JP2011158422A - シリカナノ粒子の製造方法、シリカナノ粒子および標識試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、安定した測定性能を長期間保持した、測定システム更には定量測定システムを可能とする、シリカナノ粒子の製造方法、該シリカ粒子の製造方法により得られた制御型のシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬を提供することである。
【解決手段】下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでいることを特徴とするシリカナノ粒子の製造方法。
（ａ）．含ケイ素アルコキシド類と標識機能分子とを結合した化合物を、テトラアルコキシシラン化合物とともに加水分解し、シリカナノ粒子を調製する工程
（ｂ）．前記工程（ａ）により調製したシリカナノ粒子の加水分解反応を反応停止剤により停止する工程
【選択図】なし

Description

本発明は、標識試薬として用いるシリカナノ粒子の製造方法に関する。より詳しくは反応停止剤を用いるシリカナノ粒子の製造方法、該シリカナノ粒子の製造方法により得られた制御型シリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬に関する。

シリカ粒子は光吸収特性や磁性などの標識特性がないためそれ自体では標識として使用できない。一方でシリカ粒子は高い化学的安定性、表面修飾の容易性、生体無毒性など標識試薬として好ましい特性を備えている。これに対し、シリカ粒子に有機色素などの標識機能分子を取り込むことで標識試薬を得ることができる。例えば、アミノ基と共有結合することができるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを有する蛍光色素分子とアミノプロピルトリエトキシシランとを結合させ、さらにアミノプロピルトリエトキシシランのエトキシ基を加水分解し、シリカと重合させることで標識機能分子である蛍光色素分子を内包したシリカ粒子を合成している技術が開示されている（特許文献１参照）。

一方、近年より超早期での疾病の診断を行うため、すなわち極微量のバイオマーカーの定量検出を行うため、より高い蛍光強度を有し、発光輝度のそろった標識試薬が求められている。複数の蛍光物質を一つのシリカナノ粒子に内包させる技術は高輝度の点で上記のニーズにかなっている（特許文献３参照）。この一方で粒子径に発光強度が依存しているためその粒子径の制御が課題である。すなわち、粒子径がそろっていないと測定される蛍光強度と測定対象であるバイオマーカーの量が比例関係から逸脱していまい、定量検出が不可能となってしまう。

また近年の診断はより患者の近くで行うＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ Ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔ；患者の身辺での検査）のニーズが高まっている。イムノクロマト法（特許文献２参照）は代表的なＰＯＣＴ検査システムでありインフルエンザ検査薬、妊娠検査薬などに用いられている。イムノクロマト法で使用される標識試薬は診療所などでの使いやすさの観点から保存安定性が求められ、金コロイド粒子が主に標識試薬として用いられている。この一方で、定量的な測定を必要とする診断項目ではイムノクロマト法は普及していない。このことは現在主にイムノクロマト用粒子として使用されている標識試薬である金コロイド粒子が高感度定量を可能とする標識試薬として十分な性能を保持していないことを示している。すなわち高感度定量をＰＯＣＴ検査で行うためには、高感度、粒子径制御、保存安定性の点での標識試薬の改善が産業上の課題となる。

英国特許第１０３６７６３号明細書 特開２００６−６７９７９号公報 国際公開第０７−０７４７２２号パンフレット

本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、本発明の目的は、安定した測定性能を長期間保持した、測定システム更には定量測定システムを可能とする、シリカナノ粒子の製造方法、該シリカ粒子の製造方法により得られた制御型のシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬を提供することである。

本発明者等は、上記課題を解決し、本発明の目的を達成すべく鋭意検討の結果、従来法で得られるシリカナノ粒子は、安定した定量性能、保存性において産業上の課題を有していることを見出した。これに対し、標識体粒子製造過程で反応停止剤を用いることより製造した、制御型シリカナノ粒子を用いることで安定した測定性能を長期間保持した測定システム更には定量測定システムを可能とする標識試薬を提供できることを見出し、本発明に至った。

