JP3009155B2 - 免疫クロマトグラフイー分析方法 - Google Patents

免疫クロマトグラフイー分析方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 １） 発明の分野 特定の化合物に対する天然の受容体または抗体を関心
化合物の存在の検定に使用する技術は急速に発展しつつ
ある免疫学的検定業務を創成してきた。特異的結合ペア
（sbp）構成要素の相補性ペア、通常はリガンドおよび
受容体（抗リガンド）を包含する免疫学的ペアが各検定
に関与し、この場合sbp構成要素の一つが検出可能シグ
ナルを与える標識で標識されている。免疫学的検定方法
ではsbp構成要素の複合体中に結合したシグナル標識と
非結合シグナル標識の間にシグナル標識の分布を生じ
る。結合および非結合シグナル標識間の判別は、非結合
シグナル標識から結合シグナル標識の物理的分離または
結合および非結合シグナル標識間の検出可能シグナルの
転形の結果、可能になる。
多くの場合、免疫学的検定法は、臨床検査における広
範囲の関心化合物の定量的測定を指図するものであり、
比較的手の込んだ装置と気の抜けない技法を必要とす
る。半定量的または定量的結果が得られ、検査技術によ
らずたとえば家庭または開業医の診療室での測定が可能
な免疫学的検定法の商業的応用はそれほど広く行われて
いない。臨床検査室においても、未経験者により単純か
つ迅速にスクリーニング試験が実施できればかなりの経
済性が期待できる。
免疫学的検定法の開発に際しては、多くの考慮すべき
事項がある。その一つは、結合したシグナル標識と非結
合シグナル標識から生じる実測シグナル間の判別を可能
にすることである。他の考慮すべき事項としては、関心
化合物の含有が疑われるサンプル中の内因性物質による
妨害を最小限にすることがある。さらに他の事項として
は、実測されるシグナルの検出、および関心濃度範囲に
おける濃度間の判別が容易なことがある。他の考慮すべ
き事項は、サンプル中の関心化合物の濃度である。他の
因子としては、試薬の調製の容易さ、サンプルおよび試
薬溶液の調製および測定に要求される正確さ、試薬の保
存安定性、プロトコールに必要な工程数、ならびに各工
程の実施に必要な熟練度および正確さがある。したがつ
て、非熟練者による実施が可能な検定法、たとえば家庭
で、法医学的に、開業医による等の実施が可能な検定法
の開発に際しては、プロトコールの実行方法の変動によ
る実測結果への影響を最小限とし、各工程を実行するた
めの技法は単純なものとすることが必要になる。
一般に、サンプル中の希薄な被検物質の定量を可能に
する免疫学的検定法の設計は難しく、これまで発表され
てきた方法は多数の工程と長時間を要するものである。
フロント分析（frontal analysis;またはエスケーパ
ー分析）はクロマトグラフイーカラム中の固体支持体上
の活性基を定量する既知の方法である（C.R.Lowe ＆ P.
D.G.Dean著：アフイニテイー・クロマトグラフイー、Jo
hn Wiley ＆ Sons,Ltd.,New York,1974）。フロント分
析では、反応種の既知濃度溶液をカラムに適用する。カ
ラム流出液中の反応種を検出してカラムの飽和に必要な
容量を測定すると（エスケーパー容量）、カラム上の活
性基濃度の定量が可能になる。
２） 関連技術の説明 とくに液体サンプル中の物質を測定するための、サン
プルの特性を測定する試験デバイスは米国特許第4,094,
647号に開示されている。薄層クロマトグラフイーデバ
イスおよびクロマトグラフイー試験を行う方法は米国特
許第4,384,958号に開示されている。標識抗体が固定化
被検物質類縁体から追い出す免疫学的検定法は米国特許
第4,434,236号に記載されている。ミオグロビンを検出
するデバイスおよび方法は米国特許第4,189,304号に開
示されている。液体中に溶解された物質の分析用試験ス
トリツプは米国特許第4,438,067号に記載されている。
液体サンプル成分の存在の測定用多重層試験デバイスお
よびこのようなデバイスの使用方法は、米国特許第4,16
0,008号に記載されている。標識抗原による不溶性抗体
を用いた抗原の測定方法は日本特許出願公開公報5925/7
3号（1973年１月25日）に開示されている。
不均一免疫学的検定法における濃縮領域方法は米国特
許第4,366,241号に開示されている。米国特許第4,168,1
46号には免疫学的検定試験ストリツプが記載されてい
る。米国特許第3,990,850号および第4,055,394号には診
断試験カードが記載されている。生物学的液体の定量分
析のための自動化方法は、米国特許第4,327,073号に記
載されている。色原体支援免疫学的検定は、国際出願、
PCT/US83/01887号に開示されている。
免疫学的検定法における検出可能なシグナルを産生す
る各種技術に関しては、多種多様の特許および特許出願
が広範な文献を提供する。以下に挙げる例は、本発明に
おいて応用できるこれらの技術の一部を単に例示するに
すぎない。以下、米国特許番号とそれに全般的記述があ
る標識の種類を列記する。
米国特許第3,646,346号、放射性標識；第3,654,090
号、第3,791,932号および第3,817,838号、酵素標識；第
3,996,345号、蛍光物質−消光物質標識；第4,062,733
号、放射性標識；第4,067,959号、蛍光物質または酵素
標識；第4,104,029、化学発光標識；ならびに第4,160,6
45号、非酵素触媒標識。抗体領域を用いた電気泳動法に
ついては米国特許第3,966,879号、標識被検物質を最初
に抗体を介して固体支持体に結合させるRIAについては
米国特許第4,120,945号が参考になる。米国特許第4,23
3,402号は酵素ペア標識を、同第4,720,450号は化学誘導
蛍光標識を、同第4,287,300号は酵素陰イオン電荷標識
を使用している。
発明の要約 本発明の方法は検定の実施に有用である。検定を実施
するための本発明の一方法は、第１の吸水性構成要素領
域（「第１領域」）と成分を含有する液体メジウムの組
合せを提供することにより構成される。第１領域には、
成分と相互作用する試薬が非拡散性に結合されている。
液体メジウムとそれに含まれる成分の少なくとも部分が
毛細管作用によつて第１領域のすべてを通過して第１領
域とは組成の異なる第２の吸水性構成要素領域（「第２
領域」）に移動する条件を採用する。成分が第２領域内
へ移動した距離またはメジウムおよび成分が第２領域内
へ移動した距離の差を測定する。上述の距離または差
は、液体メジウム中の成分の量または試薬の量に相関す
る。
液体メジウム中の成分の量を定量するための本発明の
他の方法は、第１の吸水性構成要素領域（「第１領
域」）を、成分含有液体メジウムと接触させることから
なる。第１領域には、成分と相互作用する試薬が非拡散
性に結合されている。接触は、液体メジウムとそれに含
まれる成分の少なくとも部分が毛細管作用によつて第１
領域のすべてを通過し第１領域とは組成の異なる第２の
吸水性構成要素領域（「第２領域」）に移動する条件下
に行われる。成分が第２領域内に移動した距離またはメ
ジウムおよび成分が第２領域内へ移動した距離の差を測
定する。その距離または差は、液体メジウム中の成分の
量、または試薬の量に相関する。
検定を実施するための本発明の他の方法は、被検物質
の溶液と第１の吸水性構成要素を組合せることからな
り、第１の吸水性構成要素には、被検物質と反応可能な
試薬が非拡散性に結合しているかまたは結合できる。成
分を含有する液体メジウムを第１の吸水性構成要素と合
すると、成分は試薬と相互作用する。第１の吸水性構成
要素は、それとは異なる組成の第２の吸水性構成要素と
液体授受関係にあるか、または第２の吸水性構成要素の
空間的に分離された部分である。条件は、液体メジウム
と成分が最初に第１の吸水性構成要素を、ついで第２の
吸水性構成要素の少なくとも部分を毛細管作用によつて
通過するように選択される。第２の吸水性構成要素上
で、成分の濃度差によつて定められる境界、または成分
の反応生成物が確定される。境界の位置は、溶液中の被
検物質の量または第１の吸水性構成要素上の試薬の量に
相関する。
検定を行う他の方法は、第２の液体メジウム中、
（１）第１の吸水性構成要素と（２）被検物質の組合せ
を提供することにより構成され、被検物質に対する試薬
は上記メジウム中または上記第１の吸水性構成要素上に
存在させる。第１の吸水性構成要素は、吸収性構成要素
と液体授受関係にある。条件は、第１のメジウムが第１
の吸水性構成要素と少なくとも吸収性構成要素の部分を
毛細管作用によつて貫流し、被検物質は吸水性構成要素
に非拡散性に結合されるように選択する。上記吸水性構
成要素と上記吸収構成要素の間の液体授受関係は終結さ
せる。第２の液体メジウム中、第１の吸水性構成要素お
よび、試薬と相互作用する成分からなる他の組合せを提
供し、第１の吸水性構成要素は第２の吸水性構成要素と
液体授受関係におく。この組合せは、第２のメジウムが
第１の吸水性構成要素と少なくとも第２の吸水性構成要
素の部分を毛細管作用によつて通過するような条件で提
供される。ただし、第１の吸水性構成要素は、吸収性構
成要素および第２の吸水性構成要素と、実質的に異なる
時期に液体授受関係にある。第２の吸水性構成要素上に
境界が決定され、境界の位置は第１のメジウム中の被検
物質の量、または第２の液体メジウム中の試薬の量もし
くは成分の量と相関する。
本発明の他の方法は、被検物質の含有が疑われるサン
プル中の被検物質の存在の検定に有用である。本発明の
方法の一態様においては、第１の吸水性構成要素の部分
を、特異的結合ペア（sbp）構成要素のような試薬を含
有する第１の液体、通常は水性のメジウムまたは溶液と
接触させて、試薬を第１の吸水性構成要素に結合させ
る。第１の吸水性構成要素は吸収性構成要素と液体授受
関係に置くことができる。接触は、第１のメジウムが第
１の吸水性構成要素および少なくとも吸水性構成要素の
部分を毛細管作用により通過または貫流するような条件
下に行われる。次に、第１の吸水性構成要素を第２の吸
水性構成要素と液体授受関係に置く。第１の吸水性構成
要素の部分を、第２の液体、通常は水性メジウムと、第
２の水性メジウムが毛細管作用により第１の吸水性構成
要素および少なくとも第２の吸水性構成要素の部分を通
過するような条件下に接触させる。この方法により、第
２のメジウム中の成分は、第１のメジウム中の被検物質
の存在に関連して第２の吸水性構成要素によつて吸着さ
れ、好ましくは第２の吸水性構成要素に非拡散的に結合
される。第２の吸水性構成要素の少なくとも部分上にお
ける成分の存在が測定され、これは被検物質の存在を指
示する。
本発明の他の局面においては、第１の液体、通常水性
のメジウムまたは溶液中の組合せを提供する。この組合
せは、（１）第１の吸水性構成要素の少なくとも部分、
第１の試薬たとえばsbp構成要素が非拡散性に結合して
いる第１の吸水性構成要素の少なくとも部分、および
（２）被検物質の含有が疑われるサンプルを包含する。
被検物質が第１の試薬に結合可能でない場合は、被検物
質と第１の試薬に結合可能な第２の試薬をメジウム中ま
たは第１の吸水性構成要素上に存在させる。第１の吸水
性構成要素は吸収性構成要素と液体授受関係にある。条
件は、第１のメジウムまたは溶液が、第１の吸水性構成
要素および少なくとも吸収性構成要素の部分を毛細管作
用により通過または貫流するように選択される。ついで
第１の吸水性構成要素を第２の吸水性構成要素と液体授
受関係に置く。他の組合せを、第２の液体、通常は水性
のメジウム中に提供する。この組合せは、第１の吸水性
構成要素の少なくとも部分と、第１のメジウム中の被検
物質の存在に関連して第１または第２の試薬に結合可能
な成分とを包含する。第２の吸水性構成要素は好ましく
は、その少なくとも部分に、成分に対する特異的結合パ
ートナーが非拡散性に結合されている。この組合せは、
第２の液体メジウムが第１の吸水性構成要素の少なくと
も部分および第２の吸水性構成要素の少なくとも部分を
毛細管作用によつて通過するような条件下に提供され
る。成分が第２の吸水性構成要素を通過する距離を測定
し、これはサンプル中の被検物質の量に相関する。
本発明の他の局面においては、第１の吸水性構成要素
と吸収性構成要素の間の液体授受関係は、第１の吸水性
構成要素を第２の吸水性構成要素に接触させる前に終結
させる。
本発明の他の態様においては、第２の吸水性構成要素
は、免疫クロマトグラフ構成要素のようなクロマトグラ
フ構成要素であり、境界はクロマトグラフ構成要素上に
決定される。境界の位置は第１のメジウム中の被検物質
の量または液体メジウム中の成分の量もしくは第１の吸
水性構成要素上の試薬の量に相関する。
本発明の他の局面は、第１の液体、通常は水性メジウ
ム中、（１）少なくともその部分に第１の特異的結合ペ
ア（sbp）構成要素が非拡散性に結合した吸水性構成要
素の部分と（２）被検物質の含有が疑われるサンプルの
組合せを提供する被検物質の検定の実施方法に関する。
第１の試薬は、被検物質と結合可能な第２のsbp構成要
素およびメジウム中または吸水性構成要素上に存在する
第１のsbp構成要素と相補性の第３のsbp構成要素からな
る抱合体を包含することができる。吸水性構成要素は吸
収性構成要素と液体授受関係にある。第１のメジウムは
吸水性構成要素および少なくとも吸収性構成要素の部分
を毛細管作用によつて通過し、抱合体は吸水性構成要素
に非拡散性に結合する。吸水性構成要素と吸収性構成要
素の間の液体授受関係を終結させる。第２の液体、通常
は水性のメジウム中に、第１の吸水性構成要素と成分を
包含する他の組合せを提供する。成分は、シグナル生成
システムの構成要素に結合したまたは結合することが可
能な被検物質類縁体からなる。吸水性構成要素は、成分
に対する結合パートナーが非拡散性に結合した免疫クロ
マトグラフ構成要素と液体授受関係にある。使用された
条件下に、第２のメジウムは毛細管作用によつて吸水性
構成要素および少なくとも免疫クロマトグラフ構成要素
の部分を通過する。吸水性構成要素は、吸収性構成要素
および免疫クロマトグラフ構成要素と実質的に異なる時
期に液体授受関係にある。第１のメジウム中の被検物質
の量にその位置が相関する免疫クロマトグラフ構成要素
上の境界を決定する。
本発明の他の局面は、第１の液体、通常は水性のメジ
ウム中（１）第１の試薬たとえば被検物質類縁体が非拡
散性に結合した第１の吸水性構成要素の部分と（２）被
検物質の含有が疑われるサンプルの組合せを提供するこ
とによる被検物質の検定の実施方法に関する。上記被検
物質に結合可能な第２の試薬が溶液中または吸水性構成
要素上に存在する。吸水性構成要素は吸収性構成要素と
液体授受関係に置く。第１のメジウムまたは溶液は毛細
管作用によつて吸水性構成要素および少なくとも吸収性
構成要素の部分を通過または貫流し、第２の試薬は、第
１のメジウムまたは溶液中における被検物質の量に逆比
例して吸水性構成要素に非拡散性に結合する。吸水性構
成要素と吸収性構成要素の間の液体授受関係を終結させ
る。第２の液体、通常は水性のメジウム中、上記吸水性
構成要素の部分と成分を包含する他の組合せを提供す
る。この成分は、シグナル生成システムの構成要素を包
含するかまたはそれに結合することが可能であり、また
吸水性構成要素に結合している第１または第２の試薬に
結合することができる。吸水性構成要素は、成分に対す
る特異的結合パートナーが非拡散性に結合している免疫
クロマトグラフ構成要素と液体授受関係にある。使用し
た条件下に、第２のメジウムが吸水性構成要素および少
なくとも免疫クロマトグラフ構成要素の部分を毛細管作
用によつて通過する。吸水性構成要素は、吸収性構成要
素および免疫クロマトグラフ構成要素と実質的に異なる
時期に液体授受関係に置かれる。第１のメジウム中の被
検物質の量がその位置に相関する免疫クロマトグラフ構
成要素上の境界を決定する。
他の態様においては、（１）被検物質に対する抗体が
非拡散性に結合した吸水性構成要素、および（２）被検
