CN105358981B - 免疫层析用试验片、用于其的展开液及使用其的免疫层析法 - Google Patents
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Abstract
一种免疫层析用试验片,其为具备凝集抑制垫、结合垫以及膜的免疫层析用试验片,所述膜具有捕捉目标物质的试验区域,所述凝集抑制垫包含脱盐剂,所述结合垫包含标记剂。
Description
技术领域
本发明涉及免疫层析用试验片、用于其的展开液及使用其的免疫层析法。
背景技术
作为检测生物体中的抗原等微量物质的方法,有利用侧流型免疫层析法的检查法。在该方法中,使标记颗粒捕捉样本中含有的被检物质,利用毛细管现象使多孔载体移动。之后,使该被检物质与固定于多孔载体上的捕捉物质接触。由此,捕捉上述被检物质并进行浓缩,在固定有捕捉物质的部分使目标物质显色。可根据该显色判定有无被检物质。作为该免疫层析法的特征,可以举出下述3点。
(1)至判定为止所需要的时间短,能够进行迅速的检查。
(2)仅通过滴加样本即可测定,操作简便。
(3)无需特别的检测装置,容易判定。
利用这些特征,免疫层析法被用于妊娠检查药、流行性感冒检查药,作为新的POCT(即时检测,Point Of Care Testing)的方法得以利用。另外,在食品检查中也被广泛用作例如食物过敏原的检查试剂等而日益受到关注。
本申请人鉴于免疫层析法相关的上述特征对应用于膜的试剂进行了研究开发,开发出了使用荧光二氧化硅微粒的技术(参照专利文献1等)。由此,与现有的将生物体物质、生物体细胞或金胶体颗粒用于试剂的方法相比,能够廉价且格外稳定地进行测定和检测。另外,还能够更为确实地应对检测灵敏度的提高或定量化之类的要求,对于免疫层析法利用范围的扩大做出贡献。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2008/018566号小册子
专利文献2:日本专利第4578570号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明人进一步对上述使用荧光微粒的免疫层析技术继续进行了研究,结果得知,有时构成标记剂的微粒会产生凝集而难以在试验片内移动。具体而言,为如下所述的现象。样本在被应用于免疫层析法时,经常利用碱或酸进行灭菌处理。由于处理后保持该状态会对膜等部件造成损害,因而通常在试验前需要进行中和处理。受到该中和所产生的盐的影响,有时标记剂在膜内产生凝集,未移动至试验区域而停滞下来。其结果,捕捉到目标物质的标记颗粒未到达试验区域,难以进行高灵敏度的检测(作为未进行碱处理而将样本利用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液进行稀释、并在其中应用EDTA的示例,参照上述专利文献2)。对于利用了二氧化硅微粒的标记剂,该影响尤其显著,要求对其进行改善。
本发明的目的在于提供即使在利用碱或酸对样本实施灭菌处理时也能够确保标记剂的良好的流动性、能够以更高的灵敏度和精度进行目标物质的检测或测定的免疫层析用试验片、用于其的展开液及使用其的免疫层析法。
用于解决课题的手段
上述课题通过下述手段得以解决。
[1]一种免疫层析用试验片,其为具备凝集抑制垫、结合垫以及膜的免疫层析用试验片,上述膜具有捕捉目标物质的试验区域,上述凝集抑制垫包含脱盐剂,上述结合垫包含标记剂。
[2]如[1]所述的免疫层析用试验片,其中,上述脱盐剂为螯合剂或适体。
[3]如[2]所述的免疫层析用试验片,其中,上述螯合剂为氨基羧酸系螯合剂。
[4]如[1]~[3]中任一项所述的免疫层析用试验片,其中,上述标记剂为荧光二氧化硅微粒。
[5]如[1]~[4]中任一项所述的免疫层析用试验片,其中,在上述凝集抑制垫中导入有连结分子,经由该连结分子导入有脱盐剂。
[6]一种免疫层析用展开液,其包含碱或酸、目标物质以及脱盐剂。
[7]如[6]所述的免疫层析用展开液,其中,上述脱盐剂为螯合剂或适体。
[8]如[7]所述的免疫层析用展开液,其中,上述螯合剂为氨基羧酸系螯合剂。
[9]如[6]~[8]中任一项所述的免疫层析用展开液,其经由下述步骤进行了处理:对样本液赋予碱或酸的步骤、进行加热的步骤、以及利用碱或酸进行中和的步骤。
[10]一种免疫层析法,其为使用[1]~[5]中任一项所述的试验片进行的免疫层析法,对上述试验片赋予包含碱或酸以及目标物质的展开液,进行该样本液中的目标物质的检测。
[11]一种免疫层析法,对具备具有捕捉目标物质的试验区域的膜的免疫层析用试验片赋予[6]~[9]中任一项所述的包含脱盐剂的展开液,进行该目标物质的检测。
[12]一种免疫层析法,其为赋予包含碱或酸以及目标物质的展开液并使其通过膜、将目标物质捕捉到膜的试验区域来进行检查的免疫层析法,通过使用含有脱盐剂的脱盐垫、或者对样本液进行脱盐处理来进行展开液的脱盐,防止目标物质的凝集。
发明的效果
根据本发明的免疫层析用试验片、用于其的展开液、以及使用其的免疫层析法,即使在利用碱或酸对样本实施灭菌处理时,也能够确保标记剂的良好的流动性,能够以更高的灵敏度和精度进行目标物质的检测或测定。对于利用了二氧化硅微粒的标记剂发挥尤其显著的效果,使其在膜内适当地移动而实现目标物质的良好检测等。
本发明的上述特征及其他特征和优点可由下述记载及所附的附图进一步明确。
附图说明
图1为示意性示出本发明中适合使用的长条试验体的分解立体图。