即ち、本発明の上記目的は、下記の構成により達成される。

１．下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでいることを特徴とするシリカナノ粒子の製造方法。
（ａ）．含ケイ素アルコキシド類と標識機能分子とを結合した化合物を、テトラアルコキシシラン化合物とともに加水分解し、シリカナノ粒子を調製する工程
（ｂ）．前記工程（ａ）により調製したシリカナノ粒子の加水分解反応を反応停止剤により停止する工程
２．前記反応停止剤が下記一般式（１）で表されることを特徴とする前記１に記載のシリカナノ粒子の製造方法。
一般式（１）
Ｒ^１Ｒ^２Ｒ^３ＳｉＲ^４
（式中、Ｒ^１はＸ−Ｃ_ｎＨ_２ｎを表し、ｎは０を含む整数であり、ＸはＮ、Ｏ、Ｓ、Ｐを含む官能基を表し、Ｒ^２、Ｒ^３は不活性官能基であって水素原子、炭素数１〜８のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基またはアルキルアリール基を表し、Ｒ^４は加水分解性の基を表す。）
３．前記反応停止剤がアミノプロピルジメチルエトキシシランまたはアミノプロピルジメチルメトキシシランであることを特徴とする前記２に記載のシリカナノ粒子の製造方法。

４．前記テトラアルコキシシラン化合物と前記反応停止剤の混合モル比が１：１から１００：１の範囲であることを特徴とする前記１〜３のいずれか１項に記載のシリカナノ粒子の製造方法。

５．前記標識機能分子が蛍光、吸光、Ｘ線吸収または磁性の機能を持つことを特徴とする前記１〜４のいずれか１項に記載のシリカナノ粒子の製造方法。

６．前記１〜５のいずれか１項に記載のシリカナノ粒子の製造方法を用いて製造されたことを特徴とするシリカナノ粒子。

７．前記１〜５のいずれか１項に記載のシリカナノ粒子の製造方法を用いて製造されたシリカナノ粒子を用いて調製されることを特徴とする標識試薬。

本発明によれば、安定した測定性能を長期間保持した、測定システム更には定量測定システムを可能とする、シリカナノ粒子の製造方法、該シリカナノ粒子の製造方法により得られた制御型のシリカナノ粒子、及びそれを用いた標識試薬を提供することができる。

以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。

本発明のシリカナノ粒子の製造方法は、下記工程（ａ）及び（ｂ）を含んでいることを特徴とする。
（ａ）．含ケイ素アルコキシド類と標識機能分子とを結合した化合物を、テトラアルコキシシラン化合物とともに加水分解し、シリカナノ粒子を調製する工程
（ｂ）．前記工程（ａ）により調製したシリカナノ粒子の加水分解反応を反応停止剤により停止する工程
本発明においては、特に「（ｂ）．前記工程（ａ）により調製したシリカナノ粒子の加水分解反応を反応停止剤により停止する工程」を有することで、安定した測定性能を長期間保持した、測定システム更には定量測定システムを可能とするシリカ粒子が得られる。

本発明のシリカナノ粒子は、制御型シリカナノ粒子（粒子径が制御されたシリカナノ粒子）であり、シリカナノ粒子中に複数の標識機能分子を内包したシリカナノ粒子であって、反応停止剤による粒子合成制御工程を有して粒子径が制御され製造されたことを特徴とする。この特徴は、請求項１から請求項７に係る発明に共通する技術的特徴である。

本発明のシリカナノ粒子は、量子ドット内包シリカナノ粒子であり、当該シリカナノ粒子と本発明の標識機能分子とが有機分子（本発明の含ケイ素アルコキシド類）を介して結合されており標識試薬として好適に用いることができる。

以下、本発明とその構成要素、及び発明を実施するための最良の形態について詳細な説明をする。

〔シリカナノ粒子、シリカナノ粒子の製造方法〕
本発明のシリカナノ粒子は、先ず、（ａ）．含ケイ素アルコキシド類と標識機能分子とを結合した化合物を、テトラアルコキシシラン化合物とともに加水分解し、シリカナノ粒子を調製し、その後、（ｂ）．前記工程（ａ）により調製したシリカナノ粒子の加水分解反応を反応停止剤により停止すること、により製造する。

本発明において、含ケイ素アルコキシド類と標識機能分子とを結合した化合物とは、本発明の含ケイ素アルコキシド類と本発明の標識機能分子とが結合した化合物のことを意味する。

上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。

本発明の含ケイ素アルコキシド類としては、例えば無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に標識機能分子の官能基と結合することが可能となるメルカプト基（チオール基）、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介してシリカナノ粒子と結合することができる。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどが挙げられる。