物質の含有が疑われる第１の液体、通常は水性のメジウ
ムまたは溶液からなる組合せが提供される。吸水性構成
要素は吸収性構成要素と液体授受関係に置かれる。条件
は、第１のメジウムが毛細管作用によつて吸水性構成要
素および少なくとも吸収性構成要素の部分を通過するよ
うに選択される。上記吸水性構成要素と吸収性構成要素
の間の液体授受関係を終結させる。第２の液体、通常は
水性のメジウム中、吸水性構成要素と成分を包含する他
の組合せを提供する。この成分はシグナル生成システム
の構成要素に結合しているかまたは結合可能であり、ま
た上記被検物質に対する抗体に結合できる。吸水性構成
要素は、成分に対する特異的結合パートナーが非拡散性
に結合した免疫クロマトグラフ構成要素と液体授受関係
に置く。この方法の条件下で、第２のメジウムは吸水性
構成要素および少なくとも免疫クロマトグラフ構成要素
を毛細管作用によつて通過する。ただし、吸水性構成要
素は、吸収性構成要素および免疫クロマトグラフ構成要
素と実質的に異なる時期に液体授受関係にある。免疫ク
ロマトグラフ構成要素上に境界が決定される。この境界
の位置は、第１のメジウムもしくは溶液中の被検物質の
量、試薬の量、または第２のメジウム中の成分の量に相
関する。
本発明の他の局面は、ジオキサンの検定を行う方法に
関する。この方法は、吸水性ストリツプの末端部から遠
位領域に分子量1500未満の有機分子に対する抗体（A
b1）が非拡散的に結合しているそのストリツプの末端部
とジゴキシンの含有が疑われる第１の水性メジウムまた
は溶液と接触させることからなる。ジオキシンに対する
抗体が有機分子に抱合または結合してなる抱合体を第１
のメジウム中または吸水性ストリツプ上に存在させる。
選択された条件下に、第１のメジウムまたは溶液は毛細
管作用によつて吸水性ストリツプと、そのストリツプと
液体授受関係にある吸収性構成要素の少なくとも一部を
通過し、抱合体は非拡散性にAb1に結合し、ジゴキシン
が存在すれば抱合体に結合する。吸水性構成要素と吸収
性構成要素の間の液体授受関係を終結させる。第２の液
体、通常は水性メジウム中、吸水性ストリツプの末端部
および酵素に結合したジゴキシン類縁体からなる成分で
構成される組合せを提供する。吸水性ストリツプはジゴ
キシンに対する抗体が非拡散性に結合した免疫クロマト
グラフストリツプと液体授受関係に置く。第２のメジウ
ムは吸水性ストリツプと少なくとも免疫クロマトグラフ
構成要素の部分を毛細管作用によつて通過させる。ただ
し、ストリツプは、吸収性構成要素および免疫クロマト
グラフストリツプと実質的に異なる時期に液体授受関係
に置く。この場合も、上記サンプル中の被検物質の量が
その位置に相関する免疫クロマトグラフストリツプ上の
境界を決定する。
ジゴキシンの検定の他の態様においては、ジゴキシン
類縁体が非拡散性に結合された吸水性ストリツプの末端
部を、ジゴキシンの含有が疑われるサンプルを含む第１
の液体、通常は水性のメジウムまたは溶液と接触させ
る。ジゴキシンに対する抗体（AbD）は第１のメジウム
中または吸水性ストリツプ上に存在させる。吸水性スト
リツプは吸収性構成要素と液体授受関係に置き、第１の
メジウムが毛細管作用によつて吸水性構成要素および少
なくとも吸収性構成要素の部分を通過し、サンプル中に
ジゴキシンが存在する場合にはジゴキサン類縁体に抗体
AbDが非拡散性に結合するような条件が選択される。吸
水性ストリツプと吸収性構成要素の間の液体授受関係を
終結させる。第２の液体、通常は水性のメジウム中、吸
水性ストリツプの末端部および酵素に結合したAbDに対
する抗体からなる抱合体を包含する組合せを提供する。
吸水性ストリツプは、AbDに対する抗体の受容体が非拡
散性に結合した免疫クロマトグラフストリツプと液体授
受関係に置かれる。検定の条件下に、第２のメジウムは
吸水性ストリツプと少なくとも免疫クロマトグラフスト
リツプの部分を毛細管作用によつて通過する。吸水性ス
トリツプは吸収性構成要素および免疫クロマトグラフス
トリツプと、実質的に異なる時期に液体授受関係に置か
れる。境界が免疫クロマトグラフストリツプ上に決定さ
れる。境界の位置は第１のメジウム中の被検物質の量に
相関する。
本発明の方法の他の態様においては、ジゴキシンに対
する抗体が非拡散性に結合した吸水性構成要素の末端部
を、ジゴキシンの含有が疑われるサンプルを含む第１の
水性メジウムまたは溶液と接触させる。吸水性ストリツ
プは吸収性構成要素と液体授受関係に置き、条件は第１
のメジウムが吸水性構成要素および少なくとも吸収性構
成要素の部分を毛細管作用によつて通過するように選択
される。吸水性構成要素と吸収性構成要素の間の液体授
受関係を終結させる。第２の液体、通常は水性のメジウ
ム中、吸水性ストリツプの末端部と、酵素に結合したジ
ゴキシン類縁体からなる抱合体との組合せを形成させ
る。吸水性ストリツプは、抱合体に対する受容体が非拡
散性に結合した免疫クロマトグラフストリツプと液体授
受関係に置く。第２のメジウムは毛細管作用によつて吸
水性ストリツプと少なくとも免疫クロマトグラフストリ
ツプの部分を通過する。吸水性ストリツプは、吸収性構
成要素および免疫クロマトグラフストリツプと実質的に
異なる時期に液体授受関係に置かれる。この場合も、記
第１のメジウム中の被検物質の量がその位置に相関する
免疫クロマトグラフストリツプ上の境界を決定する。
本発明はさらに、液体メジウム中の被検物質、試薬ま
たは成分の存在または存在量を分析するためのデバイス
を包含する。デバイスは第１の吸水性構成要素、吸収性
構成要素、および第２の吸水性構成要素からなる。吸水
性構成要素は、吸収性構成要素および第２の吸水性構成
要素と交互に液体授受関係に置くことが可能である。本
発明の方法を実施するためのキツトも本発明に包含され
る。
図面の簡単な説明 第１図は本発明によるデバイスを模式的に示した図で
ある。
特定の態様の説明 上述のように、本発明は、液体メジウム中の成分、試
薬、および／または被検物質の含有が疑われるサンプル
中の被検物質の、予め定められた最小検出可能量または
それ以上の存在または存在量を決定するための方法、デ
バイスおよびキツトを目的とするものである。本発明は
とくに、比較的希薄なメジウム中成分、表面上試薬また
はサンプル中被検物質の定量に応用可能である。本発明
は、サンプル干渉を回避する手段を提供し、従来技術に
比べて感度が高く、迅速な方法を与える。本発明はま
た、サンプル中の被検物質分子数と最終的にシグナルを
形成する分子数の間の高い平衡を得る手段を提供する。
本発明の特定の態様についてさらに説明を進める前
に、多くの用語については以下に定義する。
被検物質−測定される化合物または組成物であつて、
抗体またはキレート剤のような結合構成要素に特異的に
結合できる。通常は、抗原もしくは薬剤、または酸化も
しくは還元が可能な分子もしくはイオンのような化学的
に反応性の組成物である。
抗原および薬剤被検物質の正確な性質はその多数の例
とともに、米国特許第4,299,916号（Litmanら）のとく
に第16欄〜第23欄、および米国特許第4,275,149号第17
欄および第18欄に開示されている。
被検物質にはリガンドおよび受容体が包含され、これ
らは単一の結合部位を有するか（１価）または多数の結
合部位を有するか（多価）によつて分類される。多価被
検物質は、通常、ポリ（アミノ酸）、すなわちポリペプ
チドおよびタンパク質、多糖、核酸、ならびにそれらの
配合物である。このような配合物または集合体、細菌、
ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞
膜等が包含される。
多種類のタンパク質が、類似の構造的特徴を有するタ
ンパク質、特定の生物学的機能を有するタンパク質、特
定の微生物とくに疾患誘発微生物に関連するタンパク質
等、共通の特徴をもつ群として考慮することができる。
単一エピトープをもつリガンド被検物質は一般に分子
量的100〜2,000、通常は分子量125〜1,000である。興味
ある被検物質には薬剤、代謝物、有害生物殺滅剤、汚染
物質等が包含される。興味ある薬剤にはアルカロイドが
包含される。アルカロイドとしては、モルフイン、コデ
イン、ヘロイン、デキストロメトロフアン、それらの誘
導体および代謝物を含むモルフインアルカロイド；コカ
インおよびベンゾイルエコゴニン、それらの誘導体およ
び代謝物を含むコカインアルカロイド；リゼルグ酸ジエ
チルアミドを含む麦角アルカロイド；ステロイドアルカ
ロイド；イミナゾイルアルカロイド；キナゾリンアルカ
ロイド；イソキノリンアルカロイド；キニンおよびキニ
ジンを含むキノリンアルカロイド；ジテルペンアルカロ
イド、その誘導体および代謝物を挙げることができる。
次の薬剤群には、エストロゲン類、アンドロゲン類、
アンドレオコーチカルステロイド類、胆汁酸類、ジゴキ
シンおよびジゴキシゲニンを含む強心性グリコシドとア
グリコン類、サポニン類およびサポゲニン類、それらの
誘導体および代謝物が包含される。また、ステロイド模
倣物質たとえばジエチルスチルベストロールも包含され
る。
次の薬剤群としては５ないし６員環のラクタムがあ
り、バルビツール酸類たとえばフエノバルビタールおよ
びセコバルビタール、ジフエニルヒダントイン、プリミ
ドン、エトスキシミドならびにそれらの代謝物が包含さ
れる。
次の薬剤群としてはアルキルが２〜３個の炭素原子を
有するアミノアルキルベンゼンがあり、アンフエタミン
類、エフエドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリン、ナルセ
イン、パパベリンおよびそれらの代謝物を含むカテコー
ルアミン類が包含される。
次の薬剤群としてはベンズ異項環類があり、オキサゼ
パム、クロルプロマジン、テグレトール、イミプラミ
ン、それらの誘導体および代謝物が包含され、異項環は
アゼピン、ジアゼピンおよびフエノチアジンである。
次の薬剤群としては、テオフイリン、カフエイン、そ
れらの代謝物および誘導体を包含するプリン類がある。
次の薬剤群としては、カンナビノールおよびテトラヒ
ドロカンナビノールを包含するマリフアナから誘導され
る薬剤がある。
次の薬剤群には、ビタミンA,BたとえばB12,C,D,Eおよ
びK,葉酸ならびにチアミンのようなビタミン類が包含さ
れる。
次の薬剤群としては、ヒドロキシル基および不飽和結
合の数および位置が異なるプロスタグランジン類があ
る。
次の薬剤群としては抗生物質があり、ペニシリン、ク
ロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラサイクリ
ン、テラマイシン、それらの代謝物および誘導体が包含
される。
次の薬剤群としてはヌクレオシドおよびヌクレオチド
があり、ATP,NAD,FMN,アデノシン、グアノシン、チミジ
ンおよびシチジン、それらの適当な糖およびリン酸置換
体が包含される。
次の薬剤群としては雑多な個別の薬剤、たとえばメサ
ドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、アミ
トリプチリン、ノルトリプチリン、リドカイン、プロカ
インアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノロ
ール、グリセオフルビン、バルプロ酸、ブチロフエノン
類、抗ヒスタミン剤、抗コリン剤たとえばアトロピン、
それらの代謝物および誘導体である。
疾患状態に関連した代謝物には、スペルミン、ガラク
トース、フエニルピルビン酸、およびポルフイリンＩ型
が包含される。
次の薬剤群としてはアミノグリコシド類、たとえばゲ
ンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシンおよびア
ミカシンがある。
興味ある有害生物殺滅剤には、ポリハロゲン化ビフエ
ニル類、リン酸エステル類、チオホスフエート類、カル
バメート類、ポリハロゲン化スルフエンアミド類、それ
らの代謝物および誘導体がある。
受容体被検物質の場合は、分子量は一般に10,000から
２×108の範囲、通常10,000から106である。免疫グロブ
リン、IgA,IgG,IgEおよびIgMでは、分子量は一般に約1
6,000から約106まで変動する。酵素では分子量は一般に
約10,000〜1,000,000の範囲である。天然の受容体では
分子量は広範囲に変動し、一般には少なくとも約25,000
で、106またはそれ以上のこともある。このような物質
としては、アビジン、DNA,RNA,サイロキシン結合グロブ
リン、サイロキシン結合プレアルブミン、トランスコル
チン等が挙げられる。
特異的結合ペア構成要素（sbp構成要素）−表面上ま
たは空洞内に、他分子と特異的に結合し、他分子の特定
の空間的および極性的構成と相補性であると定義される
領域をもつ２種の異種分子の一方。特異的結合ペア構成
要素はリガンドおよび受容体（アンチリガンド）とも呼
ばれる。これらは通常、抗原−抗体のような免疫学的ペ
アの構成要素であるが、他の特異的結合ペア、たとえば
ビオチン−アビジンホルモン−ホルモン受容体、核酸二
重鎖、IgG−プロテインＡ、DNA−DNA、DNA−RNA等は免
疫学的ペアではないが、この定義に包含される。被検物
質はsbp構成要素であつてよく、通常sbp構成要素であ
る。
リガンド−受容体が天然に存在するかまたは製造できる
任意の有機化合物 受容体（アンチリガンド）−分子の特定の空間的およ
び極性的構成を認識できる任意の化合物または組成物、
たとえばエピトープまたは抗原決定部位である。受容体
の例には、天然の受容体たとえばサイロキシン結合グロ
ブリン、抗体、酵素、Fabフラグメント、レクチン、核
酸、プロテインＡ、補体成分C1q等がある。
標識sbp構成要素−一般に電気化学的検出または電磁
放射線の吸収もしくは発光が可能な標識、触媒、多くの
場合酵素が結合したsbp構成要素である。標識sbp構成要
素は一般にシグナル生成システムの構成要素である。
抗体−表面上または空洞内に、他分子と特異的に結合
し、他分子の特定の空間的および極性的構成と相補性で
あると定義される領域を有する免疫グロブリンまたはそ
の誘導体もしくはフラグメントである。抗体はモノクロ
ーナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、本技術分
野でよく知られた方法、たとえば、宿主の免疫感作つい
で血清の収集またはハイブリツド細胞系技術によつて製
造できる。
被検物質に対する抗体−被検物質に対して特異的な抗体 類縁被検物質−sbp構成要素、通常は受容体または抗
体への結合において被検物質と競合できる修飾被検物質
または被検物質類縁体もしくは代替物。修飾は、標識sb
p構成要素を提供するため被検物質類縁体を標識に結合
する手段を与える。被検物質類縁体は通常、必ずしも必
須ではないが、少なくとも被検物質類縁体をハブまたは
標識に連絡させる結合で１個の水素が置換されている点
で被検物質とは異なる。被検物質代替物の後は、被検物
質に対する抗体を結合する能力をもつ化合物を意味す
る。すなわち、被検物質代替物は、被検物質に対する抗
体と被検物質と同じ様式で結合できる。一方、代替物は
たとえば、被検物質に対する抗体のイデイオタイプに向
けられた抗体であつてもよい。
吸水性構成要素−孔径少なくとも0.1μ、好ましくは
少なくとも1.0μで、毛細管作用によつて水性メジウム
が貫流または通過できる多孔性物質である。このような
物質は一般に親水性であるか親水性とすることが可能
で、セルロース性物質またはセルロースから誘導される
物質、たとえば濾紙、クロマトグラフ用濾紙等の繊維含
有紙であることが好ましいが、無機粉末たとえばシリ
カ、硫酸マグネシウムおよびアルミナ、その他の天然ポ
リマー材料および合成または改良天然ポリマー、たとえ
ばニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニ
ル）、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロ
ース、ポリアクリレート等の単独または他の物質との結
