ートが挙げられる。

【００３３】上記−Ｂ−反復単位が選ばれるモノマー類
としては、ビニルベンジルクロリド、ビニルベンジルブ
ロミド、ｍ−およびｐ−（２−クロロエチルスルホニル
メチル）スチレン、Ｎ−（４−クロロエチルスルホニル
メチルフェニル）アクリルアミド、ビニルクロロアセテ
ート、Ｎ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリ
ルアミド、２−クロロアセタミドエチルメタクリレート
、４−クロロアセタミドスチレン、ｍ−およびｐ−クロ
ロアセタミドメチルスチレン、Ｎ−（３−クロロアセタ
ミドカルボニルイミノプロピル）メタクリルアミド、２
−クロロアセタミドカルボニルイミノエチルメタクリレ
ート、４−クロロアセタミドカルボニルイミノスチレン
、ｍ−およびｐ−クロロアセタミドカルボニルイミノメ
チルスチレン、Ｎ−ビニル−Ｎ′−（３−クロロプロピ
オニル）尿素、４−（３−クロロプロピオナミド）スチ
レン、４−（３−クロロプロピオナミドカルボニルイミ
ノ）スチレン、２−（３−クロロプロピオナミド）エチ
ルメタクリレート、Ｎ−〔２−（３−クロロプロピオナ
ミド）エチル〕メタクリルアミド、アクリル酸、メタク
リル酸、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリ
レート、ビニルベンズアルデヒドおよびＮ−（３−アミ
ノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩が挙げられる。

【００３４】上記−Ｄ−反復単位が誘導されるモノマー
類は、−Ａ−および−Ｂ−が誘導されるものとは別のモ
ノマー類が挙げられる。具体的には、上記−Ｄ−反復単
位は、粒子に対して水性分散安定性もしくは他の性質を
与えるモノマー類から誘導される。限定されるものでは
ないが、代表的なモノマー類としては、アニオンモノマ
ー類、例えば２−アクリルアミド−２−メチルプロパン
スルホン酸ナトリウム、アクリル酸、メタクリル酸、２
−カルボキシエチルアクリレートおよびスチレンスルホ
ン酸のカリウム塩ならびにｍおよびｐ−カルボキシメチ
ルスチレンならびに他のエチレン系不飽和重合性スルホ
ネート類、カルボキシレート類、スルフェート類、およ
びホスホネート類、他の親水性かつ非イオン性のモノマ
ー類、例えば２−ヒドロキシエチルアクリレートおよび
２−ヒドロキシエチルメタクリレートならびに当業者に
既知の他のものが挙げられる。

【００３５】上記−Ｄ−単位が誘導される好ましいモノ
マー類としては、アクリル酸、メタクリル酸、２−アク
リルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム
、ｍおよびｐ−カルボキシメチルスチレンならびにｐ−
スチレンスルホン酸のカリウム塩が挙げられる。

【００３６】上記モノマー類の代表的なポリマー類とし
ては、下記、ポリ（ｍおよびｐ−クロロメチルスチレン
）、ポリ（スチレン−コ−ｍおよびｐ−クロロメチルス
チレン−コ−２−ヒドロキシエチルアクリレート）（モ
ル比６７：３０：３）、ポリ（スチレン−コ−ｍおよび
ｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレン）（モル比
９５．５：４．５）、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍお
よびｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニ
ル〕アクリルアミド｝（モル比９９．３：０．７）、ポ
リ（ｍおよびｐ−クロロメチルスルレン−コ−メタクリ
ル酸）（モル比９５：５、９８：２および９９．８：０
．２）、ポリ（スチレン−コ−ｍおよびｐ−クロロエチ
ルスルホニルメチルスチレン−コ−メタクリル酸）（モ
ル比９３．５：４．５：２）、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ
−〔ｍおよびｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル
）フェニル〕アクリルアミド−コ−メタクリル酸｝（モ
ル比９７．３：０．７：２）、ならびにポリ（スチレン
−コ−ｍ−およびｐ−クロロメチルスチレン）（モル比
７０：３０）が挙げられる。

【００３７】ビーズが、カルボン酸基（もしくはそれら
の等価物）と反応する基、すなわちアミノ基もしくはス
ルフヒドリル基を含有する場合のみ、ポリマービーズは
本発明のカルボン酸酸化生成物へ結合されうる。しかし
ながら、ポリマービーズへアミノ基もしくはスルフヒド
リル基を導入するのに補助架橋剤を使用してジカルボン
酸酸化生成物へ二次付着させることもできる。この目的
に、ジアミン類およびバイオメルカプタン類などのよう
な既知架橋剤が使用できる。また、ジカルボン酸酸化生
成物へのポリマーの付着は、付加結合基を導入する必要
のない架橋剤の使用により促進できる。このような架橋
剤の具体例としては、米国特許第４，４２１，８４７号
明細書に言及されるようなカルボジイミド類およびカル
バモイルオニウム化合物類が挙げられる。

【００３８】加えて、ジカルボン酸酸化生成物は、タン
パク質のようなポリマーへ付着され、次いで上述のよう
なビーズ類へ付着でき、それによりタンパク質は、酸化
生成物およびビーズ間の大きな連結基として役立つ。タ
ンパク質は、水性および／または生物学的適合性を改良
するような、ならびに免疫学的反応性基をポリマー粒子
から伸ばすような他の目的にも役立ちうる。