本発明の標識機能分子としては、標識機能部分を有し、かつ本発明の含ケイ素アルコキシド類の官能基と結合することが可能となる官能基を有する分子である。

上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。

本発明の標識機能分子としては、蛍光、吸光、Ｘ線吸収、磁性機能を持つことが好ましい。

例えば、ローダミン、フルオロセイン、シアニン、量子ドット、ガドリニウム、ヨウ素、酸化鉄、等が挙げられる。

本発明のシリカナノ粒子の製造方法は反応停止剤を用いることが特徴であり、本発明の反応停止剤としては、下記一般式（１）で表される化合物を用いることが好ましい。
一般式（１）
Ｒ^１Ｒ^２Ｒ^３ＳｉＲ^４
（式中、Ｒ^１はＸ−Ｃ_ｎＨ_２ｎを表し、ｎは０を含む整数であり、ＸはＮ、Ｏ、Ｓ、Ｐを含む官能基を表し、Ｒ^２、Ｒ^３は不活性官能基であって水素原子、炭素数１〜８のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基または基アルキルアリール基を表し、Ｒ^４は加水分解性の基を表す。）
Ｘで表されるＮ、Ｏ、Ｓ、Ｐを含む官能基としては、例えば、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、メルカプト基、燐酸基、等が挙げられる。

Ｒ^４で表される加水分解性の基としては、加水分解性の基であれば特に限定されないが、好ましくは、アルコキシ基等が挙げられ、該アルコキシ基は置換されていてもよい。例えば、メトキシ基、エトキシ基、メトキシエトキシ基、ブトキシ基、ベンジルオキシ基、等が挙げられる。

一般式（１）で表される化合物（反応停止剤）としては、例えば、がアミノプロピルジメチルエトキシシランまたはアミノプロピルジメチルメトキシシラン、等が好ましく用いられる。

本発明の反応停止剤は、テトラアルコキシシランと本発明の反応停止剤の混合モル比が１：１から１００：１の範囲で用いられることが好ましい。

本発明のシリカナノ粒子は、例えば、非特許文献（ジャーナルオブコロイドサイエンス、２６巻、６２ページ（１９６８年））に記載されているアンモニア水などを用いたアルカリ性条件下でテトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解を行う「ストーバー法」と呼ばれる方法により製造することが好ましい。粒径は、添加する水、エタノール、アルカリ量などについて公知の反応条件を適用することで自在に調整でき、平均粒径３０〜８００ｎｍ程度にすることができる。また粒径のばらつきを示す変動係数は１０〜２０％程度とすることができる。

特に、本発明においては、シリカナノ粒子の調製後、シリカナノ粒子の加水分解反応を反応停止剤により停止すること、により、平均粒径、変動係数が制御されたシリカナノ粒子、即ち、制御型シリカナノ粒子を作製することができる。

本発明の制御型シリカナノ粒子は、平均粒径３０〜８００ｎｍであることが好ましく、５０〜２００ｎｍであることがより好ましい。また粒径のばらつきを示す変動係数は３〜２０％であることが好ましく、４〜８％であることがより好ましい。

本発明において、平均粒径とは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めた。本発明においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。

〔標識試薬〕
本発明の標識試薬は、本発明のシリカナノ粒子の製造方法を用いて製造された本発明のシリカナノ粒子を用いて調製される。

本発明の標識試薬は、本発明のシリカナノ粒子の製造方法を用いて製造された本発明のシリカナノ粒子でも良いし、または、本発明のシリカナノ粒子に、更に、標識物質（標的とする物質と特異的に結合する物質）を結合、修飾して調製されることもできる。

本発明の標識試薬は、本発明のシリカナノ粒子に、更に結合、修飾した標識物質が標的とする物質と特異的に結合することにより、物質の標識が可能となることが好ましい。

上記結合、修飾、の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。

当該標識物質としては例えば、ヌクレオチド鎖、タンパク質、抗体等が挙げられる。

例えば、本発明のシリカナノ粒子に、抗体Ａを修飾し、後、更に、抗体Ａの抗原Ｂを修飾して得られる本発明の標識試薬を用いて、抗体Ａを検出することができる。

また、標識試薬として用いる場合、生体物質との非特異的吸着を抑制するためのポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）を用いて修飾することにより生体物質との非特異的吸着を抑制することができる。シランカップリング剤を用いる場合、２種以上を併用してもよい。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。尚、特に断りない限り、実施例中の「部」あるいは「％」の表示は、「質量部」あるいは「質量％」を表す。