合物、セラミツク材料等も使用できる。吸水素構成要素
は支持体に付着させてもよい。一方、吸水性構成要素は
それ自体が支持体となるものでもよい。吸水性構成要素
は多官能性であつてもよく、また受容体、抗体、キレー
ト剤、酸化剤、還元剤等の試薬との共有結合によつて多
官能性とすることができてもよい。さらにシグナル生成
システルの部分を形成する他の化合物と結合させること
ができるものであつてもよい。
吸水性材料への受容体リガンドおよび検出剤の結合
は、文献で一般に利用されているよく知られた方法で行
うことができる［たとえば「固定化酵素」（Immobilize
d Enzymes）、Ichiro Chibata著、Halsted Press,New Y
ork（1978）およびCuatrecasas,J.Biol.Chem.,245:3059
（1970）参照］。
吸水性構成要素を形作る吸水性物質片は、ストリツプ
に切断した紙片のように単一構造でもよく、また、たと
えば薄層クロマトグラフイーの場合にみられるように支
持体もしくは固体表面に数個のストリツプもしくは粒子
状物質を結合させ、吸収パツドを一体化部分としてもし
くは液体接触で設けてもよい。吸水性材料は液体授受関
係にあり、好ましくは支持体に結合された数個の区分か
ら構成されていてもよい。吸水性構成要素は、レーンを
有するかまたはレーン編成を導くスポツテイングが可能
で、各レーンにおいて別個の検定ができるシートであつ
てもよい。
吸水性構成要素は、毛細管作用による液体メジウムの
少なくとも１方向への貫流または通過が可能であれば、
矩形、円形、卵形、三角形または他の任意の形状とする
ことができる。卵形または円形片でその中心を試験溶液
と接触させる場合には、他方向への通過を生じてもよ
い。しかしながら、多くの場合は少なくとも１方向への
通過が考慮される。以下の説明においては、吸水性物質
のストリツプについて例示するが、本発明はこれに限定
されるものではない。
支持体が望ましい場合または必要な場合の吸水性構成
要素の支持体は、通常、水不溶性、非多孔性、剛性で、
通常は吸水性構成要素と同長同幅であるが、それより長
くすることも短くすることもできる。支持体が吸水性構
成要素の毛細管作用を妨害したり、検定成分を非特異的
に結合したり、またシグナル産生システムを妨害するこ
とがない限り、天然および合成両者の広範囲の有機およ
び無機化合物、ならびにそれらの配合物を使用すること
ができる。ポリマーの例には、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン、ポリ（４−エチルブテン）、ポリスチレン、ポ
リメタクリレート、ポリ（エチレンテトラフタレー
ト）、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル）、ガラス、セラミ
ツク、金属等が包含される。
吸収性構成要素−任意の多孔性、親水性吸水性物質、
たとえばPorex 等のような多孔性ポリマー、紙、スポ
ンジ、フエルト等、液体を吸収できる物質が、本発明の
方法に使用される。吸収性構成要素には複数個の機能を
もつ。第１の機能は、第１の吸水性構成要素によつて吸
収された液体の貯蔵または収納領域としての役割であ
る。第２の機能は必ずしも必須ではないが、第１の吸水
性構成要素を通過する液体の速度を制御する役割であ
る。吸収性構成要素が、寸法が小さいかまたは第１の吸
水性構成要素と別の材料でできている場合には、液体が
第１の吸水性構成要素を通過する速度を制御するように
作用させることができる。不規則な広がりをもたせるこ
とにより、サンプルまたは試薬溶液の吸収に依存して異
なる速度を与えるように作用させることもできる。
吸収性構成要素の他の機能として吸収された液体量を
測定させることもできる。吸収性構成要素は一定容量の
液体を取り込むことができるものであることが好まし
い。第１の吸水性構成要素から吸収性構成要素に沿つて
連続性の勾配を設けることにより、液体の前線が所定の
位置に来て、メジウムからデバイスと取り出す時期を決
定することができる。また、液体の前線に溶解または接
触して着色する染料を配置して、デバイスを取り出すべ
き時期の明瞭なシグナルを設けることもできる。たとえ
ば、pH指示薬が使用できる。液体前線の存在を明瞭に指
示する任意の方法が使用できる。
ストリツプ形態では、吸収性構成要素の長さは一般に
少なくとも約1.5cm,通常は2cm,約30cm以下、通常は約20
cm以下である。幅は約0.1mmから約3cmまで変動させるこ
とができる。これらの寸法は、主として、吸収される溶
液の割合および量の制御、取扱い上の便宜および溶媒前
線の観察を容易にするためのものである。厚さは一般に
約0.1mmから5mm,通常は約0.5mmから3mmである。パツド
形態の場合、吸水性構成要素は一般に、厚さ0.5〜10mm,
面積25〜150mm2とする。
吸収性構成要素は、便利には透明なまたは部分的にも
しくは場合により完全に不透明な封入体の保護ケース中
に部分的にまたは完全に封入することもできる。吸収性
構成要素はサンプル溶液と直接接触してはならない。通
常は、被検物質を含む溶液の最小限または通常は特定の
容量が第１の吸水性構成要素を貫通することが必要であ
る。これは吸収性構成要素と検定サンプル溶液の接触を
回避することによつて最も好都合に達成される。
採用された特定のプロトコールおよびデバイスの構成
により、封入体は除去可能でも除去不能でもよく、吸収
性構成要素のみを封入してもさらに第１および第２の吸
水性構成要素を封入してもよく、１個もしくは２個以上
の窓部を設けてもよく、また通常は、吸水性構成要素を
機械的に保護し、検定の実施を妨害しない丈夫な、不活
性の、非透過性材料で作られる。通常は封入体内に空気
が捕集されないように通気孔を設ける。
標識−標識は、シグナルの生成に必要なsbp構成要素
に結合した任意の分子である。本発明においては、標識
は不活性で単にシグナル生成手段の構成要素の結合部位
として作用するものでもよく、またそれ自体検出可能な
シグナルを生成しても、シグナル生成手段と協同して検
出可能なシグナルを生成してもよい。標識は同位元素で
も非同位元素でもよいが、非同位元素であることが好ま
しい。しかしながら、写真フイルムによるオートラジオ
グラフ検出を用いる同位元素標識は高感度の達成に好ま
しい。
シグナル生成手段−標識と相互作用して検出可能シグ
ナルを生成できる手段。このような手段には、たとえ
ば、電磁放射線、熱、化学試薬等が包含される。化学試
薬を使用する場合、一部の化学試薬は現像溶液の部分と
して包含させることができる。化学試薬には、基質、補
酵素、エンハンサー、第２の酵素、アクテイベーター、
補因子、インヒビター、スカベンジヤー、金属イオン、
シグナル発生物質の結合に必要な特異的結合物質等が包
含される。補酵素、酵素産生物と反応する物質、他の酵
素および触媒等、一部の化学試薬はストリツプに結合さ
せることができる。
シグナル生成システム−シグナル生成システムは１種
または２種以上の成分を有してもよい。シグナル生成シ
ステムは、標識および標識と相互作用してシグナルを生
成できるシグナル生成手段を含む、測定可能シグナルの
生成に必要な試薬のすべてを包含する。
シグナル生成システムは、通常は電磁放射線の測定に
より、望ましくは視覚的検査により、外的手段で検出で
きるシグナルを提供する。多くの場合、シグナル生成シ
ステムは、発色団物質が酵素的に、紫外もしくは可視領
域の光を吸収する染料へ変換する発色団物質と酵素、リ
ン光体もしくは蛍光体、またはキレート剤、酸化還元指
示薬、pH指示薬等のような発色団指示薬を包含する。
シグナル生成システムには、標識として少なくとも１
種の触媒、通常は酵素、および少なくとも１種の基質を
包含し、２種または３種以上の触媒と複数個の基質を含
んでいてもよく、また１つの酵素の基質が他の酵素の生
成物である酵素の組合せを含んでいてもよい。シグナル
生成システムの操作により、サンプル中の被検物質の存
在または存在量に関連した検出可能シグナルを与える生
成物が生成する。
２種の触媒は、１種の酵素と１種の非酵素触媒または
２種の酵素の組合せとして用いられ、２種の触媒は一方
の生成物が他方の基質の関係にある。このシステムにお
いては、これらの触媒によつて接触される連続的変化を
受けて、検出可能なシグナルの生成に関与する化合物を
生じる唯一の基質が必要である。しかしながら、多くの
場合、この系列における第１の酵素に対する基質と、シ
グナルの生成に関与する化合物に対して前駆体と作用し
て通常はシグナルを生成する化合物を与える第２の化合
物とが用いられる。すなわち、第１の酵素の生成物は、
シグナルを発生する化合物を提供するため、シグナル生
成化合物に対する前駆体と反応する。
２種の酵素を用いる場合、関連する反応は多くの場
合、加水分解または酸化還元反応である。加水分解の場
合、加水分解に不安定な結合を有する誘導染料前駆体、
加水分解酵素および遊離された染料前駆体を染料変換生
成物への変換を触媒する酵素がこのタイプのシステムの
例である。酸化還元反応では、第１の酵素が第２の酵素
の要求する必須酸化生成物を生成することができ、第２
の酵素が酸化物質と染料前駆体との間の反応を触媒す
る。
２種の酵素を使用する場合、第１の酵素反応は基質の
加水分解切断または酸化還元反応で、他の酵素の基質で
ある生成物を与える。第１の段階では、たとえば、グル
コース−６−ホスフエートがアルカリホスフアターゼに
よつて接触的にグルコースに加水分解される。グルコー
スはグルコースオキシダーゼの基質である。第２の段階
では、たとえば、グルコースがグルコースオキシダーゼ
によつて酸化されて過酸化水素を与え、これが酵素的に
白色染料と反応してシグナル発生体を生成する。
触媒の組合せは酵素と非酵素触媒とを包含するもので
あつてもよい。酵素が非酵素触媒によつて触媒される反
応を受ける反応原料を生成するか、または非酵素触媒が
酵素に対する基質（補酵素を含む）を生成する。使用で
きる広範囲の非酵素触媒が米国特許第4,160,645号に記
載されている。
シグナル発生化合物を得るには様々な酵素の組合せを
使用できる。とくに、ヒドロラーゼの組合せは、不溶性
のシグナル発生体を生成するのに使用できる。別法とし
て、ヒドロラーゼとオキシドレダクターゼの組合せでも
シグナル発生化合物を提供できる。オキシドレダクター
ゼの組合せも不溶性のシグナル発生体を生成させるため
に使用できる。
酵素の組合せでは、一方の酵素は吸水性構成要素、第
１もしくは第２の吸水性構成要素に非拡散性に結合さ
せ、他方の酵素は被検物質に結合させる標識とすること
もできる。さらに選ばれた特定のシグナル生成システム
または特定のプロトコールによつては、シグナル生成シ
ステムの１種もしくは２種以上の他の構成要素を吸水性
材料に結合させることができる。
検定によつては、検出可能なシグナルを得るために、
吸水性部位上のある領域における標識の存在によつて生
じるシグナル構成要素を増幅する手段の提供が必要であ
る。したがつて、通常、標識は触媒、化学発光化合物ま
たは放射性同位元素とすることが好ましく、とくに触媒
とすることが好ましい。触媒は、シグナル標識から多数
のシグナル発生分子を生成できる酵素および補酵素であ
ることが好ましい。
光を吸収するたとえば染料または照射によつて光を放
出するたとえば蛍光体のような生成物を生成することに
よつて所望の増幅が得られる酵素または補酵素が用いら
れる。また、触媒反応が光の放出たとえば化学発光を生
じるものであつてもよい。このような生成物を与える多
数の酵素および補酵素が米国特許第4,275,149号の第19
欄から第23欄にわたつて、また米国特許第4,318,980号
第10欄〜第14欄に示されている。
多数の酵素の組合せが米国特許第4,275,149号第23欄
から第28欄に挙げられていて、これらの組合せは本発明
に使用できる。
とくに興味があるのは、過酸化水素の生成を包含する
酵素と、染料前駆体を染料へ酸化する過酸化水素の使用
である。特定の組合せは、糖オキシダーゼたとえばグル
コースおよびガラクトースオキシダーゼまたは異項環オ
キシダーゼたとえばウリカーゼおよびキサンチンオキシ
ダーゼと、過酸化水素を使用して染料前駆体を酸化する
酵素、すなわちペルオキシダーゼたとえば西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼまたはミクロ
ペルオキシダーゼとの組合せがある。その他の酵素の組
合せは上に引用した特許の主題として認めることができ
る。単一の酵素を標識として用いる場合、他の酵素、た
とえばヒドロラーゼ、トランスフエラーゼおよびオキシ
ドレダクターゼ、好ましくはアルカリホスフアターゼお
よびβ−ガラクトシダーゼのようなヒドロラーゼが使用
できる。また、ルシフエラーゼ、たとえばホタルルシフ
エラーゼおよび細菌ルシフエラーゼも使用できる。
使用できる補酵素の例には、NAD［Ｈ］;NADP［Ｈ］、
ピリドキサールホスフエート;FAD［Ｈ］、FMN［Ｈ］
等、通常、環化反応が関与する補酵素が包含される（と
くに米国特許第4,318,980号参照）。
酵素反応の生成物は通常、染料または蛍光体である。
多数の蛍光体の例が、米国特許第4,275,149号第30欄お
よび第31欄に示されている。
液体授受関係−液体が一方の吸水性構成要素から他方
に通過できるとき、２つの吸水性構成要素は液体授受関
係にある。この関係は直接でも間接でもよい。直接的な
液体授受関係は、一方の構成要素からの液体が毛細管作
用によつて他方の構成要素へ通過し、一方から他方へ引
き付けるように２種の構成要素を互いに接触させること
によつて実現される。間接的な液体授受関係は、液体が
一方から他方に通過できるように２種の構成要素を近接
した位置に置くことによつて実現される。２種の構成要
素は、不活性で液流に抵抗を与えない多孔性空間によつ
て分離することができる。一方、または多孔性空間と結
合させて、液流抵抗性構成要素を用い２種の構成要素の
間の液の流速を制御することもできる。２種の構成要素
の空間的方向性を用いて、液体授受関係を達成すること
もできる。
免疫クロマトグラフ−免疫クロマトグラフは、吸水性
支持体の一定領域にsbp構成要素、リガンドまたは受容
体が結合されていて、液体が毛細管作用によつて、被検
物質および必要に応じてシグナル生成システムの任意の
構成要素を伴いその領域を通過し、移動できるように配
置されている。sbp構成要素は支持体に、共有結合また
は非共有結合によつて非拡散的に結合されている。sbp
構成要素が均一に結合している領域は「免疫吸着領域」
とも呼ばれる。さらに、シグナル生成システムの１種ま
たは２種以上の構成要素が吸水性構成要素に、共有結合
または非共有結合によつて非拡散性に結合されていても
よい。さらに、標識に対する反応体たとえば酵素の基質
を支持体に結合させることもできる。
成分−関心分子であり、その量が本発明の一態様によ
つて測定される。成分は、無機イオン、陽イオンまたは
陰イオンのような無機イオンであつてもよく、たとえ
ば、リチウム、カリウム、ナトリウム等のようなアルカ
リ金属イオン、マグネシウム、カルシウム等のようなア
ルカリ土類金属イオン、銅、コバルト、マンガン、アル
ミニウム、鉄（第一鉄または第二鉄）、クローム、ニツ
ケル、亜鉛、カドミウムイオン等、非金属イオンたとえ
ばハロゲン（塩素、臭素、フツ素、ヨウ素等）イオン、
酸化物、硫化物、硫酸塩、亜リン酸塩、リン酸塩、セレ
ン化物、酸化ハロゲンたとえばヨウ素酸塩、過ヨウ素酸
塩、塩素酸塩、次亜塩素酸塩等のイオンが包含される。
一般に、相互作用できる試薬が存在し比色的に、好まし
くはその無機分子と反応して分光学的変化を与える化合
物との反応によつて検出できる任意の無機分子が、本発
明よつて定量できる。
成分は、結合パートナーのような相互作用できる試薬
たとえばsbp構成要素が存在し比色的に、好ましくはそ
の有機化合物と反応して分光学的変化を与えることがで
きる化合物との反応によつて検出できる任意の有機分子
であつてもよい。成分は検定においてそれ自体が測定さ