【００３９】本発明のリガンド類似体は、標識されるか
または支持体上のリガンド類似体を使用するイムノアッ
セイのいずれにも有用である。そのアッセイは上述のよ
うな競合的なものであってもよく、これらの表現上均一
系もしくは不均一系は当該技術分野で理解されている。 例えば、米国特許第４，６７０，３８１号明細書を参照
のこと。アッセイは直接的または間接的であってもよい
。ＥＬＩＳＡ，ＥＭＩＴおよびＦＩＡは、このようなイ
ムノアッセイの周知の例である。

【００４０】ある態様では、イムノアッセイに、次の工
程を含んでなるリガンドが供給される。 （ａ）支持体へ付着される本発明によるリガンド類似体
を供給する工程； （ｂ）リガンドおよびリガンド類似体に対して付着され
る検出可能な標識を有するレセプターを供給する工程；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）を混合する工程；そして（ｄ
）結合もしくは未結合の標識レセプターを測定する工程
。

【００４１】別の態様では、イムノアッセイに、次の工
程を含んでなるリガンドが供給される。 （ａ）本発明による標識リガンド類似体を供給する工程
； （ｂ）リガンドを（ａ）と混合する工程；（ｃ）（ｂ）
由来の混合物を、リガンドに対する抗体の既知量と反応
させる工程；そして （ｄ）標識リガンド類似体の量を測定する工程。

【００４２】上記構造Ｉの標識リガンド類似体は、イム
ノアッセイを実施するように設計された乾式分析要素で
有用である。典型的には、このような要素類は支持層、
試薬区画および展開区画を含む。２つの区画を単一層内
へ組み込むこともでき、または個別の層へ分けることも
できる。上記要素は、１つ以上の層、例えば個別のもし
くは共同の試薬／展開層ならびに他の必要な添加剤およ
びカプリング酵素などを含有するゼラチン緩衝層を含む
ことができる。ビーズ類としては、大きなポリマービー
ズおよび小さなポリマービーズの両方を挙げることがで
き、これらは同一のもしくは別々の層のどちらかへ塗布
されうる。小さなビーズ類は、大きなビーズ類の前に、
もしくは同時にまたは後に塗布されうる。

【００４３】要素の試薬層もしくは展開層は、１種以上
の合成もしくは天然のバインダー物質類（例えば、ゼラ
チン）または他の天然産のコロイド類、ホモポリマー類
およびコポリマー類〔例えば、ポリ（アクリルアミド）
、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−イソプロピル
アクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビ
ニル−２−ピロリドン）および同様のコポリマー類〕へ
分散された１種以上の試薬類を包含する指示組成物を含
むことができる。他の任意の層類、例えば下塗り層およ
び放射線遮断層などを必要により含むことができる。要
素のすべての層は流体中で相互に接触しており、これは
流体類、試薬類および流体類中の未複合体化反応生成物
類が隣接層の重なった領域間を通過できることを意味す
る。

【００４４】本発明のアッセイにより提供される種々の
イムノアッセイは、ジカルボン酸生成物へ付着できる適
当な標識のいずれかを用いて実施できる。有用な標識類
としては、放射性タグ類、色素類、螢光剤類、酵素類、
酵素基質類、酵素阻害剤類、アロステリックエフェクタ
ー類、コファクター類および他の既知酵素モジュレータ
ー類が挙げられる。酵素類、例えばグルコースオキシダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、
西洋ワサビペルオキシダーゼ（アミン富化西洋ワサビペ
ルオキシダーゼを含む）およびガラクトシダーゼが好ま
しい標識類である。

【００４５】酵素標識を用いる場合には、その酵素に対
する基質は要素中に存在するかまたは洗液中へそれが添
加される。上記基質は前もってもしくは液状試料と同時
に、またはバインディング反応完了後に要素へ添加でき
る。供給する標識に適する基質を決定することは、臨床
化学における当業者の技術範囲内である。上記基質は、
酵素標識により直接作用を受ける物質であるか、または
標識の酵素反応を伴う一連の反応を必要とする物質類で
あってもよい。例えば、酵素標識がペルオキシダーゼで
あれば、基質は過酸化水素である。グルコースオキシダ
ーゼを用いる例では、一般に基質グルコースを試薬層へ
存在させるか洗液へ０．０１モル／ｍ２　、好ましくは
０．００１〜０．１モル／ｍ２　となるように添加する
。 アッセイに用いられる酵素標識の量に対する特定の基質
の量をどのように調節すればよいかは当業者らに既知で
あろう。

【００４６】構造Ｉの標識リガンド類似体が、製造の際
に要素へ組み込まれていない場合には、試験試料と同時
に混合するか、または前もって要素と接触せしめること
ができる。

【００４７】ある標識、例えば酵素類、コファクター類
、酵素基質類もしくは酵素モジュレーター類を用いる場
合、試薬層は、標識反応生成物として検出可能な種を提
供する試薬類を１種以上包含する指示組成物を含む。 好ましくは、指示組成物は、基質と酵素標識リガンド類
似体の酵素反応の結果として比色的に検出可能な種を提
供する比色的指示組成物である。