图2为本发明中适合使用的试条的说明图,图2(a)为俯视图、图2(b)为展开截面图。
图3为示意性示出本发明中适合使用的试条的变形例的部分展开截面图。
图4为示意性示出本发明中适合使用的试条的其他变形例的部分展开截面图。
图5为示出实施例以及比较例中进行的目标物质的检测试验的结果(荧光强度)的曲线图。
图6为示出标记颗粒在膜内的移动状态(颗粒集聚比例)的曲线图。
图7为示出在比较例中对进行试验后的膜的内部进行观察的电子显微镜照片的附图代用照片。
图8为示出参考例中得到的二氧化硅颗粒在分散液中的粒度分布的曲线图。
图9为示出利用实施例中使用的凝集垫的实验的结果(标记颗粒在膜内的移动状态)的显微镜照片。
图10为示出利用实施例中使用的凝集垫的实验的结果(标记颗粒在膜内的移动状态)的另一显微镜照片。
具体实施方式
下面参照附图对本发明的免疫层析用试验片的优选实施方式进行说明。
[试条(试验片)]
本实施方式的免疫层析用试条(试验片)中,优选下述部件以相互产生毛细管现象的方式串联连结。
·凝集抑制垫8a
·结合垫(浸渗标记体并进行干燥而得到的部件)8b
·膜(抗体固定化膜)8c
·吸收垫8d
在本实施方式中,如图1和图2所示,具备具有上述试验区域nt和参照区域nr的膜8c的试条10被壳体上部6a与壳体下部6b夹持内包,形成长条试验体100。在壳体上部6a设置有检测开口部61和样本导入开口部62。经由该检测开口部61,能够将照射光送至内部的试条10,并对由此处发出的荧光或吸光进行检测、观测。另一方面,经由样本导入开口部62,能够将样本液S供给至试条10而进行测定试验。
参照图2(a)和图2(b)对本实施方式的免疫层析用试条的一个优选实施方式进行说明,但本发明并不受其限制。图2(a)示出了本发明的免疫层析用试条的一个优选实施方式的俯视图,图2(b)是表示图1(a)示出的免疫层析用试条的展开纵截面图的图。如上所述,本实施方式的免疫层析用试条10具备凝集抑制垫8a、结合垫8b、抗体固定化膜8c、吸收垫8d。进而,如本实施方式所述,上述各构成部件优选由带粘合剂的衬板8e进行衬底。
(目标物质)
在本发明中,作为检测、定量的对象的目标物质1可以举出抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖链、配体、受体、肽、化学物质等。在本发明中,作为含有目标物质1的试样没有特别限制,可以举出尿、血液等液体试样。
(凝集抑制垫)
在本实施方式中,凝集抑制垫8a为滴加含有目标物质的样品(样本)的构成部件。凝集抑制垫的材料、尺寸等没有特别限定,例如可以利用适用于样品垫的通常的材料、尺寸。该凝集抑制垫8a中赋予了后述的脱盐剂9。
凝集抑制垫的制作方法没有特别限定,例如可以举出在样品垫或结合垫所用的膜材料中浸渗脱盐剂的方法。具体而言,可以将膜材料浸渍在脱盐剂的溶液中、之后进行干燥来得到。或者,可以举出将脱盐剂的溶液或分散液涂布、滴加或喷雾至膜材料上、之后进行干燥的方法等。脱盐剂的应用量没有特别限定,每单位面积(cm2)的垫8a中的脱盐剂的含量优选为1μg~1000μg。
此外,将凝集剂固定于垫材料的方法例如可以举出利用冷冻干燥进行的固定化。具体而言,可以使1%EDTA溶液浸渗到玻璃纤维制造的结合垫中,之后在-80℃~-10℃冷冻。在冷冻后进行冷冻干燥处理,使其固定化于垫中。
另外,作为其他方法,可以举出在上述凝集抑制垫中导入连结分子、经由该连结分子导入脱盐剂(优选具有连结部位的脱盐剂)的方法。该垫与连结分子或者连结分子与脱盐剂的连结优选为化合物间的共价键合。例如,可以在使用具有SH基的MPMS(3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷)之类的硅烷偶联剂(连结分子)在玻璃纤维中附加SH基之后,如下述路线所示使具有马来酰亚胺结构的螯合化合物(具有连结部位的脱盐剂)与其共价键合。导入的顺序没有特别限定,可以在将连结分子导入至垫中之后导入脱盐剂,也可以使连结分子与脱盐剂预先连结再导入至垫中。或者,若为具有结合性的组合,也可以不使用连结分子而使脱盐剂与垫直接连结(共价键合等)。固定有脱盐剂(凝集抑制剂)的脱盐垫优选配置在免疫层析法试剂盒中的膜的上游侧。
【化1】
(样品垫)
在图1所示形态的试条中未使用样品垫,但也可以如图3所示的变形例那样在凝集抑制垫的上部设置样品垫8g。样品垫8g为滴加含有目标物质的样品的构成部件。其材料、尺寸等没有特别限定,可以利用适用于这种制品的通常的材料、尺寸等。
(结合垫)
结合垫8b为浸渗有标记试剂二氧化硅微粒(标记体)2、3的构成部件。并且,利用毛细管现象由凝集抑制垫8a移动来的试样所含有的目标物质是通过抗原抗体反应等特异性分子识别反应而被上述标记试剂二氧化硅微粒(标记体)捕捉并标记的部分。
每单位面积(cm2)的结合垫8b中的上述标记试剂二氧化硅微粒(标记体)的含量没有特别限制,优选为1μg~100μg。作为浸渗方法,可以举出在涂布、滴加或喷雾上述标记试剂二氧化硅微粒的分散液后进行干燥的方法等。
(抗体固定化膜)
在上述抗体固定化膜8c的抗体固定化部,设置固定有用于判定有无目标物质、即用于判定阳性阴性的目标物质捕捉用抗体的检测线nt。抗体固定化膜8c中优选含有固定化有用于捕捉标记试剂二氧化硅微粒的抗体的对照线nr。