れてもよいし、また被検物質の検定に用いられる化合物
であつてもよい。代表的な有機分子成分には、酵素基質
たとえばグルコース、エタノール、コレステロール、ア
ラビニトール、尿素、乳酸、アミノ酸、トリグリセライ
ド等；還元剤たとえばアスコルビン酸、尿酸、メルカプ
タン、ハイドロキノン等；酸化剤たとえばキノンおよび
ジスルフイド；リガンド−標識抱合体；受容体−標識抱
合体等が包含される。被検物質ならびに成分および成分
と相互作用する試薬すべてを定量的に測定できること
が、本発明の一態様の重要な特徴である。
成分と相互作用できる試薬−成分と化学的または物理
的に、化学量論的に相互作用できて、第１の吸水性構成
要素領域に結合されたまた結合できる物質。化学的相互
作用とは一般に、試薬が化学結合を切断または形成して
成分を他の物質に変換でき、それ自体新しい化合物に変
換することを意味する。物理的相互作用とは一般に、試
薬が化学的以外の様式で成分と化学量論的に相互作用す
ることを意味する。たとえば、試薬は、成分と、水素結
合の形成、静電的相互作用、疎水性相互作用等によつて
特異的に結合するリガンドまたは受容体であつてよい。
試薬はまた、無機または有機分子であつてもよい。無機
分子の例には、金属もしくは非金属イオン、酸化剤およ
び還元剤、遷移金属ハライド、有機水銀ハライド等があ
る。有機分子の例としては、キレート剤、sbp構成要
素、ジアゾニウム塩、キノン、ヨードソ化合物、ジスル
フイド、ヨードアセトアミド、ハイドロキノン、ヒドロ
キシアニリン、ベンチジン、ヒドラジド、パラコート等
を挙げることができる。
相互作用には、酸化もしくは還元たとえば無機分子の
酸化もしくは還元、直接共有結合の形成、またはキレー
ト形成、求電子もしくは求核性置換を含む配位金属−リ
ガンド結合形成、付加環化等が包含される。
第１領域とは異なる組成−第２の吸水性構成要素また
は第２領域の組成は、第１の吸水性構成要素または第１
領域の組成と異なるものでなければならない。以下に、
異なる組成の実際を例示的に説明するが、これに限定さ
れるものではない。他の例も本技術分野のの熟練者には
容易に想到できるところであろう。このような例には第
２の吸水性構成要素は化合物または被検物質と相互作用
する物質を結合させない場合がある。他の例には、第２
の吸水性構成要素が、成分または成分と試薬の反応で生
成する生成物と反応し、第１の吸水性構成要素上の試薬
とは異なる物質を含有する場合がある。他の例には、第
１の吸水性構成要素の試薬が第２の吸水性構成要素上に
もあるが、両構成要素上のそれぞれの濃度は異なる場合
がある。
補助材料−本発明の検定には様々な補助材料が使用さ
れることが多い。たとえば、検定メジウム中には緩衝剤
ならびに安定化剤が通常、添加される。これらの添加剤
のほかに、しばしば、付加的タンパク質たとえばアルブ
ミン、または界面活性剤とくに非イオン界面活性剤、結
合エンハンサーたとえばポリアルキレングリコール等が
包含される。
上述のように、検定を実施するための本発明の一方法
によれば、第１の吸水性構成要素領域（「第１領域」）
と成分を含有する液体メジウムの組合せが提供される。
第１領域には上記成分と相互作用する試薬が非拡散性に
結合されている。条件は、液体メジウムが第１領域のす
べてを通過し、そこに含有された成分の少なくとも部分
がすべての試薬と反応し、したがつて第１領域のすべて
を通過して液体メジウムの毛細管移動によつて、第１領
域とは組成の異なる第２の吸水性構成要素領域（「第２
領域」）内へ輸送されるように選択される。成分が第２
領域内へ移動する距離または液体メジウムと成分が第２
領域内へ移動する距離の差を測定する。距離または差は
液体メジウム中の成分量または試薬量に相関する。これ
らの物質の一方の量の測定が所望の場合は、他の物質の
量は予め決定され、移動距離を既知カリブレーターで得
られた距離と関連づけることになる。移動距離は、第２
領域を適当な検出剤と接触させることにより、成分の存
在に関連して第２領域上に検出可能なシグナルを生成さ
せる適当な検出剤を第２領域上に存在させるか結合させ
ることにより、または第２領域上の成分を直接検出する
ことにより、検出できる。
検定は成分濃度または試薬濃度を測定するように配置
することもできる。
上述のように、液体メジウムと第１領域の組合せに先
立つて、第１領域を試薬含有溶液と接触させることによ
り、試薬を第１領域に非拡散的に結合させることができ
る。先に定着した差または距離は、溶液中の試薬量に関
連させることができる。さらに、試薬の溶液中の被検物
質の量に試薬量を関連させることができる。
本発明の一態様における新規な特徴は、前述のエスケ
ーパー容量の測定方法にある。第１領域を通過した液体
は第２領域に入り、この領域に取り込まれた容量がこの
領域に沿つた液体の移動距離に関連する。適当容量の液
体が第２領域に入つたのち、成分を含有する領域と有意
な濃度の成分を欠く領域を画する境界が得られる。液体
がこの領域に沿つて移動した距離と境界によつて画され
た成分がこの領域に沿つて移動した距離とを測定すると
エスケーパー容量の測定が可能になる。第２領域の長さ
がすべての検定について同一で、第１領域を通過した容
量が丁度第２領域を満たした場合には、移動距離すなわ
ち境界までの距離を測定するだけでエスケーパー容量の
測定に十分である。
移動距離は、第２領域上の成分の直接検出により、ま
たは第２領域を適当な検出剤と接触させることにより決
定できる。この検出剤が前もつて存在しない場合には、
この検出剤が成分の存在に関連する検出可能シグナルを
第２領域上に生成することになる。検出剤は成分と化学
的に相互作用して通常、可視シグナルたとえば色を生成
する物質とすることができる。検出剤はシグナル生成シ
ステムの一構成要素であつてもよい。一般に、検出剤は
検定成分または検定成分と試薬の反応生成物と反応し、
この反応で分光学的に検出できる変化が生じる。代表的
な検出剤は、キレート剤たとえばフエナンスロリン類、
カルボキシピリドン類、フエノール類、β−ジケトン類
等、酸化剤たとえばキノン類、セリウムイオン類、二酸
化マンガン、過ヨウ素酸塩、クロム酸塩、ジスルフイ
ド、テトラゾリウム塩類等、還元剤たとえば白色染料、
メルカプタン類、チオ硫酸塩類、ハイドロキノン類、ベ
ンチジン類等、触媒たとえば酵素、補酵素、補欠分子
団、メドラブルー等、酵素基質等である。
第１領域と第２領域は単一の吸水性構成要素に一体化
することができるが、２つの領域は液体メジウムが第２
領域に接触する前に第１領域を通過するように配置さ
れ、また２種の領域は組成の異なるものでなければなら
ない。一方、第１領域は第１の吸水性構成要素と一体化
し、第２領域は第２の吸水性構成要素と一体化すること
ができる。この場合、第１の領域はたとえば、第１領域
と液体メジウムの組合せを提供する前に、第２領域と液
体授受関係に配置する。本発明のこの局面に対して便利
なデバイスを第１図に示す。
成分と試薬はそれぞれ、特異的結合ペアの構成要素で
あつてもよい。たとえば、成分は酵素標識リガンド類縁
体であり、試薬はそのリガンドに対する抗体とすること
ができる。この方法はリガンドである被検物質の量の測
定も包含する。
前述のように、成分と試薬は化学的に相互作用または
物理的に相互作用するものとすることができる。この方
法は無機、有機、両分子の定量に応用可能である。
本発明のこの定量的局面における他のアプローチは、
第１の吸水性構成要素領域（「第１領域」）の成分含有
液体メジウムとの接触を包含する。第１領域には成分と
相互作用する試薬が非拡散性に結合している。接触は、
液体メジウムおよびそれに含まれる成分の少なくとも部
分が第１領域のすべてを通過し、第１領域とは組成の異
なる第２の吸水性構成要素領域（「第２領域」）内に毛
細管作用によつて移動するような条件下に行われる。成
分が第２領域内に移動した距離またはメジウムと成分が
第２領域内に移動した距離の差を測定すると液体メジウ
ム中の成分の量の決定が可能になる。
本発明のこの局面における他のアプローチは、被検物
質の溶液と、被検物質と反応できる試薬が非拡散性に結
合しているかまたは結合する第１の吸水性領域との組合
せを包含する。次に、試薬と相互反応する成分を含有す
る液体メジウムを第１の吸水性構成要素と合する。第１
の吸水性構成要素は第２の吸水性構成要素と液体授受関
係に置かれる。条件は、液体メジウムが毛細管作用によ
つて第１の吸水性構成要素と少なくとも第２の吸水性構
成要素の部分を通過するように選択される。第２の吸水
性領域上に境界が決定される。境界の位置は、溶液中の
被検物質の量または第１の吸水性構成要素上の試薬量も
しくは液体メジウム中の成分量に相関する。たとえば、
被検物質は薬剤であり、試薬は薬剤に対する抗体であ
り、成分は酵素標識薬剤類縁体とすることができる。
他のアプローチにおいては、第１の液体メジウム中、
（１）第１の吸水性構成要素と（２）被検物質からな
り、被検物質に対する試薬がメジウム中または第１の吸
水性構成要素上に存在する組合せが提供される。第１の
吸水性構成要素は吸収性構成要素と液体授受関係に置
く。条件は、第１のメジウムが第１の吸水性構成要素と
少なくとも吸収性構成要素の部分を毛細管作用によつて
貫流し、試薬および通常は被検物質が吸収性構成要素に
非拡散性に結合するような条件が選択される。すなわ
ち、第１の液体メジウムは、第１の構成要素のすべてと
接触させて一度に第１の構成要素を貫流させるか、また
は第１の吸水性構成要素の部分とのみ接触させることが
できる。後者の場合、メジウムは毛細管作用によつて構
成要素の残部を通過する。ついで吸水性構成要素と吸収
性構成要素の間の液体授受関係を停止させる。第２の液
体中、第１の吸水性構成要素の部分と試薬と相互作用す
る成分とからなり、第１の吸水性構成要素は第２の吸水
性構成要素と液体授受関係にある組合せを提供する。条
件は、第２のメジウムが第１の吸水性構成要素と少なく
とも第２の吸水性構成要素の部分を毛細管作用によつて
通過するように選択される。ただし、第１の吸水性構成
要素は、吸収性構成要素および第２の吸水性構成要素と
は実質的に異なる時期に液体授受関係に置かれる。次
に、第２の吸水性構成要素上に境界が決定される。境界
の位置は、第１のメジウム中の被検物質の量、または試
薬の量、もしくは第２の液体メジウム中の成分の量に相
関する。
本発明の他の局面においては、方法は、第１の吸水性
構成要素を第１の液体メジウムもしくは溶液と接触させ
ることにより、第１のメジウム中のsbp構成要素のよう
な試薬を第１の吸水性構成要素に結合させることからな
る。第１吸水性構成要素は吸収性構成要素と液体授受関
係に置く。条件は、第１のメジウムが毛細管作用によつ
て、第１の吸水性構成要素および少なくとも吸収性構成
要素の部分を通過または貫流するように選択される。第
１の吸水性構成要素の機能は、試薬を定量的かつ強固に
結合することである。試薬は、関心被検物質の既定の最
小検出可能量に応じて、一定量または既定量が結合され
ねばならない。一般に、結合される試薬は、第１の吸水
性構成要素を通過する被検物質または成分の量の20分の
１以上または20倍未満である。多くの場合、第１のメジ
ウムまたは溶液中のすべての試薬が結合される。
本発明における−アプローチでは、第１の液体、通常
は水性のメジウム中または溶液中、（１）その部分にsb
p構成要素のような第１の試薬が非拡散性に結合した第
１の吸水性構成要素と（２）被検物質の含有が疑われる
サンプルとを含む組合せが提供される。被検物質が第１
の試薬に結合できない場合は、被検物質および第１の試
薬に結合できる第２の試薬をメジウム中または第１の吸
水性構成要素上に存在させる。
組合せは、多数の順序のひとつで形成させることがで
きる。たとえば、第１の吸水性構成要素に第１の試薬を
結合させることができる。第１の吸水性構成要素の部分
（「接触部分」）を、被検物質を含む第１のメジウムま
たは溶液と接触させる。サンプルが被検物質を含む水性
メジウムである場合には、サンプルが第１のメジウムま
たは溶液の一部またはすべてを占めることができる。基
本的に考慮すべき点は、第１のメジウム中サンプルと第
１の吸水性構成要素たとえばストリツプの部分上第１の
試薬との組合せを提供し、毛細管作用によつて構成要素
を貫流または通過させることである。この移動は上方方
向、下方方向、水平方向またはそれらの組合せとするこ
とができる。第１の吸水性構成要素に沿つてまたはそれ
を貫く第１のメジウムの移動は、第１の吸水性構成要素
と液体授受関係にある吸収性構成要素によつて駆動させ
ることができる。このような駆動または浸透型作用は、
第１の吸水性構成要素の化学的活性部分に接触する液体
の制御を改善する。
被検物質が第１の試薬に結合できない場合には、被検
物質と第１の試薬に結合できる第２の試薬を、第１のメ
ジウムもしくは溶液中または第１の吸水性構成要素上に
存在させる。第２の試薬が第１の吸水性構成要素上にあ
る場合には、一般に拡散性に結合させ、したがつて水性
メジウムとの接触により第２の試薬は第１のメジウム中
に拡散される。この拡散は第１の吸水性構成要素に沿つ
た第１のメジウムによる移動中に起こる。
上述のように、第２の試薬は、被検物質および第１の
試薬に結合する性質を有する。被検物質と第１の試薬が
同一または類縁体である場合には、第２の試薬は、被検
物質または被検物質類縁体に対するsbp構成要素のよう
な結合パートナーとすることができる。しかしながら、
第１のsbp構成要素は被検物質または被検物質類縁体以
外のものであつてもよい。第１の試薬の機能は、サンプ
ル中の被検物質の量に関連して、被検物質または第２の
試薬に結合することである。したがつて、第１の試薬が
被検物質または被検物質類縁体と結合しない場合には、
第１の試薬は第２の試薬に対する結合パートナーである
ように選択される。このような場合には、第２の試薬は
２つの組成、すなわち被検物質に結合できる組成たとえ
ば第２のsbp構成要素、および第１の試薬に結合できる
組成たとえば第３のsbp構成要素をもつことになる。被
検物質に結合できる組成は被検物質に相補性で、被検物
質に対するsbp構成要素たとえば抗体である。第２の試
薬の他の部分は、分子量1500未満、好ましくは250以上
の小有機分子であつてもよい。この場合の第１の試薬
は、被検物質に相補性の成分または小有機分子に相補性
のsbp構成要素であつてよい。すなわち、第１の試薬は
たとえば、抗体に対する抗体または小有機分子に対する
抗体である。小有機分子の例には、ビオチン、フルオレ
セイン、LSD,モルフイン、ベンゾイルエクゴニン等があ
る。
吸水性構成要素に結合する第２の試薬の量は、相当す
る被検物質の既定の最小検出可能量またはそれを越える
量でのサンプル中の存在に関連する。この最小検出可能
量は一般に被検物質が存在するとみなされる以上の量で
ある。たとえば薬剤の場合、興味があるのは薬剤がある
濃度範囲で存在するときだけである。薬剤がサンプルま
たは試験溶液中にその範囲以下に存在しても、その濃度
は最小検出可能量またはそれ以上ではないので存在する
とみなす必要がない。
水性メジウムまたは溶液および液体メジウムは、約40
重量％までの他の極性溶媒とくに１個から６個まで、さ
らに通常は１個から４個までの炭素原子を有する酸素含
有溶媒、たとえばアルコール、エーテル等から構成され
る。通常、約20重量％未満の補溶媒が存在することもあ
る。サンプルの性質によつては、水性メジウムの一部ま
たはすべてがサンプル自体によつて与えられる場合もあ
る。また場合によつては、極性または非極性有機溶媒の
非水溶液または液体メジウムを用いることもできる。こ
れは、たとえば、水が検定における物質の反応に不必要
な場合、または水がこのような物質の活性に有害な場合
が挙げられる。
水性メジウムを使用する場合、メジウムのpHは通常４
〜11の範囲であり、さらに通常は５〜10、好ましくは約
６〜９の範囲である。pHは検定に関与する相互作用を促
進するように、たとえば結合構成要素の結合親和性を有
意なレベルおよびシグナル生成システムによるシグナル