【００４８】指示組成物は、酵素反応で検出可能な色素
を生成する単一化合物、もしくは色素を生成する試薬類
の組み合わせであってもよい。例えば、グルコースが基
質として用いられそしてグルコースオキシダーゼが酵素
標識として用いられる場合、比色的指示組成物は反応し
て色素を提供するカプラーおよび被酸化性化合物を含ん
でもよい。または、上記組成物は、グルコースオキシダ
ーゼがグルコースをグルコン酸へ転化する場合に生成さ
れる過酸化水素の生成の結果として検出可能な色素を生
成するロイコ染料およびペルオキシダーゼあるいは別の
適当な過酸化物に作用する化合物を含んでもよい。有用
なロイコ染料は当該技術分野で既知であり、そして、例
えば米国特許第４，０８９，７４７号および同４，６７
０，３８５号明細書に記載のものを含む。比色的指示組
成物およびその種々の成分類の特定の量は、当業者の技
術範囲内にある。

【００４９】要素の層は、界面活性剤類、増粘剤類、緩
衝剤類、硬化剤類、抗酸化剤類、カプラー溶剤類および
当該技術分野で既知の他の物質類を初めとする種々の他
の所望の成分類を含んでもよい。これらの成分類の量も
また当業者の技術範囲内にある。

【００５０】上記イムノアッセイは手動もしくは自動化
できる。一般に液状試料中の被検体量は、供給ロール、
チップパケットもしくは他の供給源から要素を取り出し
て、そして展開層の限定領域をその液状試料（例えば、
１〜１００μｌ）と物理的に接触せしめることにより測
定される。接触される限定領域は一般に１００ｍｍ２　
以下である。

【００５１】試料塗布後、いずれの態様においても、要
素をインキュベーションもしくは加熱などのようないず
れかの状況下にさらし、試料結果を得ることを速めるか
または促進することが望ましいかもしれない。要素を、
複合体化リガンド類似体を直接測定するかまたは酵素標
識と基質の酵素反応の結果として生成される検出可能な
種を検出するのに適する装置を通過させることにより被
検体量は測定される。例えば、上記種は一般に既知の操
作により、適する放射線測定器、螢光測定器もしくは分
光測定器で検出できる。ある酵素反応では、試験試料と
接触する限定領域の中心で、例えば反射濃度、透過濃度
もしくは螢光を測定することにより生成物を測定する。 一般に測定される領域は競合アッセイについて直径３〜
５ｍｍである。液状試料中の被検体量は限定領域の中心
で測定される標識の量に対して反比例する。本明細書に
言及されるように、好ましい態様における分離洗浄工程
は複合体化リガンドを未複合体化リガンドから分離する
ために必要とされる（ラジアル洗浄）。一般に標識測定
は試料を接触および展開後または洗液の塗布後、５〜１
８０秒後に実施される。

【００５２】

【実施例】下記例１〜３は、構造Ｉのリガンド類似体を
製造するのに用いられるジカルボン酸生成物を製造する
方法を具体的に示すものである。

【００５３】例１−ジゴキシンのジカルボン酸酸化生成
物の製造 過ヨウ素酸（６．８４ｇ、３０．０ミリモル）および三
酸化クロム（１．５０ｇ、１５．０ミリモル）を、０℃
に冷却した５０％水性ジオキサン１５０ｍＬ中ジゴキシ
ン（２．００ｇ、２．５６ミリモル）のスラリーへ同時
に加えた。得られた溶液を０℃で１時間攪拌した。その
反応混合物を５００ｍＬの水へ注いだ。生成物を酢酸エ
チル（７５ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機抽出物
をブライン（１００ｍＬ×３）で洗浄して硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、そして濃縮した。その残渣を熱酢酸エチル
２０ｍＬ中に溶解し、次いで周囲温度にてその溶液が濁
るまでエーテルを用いて希釈した。冷却析出した白色粉
末を濾取し、エーテルで洗浄し、そして乾燥して酸化さ
れたジゴキシン生成物が得られた。収量１．６８ｇ（８
１％）、ｍｐ１５２〜１５５℃：　１Ｈ　　ＮＭＲ（Ｄ
２　Ｏ、ＣＤＣｌ３　）δ５．９５（ｓ，１Ｈ），５．
２−４．６（ｍ，７Ｈ），４．３−３．７（ｍ，５Ｈ）
，３．５５（ｍ，２Ｈ），３．３０（ｍ，１Ｈ），２．
９−２．６（ｍ，４Ｈ），２．５−２．１（ｍ，２Ｈ）
，２．１−１．５（ｍ，１１Ｈ），１．５−１．１（ｍ
，１６Ｈ），１．０３（ｓ，３Ｈ），１．００（ｓ，３
Ｈ）；１３Ｃ　　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３　）δ２１２．２
，２０５．４，２０３．８，２０２．３，２０１．８，
１７５．３，１７５．１，１７４．４，１１８．２，１
００．３，９９．６，９９．５，９８．３，８６．５，
８６．４４，８４．３，８４．１，７８．１，７７．７
，７４．０，７３．７，７３．６，７３．０，７１．２
，７１．１，６４．１，４８．９，４６．２，４１．１
，３９．８，３７．３，３６．４，３５．４，３３．４
，３２．７，２９．９，２９．８５，２９．８，２６．
９，２６．３，２６．２，２６．１５，２６．１，２３
．２，２１．８，１８．９，１８．６，１８．６，１８
．５５，１８．５３，１８．４５，１６．５，１５．１
．