膜8c是由二氧化硅微粒(标记体)2、3标记的目标物质1利用毛细管现象进行移动的构成部件,其具有进行由固定化抗体-目标物质-标记试剂二氧化硅微粒构成的夹心型免疫复合物形成反应的抗体固定化部(判定部)。作为上述膜中的上述抗体固定化部(判定部)的形状,只要可将捕捉用抗体局部固定化,则没有特别限制,可以举出线状、圆状、带状等,优选为线状,更优选为宽0.5~1.5mm的线状。
上述抗体固定化部(试验区域)nt的抗体固定化量没有特别限制,在形状为线状的情况下,优选每单位长度(cm)为0.5μg~5μg。作为固定化方法,可以举出将抗体溶液涂布、滴加或喷雾后进行干燥、通过物理吸附进行固定化的方法等。在上述的抗体固定化之后,为了防止非特异性吸附对测定的影响,优选对上述抗体固定化膜整体实施所谓的封闭处理。例如可以举出在含有白蛋白、酪蛋白、聚乙烯醇等封闭剂的缓冲液中浸渍适当的时间后进行干燥的方法等。作为市售的上述封闭剂,例如可以举出脱脂乳(DIFCO公司制造)、4%Block ACE(明治乳业公司制造)等。
在膜8c中还具有参照区域nr,未捕捉到目标物质的标记颗粒(标记体)3被捕捉于此处。由此,可以与检测区域nt中的荧光、吸光进行对比来判定目标物质的有无和量。为了实现该功能,试验用标记体2由二氧化硅微粒2a和试验用结合性物质2b构成。试验用结合性物质2b具有与目标物质的结合性。另一方面,参照用标记体3由二氧化硅微粒3a和参照用结合性物质3b构成。参照用结合性物质不具有与目标物质的结合性而具有与参照用捕捉性物质的结合性。
(吸收垫)
吸收垫8d是用于吸收利用毛细管现象在膜中移动而来的样本S(目标物质)和标记试剂二氧化硅微粒(标记体)2、3并始终产生一定流动的构成部件。
作为这些各构成部件的材料没有特别限制,可以使用在免疫层析用试条中使用的部件,作为样品垫和结合垫,优选Glass Fiber Conjugate Pad(商品名、MILLIPORE公司制造)等玻璃纤维垫,作为膜,优选Hi-Flow Plus120膜(商品名、MILLIPORE公司制造)等硝酸纤维素膜,作为吸收垫,优选Cellulose Fiber Sample Pad(商品名、MILLIPORE公司制造)等纤维素膜。
作为上述带粘合剂的衬板,可以举出AR9020(商品名、Adhesives Research公司制造)等。
图3和图4为示出本发明的优选实施方式的免疫层析用试验片的变形例的展开截面图。在图3的示例中,在凝集抑制垫8a的上部应用了样品垫8g。由此,可通过优化样品垫的材料来促进样本的更确实的吸收和向内部的移动。在图4的示例中,在凝集抑制垫8a’中浸渗有标记体,其兼具结合垫的功能。由此,可减少部件件数,可提供更为简单且廉价的试验片。在这些变形例中,凝集抑制垫所含有的脱盐剂也随着样本的流通而移动,与标记剂(二氧化硅微粒等)接触,发挥出良好的凝集抑制效果。
[脱盐剂]
本实施方式中脱盐剂的种类没有特别限定,优选为在样本处理后的酸、碱中和处理中添加、用于除去导致标记剂凝集的盐成分的化合物。作为盐成分,可以举出碱成分,具体而言,可以举出碱金属、其离子或其盐(例如钠、钾、锂、其离子或其盐等);碱土金属、其离子或其盐(例如钙、镁、钡、其离子或其盐等)等。或者,作为盐成分,可以举出酸成分,具体而言,可以举出盐酸、其离子或其盐;氢氟酸、其离子或其盐等。此外,作为脱盐剂,优选为对上述盐成分具有吸附性的化合物,优选为与这些金属一起形成金属络合物的配体化合物(螯合剂)。作为螯合剂,具体而言,可以举出具有杂原子的有机化合物,可以举出含氮烃化合物、含氧烃化合物、含硫烃化合物等。
作为含氮烃化合物,优选为在分子内具有氨基(NRN 2)、亚氨基(NRN)的化合物。进一步优选为具有氨基(NRN 2)或亚氨基(NRN)、同时具有羧基的化合物。此时,在其结构内可以具有醚基(O)。此处,RN为氢原子、碳原子数为1~12的烷基、碳原子数为2~12的烯基、碳原子数为6~14的芳基。该烷基、烯基、芳基可以进一步具有取代基,作为该取代基,可以举出羟基或羧基。
更具体而言,可以举出在分子内具有>N-(CH2)n-COOH(n为1~4的整数)结构或-N-((CH2)n-COOH)2结构的化合物。
构成脱盐剂的化合物的分子量没有特别限定,若考虑这种典型的螯合剂的示例,则优选为50~1000左右。
作为上述螯合剂,优选为氨基羧酸系螯合剂(碳原子数优选为2~24、更优选为2~12、特别优选为2~10)。作为其示例,可以举出下述螯合剂。氨基羧酸系螯合剂的羧基数优选为1~12、更优选为1~8、特别优选为1~6。氨基羧酸系螯合剂的氨基或亚氨基数优选为1~8、更优选为1~6、特别优选为1~4。
【化2】
EDTA:乙二胺四乙酸
EGTA:乙二醇醚二胺四乙酸
DTPA:二亚乙基三胺五乙酸
此外,作为构成螯合剂的含氮烃化合物,可以举出乙二胺、具有咪唑部位的化合物、具有吡唑部位的化合物、具有三唑部位的化合物、具有哌嗪部位的化合物、具有哌啶部位的化合物、具有吗啉部位的化合物、具有吡咯烷部位的化合物、具有噻唑部位的化合物、具有吡咯部位的化合物等。此外,作为含氧烃化合物,可以举出具有呋喃部位的化合物、醚化合物(冠醚:C8~C24)、羧酸化合物(柠檬酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、马来酸等)。
在本发明中具有效果的脱盐剂可以按如下方式来选择。具体而言,可以通过评价脱盐剂添加的有无所带来的二氧化硅颗粒在生理盐水中的行为差异来判断。可以通过在不存在脱盐剂的情况下平均粒径随时间而增大、在脱盐剂存在下维持平均粒径来进行选择。即,在不添加脱盐剂的情况下,颗粒表面的电荷因盐而消除,颗粒的分散性开始降低,颗粒彼此凝集,作为其结果,动态光散射法(DLS)测定的表观粒径增大。与此相对,通过添加脱盐剂,将盐成分(Na离子等)捕获,颗粒表面的电荷得以维持,由此能够防止颗粒彼此的凝集。具体例示于图8。