の至適発生を維持するように選択される。所望のpHを達
成し、検定時そのpHを維持するためには、様々な緩衝剤
が使用できる。緩衝剤の例としては、ホウ酸塩、リン酸
塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等がある。使用され
る緩衝剤にはとくに制限はないが、個々の検定ではある
緩衝剤が他の緩衝剤より好ましいことがある。
場合によつては、サンプルとともに約0.05〜0.5重量
％の非イオン界面活性剤を添加することが望ましい。約
200〜20,000ダルトンの各種ポリオキシアルキレン化合
物が使用できる。
検定の実施に際しては、中等度、望ましくは実質的に
一定の温度が使用される。検定および検出可能なシグナ
ルの生成に際しての温度は一般に約４〜50℃の範囲、通
常は約10〜40℃、多くの場合は室温、すなわち約15〜25
℃である。
検定される成分または被検物質の第１の水性メジウム
または溶液中の濃度は一般に、約10-4〜約10-15M、通常
は約10-6〜10-14Mを変動する。
他の試薬の濃度は通常、成分または関心被検物質の濃
度およびプロトコール等を考慮して決定される。
サンプルおよび試薬溶液中の各種試薬の多くの濃度は
一般に、成分および／または被検物質の関心濃度範囲に
よつて決定されるが、少なくとも一部の試薬の最終濃度
は、関心範囲における検定の感度を最適にするように経
験的に決定される。ある種のプロトコールでは、個々の
試薬を、検定の感度に悪影響を与えることなく、かなり
過剰に使用することができる。
第１の吸水性構成要素としてストリツプが用いられる
場合、ストリツプの大きさはいくつかの因子によつて決
定される。第１の因子は、十分な量の被検物質または試
薬もしくは成分が捕捉され、その結果、感度が高く正確
な検定を達成するために十分なシグナルが得られること
である。この点に関しては、メジウムが第１の吸水性構
成要素を貫流し、第１の吸水性構成要素と第２の吸水性
構成要素が液体授受関係に置かれる以前に、吸収性構成
要素内に流れることにより、第１の吸水性構成要素上の
すべての利用可能な結合部位を満たして被検物質または
試薬を濃縮させることができるので、本発明の質的な面
では、感度の上昇が与えられる。一般に、上昇法ストリ
ツプの場合、液体保持容量は通常１μ以上、好ましく
は少なくとも５〜200μである。下降法ストリツプの
場合、保持容量は最低１〜20μとすることができる
が、５〜200μが好ましい。
ストリツプの厚さにはとくに制限はないが、一般には
0.05〜2mm、通常は0.1〜1mm、好ましくは0.2〜0.7mmで
ある。一般に厚さの下限は材料の強度および容易に検出
可能なシグナルの生成のための要求によつて決定され、
一方、幅の上限は取り扱いの便宜および試薬の価格によ
つて決定される。
試薬を節約し、限られた量のサンプルに対応するため
には、ストリツプの幅は一般に比較的狭くされ、通常は
20mm未満、好ましくは10mm未満である。一般には、スト
リツプの幅は約1.0mm以上とし、通常約2mm〜12mmの範
囲、好ましくは約4mm〜8mmである。
ストリツプの長さは、被検物質または成分もしくは試
薬の濃度、および実用上の問題たとえば取り扱いの容易
さおよびストリツプ上の部位数によつて決定され、約0.
5cm〜40cm、通常約1cm〜25cm,好ましくは約４〜20cmで
あるが、実用的な任意の長さとすることができる。スト
リツプの構造は広く変動させることが可能で、細、中等
度細、中等度、中等度粗および粗を使用できる。一般
に、孔径が小さくて、材質が微細であるほど、毛細管移
動は遅く、ストリツプ上への所望の試薬の捕集効率は高
くなる。材質が粗く孔径が大きい材料ほど流速は早くな
るが、捕集効率は低下する。材料の多孔度の選択は、与
えられた検定での成分の結合率に依存する。孔径は液流
を制限するほど小さくはなく、たとえば血清が関心サン
プルの場合には血清を吸蔵するほど大きくてはいけな
い。適当な選択により、本発明の利点のひとつである洗
浄工程の必要性の回避が可能になる。
ストリツプの断面の寸法は、矩形の場合について上述
の説明で述べたとおりであるが、これは単なる例示であ
つてそれに限定されるものではない。上述のように、他
の形状たとえば円形、三角形、卵形等も本発明の範囲内
に包含される。それらの寸法は、本明細書の開示を参考
に本技術分野の熟練者には容易に決定できるものであ
る。
検出システムたとえばシグナル生成システムの構成要
素である他の試薬の濃度は、特定のプロトコールおよび
それらのシグナル生成における役割によつて広範囲に変
動できる。通常、第１の吸水性構成要素上の試薬たとえ
ば第１のsbp構成要素は、その接触部分と吸収性構成要
素の間の少なくとも部分に均一もしくは均等に結合さ
れ、その量は成分または被検物質の予め定められた最小
検出可能量によつて決定される。通常、この量は検定さ
れる成分または被検物質の最大量の104倍以下、検定に
用いられる第１の試薬のような試薬の最小量にほぼ等し
い量以上である。試薬の最小濃度は、成分の最小検知可
能量を参考に決定される。この量は検出の感度に依存
し、10-19モル〜10-6モル、通常は10-18〜10-10モルで
ある。第１の試薬が第２の試薬の捕集に用いられる場合
には、第１の吸水性構成要素上の第１の試薬の量は、第
２の試薬の予め定められた量のみが結合されるように選
択することができる。
被検物質の検定を実施する場合には、プロトコールは
通常、水性メジウム中、被検物質の含有が疑われるサン
プルと第１の試薬の組合せの形成を包含する。サンプル
は広範囲の材料、たとえば唾液、血液、血清、血漿、
尿、接眼レンズ液、脊髄液等の生理的液体、ミルクおよ
びワインのような食品、化学処理用水、食品廃水等から
誘導される。
第１の吸水性構成要素の接触部分または全体は、通常
メジウム中に接触部分を浸すような浸漬によつて、第１
のメジウムと接触させる。しかしながら、第１の吸水性
構成要素と第１の液体メジウムまたは溶液の接触は、他
の方法たとえば第１の吸水性構成要素上に第１のメジウ
ムを点滴することによつても実施できる。この方法はと
くに、ストリツプ様、円形、卵形、シート状等の第１の
吸水性構成要素に適用される。毛細管作用による第１の
吸水性構成要素の湿潤は、定められた容量のメジウムが
吸水性構成要素を通過するまで継続される。一般に第１
のメジウム少なくとも20μ，通常は少なくとも50μ
，多くの場合少なくとも100μが吸水性構成要素を
通過する。吸水性構成要素を通過する第１のメジウムの
上限は一般に、実用上の問題から、たとえばデバイスの
サイズによつて決定される。
実用上、第１のメジウムが第１の吸水性構成要素を通
過する時間は比較的短いことが望ましい。一般に、第１
のメジウムが第１の吸水性構成要素を通過するに要する
時間は少なくとも30秒、１時間以下であり、通常は約１
分〜30分であるが、24時間程度の長時間も使用できる。
第１のメジウムが第１の吸水性構成要素と少なくとも
吸収性構成要素の部分を通過したのち、または第１の吸
水性構成要素の全体を第１のメジウムと接触させたの
ち、第１の吸水性構成要素を第２の吸水性構成要素と液
体授受関係に置く。好ましい態様においては、第１の吸
水性構成要素は、吸収性構成要素および、毛細管作用に
よつて液体の移動が可能なクロマトグラフ構成要素たと
えば免疫クロマトグラフ構成要素と、実質的に異なる時
期に液体授受関係に置く。さらに好ましくは、第２の吸
水性構成要素と第２のメジウムの間の液体授受関係を設
立する前に、第１の吸水性構成要素と吸収性構成要素の
間の液体授受関係を停止させる。第１の吸水性構成要素
と一方では吸収性構成要素および他方では第２の吸収性
構成要素との間の関係は、物理的もしくは機械的手段ま
たはそれらの組合せによつて設立しまた停止させること
ができる。
第２の吸水性構成要素の部分を第２の液体、通常は水
性のメジウムと接触させる。第２のメジウムは第１の吸
水性構成要素と少なくとも第２の吸水性構成要素の部分
を毛細管作用によつて通過する。第２のメジウム中の成
分は、第１のメジウム中の被検物質の存在に関連して第
２の吸水性構成要素に非拡散性に結合される。第２の吸
水性構成要素には検出剤を結合させておくこともでき
る。
本発明の方法は、被検物質、試薬または成分の定性的
結果または定量的測定を与えることができる。本発明に
より定性的結果を得るためには、第１の吸水性構成要素
と第２の吸水性構成要素の間の液体授受関係は、成分ま
たは被検物質が第１の吸水性構成要素上に濃縮されたの
ちにはじめて確立させる。定量的測定のためには、第２
の吸水性構成要素はクロマトグラフ構成要素たとえば免
疫クロマトグラフ構成要素とすることができる。試薬が
用いられる一態様においては、成分はたとえば、酵素と
被検物質類縁体との抱合体とすることができる。サンプ
ル中の被検物質の存在または存在量に応じて成分は、第
１の吸水性構成要素に非拡散性に結合した試薬に結合す
る。被検物質がサンプル中に最小検出可能量以上存在す
ると、比例した量の成分が第１の吸水性構成要素に結合
しないで第２の吸水性構成要素に通過するように第１の
試薬の量が選択される。場合によつては、第２の吸水性
構成要素に、成分の結合パートナーを含有させてもよ
い。成分が酵素標識被検物質類縁体である場合には、こ
の結合パートナーは抱合体の酵素部分または抱合体の被
検物質類縁体部分に結合する。したがつて、この結合パ
ートナーは、酵素に対する抗体または被検物質類縁体に
対する抗体であつてもよい。成分は標識を包含してもよ
いし、また標識に結合できるものであつてもよい。第２
の吸水性構成要素上の結合パートナーは抗体に対する受
容体であつてもよく、たとえば第１の試薬が免疫グロブ
リンに対して特異的な抗原である場合プロテインＡでも
よい。
免疫クロマトグラフ法の例は、米国特許第4,168,146
号および第4,435,504号に記載されている。本発明に適
用される場合、第２の水性メジウム中の成分は免疫クロ
マトグラフ構成要素の免疫吸着領域を通過し、第１の吸
水性構成要素からの液体とともに運ばれる。成分は第２
の吸水性構成要素に、たとえば、sbp構成要素複合体の
形成を介して結合してもよい。定性的結果のためには、
免疫吸着領域を狭いバンドが小部位とし、そこにサンプ
ル中の被検物質の存否を指示させることができる。第２
のメジウムが通過する第２の吸水性構成要素の部分は用
いられる特定のプロトコールによつて決定されるが、吸
水性構成要素全体とすることが好ましい。しかしなが
ら、一般には定性試験および定量測定のいずれかにおい
ても、メジウムは少なくとも免疫吸着領域を通り、第２
の吸水性構成要素の部分を通過する。第２の吸水性構成
要素の寸法は、第１の吸水性構成要素について上述した
のと同じ点を考慮して決定できる。免疫吸着領域の大き
さと第２の吸水性構成要素の残部の関係は、正確な検定
を実現するために十分な量の成分が免疫吸着領域を通過
できるように設定される。
第２のメジウムが第１および第２の吸水性構成要素を
通過したのち、定性的検定においては、第２の吸水性構
成要素上のまたはそれに結合した成分の存在を確認す
る。第２の吸水性構成要素上における成分の存在は、サ
ンプル中の被検物質の量に関連する。成分が標識を含有
する場合には、第２の吸水性構成要素について検知可能
なシグナルの存在を検査すればよい。シグナルが放射性
標識等の結果である場合には、シグナルは第２の吸水性
構成要素で直接検知することができる。化学剤が標識を
含めたシグナル生成手段の一部を形成している場合に
は、第１の吸水性構成要素の接触部分を、シグナル生成
システムの残りの構成要素を含む現像溶液に浸漬、また
は他の方法で接触させる。第２の吸水性構成要素の部分
のみを接触させる場合には、この現像溶液を第１の吸水
性構成要素から第２の吸水性構成要素を通して流す。プ
ロトコールによつては、洗浄工程を設けてもまた設けな
くてもよい。別法として、第２の吸水性構成要素を、た
とえば全体の浸漬、噴霧等により、直接現像溶液と接触
させることもできる。
プロトコールによつては、第２の吸水性構成要素をま
ず現像溶液と接触させ、ついで第２の吸水性構成要素を
現像溶液中もしくは第１および第２のメジウム中には存
在しないかまたは第１もしくは第２の吸水性構成要素上
に存在するシグナル生成システムの残りの構成要素と接
触させるのが望ましい場合もある。
一般に、成分が存在するかまたは結合している第２の
吸水性構成要素の領域を決定するのに必要な量のシグナ
ル生成化合物が生成するのに十分な時間が経過してから
シグナルを測定する。検知可能なシグナルが生成したな
らば、サンプル中の被検物質の存否もしくは存在量およ
び／または試薬もしくは成分の量がわかる。定量的測定
のためには、シグナル生成システムが、第２の吸水性構
成要素内の被検物質または成分が存在または結合してい
る領域を、それが存在しない領域と識別する方法を与え
る。この方法ではクロマトグラフ上の既定の位置からの
その距離がサンプル中の被検物質および／または成分も
しくは試薬の量の指標となる。一態様においては、成分
が通過した第２の吸水性構成要素の領域は、成分が存在
する領域を通じて実質的に均一に検知可能なシグナルが
生成することにより観察可能となる。他の態様において
は、第２の試薬によつて占められた第２の吸水性構成要
素内の領域に関連した境界に主として検知可能なシグナ
ルが認められる。
本発明の特定の一態様においては、被検物質の含有が
疑われるサンプルと、被検物質に対する抗体と小有機分
子の抱合体である第１の試薬を含む水性メジウムが調製
される。水性メジウムを、小有機分子に対する抗体また
は被検物質に対する抗体を認識する抗体が非拡散性に結
合されている吸水性ストリツプの接触部分に接触させ
る。吸水性ストリツプの末端部は吸収性ストリツプと接
触させる。溶液は吸水性ストリツプと、吸収性ストリツ
プの部分を通過する。吸水性ストリツプ上の抗体は第１
の試薬を捕捉する。水性メジウム中に被検物質が存在す
ると、被検物質は第１の試薬の抗体によつて捕捉され
る。
吸水性ストリツプと吸収性構成要素の間の液体授受関
係を停止させ、吸水性ストリツプは第２の吸水性ストリ
ツプと液体授受関係に置く。酵素標識被検物質類縁体で
ある成分を含有する第２の液体メジウムを第１の吸水性
ストリツプの接触部分に接触させる。第２の吸水性スト
リツプは、第２の試薬の被検物質類縁体部分もしくは酵
素部分またはその抱合体自体に結合する抗体を含有す
る。第２の吸水性材料上の抗体は、第２の吸水性ストリ
ツプの実質的部分に非拡散性、均一に結合され、免疫ク
ロマトグラフを形成する。第２の水性メジウムは第１の
吸水性ストリツプと第２の吸水性ストリツプを通過す
る。
サンプル中に被検物質が存在すると、被検物質は、第
１の吸水性ストリツプに結合している被検物質に対する
抗体の結合部位を占拠する。したがつて、酵素標識被検
物質類縁体は、第１の吸水性構成要素上の占拠された結
合部位には結合せず、第２の吸水性ストリツプに移動
し、ここで第２の吸水性ストリツプ上の抗体によつて捕
捉される。したがつて、使用される第１の試薬および成
分の量は、被検物質の予想される関心濃度範囲に基づい
て予め決定された量でなければならない。サンプル中に
被検物質が存在しないかまたは被検物質の量が予め定め
られた関心濃度以下の場合には、成分はすべて第１の吸
水性構成要素に結合し、成分は第２の吸水性ストリツプ
には移動してこない。しかしながら、被検物質がサンプ
ル中に存在すると、成分はサンプル中の被検物質の量に
比例して第２の吸水性構成要素に移動する。サンプル中
に被検物質が存在しなくても少なくとも一部の成分が第
２の吸水性ストリツプに移動するように量を選択すれ
ば、成分は第２の吸水性構成要素に沿つて、サンプル中
の被検物質の量に比例する距離を移動するようにするこ
とができる。
第２の液体メジウムが第１の吸水性ストリツプおよび
第２の吸水性ストリツプを通過したのちに、第１の吸水
性構成要素と第２の水性メジウムの接触を停止させる。
ついで、第２の吸水性ストリツプを現像剤溶液と接触さ
せて、第２の吸水性ストリツプに結合した酵素抱合体の