【００５４】例２−ジギトキシンのジカルボン酸酸化
生成物の製造 過ヨウ素酸（６．８４ｇ、３０．０ミリモル）および三
酸化クロム（１．５０ｇ、１５．０ミリモル）を、０℃
に冷却した５０％水性ジオキサン１５０ｍＬ中ジギトキ
シン（２．００ｇ、２．６１ミリモル）のスラリーへ同
時に加えた。得られた溶液を０℃で１時間攪拌し、次い
で周囲温度まで暖まるよう放置した。その溶液を５００
ｍＬの水へ注いだ。生成物を酢酸エチル（７５ｍＬ×３
）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（１００
ｍＬ×３）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで
濃縮した。その残渣を熱酢酸エチル２０ｍＬ中に溶解し
、次いで周囲温度にてその溶液が濁るまでペンタンを用
いて希釈した。冷却析出した白色粉末を濾取し、ペンタ
ンで洗浄し、次いで乾燥したところ、１．５５ｇ（７５
％）の酸化されたジギトキシン生成物が得られた。ｍｐ
１３５〜１４５℃：　１Ｈ　　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３　）
δ５．９０（ｓ，１Ｈ），５．１８（ｍ，１Ｈ），５．
０１（ｄ，１Ｈ），４．９８（ｂｒ　　ｓ，１Ｈ），４
．８３（ｂｒ　　ｓ，１Ｈ），４．８１（ｄ，１Ｈ），
４．７９（ｍ，１Ｈ），４．５０（ｂｒ，５Ｈ），４．
２３（ｄ，１Ｈ），４．１０（ｂｒ　　ｓ，１Ｈ），３
．９６（ｄ，１Ｈ），３．６４（ｍ，１Ｈ），３．５８
（ｍ，１Ｈ），２．７８（ｍ，６Ｈ），２．１５（ｍ，
２Ｈ），１．８７（ｍ，２Ｈ），１．８−１．３（ｍ，
１９Ｈ），１．２５（ｍ，９Ｈ），０．９５（ｓ，３Ｈ
），０．９０（ｓ，３Ｈ）．

【００５５】例３−ウワバインのジカルボン酸酸化生成
物の製造 過ヨウ素酸（４．５６ｇ、２０．０ミリモル）および三
酸化クロム（１．００ｇ、１０．０ミリモル）を、０℃
に冷却した５０％水性ジオキサン５０ｍＬ中ウワバイン
（１．００ｇ、１．３７ミリモル）の攪拌したスラリー
へ同時に加えた。得られた溶液を０℃で１時間攪拌し、
次いで周囲温度まで暖まるよう放置した。その反応混合
物を２００ｍＬの水へ注いだ。生成物を酢酸エチル（５
０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機抽出物を無色に
なるまでブライン（５０ｍＬ×５）で洗浄して硫酸ナト
リウムで乾燥し、そして濃縮した。その残渣を熱酢酸エ
チル５ｍＬに溶解し、次いで周囲温度にてその溶液が濁
るまでエーテルを用いて希釈した。冷却析出した白色粉
末を濾取し、エーテルで洗浄し、次いで乾燥した。収量
０．１３ｇ（１３％）、ｍｐ１３５〜１３９℃。

【００５６】下記例４〜８は、本発明による標識リガン
ド類似体を製造する方法を具体的に説明するものである
。 例４−アミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
）標識ジゴキシン類似体の製造 例１の酸化されたジゴキシン生成物（１０２ｍｇ、１．
２５×１０−４モル）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）２．５ｍＬに溶解した。トリブチルアミ
ン（２３μＬ、１．２５×１０−４モル）を加え、こう
して得られた溶液を氷浴中で冷却した。クロロギ酸イソ
ブチル（１７．１μＬ、１．２５×１０−４モル）を加
え、こうして得られた溶液を０℃で２０分間攪拌した。

【００５７】改良されたアミン富化ＨＲＰを下記のよう
に製造した。ＨＲＰ（２００ｍｇ）をイオン交換蒸留水
４０ｍＬに溶解した。新たに調製した０．１Ｍ過ヨウ素
酸ナトリウム水溶液１０ｍＬを加え、こうして得られた
溶液を２０分間遮光して攪拌した。その反応混合物を０
．００１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に対し
て一晩透析した。リシル−リジン二塩酸塩（０．８６８
ｇ、１２．５ミリモル）を０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐ
Ｈ９．５）５０ｍＬに溶解した。その酸化されたＨＲＰ
溶液を加え、こうして得られた溶液を周囲温度で１時間
攪拌した。ｐＨを８．０まで下げ、そしてシアノボロヒ
ドリドナトリウム（１００ｍｇ）を加えた。３時間攪拌
を続けた。 グリシン（１．５ｇ）およびさらに１００ｍｇのシアノ
ボロヒドリドナトリウムを３〜４時間かけて攪拌しなが
ら添加した。その反応混合物を０．０２Ｍ３−Ｎ−モル
ホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０）に
対して１４時間に亘って透析し、その間に透析緩衝液を
２回交換した。いずれかのＨＲＰ凝集物を除去する必要
がある場合には、サイズ排除クロマトグラフィーにより
アミン富化ＨＲＰを精製した。マーシオレート（０．０
２％）を防腐剤として添加した。