在本发明中,还优选使用适体作为脱盐剂。所谓适体是与特定分子或原子特异性地结合的核酸分子或肽等。在本发明中,优选使用具有与盐成分(碱成分、酸成分)特异性地结合而从体系内除去碱的效果的适体。作为具有这种性质的适体,例如可以使用以下所示的论文中记载的适体。在该论文中公开了对K离子具有亲和性的适体。
“Colorimetric detection of potassium ions using aptamer-functionalized gold nanoparticles”Zhengbo Chena,Yanqin Huangb,Xiaoxiao Lia,Tong Zhoua,He Maa,Hong Qianga,Yifei Liua,
a Department of Chemistry,Capital Normal University,Beijing 100048,China
b College of Chemistry and Chemical Engineering,Xinxiang University,Xinxiang453003,China
[展开液]
本发明的优选实施方式的展开液含有目标物质和上述脱盐剂。此时的展开液优选含有盐成分(碱成分或酸成分),进而更优选在加热后利用酸或碱进行了中和。加热优选在高温下进行,特别优选为煮沸温度(超过100℃)。在利用酸中和后,优选利用旋涡混匀器等充分混合。
在现有的展开液中,在盐存在下产生颗粒的凝集,超过膜的孔尺寸的凝集体增多,结果二氧化硅颗粒无法到达检测线。另一方面,根据本发明,通过添加特定的脱盐剂,能够防止颗粒(特别是二氧化硅颗粒)的凝集。因此,能够通过膜的孔尺寸的颗粒增多,能够有效地将颗粒运送至检测线。其结果,能够带来灵敏度的提高。
[技术术语的含义]
若要确认本说明书中使用的技术术语的含义,目标物质1(虽然将图1中的符号合在一起来表示,但并不限定解释于此)是作为利用侧流法的检测对象的物质,与样本中的被检物质含义相同。结合性物质2b、3b分别为对上述目标物质和捕捉性物质具有结合能力的物质,优选为生物体分子。将导入有结合性物质的标记颗粒2a、3a称为标记体2、3。其中,有时在广义上以包括标记体的含义来使用标记颗粒这一术语。另一方面,在试验区域被固定于膜上、经由目标物质1捕捉标记体2的物质为试验用捕捉性物质4。另一方面,在参照区域被固定于膜上的物质为参照用捕捉性物质5,标记体3不经由目标物质1而被捕捉于此。
需要说明的是,本说明书中的物质除了表示化合物或化学合成的分子等以外,还包含生物体分子(蛋白质、肽、核酸等),可以为人工来源物,也可以为天然来源物。在广义上其含义还包含生物体细胞、微生物(细菌等)、病毒。另外,所谓结合或连结在总体上是指多个物质自分离的状态连续地成为一体,除了共价键、离子键、氢键之类的化学键合以外,其含义还包括化学吸附或物理吸附、以及嵌合、螺合、咬合而成的物理连结状态等。此处,结合表示多个物质可以直接结合、也可以经由其他物质而间接结合的含义。
·样本
作为本实施方式中适用的样本S,没有特别限制,可以举出以人或动物的血液、血浆、血清、淋巴液、尿、唾液、胰液、胃液、咳痰、由鼻或咽等的粘膜采集的拭子液等体液或粪便等为代表的临床样本;以液体饮料、半固体食品、固体食品等为代表的食品样本;以来自土壤、河川、海水等自然界的采样样本、工厂内的生产线或无尘室的擦拭样本、利用空气采样器得到的采样样本等为代表的环境采样样本等。样本若为液体,也可以直接使用,在半固体或固体物质等的情况下,也可以在实施稀释或提取等处理后进行使用。
·结合性物质
本实施方式中,试验用的结合性物质2b与上述标记颗粒2a一体化来使用(标记体2)。结合性物质2b的具体例没有特别限定,可以举出与上述目标颗粒具有结合能力的生物体分子,具体而言,可以举出抗体。结合性物质可以直接与标记颗粒结合而一体化,也可以经由其他物质而间接结合。标记颗粒与结合性物质的结合可以通过下述常规方法来进行:利用疏水性相互作用等进行物理吸附的方法;如琥珀酰亚胺基与氨基的结合或马来酰亚胺基与巯基的结合那样经由官能团进行化学结合的方法;等等。在标记颗粒为微粒的情况下,在一个标记体的表面可以结合多个结合性物质。需要说明的是,关于使用荧光二氧化硅微粒作为标记颗粒并与结合性物质一体化而成的标记体的实施方式,例如可以参照国际公开第2008/018566号小册子。
在本实施方式中,在上述试验用的结合性物质2b之外使用参照用的结合性物质3b。该参照用结合性物质3b与后述的参照用的捕捉性物质5具有结合性。并且,标记颗粒3a与参照用结合性物质3b一体化而形成参照用的标记体3。因此,该标记体3在膜中移动的过程中被捕捉性物质5捕捉。标记颗粒3a与结合性物质3b的结合一体化的方式或者结合性物质3b的优选物质的种类与上述试验用的结合性物质2b相同。但是,该参照用结合性物质3b优选与试验用的捕捉性物质4或目标物质不具有结合性。另一方面,上述试验用的结合性物质2b可以与参照用的捕捉性物质5具有结合性,但更优选不具有该结合性。
需要说明的是,标记颗粒可以为1种,也可以为不使用3a(3b)而仅将2a(2b)用于试验用和参照用的方式。
·试验用捕捉性物质