場所を調べる。この目的では、第１および第２の吸水性
ストリツプを現像剤溶液に浸漬するか、または第２の吸
水性ストリツプの第１の吸水性ストリツプとの液体授受
関係を解除しついで第のストリツプをシグナル生成シス
テムの残りの構成要素を含有する現像剤溶液と接触させ
ることができる。このようにして、第２の吸水性ストリ
ツプ上の成分の移動距離が決定され、この距離が定量的
結果を得るに当つて、サンプル中の被検物質の量と関連
する。この関連は、上記方法を既知サンプルについて実
施して移動距離を測定し、未知サンプルにおける移動距
離を既知の値と比較してサンプル中に存在する被検物質
の量を決定した結果である。
現像剤溶液にシグナル生成システムの残りの構成要素
を含有させることもできるし、また、シグナル生成シス
テムの一部たとえば第２の酵素を第２の吸水性ストリツ
プ上に存在させることもできる。たとえば、米国特許第
602,297号（1984年４月20日出願、ヨーロツパ特許出願
第85302761.3号，カナダ特許出願第SN479,634号および
日本特許出願第60−085297号に対応）および米国特許出
願第733,013号（1985年５月10日出願、ヨーロツパ特許
出願第86303533.3号、カナダ特許出願第SN508,833号お
よび日本特許出願第61−107524号に対応）参照。
本発明の他の態様においては、被検物質類縁体が結合
された第１の吸水性ストリツプを接触部分において、被
検物質の含有が疑われるサンプルおよび被検物質に対す
る抗体を含む水性メジウムと接触させる。第１の吸水性
ストリツプは吸収性構成要素と液体授受関係に置き、メ
ジウムは第１の吸水性ストリツプと、吸収性構成要素の
部分を通過させる。吸収性構成要素と第１の吸水性スト
リツプの間の液体授受関係を終結させ、第１の吸水性ス
トリツプを第２の吸水性ストリツプと液体授受関係に置
く。第１の吸水性ストリツプの接触部分を、被検物質に
対する抗体に結合する抗体酵素抱合体を含む第２の水性
メジウムと接触させる。第２の吸水性ストリツプは被検
物質に対する抗体の受容体たとえばプロテインＡを含有
する。
サンプル中に被検物質が存在すると、被検物質はその
相補性構体に結合し、その結果、この複合体は第１の吸
水性ストリツプに結合しなくなる。しかしながら、被検
物質がサンプル中に存在しないかまたは予め定められた
検出可能量以下しか存在しないと、被検物質に対する抗
体は、第１の吸水性構成要素上の被検物質類縁体に結合
する。第１の吸水性ストリツプを、抗体酵素抱合体を含
む第２の水性メジウムと接触させると、被検物質に対す
る抗体が第１の吸水性ストリツプに結合している場合に
は、上記抱合体が第１の吸水性ストリツプに結合する。
サンプル中に存在する被検物質の量に関連する第１の吸
水性構成要素に結合した被検物質に対する抗体の量に応
じて、抱合体のある量が第２の吸水性ストリツプに移動
し、そこで抗体に対する受容体によつて捕捉される。
メジウムが第１の吸水性ストリツプと第２の吸水性ス
トリツプとを通過したのち、第２の吸水性ストリツプ上
の酵素活性を測定するため第２の吸水性ストリツプを前
述の態様に関して上述したように処理する。この場合
も、第２の吸水性ストリツプ上を抱合体が移動した距離
はサンプル中の被検物質の量に相関する。
他の態様においては、その部分に被検物質に対する抗
体が結合されている第１の吸水性ストリツプを関心サン
プルを含有する水性メジウムと接触させる。サンプルは
第１の吸水性構成要素を通過し、第１の吸水性構成要素
と液体授受関係にある吸収性構成要素内へ毛細管作用に
よつて駆動される。通過が起こつたのち、第１の吸水性
構成要素と吸収性構成要素の間の液体授受関係を終結さ
せ、第１の吸水性構成要素を、被検物質に対する抗体が
結合している第２の吸水性構成要素と液体授受関係に置
く。ついで第１の吸水性構成要素を、酵素標識被検物質
類縁体を含む水性メジウムと接触させる。この第２の水
性メジウムは第１の吸水性構成要素および第２の吸水性
構成要素を通過する。
サンプル中に被検物質が存在すると、最初の通過時に
被検物質は第１の吸水性構成要素に結合し、第１の吸水
性構成要素上の抗体結合部位を占拠する。したがつて、
第２の水性メジウムが第１の吸水性構成要素を通過する
ときには、酵素標識被検物質類縁体は第１の吸水性構成
要素に結合しないで、サンプル中に存在する被検物質の
量に直接比例して第２の吸水性構成要素に移動しくて
る。この場合も第２の吸水性構成要素を処理して酵素活
性を検出すると移動距離の測定が可能となり、これがサ
ンプル中の被検物質の量と相関する。
本発明は、サンプル中の１種または２種以上の被検物
質の存在および／または存在量を決定するための広範囲
の多様なプロトコールに対する適応性を有する。本発明
の一例においては、第１の水性メジウム中のsbp構成要
素を、第１の吸水性構成要素の部分をメジウムと接触さ
せることにより、第１の吸水性構成要素上に結合させ
る。第１の吸水性構成要素は吸収性構成要素と液体授受
関係に置く。メジウムは第１の吸水性構成要素と少なく
とも吸水性構成要素の部分を毛細管作用によつて通過す
る。次に、第１の吸水性構成要素を第２の吸水性構成要
素と液体授受関係に置く。第２の水性メジウム中の成分
は、第１のメジウム中の被検物質の存在に関連して第２
の吸水性構成要素に非拡散性に結合することになる。第
１の吸水性構成要素の部分を第２の水性メジウムと、第
２のメジウムが毛細管作用によつて第１の吸水性構成要
素と少なくとも第２の吸水性構成要素の部分を通過する
ような条件下に接触させる。第２の吸水性構成要素の少
なくとも部分における成分の存在またはその上の成分の
移動距離を調べて、サンプル中の被検物質の存在および
／または存在量を決定する。米国特許出願第SN904,597
号（1986年９月５日出願、ヨーロツパ特許出願第873077
76.2号およびカナダ特許出願第SN546,080号に対応）、
米国特許出願第SN928,233号（1986年11月７日出願、ヨ
ーロツパ特許出願第87309723.3号、カナダ特許出願第SN
551,172号および日本特許出願第62−281921号に対応）
および米国特許出願第SN928,771号（1986年11月７日出
願、ヨーロツパ特許出願第87309724.0号、カナダ特許出
願第SN551,171号および日本特許出願第62−281922号に
対応）に記載されたようなプロトコールは本発明に従つ
て改変して、サンプル中の１種または２種以上の被検物
質を定量することができる。
液体、通常は水性のメジウム中の成分たとえば金属イ
オンまたは被検物質の量を測定するための検定を実施す
るに際してのプロトコールは、一般に、液体メジウム
中、成分と第１の吸水性構成要素（「第１領域」）の組
合せの形成を包含する。関心成分は広範囲の材料たとえ
ば化学処理用水、汚染物質含有メジウム、廃水、生理学
的液体等に見出される。第１領域には成分と相互作用す
る試薬、たとえば金属イオンに対するキレート剤または
被検物質に対するsbp構成要素の既定レベルが非拡散性
に結合されている。−アプローチにおいては、第１領域
の接触部分を液体メジウムと接触させる。毛細管作用に
よる第１領域の湿潤を、メジウムおよび成分が第１領域
のすべてを通過し、第２の吸水性構成要素領域（「第２
領域」）内へ移動するまで継続する。第２領域は、第１
領域が設けられている同じ吸水性構成要素の部分であつ
てもよいが、２つの領域に結合された試薬の組成は異な
つている。別法として、第２領域は、第１領域と接触し
ていて、メジウムと成分の毛細管作用による第２領域へ
の移動が可能な別個の吸水性構成要素の部分とすること
もできる。
次に、第２領域を調べて、メジウムおよび成分の移動
距離を測定する。これは一般に、成分が直接検出可能で
あるかまたは検出剤が領域に結合されている場合を除い
て、領域を検出剤と接触させることによつて達成され
る。検出剤は、成分が酵素標識リガンド類縁体の場合の
ように酵素を含んでいるときには、酵素の基質を与える
たとえば現像剤溶液とすることができる。成分が無機分
子である場合には、検出剤は、成分と相互作用してシグ
ナルたとえば色を生成する物質とすることができる。た
とえば、その構成要素として成分があり、反応の結果着
色生成物が発生する酸化−還元反応を使用することがで
きる。
検出剤は、たとえば第２領域を検出剤を含むメジウム
中に浸漬するかまたは検出剤を第２領域に噴霧等によつ
て適用して、第２領域と接触させる水性メジウムに含有
させる場合が多い。
適当な相互作用が必要な程度まで起こるのに十分な時
間を設ける。この時間は、相互作用が化学的なものであ
るか物理的はなものであるか、関与する分子の相互作用
活性等、相互作用の性質に依存する。
適当なレベルのシグナルが発生したのち、成分が第２
領域内へ移動した距離またはメジウムと成分が第２領域
内へ移動した距離の差を測定する。この距離または差
は、液体メジウム中の成分量または試薬量に関連する。
たとえば成分および試薬の既知量を用いて標準曲線を作
成し、上述の距離または差を標準曲線と比較することに
よつて未知量を知ることができる。
第２のメジウムが第１および第２の吸水性構成要素を
通過したのち、定性的検定では、成分が第２の吸水性構
成要素に通過した距離を測定すると、これがサンプル中
の被検物質の量に相関する。成分が標識を含有する場合
には、通過距離は通過領域における検知可能シグナルの
存在から決定できる。標識が蛍光の場合には、たとえ
ば、シグナルは第２の吸性構成要素において直接検出で
きる。検出剤が、標識を含めたシグナル生成システムの
部分を形成する場合には、検出剤を第２の吸水性構成要
素に結合させるかまたは第２の吸水性構成要素を現像剤
の溶液と接触させればよい。
一般に、成分が通過した第２の吸水性構成要素に沿つ
た距離を定めるのに必要な量のシグナル生成化合物が生
成するのに十分な時間が経過してからシグナルを測定す
る。検知可能なシグナルが生成したならば、サンプル中
の被検物質の量または試薬もしくは成分の量が決定でき
る。すなわち、クロマトグラフ上のメジウムが通過した
最遠点と成分が通過した最遠点との間の距離が、サンプ
ル中の被検物質の量または成分もしくは試薬の量の指標
となる。成分が通過した第２の吸水性構成要素の領域は
通常、成分が存在する領域を通じて実質的に均一な検出
可能シグナルとして観察される。
本発明はまた、被検物質または関心試薬もしくは成分
の存在または存在量を分析するためのデバイスを包含す
る。第１図を参照しながら説明すると、デバイスは、第
１の吸水性構成要素10,吸収性構成要素18および第２の
吸水性構成要素20から構成される。第１の吸水性構成要
素は、吸収性構成要素および第２の吸水性構成要素と交
互に液体授受関係に置くことができる。別の態様におい
ては、本発明のデバイスはさらに液体授受関係を変える
ための手段を包含する。上述のように、この手段は物理
的または機械的手段のいずれでもよく、自動化されてい
てもされてなくてもよい。本発明のデバイスの一態様に
おいては、第２の吸水性構成要素は免疫クロマトグラフ
である。
便宜上の問題から、本発明において使用される試薬お
よびデバイスは、サンプル中の被検物質を検定する本発
明の方法の実施に使用するための既定量をパツクとして
組合せたキツトとして提供することができる。たとえ
ば、本発明の方法に有用なキツトは、上述のデバイスと
上述の成分または成分と第１の試薬をパツクとして組合
わせて構成することができる。酵素を標識として使用す
る場合には、試薬には酵素標識被検物質類縁体および現
像剤溶液を包含することができ、後者には、酵素の基質
もしくは任意の付加的基質を含めたその前駆体、酵素お
よび補酵素、ならびに検出可能な発色団または蛍光団を
与えるのに必要な酵素生成物の任意の反応パートナーを
含有させることができる。さらに他の添加物たとえば補
助剤として、たとえば安定剤、緩衝剤等を含有させるこ
ともできる。各種試薬の相対量は、検定の感度を至適に
できる試薬溶液の濃度を与えるように広範囲に変動させ
ることができる。１種または２種以上の試薬は、賦形剤
を含有した乾燥粉末、通常は凍結乾燥物として提供し、
検定の実施に際して適当な濃度の試薬溶液に溶解させる
こともできる。各試薬は別個の容器に充填してもよく、
また反応性や貯蔵寿命に問題がなければ、いくつかの試
薬をひとつの容器内にまとめることもできる。
例 本発明を以下の例示的な例によつてさらに説明する。
とくに指示のない限り、部および百分率は重量／容量を
示す。
例１ 定義： PVA−ポリビニルアルコール MES緩衝液−２−モルホリノエタンスルホン酸 TNBS−トリニトロベンゼンスルホン酸 HEPES緩衝液−ヒドロキシエチルピペラジンエタンス
ルホン酸 DMF−ジメチルホルムアミド PBS−リン酸緩衝食塩水−10mMリン酸ナトリウム、150
mM食塩、pH7 NHS−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド Ig−免疫グロブリン IgG−免疫グロブリンＧ 材料 ニトロセルロース膜（孔径12μ）Schleicher ＆ Schu
ellから入手した。アフイニテイ精製ウサギ抗−マウスI
gはZymedから入手した。グルタルアルデヒド（25％水溶
液）はSigmaから得た。ウシIgGはMiles Diagnosticsか
ら入手した。モノクローナル抗−フルオレセイン11H7お
よびモノクロノール抗−ジゴキシン2H6は、フルオレセ
イン標識ウシIgGおよびジゴキシン標識キーホールリン
ペツトヘモシアニンをそれぞれ免疫原として用いて、標
準方法（Galfreら:Nature,266:550,1977）に従つて調製
した。リン酸緩衝液は0.1Mリン酸ナトリウム、0.2M食
塩,pH7.3とした。硫酸ナトリウム緩衝液は、さらに9w/w
％の硫酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝液とした。西
洋ワサビペルオキシダーゼはShinko Americanから入手
した。ブロツテイングペーパーはBio−Radから入手した
（カタログ番号1650921）。カルボキシフルオレセイン
はKodakから入手した。
固定化抗−フルオレセインの調製 ニトロセルロース膜（7.5×9cm）を、硫酸ナトリウム
緩衝液中40μg/mのウサギ抗−マウスIgおよび1mg/m
ウシIgGを含む溶液50mとともに30分間インキユベート
した。膜を硫酸ナトリウム緩衝液50mで15分間洗浄
し、ついで硫酸ナトリウム緩衝液中62μg/mのグルタ
ルアルデヒドを含有する溶液50mと２時間インキユベ
ートして固定化した。膜を２回、各50mのリン酸緩衝
液で15分間洗浄し、ついでリン酸緩衝液中100μg/mの
モノクローナル抗−フルオレセイン11H7および1mg/m
のウシIgGを含有する溶液50mと１時間インキユベート
した。膜をリン酸緩衝液50mで15分間、脱イオン水50m
で15分間洗浄し、0.2mg/m20/30PVA 50mとともに
インキユベートした。膜はついで50℃で15分間乾燥し
た。
固定化抗−ジゴキシンの調製 ニトロセルロース膜（27.5×9cm）を3M9460トランス
フアーアドヘツシブを用いて３−mil酢酸ビニルフイル
ム上に薄層化し、ついで、硫酸ナトリウム緩衝液中１μ
g/mのウサギ抗−マウスIgおよ部1mg/mのウシIgGを
含有する溶液250mと30分間インキユベートした。膜を
硫酸ナトリウム緩衝液250mで15分間洗浄し、ついで、
硫酸ナトリウム緩衝液中62μg/mのグルタルアルデヒ
ドを含む溶液250mと２時間インキユベートして固定化
した。膜を２回、各250mのリン酸緩衝液と15分間洗浄
し、ついで、リン酸緩衝液中１μg/mのモノクローナ
ル抗−ジゴキシン2H6および1mg/mのウシIgGを含有す
る溶液と１時間インキユベートした。膜を250mのリン
酸緩衝液で15分間、250mの脱イオン水で15分間洗浄
し、0.2mg/m20/30PVA250mとインキユベートした。
膜はついで、50℃で15分間乾燥した。
遮断ニトロセルロース膜の調製 ニトロセルロース膜（7.5×9cm）を硫酸ナトリウム緩