【００５８】イオン交換蒸留水をアミン富化ＨＲＰ５０
ｍｇ（１．２５×１０−６モル）へ加えて容量２５ｍＬ
にした。この溶液のｐＨを希水酸化ナトリウム溶液で９
．０に調整した。ｐＨを９．０に維持しながら、酸化さ
れたジギトキシンを含む溶液を、アミン富化ＨＲＰを含
む溶液へ滴下した。添加完了後、ｐＨ９で１．５時間攪
拌を続け、次いで希塩酸でｐＨを７．０まで下げた。最
終濃度が０．０２０Ｍとなるまでヒドロキシルアミンを
加え、こうして得られた溶液を２時間攪拌した。その反
応混合物を０．０２ＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）３Ｌに対
して一晩透析し、この間に透析緩衝液を１回交換した。 その標識を、０．０２Ｍ　　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）で
溶出するゲル濾過（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ　　Ｐ−２、２００
〜４００メッシュ）により精製した。マーシオレート（
０．０１％）を防腐剤として添加した。

【００５９】例５−ＨＲＰ標識リガンドジゴキシン類似
体の製造 例１の酸化されたジゴキシン生成物（１０２ｍｇ、１．
２５×１０−４モル）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）２．５ｍＬに溶解した。トリブチルアミ
ン（２３μＬ、１．２５×１０−４モル）を加え、こう
して得られた溶液を氷浴中で冷却した。クロロギ酸イソ
ブチル（１７．１μＬ、１．２５×１０−４モル）を加
え、こうして得られた溶液を０℃で２０分間攪拌した。

【００６０】イオン交換蒸留水をＨＲＰ５０ｍｇ（１．
２５×１０−６モル）へ加えて容量２５ｍＬにした。こ
の溶液のｐＨを希水酸化ナトリウム溶液で９．０に調整
した。ｐＨを９．０に維持しながら、酸化されたジゴキ
シンを含む溶液をＨＲＰを含む溶液へ滴下した。添加完
了後、ｐＨ９で１．５時間攪拌を続け、次いで希塩酸で
ｐＨを７．０まで下げた。最終濃度が０．０２０Ｍとな
るまでヒドロキシルアミンを加え、こうして得られた溶
液を２時間攪拌した。その反応混合物を０．０２Ｍ　　
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）３Ｌに対して一晩透析し、この
間に透析緩衝液を１回交換した。その標識を、０．０２
Ｍ　　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）で溶出するゲル濾過（Ｂ
ｉｏ−Ｇｅｌ　　Ｐ−２、２００〜４００メッシュ）に
より精製した。マーシオレート（０．０１％）を防腐剤
として添加した。

【００６１】例６−アミン富化ＨＲＰ標識ジギトキシン
類似体の製造 例２の酸化されたジギトキシン生成物（１００ｍｇ、１
．２５×１０−４モル）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
アミド（ＤＭＦ）２．５ｍＬに溶解した。トリブチルア
ミン（２３μＬ、１．２５×１０−４モル）を加え、こ
うして得られた溶液を氷浴中で冷却した。クロロギ酸イ
ソブチル（１７．１μＬ、１．２５×１０−４モル）を
加え、こうして得られた溶液を０℃で２０分間攪拌した
。

【００６２】イオン交換蒸留水をアミン富化ＨＲＰ５０
ｍｇ（１．２５×１０−６モル）へ加えて容量２５ｍＬ
にした。この溶液のｐＨを希水酸化ナトリウム溶液で９
．０に調整した。ｐＨを９．０に維持しながら、酸化さ
れたジギトキシン生成物を含む溶液を、アミン富化ＨＲ
Ｐを含む溶液へ滴下した。添加完了後、ｐＨ９で１．５
時間攪拌を続け、次いで希塩酸でｐＨを７．０まで下げ
た。最終濃度が０．０２０Ｍとなるまでヒドロキシルア
ミンを加え、こうして得られた溶液を２時間攪拌した。 その反応混合物を０．０２Ｍ　　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０
）３Ｌに対して一晩透析し、この間に透析緩衝液を１回
交換した。その標識を、０．０２Ｍ　　ＭＯＰＳ（ｐＨ
７．０）で溶出するゲル濾過（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ　　Ｐ−
２、２００〜４００メッシュ）により精製した。マーシ
オレート（０．０１％）を防腐剤として添加した。

【００６３】例７−アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ
）標識ジゴキシン類似体の製造 例１の酸化されたジゴキシン生成物（２０．３ｍｇ、２
．５×１０−５モル）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）２．５ｍＬに溶解した。トリブチルアミ
ン（４．６μＬ、２．５×１０−５モル）を加え、こう
して得られた溶液を氷浴中で冷却した。クロロギ酸イソ
ブチル（３．４２μＬ、２．５×１０−５モル）を加え
、こうして得られた溶液を０℃で２０分間攪拌した。