本实施方式中使用的膜在上述膜的材料上固定化有试验用捕捉性物质4。该捕捉性物质4具有对目标物质1的结合能力,以捕捉含有上述标记颗粒2a、结合性物质2b和上述目标物质1的复合物。通过使捕捉性物质4具有上述那样的结合能力,能够捕捉由标记体2和目标物质1构成的复合物。其结果,在试验区域nt形成因发出标记体2所产生的荧光或吸光而着色的线。作为“结合性物质”-“目标物质”-“捕捉性物质”的组合的示例,可以举出抗体(B)-抗体(B)的抗原(C)-抗原(C)的抗体(D)、抗原(E)-抗原(E)的抗体(F)-抗体(F)的抗体(G)、核酸(H)-具有与核酸(H)互补的序列的核酸(I)-具有与核酸(I)互补的序列且与核酸(H)的序列不同的序列的核酸(J)、受体(K)-受体(K)的配体(L)-针对配体(L)的抗体(M)、适体(N)-适体(N)特异性结合的蛋白质(O)-在不同于适体(N)的部位与蛋白质(O)特异性结合的适体(P)、适体(Q)-与适体(Q)特异性结合的蛋白质(R)-针对蛋白质(R)的抗体(S)等,但本发明并不限于这些。
·参照用捕捉性物质
在本实施方式中,在膜的参照区域nr固定有参照用捕捉性物质5。其不经由目标物质1而直接与参照用的结合性物质3b结合。因此,若混合在移动来的样本液s中而未与目标物质1结合的标记体3移动过来,则直接将其捕捉(参照图2)。其结果,在参照区域nr形成呈现出由标记体3产生的吸光或荧光的线。参照用捕捉性物质5没有特别限定,可以举出与结合性物质具有结合能力的生物体分子,具体而言可以举出抗体等。
该参照区域的参照用捕捉性物质5与试验用结合性物质2b可以具有结合性。这种情况下,试验用的标记颗粒2a在参照区域nr被捕捉。即,成为在参照区域内标记颗粒3a与标记颗粒2a一起被捕捉的状态,这种情况下,也可以辨认出参照区域的标记颗粒的着色、荧光状态。另一方面,在试验区域内,伴有目标物质的荧光性的标记体2被捕捉,因而在通常的使用中没有影响。
·材料
作为在本实施方式的平面试验片(试条)10中可采用的各构成部件的材料,没有特别限制,可以使用在免疫层析用试条中使用的通常的部件。作为样品垫和结合垫,例如优选Glass Fiber Conjugate Pad(商品名、MILLIPORE公司制造)等玻璃纤维垫。作为膜,优选Hi-Flow Plus120膜(商品名、MILLIPORE公司制造)等硝酸纤维素膜。作为吸收垫,优选Cellulose Fiber Sample Pad(商品名、MILLIPORE公司制造)等纤维素膜。在使用上述带粘合剂的衬板的情况下,可以举出AR9020(商品名、Adhesives Research公司制造)等。
·标记颗粒向结合垫的导入
在本实施方式的免疫层析法中,优选在上述结合垫中预先导入结合有结合性物质的着色颗粒或荧光微粒作为上述标记体。每单位面积(cm2)的结合垫中的上述标记颗粒的含量没有特别限制,优选为20μg/cm2~2mg/cm2、更优选为20μg/cm2~200μg/cm2。若含量过多,则每1个颗粒的样本结合数降低,检测灵敏度降低。作为含有上述标记颗粒的方法,可以举出涂布、滴加或喷雾上述标记颗粒的分散液后进行干燥的方法等。此时,可以含有着色颗粒或荧光微粒,在暂时干燥后使其含有荧光微粒或着色颗粒;也可以预先混合着色颗粒和荧光微粒,并使其含有该混合胶体。
[标记剂]
作为标记剂,可以适当使用适用于这种试验的标记剂,例如可以使用荧光、吸光二氧化硅颗粒、荧光、吸光乳胶颗粒、半导体微粒、金胶体颗粒等标记颗粒2a、3a与结合性生物体分子2b、3b组合而成的标记剂。另外,也可以不是颗粒状的物质,也可以为蛋白质、抗体等生物体分子或其复合物等。在本发明中,上述由盐成分(酸成分或碱成分)所致的凝集问题显著,因此,特别优选可应对使用二氧化硅颗粒的实施方式的物质作为标记剂。
·荧光二氧化硅颗粒
荧光二氧化硅颗粒的制备方法没有特别限制,可以为利用任意的制备方法得到的二氧化硅颗粒。例如可以举出Journal of Colloid and Interface Science,159,150-157(1993)中记载的溶胶凝胶法。
在本发明中,特别优选使用按照国际公开2007/074722A1公报所记载的含有荧光色素化合物的胶体二氧化硅颗粒的制备方法得到的、含有功能性化合物的二氧化硅颗粒。作为上述功能性化合物的具体例,可以举出荧光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射线标记化合物、pH敏感性色素化合物等。
具体而言,含有上述功能性化合物的二氧化硅颗粒可以通过如下方法制备:使上述功能性化合物与硅烷偶联剂反应,进行共价结合、离子结合等化学结合或吸附,使1种或2种以上的硅烷化合物与所得到的产物缩聚,形成硅氧烷键。由此得到有机硅氧烷成分与硅氧烷成分进行硅氧烷结合而成的二氧化硅颗粒。
作为含有上述功能性化合物的二氧化硅颗粒的优选制备方法的方式,可以通过如下方法制备:使具有或加成有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基、马来酰亚胺基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、醛基、对硝基苯基、二乙氧基甲基、环氧基、氰基等活性基团的上述功能性化合物与具有与这些活性基团相应地发生反应的取代基(例如氨基、羟基、巯基)的硅烷偶联剂发生反应而进行共价结合,使1种或2种以上的硅烷化合物与所得到的产物进行缩聚,形成硅氧烷键。