衝液中1mg/mウシIgGの溶液50mと30分間インキユベ
ートした。膜を硫酸ナトリウム緩衝液50mで15分間洗
浄し、ついで、硫酸ナトリウム緩衝液中62μg/mグル
タルアルデヒド溶液50mと２時間インキユベートし
た。膜を２回、各回50mのリン酸緩衝液で15分間洗浄
し、リン酸緩衝液中1mg/mのウシIgGを含む溶液50m
と１時間インキユベートした。膜をリン酸緩衝液50m
で15分間、脱イオン水50mで15分間洗浄し、0.2mg/m
20/30PVA50mとインキユベートした。膜はついで50℃
で15分間乾燥した。
ジゴキシン標識HRPの調製 HRPの溶液（138mM MES緩衝液、pH5.0,6.6m中50m
g）にエチレンジアミン（3M,pH5.0;3.33m）および１
−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボ
ジイミド（1M,0.1m）を加え、この混合物を室温で15
時間保存した。得られたアミノ化HRPをSephadex Ｇ−2
5上、溶出液として0.02％ナトリウムアジド水溶液を用
いたクロマトグラフイーにより精製し、HRPあたり平均1
1個のアミノ基が存在することが明らかにされた（TNBS
滴定）。アミノ化HRP（37.9mg）にHEPES緩衝液（200mM,
pH8.0;7m）中、95μ部の無水コハク酸（DMF中2M）
を10分間隔で加えて処理し、各添加の５分後に1M水酸化
ナトリウム190μ部を加えてpHを８に保持した。スク
シニル化されたアミノ化HRPをSephadex Ｇ−25上、溶
出液として0.02％ナトリウムアジド水溶液を用いたクロ
マトグラフイーにより精製した。スクシニル化されたア
ミノ化HRP（30.8mg）をMES緩衝液（70mM,pH5.0;4.1m
）中、エチレンジアミン（3M,pH5.0;2.07m）および
１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル
ボジイミド（1M,0.062m）と、室温で６時間処理して
再アミノ化した。再アミノ化HRPはSephadex Ｇ−25
上、溶出液として0.02％ナトリウムアジド水溶液を用い
てクロマトグラフイーに付し精製したところ、HRPあた
り15.5個のアミノ基が認められた（TNBS滴定）。再アミ
ノ化HRP（PBS,pH7.0中2mg/m）を200倍過剰の３−ジゴ
キシゲニン−Ｏ−カルボキシメチルオキシムのNHSエス
テルと反応させ、透析した。得られたジゴキシン標識HR
Pは、HRPあたり12個のジゴキシンを有した（残留アミノ
基のTNBS滴定に基づく）。
フルオレセイン標識抗−ジゴキシン2H6の調製 リン酸緩衝液中モノクローナル抗−ジゴキシン2H6
（7.3mg/m,0.2m）に６−カルボキシルフルオレセイ
ンのNHSエステル（DMF中20mM;5μ）を加え、室温で５
分間ついで４℃で16時間インキユベートした。フルオレ
セイン標識抗−ジゴキシンはSephadex Ｇ−25上、溶出
液としてリン酸緩衝液を用いて精製した。抗体１分子あ
たり3.6個のフルオレセインを有することが認められ
た。
デバイス（第１図参照） 第１の吸水性構成要素10−6mm×6mmの遮断ニトロセル
ロース膜の小片からなる末端部12と6mm×10mmの固定化
抗−フルオレセイン片からなる捕捉パツドを、この２つ
の部分が1mmだけ重なるように３−milアセテートフイル
ム16上に薄層化した。
吸収性構成要素18−12mm×50mmのブロツテイングペー
パーストリツプ 第２の吸水性構成要素20（定量ストリツプ）−固定化
抗−ジゴキシンの6mm×90mmストリツプ 検定時には、第１の吸水性構成要素をまず吸収性構成
要素と液体授受関係（1mm重なつている）に置き（以下
のサンプル取り込み工程参照）、ついで第２の吸水性構
成要素と液体授受関係に置く（以下の定量工程参照）。
検定プロトコール 検定は２工程−サンプル取り込み工程と定量工程によ
つて実施される。サンプル取り込み工程では、サンプル
（100μ）とフルオレセイン標識抗−ジゴキシン2H6
（1.25μg/m,50μ）を16×100mmの試験管の底部に
取り、混合した。第１図に示されたような検定デバイス
の第１の吸水性構成要素の末端部を試験管内に置き、液
体を第１の吸水性構成要素に沿つて吸水体に浸透させ
た。液体のすべてがデバイスに取り込まれたのち、吸収
体と第１の吸水性構成要素の間の接触を停止させた。定
量工程では、定量用ストリツプを捕捉パツドの上端と接
触させた。検定デバイスの第１の吸水性構成要素の末端
部を、ジゴキシン標識HRP（250ng/m,100μ）を含有
する試験管内に置き、液体を捕捉パツドを通つて定量ス
トリツプ内に、定量ストリツプが液体で満たされるまで
通過させた。定量ストリツプをついでデバイスから取り
出し、現像剤溶液（0.5mg/mのジカルボキシジン、10m
M過酸化水素を100mMクエン酸ナトリウム,pH5.0中に含
有）中に、定量ストリツプの一部に青色が発色するまで
置いた。青色領域の長さ（移動高）を測定した。これが
サンプル中のジゴキシン濃度に相関した。
検定結果 ジゴキシンの既知濃度を含有する血清サンプル（カラ
ムジゴキシンカリブレーター,Syva Company）を用いて
一連の検定を実施した。結果は第１表にまとめる。
上記結果は、本発明の方法およびデバイスを用いて正
確かつ高感度のジゴキシンの検定が実施できることを示
している。ジゴキシン濃度が増大すると、定量ストリツ
プ上に移動高の増加が認められた。
例２ ジゴキシン標識HRPの濃度の測定 例１に記載したデバイスを用い、フルオレセイン標識
抗−ジゴキシンの400ng/m溶液100μを毛細管作用に
よつて、第１の吸水性構成要素から吸収体内に通過させ
た。様々な濃度のジゴキシン標識HRPを含む溶液を毛細
管作用によつて第１の吸水性構成要素から第２の吸水性
構成要素内へ通過させることにより、このデバイスを用
いて上記溶液を分析した。以下の第２表に示すように、
移動距離はジゴキシン標識HRPの濃度の函数であつた。
例３ フルオレセイン標識抗−ジゴキシンの濃度の測定 上記例１に記載したデバイスを用い、様々の濃度のフ
ルオレセイン標識抗−ジゴキシン溶液120μを毛細管
作用によつて、第１の水性構成要素を通つて吸水体内に
通過させた。ジゴキシン標識HRP275ng/m溶液を毛細管
作用によつて第１の吸水性構成要素を通つて第２の吸水
性構成要素内に通過させることにより、分析が完了し
た。以下の第３表に示すように、移動距離はフルオレセ
イン標識抗−ジゴキシン濃度の函数であつた。
例４ 塩化マグネシウム濃度の測定 第１図に従つて、第２の吸水性構成要素が非処理ニト
ロセルロース膜（孔径12μ）の小切（0.5×10cm）であ
るデバイスを調製する。第１の吸水性構成要素（0.5×
1.0cm）は、Whatman 1Cクロマトグラフイー用濾紙を、
カルボニルジイミダゾール（R.F.Zuk,V.K.Ginsberg,T.H
outsら:Clin.Chem.,31:1144〜1150,1986）、エチレンジ
アミンおよびジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物に
より、メチレンクロリド中で順次処理する。膜は乾燥
し、くり返し水洗し、再乾燥する。
これらのデバイスを用い、様々の濃度の塩化マグネシ
ウム水溶液を、第１の吸水性構成要素を通して第２の吸
水性構成要素内に、毛細管作用によつて通過させる。マ
グネシウムイオンは第１の吸水性構成要素上のキレート
化基によつて取り込まれる。第２の吸水性構成要素上の
塩化マグネシウム含有領域は、ストリツプを、pH9に緩
衝化したエリオクロームブラツクＴの希溶液で噴霧する
ことにより可視化される。移動距離は塩化マグネシウム
濃度の函数である。
例５ ヨウ化ナトリウム濃度の測定 上例におけるデバイスと類似のデバイスの第１の吸水
性構成要素を過剰の塩化第一鉄水溶液で処理したのち、
洗浄し、乾燥する。様々の濃度のヨウ素酸ナトリウム水
溶液を第１の吸水性構成要素を通つて、第２の吸水性構
成要素内に毛細管作用で通過させる。ヨウ素酸ナトリウ
ムはキレート化された第一鉄イオンによつてヨウ化ナト
リウムに還元される。第２の吸水性構成要素が液体で満
たされたのち、第２の吸水性構成要素をデンプンとヨウ
化ナトリウムを含む現像剤溶液と接触させて、還元され
ていないヨウ素酸ナトリウム含有領域を可視化する。移
動距離はヨウ素酸ナトリウム濃度の函数である。
例６ 塩化第一鉄濃度の測定 例４に記載したデバイスと類似のデバイスを用い、様
々の濃度の塩化第一鉄水溶液を第１の吸水性構成要素を
毛細管作用によつて通過させ、吸水性ストリツプ内まで
移動させる。ついで0.10mMのヨウ素酸ナトリウム溶液を
第１の吸水性構成要素を毛細管作用によつて通過させ、
第２の吸水性構成要素内へ移動させる。還元されないヨ
ウ素酸ナトリウムを含む第２の吸水性構成要素上の領域
を前例と同様にして可視化する。移動距離は、塩化第一
鉄の濃度の函数である。
例７ 塩化第一鉄濃度の別法による測定 塩化第一鉄水溶液のサンプル５μを、第１の吸水性
構成要素を通過させるのではなく直接第１の吸水性構成
要素に適用するほかは、例６に記載した塩化第一鉄の濃
度の測定操作を同様に行う。移動距離は、塩化第一鉄濃
度の函数である。
以上、本発明を例示または実施例によつて詳細に説明
したが、これは理解を容易にするためのものであつて、
本発明を限定するものではない。ある種の改変および修
飾が本発明の範囲から逸脱することなく実施可能なこと
は自明である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明によるデバイスの見取図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カール エヌ．スコールド アメリカ合衆国カリフォルニア州マウン テイン ビュー，デル アベニュー 2487 (72)発明者 エドウィン エフ．ウルマン アメリカ合衆国カリフォルニア州アサー トン，セルビイ レーン 135 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543

Claims (36)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】第１の液体メジウムが毛細管作用によって
    第１の吸水性構成要素領域を貫流または通過するような
    条件下に上記液体メジウムと上記第１の吸水性構成要素
    領域とを接触させることにより上記第１の液体メジウム
    中の試薬を被検物質の存在または存在量に相関して上記
    第１の吸水性構成要素領域に結合させ、 第２の液体メジウムが毛細管作用によって上記第１の吸
    水性構成要素領域および少なくとも第２の吸水性構成要
    素領域の部分を通過するような条件下に上記第１の吸水
    性構成要素の一部を上記第２の液体メジウムと接触させ
    ることにより上記第１のメジウム中の上記被検物質の存
    在に相関して第２の液体メジウム中の成分を第２の吸水
    性構成要素領域に吸着させ、 ついで上記被検物質の量を決定するためには上記成分が
    上記第２の吸水性構成要素領域を通過した距離を測定
    し、または上記被検物質の存在を決定するためには上記
    第２の吸水性構成要素の少なくとも部分における上記成
    分の存在を確認し、ただし、上記被検物質の存在のみを
    確認する場合には上記試薬を上記第１の吸水性構成要素
    に結合させたのちに上記第１の吸水性構成要素領域を上
    記第２の吸水性構成要素領域と液体授受関係に置くこと
    からなる被検物質の検定を実施する方法。
  2. 【請求項２】第１の吸水性構成要素領域を第２のメジウ
    ムと接触させる前に第１の吸水性構成要素領域と第２の
    吸水性構成要素領域を液体授受関係におく特許請求の範
    囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】試薬を結合できる結合パートナーが第１の
    吸水性構成要素領域の少なくとも部分に非拡散的に結合
    されている特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】成分は、第１のメジウム中における被検物
    質の存在に応答して第２の吸水性構成要素領域に結合す
    る特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】試薬と被検物質は互いに結合して複合体を
    形成し、この複合体が第１の吸水性構成要素領域に結合
    する特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】成分に対する結合パートナーが第２の吸水
    性構成要素領域に非拡散的に結合している特許請求の範
    囲第１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】被検物質はsbp構成要素である特許請求の
    範囲第１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】第１の吸水性構成要素領域（「第１領
    域」）と成分を含有する液体メジウムの組合せを、第１
    領域には上記成分と相互作用する試薬が非拡散的に結合
    され、上記液体メジウムとそれに含有される上記成分の
    少なくとも部分が毛細管作用によって上記第１領域のす
    べてを通過して、第１領域とは組成が異なり、被検物質
    が検出される場合を除いて上記成分を特異的に結合でき
    ない第２の吸水性構成要素領域（「第２領域」）内に移
    動するような条件下に提供すること、および上記試薬が
    存在する被検物質の量に相関して第１領域に結合するよ
    うに構成すること、ついで 上記液体メジウム中の上記成分量または上記試薬量に相
    関する第２領域内へ上記成分が移動した距離または第２
    領域内へ上記メジウムと上記成分が移動した距離の差を
    測定することからなる検定の実施方法。
  9. 【請求項９】上記組合せの配置前に、第１領域を試薬含
    有溶液と接触させることによって試薬を第１領域に非拡
    散的に結合させ、上記差または上記距離は試薬量に相関
    する特許請求の範囲第８項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】試薬量は、その試薬の溶液中における被
    検物質の量に相関する特許請求の範囲第９項に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】第１領域および第２領域は単一の吸水性
    構成要素に一体化されている特許請求の範囲第８項に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】第１領域は第１の吸水性構成要素と一体
    化され、第２領域は第２の吸水性構成要素と一体化さ
    れ、上記組合せの配置前に第１領域は第２領域と液体授
    受関係に置く特許請求の範囲第８項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】成分と試薬はそれぞれ特異的結合ペアの
    構成要素である特許請求の範囲第８項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】第２領域内へ成分が移動した距離の測定
    には酸化または還元反応を包含する特許請求の範囲第８
    項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】成分は酵素標識リガンド類緑体であり、
    試薬はそのリガンドに対する抗体である特許請求の範囲
    第８項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】メジウムおよび成分が第２領域内へ移動