【００６４】イオン交換蒸留水をＡＬＰ２５ｍｇ（２．
５×１０−７モル）へ加えて容量２５ｍＬにした。この
溶液のｐＨを希水酸化ナトリウム溶液で９．０に調整し
た。ｐＨを９．０に維持しながら、酸化されたジゴキシ
ン生成物を含む溶液を、ＡＬＰを含む溶液へ滴下した。 添加完了後、ｐＨ９で１．５時間攪拌を続け、次いで希
塩酸でｐＨを７．０まで下げた。最終濃度が０．０２０
Ｍとなるまでヒドロキシルアミンを加え、こうして得ら
れた溶液を２時間攪拌した。その反応混合物をリン酸緩
衝溶液（ＰＢＳ）３Ｌに対して一晩透析し、この間に透
析緩衝液を１回交換した。その標識を、ＰＢＳで溶出す
るゲル濾過（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ　　Ｐ−２、２００〜４０
０メッシュ）により精製した。そのフラクションに含ま
れるタンパク質を、０．００１Ｍ塩化マグネシウムおよ
び０．０００１Ｍ塩化亜鉛を含む０．０５Ｍトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、ｐＨ８．
０に対して透析した。透析緩衝液を１回交換した。アジ
化ナトリウム（０．０２％）を防腐剤として添加し、そ
してその標識を４℃で遮光して保管した。

【００６５】例８−ＡＬＰ標識ジギトキシン類似体の製
造 例２の酸化されたジギトキシン生成物（１９．９ｍｇ、
２．５×１０−５モル）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルム
アミド（ＤＭＦ）２．５ｍＬに溶解した。トリブチルア
ミン（４．６μＬ、２．５×１０−５モル）を加え、こ
うして得られた溶液を氷浴中で冷却した。クロロギ酸イ
ソブチル（３．４２μＬ、２．５×１０−５モル）を加
え、こうして得られた溶液を０℃で２０分間攪拌した。

【００６６】イオン交換蒸留水をＡＬＰ２５ｍｇ（２．
５×１０−７モル）へ加えて容量２５ｍＬにした。この
溶液のｐＨを希水酸化ナトリウム溶液で９．０に調整し
た。ｐＨを９．０に維持しながら、酸化されたジギトキ
シンを含む溶液を、ＡＬＰを含む溶液へ滴下した。添加
完了後、ｐＨ９．０で１．５時間攪拌を続け、次いで希
塩酸でｐＨを７．０まで下げた。最終濃度が０．０２０
Ｍとなるようにヒドロキシルアミンを加え、こうして得
られた溶液を２時間攪拌した。その反応混合物をリン酸
緩衝溶液（ＰＢＳ）３Ｌに対して一晩透析し、この間に
透析緩衝液を１回交換した。その標識を、リン酸緩衝溶
液で溶出するゲル濾過（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ　　Ｐ−２、２
００〜４００メッシュ）により精製した。そのフラクシ
ョンに含まれるタンパク質を、０．００１Ｍ塩化マグネ
シウムおよび０．０００１Ｍ塩化亜鉛を含む０．０５Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）
、ｐＨ８．０に対して透析した。透析緩衝液を１回交換
した。アジ化ナトリウム（０．０２％）を防腐剤として
添加し、そしてその標識を４℃で遮光して保管した。

【００６７】例９〜１０ 以下の方法は、例４〜５で製造される構造Ｉの具体的な
酵素標識リガンド類似体の免疫能を試験するのに用いら
れた。１．０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰ
ＢＳ中固定化されたジゴキシン抗体を塗布したポリマー
ビーズを種々の希釈度（固定化された抗体の最終濃度が
０．００２５から２５０ｎＭの範囲内であるような）で
、Ｖ底、９６−ウェルマイクロタイタープレートのウェ
ル（試料５０μＬ）へ入れた。次いで例４〜５の１つで
製造される構造Ｉの酵素標識（５０μＬ）を加え、続い
てＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液５０μＬを加えた。

【００６８】ジゴキシンの過ヨウ素酸ナトリウム酸化に
続くＨＲＰとの反応により製造される対照酵素標識は同
様の方法で処理した。各ＨＲＰ標識の最終濃度は５×１
０−１１　Ｍであった。対照標識および構造Ｉの標識用
のウェルはふたをして１時間シェーカー上においた。次
いでウェルを２５００ＲＰＭで遠心した。各ウェルから
上清を２５μＬずつ３回採取して平底プレートへ入れた
。次いでＨＲＰ検出試薬（ロイコ染料、過酸化水素およ
び電子移動剤から調製される）を７５μＬずつ加えた。 続いて色素濃度の出現速度を分光光度計でモニターした
。

【００６９】図１は、本発明による酸化されたジゴキシ
ン生成物を含むアミン富化ＨＲＰ標識リガンド類似体お
よびＨＲＰ標識リガンド類似体を対照と比較した前述の
試験の結果を示すものである。免疫反応性試験用の酵素
標識類は、例４由来のアミン富化ＨＲＰ（白い四角）お
よび例５由来のＨＲＰ（黒い四角）で標識された酸化さ
れたジゴキシンから製造した。これらのデータは、対照
（黒い三角）と比較できる。図１のデータは、ＨＲＰお
よびアミン富化ＨＲＰへ直接付着される酸化されたジゴ
キシン二酸より製造される標識は、抗体によりそれぞれ
７５％および１００％結合されたことを示す。