下面例示出使用APS作为上述硅烷偶联剂、使用四乙氧基硅烷(TEOS)作为硅烷化合物的情况。
【化3】
作为具有或加成有上述活性基团的上述功能性化合物的具体例,可以举出5-(以及-6)-羧基四甲基若丹明-NHS酯(商品名、emp Biotech GmbH公司制造)、由下式分别表示的DY550-NHS酯或DY630-NHS酯(均为商品名、Dyomics GmbH公司制造)等具有NHS酯基的荧光色素化合物。
【化4】
作为具有上述取代基的硅烷偶联剂的具体例,可以举出γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷、N-2(氨基乙基)-3-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷等具有氨基的硅烷偶联剂。其中优选APS。
作为进行上述缩聚的上述硅烷化合物,没有特别限制,可以举出TEOS、γ-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS)、γ-巯基丙基三乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)、3-硫氰基丙基三乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷、3-异氰酸根合丙基三乙氧基硅烷以及3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷。其中,从形成上述二氧化硅颗粒内部的硅氧烷成分的观点考虑,优选TEOS;从形成上述二氧化硅颗粒内部的有机硅氧烷成分的观点考虑,优选MPS或APS。
若按上述方式进行制备,则能够制造球状或接近球状的二氧化硅颗粒。接近球状的二氧化硅颗粒具体是指长轴与短轴之比为2以下的形状。
为了得到所期望的平均粒径的二氧化硅颗粒,可以使用YM-10、YM-100(均为商品名、MILLIPORE公司制造)等超滤膜进行超滤,除去粒径过大或过小的颗粒,或者在适当的重力加速度下进行离心分离,仅回收上清或沉淀。
作为吸附或结合在上述二氧化硅颗粒的表面的生物体分子(结合性物质),可以举出抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖链、配体、受体、蛋白质或肽。此处,配体是指与蛋白质特异性结合的物质,例如是指与酶结合的底物、辅酶、调节因子或激素、神经递质等,不仅包含低分子量的分子或离子,还包含高分子量的物质。
标记颗粒(优选荧光二氧化硅颗粒)的平均粒径优选为1nm~1μm、更优选为20nm~500nm、进一步优选为50nm~300nm。
在本发明中,上述平均粒径如下求出:从透射型电子显微镜(TEM)、扫描型电子显微镜(SEM)等的图像中随机选择100个标记试剂二氧化硅颗粒,利用图像处理装置由上述100个标记试剂二氧化硅颗粒的合计投影面积求出标记试剂二氧化硅颗粒的占有面积,用该合计占有面积除以选择出的标记试剂二氧化硅颗粒的个数(100个),求出与所得到的值相当的圆的直径的平均值(平均圆等效直径)。
需要说明的是,上述平均粒径与作为包含一次颗粒凝集而成的二次颗粒的概念的后述“利用动态光散射法得到的粒度”不同,其是仅由一次颗粒构成的颗粒的平均粒径。
在本说明书中,上述“利用动态光散射法得到的粒度”是利用动态光散射法测定的、与上述平均粒径不同、不仅包含一次颗粒、还包含一次颗粒凝集而成的二次颗粒的概念,其成为评价上述复合颗粒的分散稳定性的指标。
作为利用动态光散射法得到的粒度的测定装置,可以举出Zetasizer Nano(商品名;Malvern公司制造)。该方法为如下方法:测定由微粒等光散射体引起的光散射强度的时间变动,由其自相关函数计算出光散射体的布朗运动速度,由该结果导出光散射体的粒度分布。
荧光二氧化硅颗粒优选以粒状物质的形式单分散,粒度分布的变异系数即所谓的CV值没有特别限制,优选为10%以下、更优选为8%以下。
·乳胶颗粒
在本发明中,出于其效果显著的原因,优选应用上述的二氧化硅微粒,但也可以代替上述二氧化硅微粒、或者在上述二氧化硅微粒的基础上使用乳胶颗粒来作为标记颗粒。作为乳胶颗粒,可以举出由聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸(盐)共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-磺酸共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物等构成的合成高分子颗粒。另外,作为乳胶颗粒的着色方法,可以利用日本特开2000-178309、日本特开平10-48215号、日本特开平8-269207号、日本特开平6-306108号等中记载的方法来进行。需要说明的是,荧光物质(标记物质)在这种颗粒上的固定化可以适当利用常规方法来进行。例如可以参照日本特表2005-534907、日本特开2010-156642、日本特开2010-156640等。作为商品化的荧光乳胶颗粒,已知有Luminex公司的商品名xMAP(注册商标)Multi-Analyte COOH Microspheres,(http://hitachisoft.jp/products/lifescience/lineup/luminex/about/bead.htmlhttp://hitachisoft.jp/products/lifescience/pdf/the_luminex_labmap_system.pdf)。