（実施例１：テトラメチルローダミン内包・制御型シリカナノ粒子の合成）
下記工程（１）〜（３）を含む方法により、テトラメチルローダミン内包・制御型シリカナノ粒子を作製した。
工程（１）
テトラメチルローダミン（インビトロジェン社製ＴＡＭＲＡ−ＳＥ）６．６ｍｇと３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ（信越シリコーン社製 ＫＢＭ９０３）３μＬをＤＭＦ中で混合、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物０．６ｍｌを４８ｍｌのエタノール、０．６ｍｌのＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）、２ｍｌの水、２ｍｌの２８％アンモニア水と１時間混合した。
工程（２）
工程（１）で作製した混合液に、３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（信越シリコーン社製）を１．２ｍｌ反応停止剤として加え、２時間混合した。
工程（３）
工程（２）で作製した混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を２回ずつ行った。

得られたテトラメチルローダミン内包・制御型シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１２０ｎｍ、変動係数は４％であった。また赤外スペクトルの測定を行ったところ（日本分光社製）、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ由来のスペクトルに対するＳｉ−ＯＨのスペクトルの比は０．０３であった。

（比較例１：テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子の合成）
特許文献３にならい、下記工程（１）〜（２）含む方法により、テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子を作製した。
工程（１）
テトラメチルローダミン（インビトロジェン社製ＴＡＭＲＡ−ＳＥ）６．６ｍｇと３−アミノプロピルトリメトキシシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ、信越シリコーン社製、ＫＢＭ９０３）３μＬをＤＭＦ中で混合、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物０．６ｍｌを４８ｍｌのエタノール、０．６ｍｌのＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）、２ｍｌの水、２ｍｌの２８％アンモニア水と３時間混合した。
工程（２）
工程（１）で作製した混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を２回ずつ行った。

得られたテトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１２４ｎｍ、変動係数は１２％であった。また赤外スペクトルの測定を行ったところ（日本分光社製）、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ由来のスペクトルに対するＳｉ−ＯＨのスペクトルの比は０．１３であった。

（実施例２：テトラメチルローダミン内包・制御型シリカナノ粒子への抗体の結合）
実施例１で得られた、テトラメチルローダミン内包・制御型シリカナノ粒子をＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し１時間反応した。この混合液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで抗体結合用シリカナノ粒子を得た。

一方、抗ｈＣＧ抗体を１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去することによりシリカ粒子に結合可能な還元化抗体溶液を得た。

上記で得られた抗体結合用シリカナノ粒子と還元化抗体とを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで抗ｈＣＧ抗体結合・テトラメチルローダミン内包・制御型シリカナノ粒子を得た。

抗ｈＣＧ抗体結合・テトラメチルローダミン内包・制御型シリカナノ粒子０．１ｍｇを純水０．５ｍｌに分散させ、蛍光測定を行ったところ、反応前の蛍光強度を維持していた。また、ＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１２２ｎｍ、変動係数は５％であった。

（比較例２：テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子への抗体の結合）
比較例１で得られたテトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子１ｍｇを純水５ｍｌに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液（１００％溶液）１００μＬを添加し、室温で１２時間攪拌した。

反応混合物を１００００Ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を２回行った。

得られたアミノ基修飾した・テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子をＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて３ｎＭに調整、その後実施例２と同様の方法で抗ｈＣＧ抗体結合・テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子を得た。得られた粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１２８ｎｍ、変動係数は１４％であった。

（検出実験１：抗ｈＣＧ抗体結合・テトラメチルローダミン内包・制御型シリカナノ粒子、または、抗ｈＣＧ抗体結合・テトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子、を用いたｈＣＧの検出）
ｈＣＧ検出用イムノクロマトメンブレンを作製するために以下の工程を行った。イムノクロマト用メンブレン（ミリポア社製）の下端から１４０ｍｍの位置に、５％ショ糖含有、５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０で希釈した抗ｈＣＧαサブユニット抗体（メディクスバイオケミカ社製）を０．２μｇ／ｃｍで塗布し、４０℃で２０分間減圧乾燥した。乾燥したメンブレンは０．５％カゼイン含有５０ｍＭホウ酸 ｐＨ８．５によるブロッキング処理と０．５％ショ糖、０．０５％コール酸Ｎａ含有５０ｍＭトリス ｐＨ７．５による安定化処理を施した。安定化処理後のイムノクロマトメンブレンは乾燥後、バッキングシート（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）に貼り付け下端に１０ｍｍ幅のイムノクロマト用吸収パッドを貼り付けた。完成したｈＣＧ検出用イムノクロマトメンブレンは乾燥剤とともに密封し４℃で検出に使用する日まで保存した。