【００７０】図１に示されるように、ジアルデヒドへの
ジゴキシンの過ヨウ素酸ナトリウム酸化に欠く酵素のア
ミノ基を介したＨＲＰへの結合により製造された対照は
、免疫能試験では免疫反応性が乏しい。９０％を越える
酵素が未結合のままである。この発明により製造される
標識類は、ジゴキシンのイムノアッセイで重要な改良を
表わしている。

【００７１】具体的な多層乾式イムノアッセイ要素フォ
ーマットは、「単分散されたビーズを含んでなる乾式イ
ムノアッセイ分析要素」と題する米国特許第４４４，０
７９号に公表されており、上記文書では、個別の層にま
たは混合して単一層にのどちらかに塗布される２種の異
なるサイズの単分散ポリマービーズを使用している。こ
のフォーマットは、下記例１１で用いられる。

【００７２】例１１−ジゴキシン用に塗布された薄層フ
ィルムイムノアッセイ 本例は、多層薄層フィルムフォーマットおよび個別洗浄
工程を用いるジゴキシン用競争的イムノアッセイを具体
的に説明するものである。特に、標識を例４に記載され
るように製造した。要素の構造は次のとおりである。

【００７３】

【表１】

【００７４】ジゴキシン−ＨＲＰ標識リガンド類似体の
保管溶液を、ウシ血清アルブミン（１％）、０．０１Ｍ
４′−ヒドロキシアセトアニリドおよび０．０２％マー
シオレートを含む０．２Ｍ　　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）
中で製造した。上記ジゴキシン−ＨＲＰの保管溶液の試
料（０．１ｍＬ）を、脱脂ヒト血清マトリックスへジゴ
キシンを添加することにより調製される一連のジゴキシ
ン標準（０．９ｍＬ）と組み合わせた。

【００７５】１０μＬずつジゴキシン要素上へスポット
した。３７℃で５分経過後、過酸化水素を含む洗液（１
０μＬ）を加えて未結合ジゴキシン−ＨＲＰを要素の中
心から洗浄した。４０秒後、反射率濃度（ΔＤｒ）の変
化を３７℃、６８０ｎｍで３０秒間、要素の中心で測定
した。Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｃｌａｐｐｅｒ変換〔Ｊ．Ｏ
ｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．，４３，５９５（１９５３）〕は
、反射濃度を透過率価（ΔＤｔ）へ換算するのに用いた
。その結果を以下に示す。

【００７６】

【表２】

【００７７】これらの結果は、本発明方法により製造さ
れるジゴキシン−ＨＲＰ標識が、塗布されたジゴキシン
アッセイ用多層乾式分析要素中、都合のよいことを示す
。本発明の具体的な態様を前述の詳細な説明および例に
関連して以下に列挙する。

【００７８】２．免疫学的反応性の単糖類もしくは多糖
類のジカルボン酸酸化生成物を含有するリガンド類似で
あって、前記酸化生成物に標識もしくは支持体をアミド
結合もしくはチオエステル結合を介して付着したリガン
ド類似体である上記リガンド類似体は次式で示される。

【００７９】

【化７】

【００８０】Ｒは、ビシナルジオール基、カルボン酸基
、第１級アミノ基およびスルフヒドリル基を欠く免疫学
的反応性基であり；Ｚは、ビシナルジオール基を含む炭
素原子の酸化により形成されるジカルボン酸を有する糖
環の残存原子類を示し；Ｚ′は、糖環を完成するのに必
要な原子類を示し；そしてｎは、０から２，５００まで
の整数であり、Ｒ２　およびＲ３　は、各々独立してａ
）−ＯＲ４　，ＳＲ４　，−ＮＲ４　Ｒ５　；またはｂ
）アミノ基もしくはスルフヒドリル基を介してカルボキ
シル基へ結合される標識もしくは支持体の残基であって
、それが付着されるとアミド結合基（−ＮＨＣＯ−）も
しくはチオエステル結合基（−ＳＣＯ−）を形成する残
基、を示し；Ｒ４　およびＲ５　は、各々独立して水素
、炭素原子数１〜６個の低級アルキル、もしくは炭素原
子数６〜１０個のアリールより選ばれ；供給されるＲ２
　およびＲ３　の少なくとも１つは、標識もしくは支持
体の残基を含み、そして単糖類単位間の結合は、αもし
くはβグリコシド結合である。

【００８１】３．次式

【化８】

【００８２】（Ｒ，Ｒ２　，Ｒ３　およびｎは、請求項
２に定義したとおりであり、そしてＲ１　は、各々独立
して水素、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アシル
オキシ、低級アルカナミド、ヒドロキシもしくはヒドロ
キシメチルである）で示される請求項２のリガンド類似
体。

【００８３】４．次式

【化９】

【００８４】（Ｒ，Ｒ１　，Ｒ２　およびＲ３　は、請
求項２に定義したとおりであり、そしてｎは、０から３
までである）で示される請求項２のリガンド類似体。

【００８５】５．Ｒが、ステロイド基の残基である請求
項２，３もしくは４のリガンド類似体。

【００８６】６．Ｒが、ジゴキシン、ジギトキシンもし
くはウワバインの残基である請求項２，３もしくは４の
リガンド類似体。

【００８７】７．その標識が、酵素である請求項２，３
もしくは４のリガンド類似体。

【００８８】８．その標識が、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ、アミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼもしくは
アルカリ性ホスファターゼである請求項２，３もしくは
４のリガンド類似体。