·半导体颗粒等
标记剂也可以应用半导体颗粒。半导体颗粒的材质没有特别限制,优选例示ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdO、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、InP、InAs、GaN、GaP、GaAs、TiO2、WO3、PbS或PbSe。例如可以使用日本专利第3897285号公报等中记载的半导体微粒。上述半导体微粒可以通过硫醇化合物的-SH基与半导体微粒表面的S、O、Se、Te、P、As、N等原子置换来进行表面修饰。作为上述金颗粒、上述金属微粒,可以使用日本特开2003-26638说明书等中记载的金胶体颗粒和金属胶体颗粒。作为上述金属胶体颗粒的具体例,可以举出铂、铜、氧化铁等金属胶体颗粒。作为上述无机晶体,可以举出氧化铁(III)(Fe2O3)、氧化银(I)(Ag2O)、氧化锡(IV)(SnO2)、二氧化钛(IV)(TiO2)、铟锡氧化物(ITO)等。例如可以使用日本特开2005-76064公报中记载的无机晶体。
·吸光系数
在标记剂具有吸光微粒的情况下,优选为吸收可见光而着色从而能够辨认的标记剂。优选为其摩尔吸光系数ε为5×106M-1cm-1以上的颗粒,更优选摩尔吸光系数ε为5×107M- 1cm-1~1×1010M-1cm-1。
此处,摩尔吸光系数ε可由下述朗伯-比尔(Lambert-Beer)公式算出。
A=Log10(I0/I)=εbp=asbp’
[A:吸光度、I:透射光的强度、I0:入射光的强度、ε:摩尔吸光系数(M-1cm-1)、b:光程(cm)、p:标记颗粒(包括着色颗粒和荧光微粒的混合分散液)的浓度(M(mol/l))、as:比吸光度、p’:标记颗粒(包括着色颗粒和荧光微粒的混合分散液)的浓度(g/l)]
上述浓度p’(g/l)是从一定量(例如1ml)的标记颗粒分散液中仅回收标记颗粒、确定其干燥得到的质量而得到的值。另一方面,上述浓度p(mol/l)是从TEM照片求出标记颗粒的尺寸,确定一个颗粒的体积,由颗粒的密度(例如二氧化硅颗粒的情况下为2.3g/cm3)确定一个颗粒的质量,从一定量(例如1ml)的标记颗粒分散液中仅回收标记颗粒,由干燥得到的标记颗粒的质量确定摩尔数而得到的值。在本发明中,“标记颗粒的摩尔吸光系数ε”是指通过对标记颗粒分散液测定吸光度并应用于上述朗伯-比尔公式而得到的、上述分散液中的标记颗粒的摩尔吸光系数ε。标记颗粒的吸光度、吸光光谱和ε可以使用任意的吸光光度计或酶标仪以水分散液、乙醇分散液、N,N-二甲基甲酰胺分散液等分散液的形式进行测定。
吸光微粒的表面修饰或结合性物质的导入的实施方式与上述荧光微粒相同。
[检测方法]
免疫层析法通常为使用利用毛细管现象等进行移动的标记试剂二氧化硅微粒(标记体)2、3、使上述颗粒在判定部集聚来进行判定的检测方法。例如优选利用免疫层析法或微通道芯片等来进行。此时,标记试剂二氧化硅微粒可以适合用作侧流用标记体。此外,在本发明的目标物质的检测方法中,优选利用侧流型的免疫层析法进行目标物质的检测。
作为上述试条的制作法,可以通过如下方法制作:按照样品垫、结合垫、抗体固定化膜、吸收垫的排列顺序,并且为了容易在各部件间产生毛管现象,使这些各部件的两端与相邻的部件重叠1mm~5mm左右来进行粘贴(优选粘贴在衬板上)。
作为上述免疫层析用荧光检测系统,优选至少包括:(1)由样品垫、浸渗有含有荧光物质的标记试剂二氧化硅微粒或侧流用标记试剂二氧化硅微粒的部件(结合垫)、抗体固定化膜以及吸收垫构成的试条、以及(2)激发光源。
在上述荧光检测系统中,从通过目视等来检测上述标记试剂二氧化硅微粒(标记体)所发出的荧光的观点考虑,优选上述激发光源发出波长200nm~400nm的激发光。作为上述激发光源,可以举出汞灯、卤素灯和氙灯。在本发明中,特别优选使用由激光二极管或发光二极管照射的激发光。
另外,上述荧光检测系统更优选具备用于仅使来自上述激发光源的特定波长的光透过的滤光器;此外,从通过目视等仅检测荧光的观点考虑,更优选具备除去上述激发光而仅使荧光透过的滤光器。
上述荧光检测系统特别优选具备接收上述荧光的光电倍增管或CCD检测器,由此,通过目视无法确认的强度或波长的荧光也能够进行检测,进而能够测定其荧光强度,因此还能够进行目标物质的定量,能够进行高灵敏度的检测和定量。
上述激发光的波长优选为300nm~700nm。上述荧光的波长优选为能够通过目视识别的波长,优选为350nm~800nm。另外,出于在通过目视观察时可得到高可见度的原因,该波长更优选为530nm~580nm。此时,为了有效地生成上述波段的荧光,激发光的波长优选为500nm~550nm。
本发明的优选实施方式的试条中,从即使是手法不熟练的普通需求者也容易操作以及进行POCT(即时检测,Point Of Care Testing)的观点出发,优选利用塑料材料等对通过目视观察试条的检测线的观察窗施以外壳(外罩)。例如可以举出日本特开2000-356638等中记载的外壳等。
此处,所谓POCT是指用于在尽可能接近患者的场所进行诊断的检查。以往,所采取的血液、尿、患部组织等样本被送至医院的中央检查室或专门的检查中心来出具数据,因而至诊断确定为止需要花费时间(例如1天以上)。利用POCT,能够基于瞬时提供的检查信息迅速且确切地进行治疗,因而可实现医院中的紧急检查或手术中的检查,因此,近来在医疗现场的需求高。