検出実験は以下の方法で行った。実施例２、比較例２で作製したシリカナノ粒子のＰＢＳ溶液に、０．６ＩＵ／ＬとなるようにｈＣＧ（シグマ社製、抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン）を希釈、１分間混和した。それぞれの混和溶液をｈＣＧ検出用イムノクロマトメンブレン上の吸収パッドに１００μｌ滴下し、後、展開させて（展開液：ＰＢＳ）、抗ｈＣＧαサブユニット抗体を塗布したラインの蛍光を２分毎に滴下後３０分まで測定した。測定はイメージアナライザー ＦＬＡ−９０００（富士フイルム社製）を用い、１μＭに希釈したテトラメチルローダミンをイムノクロマト用メンブレンに２０μｌ滴下したエリアの発光との発光比を求めることで行った。同様の検出実験を２０回繰り返し、蛍光が最高値に達するまでの時間（平均値）と最高値（平均値）とそのバラツキを表１に示す。

表１から、公知のシリカナノ粒子と比較して、本発明の制御型シリカナノ粒子では蛍光が最高値に達するまでの時間が短縮しかつ、蛍光最高値のバラツキが低減していることがわかる。

（検出実験２：長期保存後の、テトラメチルローダミン内包・制御型シリカナノ粒子またはテトラメチルローダミン内包・シリカナノ粒子を用いたｈＣＧの検出）
実施例２、比較例２で作製したシリカナノ粒子をＰＢＳ中で６ヶ月間４℃で保存した後、検出実験１と同様のｈＣＧ検出実験を行った。保存前後のシリカナノ粒子について行った２０回の繰り返し実験から得られた蛍光が最高値に達するまでの時間（平均値）と最高値（平均値）とそのバラツキを表２に示す。

表２から、本発明の制御型シリカナノ粒子では保存前後で最高値に達する間での時間と最高値とそのバラツキに大きな変化がないのに対し、公知のシリカナノ粒子では蛍光が最高値に達する間での時間増大、最高値の低下、最高値のバラツキの増大があることが分かる。

Claims (7)

1. 下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでいることを特徴とするシリカナノ粒子の製造方法。
   （ａ）．含ケイ素アルコキシド類と標識機能分子とを結合した化合物を、テトラアルコキシシラン化合物とともに加水分解し、シリカナノ粒子を調製する工程
   （ｂ）．前記工程（ａ）により調製したシリカナノ粒子の加水分解反応を反応停止剤により停止する工程
2. 前記反応停止剤が下記一般式（１）で表されることを特徴とする請求項１に記載のシリカナノ粒子の製造方法。
   一般式（１）
   Ｒ^１Ｒ^２Ｒ^３ＳｉＲ^４
   （式中、Ｒ^１はＸ−Ｃ_ｎＨ_２ｎを表し、ｎは０を含む整数であり、ＸはＮ、Ｏ、Ｓ、Ｐを含む官能基を表し、Ｒ^２、Ｒ^３は不活性官能基であって水素原子、炭素数１〜８のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基またはアルキルアリール基を表し、Ｒ^４は加水分解性の基を表す。）
3. 前記反応停止剤がアミノプロピルジメチルエトキシシランまたはアミノプロピルジメチルメトキシシランであることを特徴とする請求項２に記載のシリカナノ粒子の製造方法。
4. 前記テトラアルコキシシラン化合物と前記反応停止剤の混合モル比が１：１から１００：１の範囲であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のシリカナノ粒子の製造方法。
5. 前記標識機能分子が蛍光、吸光、Ｘ線吸収または磁性の機能を持つことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のシリカナノ粒子の製造方法。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のシリカナノ粒子の製造方法を用いて製造されたことを特徴とするシリカナノ粒子。
7. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のシリカナノ粒子の製造方法を用いて製造されたシリカナノ粒子を用いて調製されることを特徴とする標識試薬。