【００８９】９．ビシナルジオールを有する免疫学的反
応性の単糖類もしくは多糖類のジカルボン酸酸化生成物
を含有するリガンド類似体であって、前記酸化生成物に
標識もしくは支持体をアミド結合もしくはチオエステル
結合を介して付着したリガンド類似体を製造する方法で
あって、下記の工程を含んでなる方法。 （ａ）ａ）免疫学的反応性被検体（リガンド）と特異的
にバインディングできる基およびｂ）末端糖基上に位置
する２つのビシナルジオールを有する単糖類もしくは多
糖類を供給する工程； （ｂ）水混和性有機溶媒混合物を含む水性溶液中で上記
末端糖のビシナルジオール部分を過ヨウ素酸および三酸
化クロムの混合物で酸化してジカルボン酸生成物を生成
する工程；ならびに （ｃ）ジカルボン酸生成物を、アミノ基もしくはスルフ
ヒドリル基を含有する標識もしくは支持体と縮合する工
程。

【００９０】１０．その過ヨウ素酸および三酸化クロム
の混合物が、４／１から１／１の範囲内のモル濃度比で
ある請求項９の方法。

【００９１】１１．そのモル濃度比が、２／１である請
求項１０の方法。

【００９２】１２．その標識が、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ、アミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼもしく
はアルカリ性ホスファターゼからなる群より選ばれる酵
素である請求項１０もしくは１１の方法。

【００９３】１３．その支持体が、ポリマー粒子、繊維
もしくはフィルムである請求項１０もしくは１１の方法
。

【００９４】１４．請求項１，２，３，４，５，６，７
もしくは８の、ビシナルジオールを有する免疫学的反応
性の単糖類もしくは多糖類のジカルボン酸酸化生成物を
含有するリガンド類似体であって、前記酸化生成物に標
識もしくは支持体をアミド結合もしくはチオエステル結
合を介して付着したリガンド類似体が用いられるイムノ
アッセイ。

【００９５】１５．（ａ）支持体へ付着されるリガンド
類似体を供給する工程； （ｂ）リガンドおよびリガンド類似体に対して付着され
る検出可能な標識を有するレセプターを供給する工程；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）を混合する工程；そして（ｄ
）結合もしくは未結合の標識レセプターを測定する工程
；を含んでなるリガンド用イムノアッセイであって、上
記リガンド類似体が、ビシナルジオールを有する免疫学
的反応性の単糖類もしくは多糖類のジカルボン酸酸化生
成物であってアミド結合もしくはチオエステル結合を介
して支持体へ付着した請求項１，２，３，４，５，６，
７もしくは８のリガンド類似体であることを特徴とする
。

【００９６】１６．（ａ）ビシナルジオールを有する免
疫学的反応性の単糖類もしくは多糖類のジカルボン酸酸
化生成物を含有し、アミド結合もしくはチオエステル結
合を介して標識へ付着した請求項１，２，３，４，５，
６，７もしくは８の標識リガンド類似体を供給する工程
； （ｂ）リガンドを（ａ）と混合する工程；（ｃ）（ｂ）
由来の混合物をリガンドに対する抗体の既知量と反応さ
せる工程；ならびに （ｄ）標識リガンド類似体の量を測定する工程；を含ん
でなるリガンド用イムノアッセイ。

【００９７】１７．その標識リガンド類似体が酵素標識
を含有し、そしてＲがステロイド残基である請求項１４
の方法。

【００９８】１８．その標識が、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ、アミン富化西洋ワサビペルオキシダーゼおよび
アルカリ性ホスファターゼであり、そしてＲが、ジゴキ
シン、ジギトキシンもしくはウワバインの残基である請
求項１７の方法。

【００９９】１９．ビシナルジオールを有する免疫学的
反応性の単糖類もしくは多糖類のジカルボン酸酸化生成
物を含んでなる乾式分析要素であって、前記酸化生成物
に標識もしくは支持体をアミド結合もしくはチオエステ
ル結合を介して付着した請求項１，２，３，４，５，６
，７もしくは８の乾式分析要素。

【０１００】２０．展開層に小さなビーズおよび大きな
ビーズを含んでなる請求項１９の多層要素。

【０１０１】

【発明の効果】本発明の新規標識リガンド類似体類（構
造Ｉ）、特にジゴキシン、ジギトキシンおよびウワバイ
ンのステロイド誘導体類を含む類似体類を用いるイムノ
アッセイで、改良された免疫反応性および応答反応曲線
を発明者らは観察した。

【図面の簡単な説明】

【図１】酵素標識ジゴキシン類似体の免疫反応性。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ビシナルジオールを有する免疫学的反
   応性の単糖類もしくは多糖類のジカルボン酸酸化生成物
   を含有するリガンド類似体であって、前記酸化生成物に
   標識もしくは支持体をアミド結合もしくはチオエステル
   結合を介して付着したリガンド類似体。