    した距離の差を測定する特許請求の範囲第８項に記載の
    方法。
  17. 【請求項１７】液体メジウムとそれに含有される成分の
    少なくも一部が毛細管作用によって第１の吸水性構成要
    素領域（「第１領域」）のすべてを通過して、上記第１
    の領域とは組成が異なり、上記成分を特異的に結合でき
    ない第２の吸水性構成要素領域（「第２領域」）内へ移
    動する条件下に、上記成分と相互作用する試薬が非拡散
    的に結合された第１領域を上記成分を含有する液体メジ
    ウムと接触させ、 ついで、上記液体メジウム中の上記成分量または上記試
    薬量に相関する上記第２領域内へ上記成分が移動した距
    離または上記第２領域内へ上記メジウムおよび上記成分
    が移動した距離の差を測定して液体メジウム中の成分量
    を定量する特許請求の範囲第８項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】被検物質の溶液をその被検物質と反応可
    能な試薬が非拡散的に結合しているかまたは結合するよ
    うになる第１の吸水性構成要素と合し、 上記試薬と相互作用する成分を含有する液体メジウム
    を、上記第１の吸水性構成要素と組成の異なる第２の吸
    水性構成要素と液体授受関係にあるかまたはその部分で
    ある上記第１の吸水性構成要素と、上記液体メジウムが
    毛細管作用によって上記第１の吸水性構成要素および少
    なくとも上記第２の吸水性構成要素の部分を通過するよ
    うな条件下に合し、 ついで、上記溶液中の被検物質の量または上記第１の吸
    水性構成要素上の試薬量に境界の位置が相関する上記第
    ２の吸水性構成要素上の境界を決定して検定を行う特許
    請求の範囲第１項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】第１の液体メジウム中（１）第１の吸水
    性構成要素と（２）被検物質の組合せを、上記被検物質
    に対する試薬が上記メジウム中または上記第１の吸水性
    構成要素上に存在し、上記第１の吸水性構成要素は吸収
    性構成要素と液体授受関係に置き、上記第１のメジウム
    が毛細管作用によって上記第１の吸水性構成要素および
    少なくとも上記吸収性構成要素の一部を貫流して上記被
    検物質が上記吸水性構成要素に非拡散的に結合するよう
    な条件下に提供すること、 上記吸水性構成要素と上記吸収性構成要素の間の液体授
    受関係を終結させること、 第２の液体メジウム中上記第１の吸水性構成要素の部分
    と上記試薬と相互反応する成分の組合せを、上記第１の
    吸水性構成要素が第２の吸水性構成要素と液体授受関係
    にあり、上記第２のメジウムが毛細管作用によって上記
    第１の吸水性構成要素および少なくとも上記第２の吸水
    性構成要素の部分を通過するような条件下、ただし上記
    第１の吸水性構成要素は上記吸収性構成要素および上記
    第２の吸水性構成要素と実質的に異なる時期に液体授受
    関係にあるように提供すること、および 上記第１のメジウム中の被検物質の量または上記第２の
    液体メジウム中の試薬量もしくは上記成分量に境界の位
    置が相関する上記第２の吸水性構成要素上の境界を決定
    して検定を行う特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】第１の液体メジウム中（１）少なくとも
    その部分に第１の試薬が非拡散的に結合した第１の吸水
    性構成要素と（２）被検物質の含有が疑われるサンプル
    の組合せを、上記被検物質が上記第１の試薬に結合可能
    でない場合には上記被検物質と上記第１の試薬に結合可
    能な第２の試薬を上記メジウム中または上記第１の吸水
    性構成要素上に存在させ、上記第１の吸水性構成要素が
    吸収性構成要素と液体授受関係にあり、上記第１のメジ
    ウムが毛細管作用によって上記第１の吸水性構成要素お
    よび少なくとも上記吸収性構成要素の部分を通過するよ
    うな条件下に提供すること、 上記第１の吸水性構成要素と第２の吸水性構成要素を液
    体授受関係に置くこと、 第２の水性メジウム中上記第１の吸水性構成要素の部分
    および成分の組合せを、上記成分は上記第１のメジウム
    中の上記被検物質の存在に相関して上記第１の試薬に結
    合可能であり、上記第２の吸水性構成要素には少なくと
    もその部分に上記成分に対する特異的結合パートナーが
    非拡散的に均一に結合され、上記第２のメジウムは毛細
    管作用により少なくとも第１の吸水性構成要素の部分お
    よび少なくとも第２の吸水性構成要素の部分を通過する
    ような条件下に提供すること、および 上記サンプル中の上記被検物質の存在に関連する上記第
    ２の吸水性構成要素上の上記成分の存在の確認または上
    記サンプル中の上記被検物質の量に相関する上記第２の
    吸水性構成要素上の上記成分の移動距離の測定により検
    定を行う特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】第１の吸水性構成要素と吸収性構成要素
    の間の液体授受関係は第２の吸水性構成要素と第２のメ
    ジウムの接触前に終結させる特許請求の範囲第20項に記
    載の方法。
  22. 【請求項２２】第２の吸水性構成要素は免疫クロマトグ
    ラフであり、成分は酵素を包含し、上記免疫クロマトグ
    ラフ構成要素に結合した上記成分の量は上記免疫クロマ
    トグラフ構成要素上の境界の位置によって測定する特許
    請求の範囲第20項に記載の方法。
  23. 【請求項２３】被検物質は薬剤であり、薬剤は好ましく
    はジゴキシンである特許請求の範囲第20項に記載の方
    法。
  24. 【請求項２４】成分は標識に結合した被検物質からな
    り、標識は好ましくは酵素である特許請求の範囲第20項
    に記載の方法。
  25. 【請求項２５】成分に対する特異的結合パートナーは抗
    体である特許請求の範囲第20項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】第１の試薬は被検物質類縁体であり、第
    ２の試薬は被検物質に対する抗体である特許請求の範囲
    第20項に記載の方法。
  27. 【請求項２７】成分は標識に結合した第１の試薬に対す
    る抗体からなり、標識は好ましくは酵素である特許請求
    の範囲第20項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】第１の水性メジウム中（１）少なくとも
    その部分に第１の特異的結合ペア（sbp）構成要素が非
    拡散的に結合医された吸水性構成要素の部分と（２）被
    検物質の含有が疑われるサンプルの組合せを、上記被検
    物質に結合可能な第２のsbp構成要素および上記第１のs
    bp構成要素の相補性の第３のsbp構成要素からなる抱合
    体を上記メジウムまたは上記吸水性構成要素上に存在さ
    せ、上記吸水性構成要素は吸収性構成要素と液体授受関
    係にあり、上記第１のメジウムが毛細管作用によって上
    記吸水性構成要素および少なくとも上記吸収性構成要素
    の部分を通過し、上記抱合体を上記吸水性構成要素に非
    拡散的に結合させるような条件下に提供すること、 上記吸水性構成要素と上記吸収性構成要素の間の液体授
    受関係を終結させること、 第２の水性メジウム中上記吸水性構成要素の部分とジグ
    ナル生成システムの構成要素に結合したまたは結合させ
    ることが可能な被検物質類縁体からなる成分の組合せ
    を、上記吸水性構成要素は上記成分に対する結合パート
    ナーが非拡散的に結合した免疫クロマトグラフ構成要素
    と液体授受関係にあり、上記第２のメジウムが毛細管作
    用により上記吸水性要素および少なくとも上記免疫クロ
    マトグラフ構成要素の部分を通過するような条件下、た
    だし上記吸水性構成要素は上記吸収性構成要素および上
    記免疫クロマトグラフ構成要素と実質的に異なる時期に
    液体授受関係にあるように提供すること、および 上記第１のメジウム中の被検物質の量に境界の位置が相
    関する上記免疫クロマトグラフ構成要素上の境界を決定
    することにより被検物質を検定する特許請求の範囲第１
    項に記載の方法。
  29. 【請求項２９】被検物質は薬剤であり、薬剤は好ましく
    はジゴキシンである特許請求の範囲第28項に記載の方
    法。
  30. 【請求項３０】抱合体は被検物質に対する抗体とタンパ
    ク質からなる特許請求の範囲第28項に記載の方法。
  31. 【請求項３１】第１の水性メジウム中（１）被検物質類
    縁体が非拡散的に結合した吸水性構成要素の部分と
    （２）被検物質の含有が疑われるサンプルの組合せを、
    上記被検物質に結合可能な試薬を上記メジウムまたは上
    記吸水性構成要素上に存在させ、上記吸水性構成要素は
    吸収性構成要素と液体授受関係にあり、上記第１のメジ
    ウムが毛細管作用によって上記吸水性構成要素および少
    なくとも上記吸収性構成要素の部分を通過し、上記試薬
    が上記第１のメジウム中の上記被検物質の量と逆相関し
    て上記吸水性構成要素に非拡散的に結合するような条件
    下に提供すること、 上記吸水性構成要素と上記吸収性構成要素の間の液体授
    受関係を終結させること、 第２の水性メジウム中上記吸水性構成要素の部分と成分
    の組合せを、上記成分は、シグナル生成システムの構成
    要素に結合しているかまたは結合可能であり、上記試薬
    が上記吸水性構成要素に非拡散的に結合しているときは
    その試薬に結合可能であり、上記吸水性構成要素は上記
    成分に対する特異的結合パートナーが非拡散的に結合し
    ている免疫クロマトグラフ構成要素と液体授受関係にあ
    り、上記第２のメジウムが毛細管作用により上記吸水性
    構成要素および少なくとも上記免疫クロマトグラフ構成
    要素の部分を通過するような条件下、ただし上記吸水性
    構成要素は上記吸収性構成要素および上記免疫クロマト
    グラフ構成要素と実質的に異なる時期に液体授受関係に
    あるように提供すること、および 上記第１のメジウム中の被検物質の量に境界の位置が相
    関する上記免疫クロマトグラフ構成要素上の境界を決定
    することにより被検物質を検定する特許請求の範囲第１
    項に記載の方法。
  32. 【請求項３２】第１の水性メジウム中（１）被検物質に
    対する抗体が非拡散的に結合した吸水性構成要素の部分
    と（２）被検物質の含有が疑われるサンプルの組合せ
    を、上記吸水性構成要素は吸収性構成要素と液体授受関
    係にあり、上記第１のメジウムが毛細管作用によって上
    記吸水性構成要素および少なくとも上記吸収性構成要素
    の部分を通過するような条件下に提供すること、 上記吸水性構成要素と上記吸収性構成要素の間の液体授
    受関係を終結させること、 第２の水性メジウム中上記吸水性構成要素の部分と成分
    の組合せを、上記成分は、シグナル生成システムの構成
    要素に結合しているかまたは結合可能で、また上記被検
    物質に対する上記抗体に結合可能であり、上記吸水性構
    成要素は上記成分に対する特異的結合パートナーが非拡
    散的に結合している免疫クロマトグラフ構成要素と液体
    授受関係にあり、上記第２のメジウムが毛細管作用によ
    り上記吸水性要素および少なくとも上記免疫クロマトグ
    ラフ構成要素の部分を通過するような条件下、ただし上
    記吸水性構成要素は上記吸収性構成要素および上記免疫
    クロマトグラフ構成要素と実質的に異なる時期に液体授
    受関係にあるように提供すること、および 上記第１のメジウム中の被検物質の量に境界の位置が相
    関する上記免疫クロマトグラフ構成要素上の境界を決定
    することにより被検物質を検定する特許請求の範囲第１
    項に記載の方法。
  33. 【請求項３３】吸水性ストリップの末端部から遠位領域
    に分子量1500未満の有機分子に対する抗体（Ab1）が非
    拡散的に結合しているそのストリップの末端部とジゴキ
    シンの含有が疑われるサンプルを含む第１の水性メジウ
    ムを、上記有機分子に結合したジゴキシンに対する抗体
    からなる抱合体が上記第１のメジウム中または上記吸水
    性ストリップ上に存在し、上記第１のメジウムが毛細管
    作用により上記吸水性ストリップおよび少なくとも上記
    吸収性構成要素の部分を通過して、上記抱合体が上記Ab
    1に非拡散的に結合しまたジゴキシンが存在すればそれ
    が上記抱合体に結合するような条件下に接触させるこ
    と、 上記吸水性構成要素と上記吸収性構成要素の間の液体授
    受関係を終結させること、 第２の水性メジウム中上記吸水性ストリップの上記末端
    部と酵素に結合したジゴキシン類縁体からなる成分の組
    合せを、上記吸水性ストリップはジゴキシンに対する抗
    体が非拡散的に結合している免疫クロマトグラフストリ
    ップと液体授受関係にあり、上記第２のメジウムが毛細
    管作用によって上記吸水性ストリップおよび少なくとも
    上記免疫クロマトグラフ構成要素の部分を通過するよう
    な条件下、ただし上記ストリップは上記吸収性構成要素
    および上記免疫クロマトグラフストリップと実質的に異
    なる時期に液体授受関係にあるように提供すること、お
    よび 上記サンプル中の被検物質の量に境界の位置が相関する
    上記免疫クロマトグラフストリップ上の境界を決定する
    ことによりジゴキシンを検定する特許請求の範囲第１項
    に記載の方法。
  34. 【請求項３４】第１の吸水性構成要素、吸収性構成要素
    および第２の吸水性構成要素からなり、第１の吸水性構
    成要素は交互に上記吸収性構成要素および上記第２の吸
    水性構成要素と液体授受関係に置くことが可能な検定実
    施用デバイス
  35. 【請求項３５】（ａ） 特許請求の範囲第34項に記載の
    デバイス、および（ｂ）検定を実施するための試薬をセ
    ットに組合せてなる検定を実施するためのキット。
  36. 【請求項３６】第１の水性メジウム中の特異的結合ペア
    （sbp）構成要素を、吸収性構成要素と液体授受関係に
    ある第１の吸水性構成要素の部分と上記メジウムとを、
    上記第１のメジウムが毛細管作用によって第１の吸水性
    構成要素と少なくとも上記吸収性構成要素の部分を通過
    するような条件下に接触させて、第１の吸水性構成要素
    に結合させること、 上記第１の吸水性構成要素を第２の吸水性構成要素と液
    体授受関係におくこと、 上記第１の吸水性構成要素の部分を、成分を含有する第
    ２の水性メジウムと、上記第２の水性メジウムが毛細管
    作用によって第１の吸水性構成要素および少なくとも上
    記第２の吸水性構成要素の部分を通過するような条件下
    に接触させて、上記第１のメジウム中の被検物質の存在
    に関連して上記第２の水性メジウム中の成分を上記第２
    の吸水性構成要素に吸収させること、および 上記第２の吸水性構成要素の少なくとも部分における上
    記成分の存在を確認することからなる被検物質の検定の
    実施方法。
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