【实施例】
下面基于实施例进一步详细地说明本发明。本发明并不受这些实施例的任何限定。
(二氧化硅微粒的制备)
将5-(以及-6)-羧基四甲基若丹明-琥珀酰亚胺基酯(商品名、emp Biotech GmbH公司制造)2.9mg溶解在1mL的二甲基甲酰胺(DMF)中。向其中加入1.3μL的APS,在室温(24℃)进行1小时的反应。
将所得到的反应液600μL与乙醇140mL、四乙氧基硅烷(TEOS)6.5mL、蒸馏水35mL和28质量%氨水15mL混合,在室温进行24小时的反应。
将反应液在15000×g的重力加速度下进行30分钟离心分离,除去上清。在沉淀出的二氧化硅颗粒中加入蒸馏水4mL,使颗粒分散,再次在15000×g的重力加速度下进行20分钟离心分离。将本清洗操作再重复2次,将二氧化硅微粒分散液所含有的未反应的TEOS、氨等除去,得到平均粒径为200nm的二氧化硅微粒1.71g(收率为约97%)。
<比较例1>
在2N的氢氧化钠中追加中和量的盐酸,向所得到的含有盐成分的水溶液中以含有0.02质量%的方式添加上述中制作的二氧化硅微粒,制备展开液试样。使用其进行展开液的移动试验。其结果为图5(b)。此时的SEM图像示于图7。可知标记剂(二氧化硅微粒)局部不均匀地存在,固定在膜(长度25mm、商品名:Hi-Flow Plus120膜、MILLIPORE公司制造)的纤维表面。图6是使纵轴为颗粒的集聚比例来表示图5(a)和图5(b)的结果的图。
<实施例1>
向上述比较例的展开液中以达到1质量%的方式添加乙二胺四乙酸(EDTA)。与比较例1同样地对其进行展开液的移动试验。图5(a)示出其结果。
将图5(a)和图5(b)进行比较可知,在比较例中,在到达相当于试验区域(nt)的位置(8000μm附近)之前,标记剂发生滞留;而在本发明中,样本物质确实地到达了试验区域(nt)的位置并被捕捉。由该结果可知,根据本发明,标记剂的凝集或在膜上的局部固定受到了抑制,实现了其适当的流动性。
<实施例2>
作为上述脱盐剂,使用EGTA和DTPA来代替EDTA,进行同样的展开液的移动试验。其结果,观察到与EDTA同样良好的凝集抑制效果。
<参考例>
图8中示出了在高浓度(6质量%)的NaCl盐中添加二氧化硅颗粒并测定其粒度分布的经时变化的结果。图8的各曲线的数值表示从试验开始起的经过时间(秒)。根据图8(a),在添加时平均粒径为400nm左右的颗粒在30分钟后增大至600nm,在1小时后增大至800nm。另一方面,若添加EDTA,则在添加时平均粒径为500nm,即使时间推移,也未观察到大的变化(图8(b))。由该结果可知,通过添加EDTA,能够维持颗粒的表面电荷。认为这是由于,颗粒未发生凝集,颗粒的集合体的粒径(尺寸)未发生变化。需要说明的是,虽然在0分钟时本发明的粒径大,但400nm与500nm的差异并不显著,且重要的是即使时间推移也未发生凝集。
图9、图10为示出使用另一实施例中的经脱盐处理(利用连结材料将脱盐剂固定化)的垫时的状态的显微镜照片。没有大的凝集块,颗粒斑点状地存在,在每1视野(24μm□)观察到6个颗粒。由该结果也可知,在本发明的实施例中,标记颗粒的堵塞得到大幅改善。
【符号的说明】
1 目标物质(被检物质)
2 标记体
2a 标记颗粒
2b 试验用结合性物质
3 标记体
3a 标记颗粒
3b 参照用结合性物质
4 试验用捕捉性物质
5 参照用捕捉性物质
6 壳体
61 检测开口部
62 样本导入开口部
6a 壳体上部
6b 壳体下部
8a 凝集抑制垫
8b 结合垫
8c 膜
8d 吸收垫
8g 样品垫
9 脱盐剂
10 试条
100 长条试验体
nr 参照区域
nt 试验区域
L 侧流方向
S 样本
将本发明与其实施方式一并进行了说明,但只要申请人未特别指定,则说明中的任何细节均不意图对本发明进行限定,应当在不违反所附的权利要求书中所示的发明的精神和范围的情况下宽泛地进行解释。
本申请要求基于2013年7月25日在日本提交的日本特愿2013-154763的优先权,在此参照并引入其内容作为本说明书的记载的一部分。
Claims (6)
1.一种免疫层析用试验片,其为具备按顺序排列的凝集抑制垫、结合垫以及膜的免疫层析用试验片,所述膜具有捕捉目标物质的试验区域,所述凝集抑制垫包含脱盐剂,所述结合垫包含标记剂,
其中,所述凝集抑制垫仅包含脱盐剂;或在所述凝集抑制垫中通过导入有连结分子,并经由该连结分子导入有脱盐剂而仅包含连结分子和脱盐剂。
2.如权利要求1所述的免疫层析用试验片,其中,所述脱盐剂为螯合剂或适体。
3.如权利要求2所述的免疫层析用试验片,其中,所述螯合剂为氨基羧酸系螯合剂。
4.如权利要求1~3中任一项所述的免疫层析用试验片,其中,所述标记剂为荧光二氧化硅微粒。
5.一种免疫层析法,其为使用权利要求1~4中任一项所述的试验片进行的免疫层析法,对所述试验片赋予包含碱或酸以及目标物质的展开液,进行该样本液中的目标物质的检测。
6.一种免疫层析法,其为赋予包含碱或酸以及目标物质的展开液并使其通过膜、将目标物质捕捉到膜的试验区域来进行检查的免疫层析法,通过使用仅含有脱盐剂或仅包含连结分子和脱盐剂的脱盐垫来进行展开液的脱盐,防止目标物质的凝集。
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