KR101194112B1 - 크로마토그래피식 검출 장치, 검사법 및 이것을 응용한키트 - Google Patents

크로마토그래피식 검출 장치, 검사법 및 이것을 응용한키트 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따르면, 면역 크로마토그래피식 검사법에서의 피분석 물질과 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약이 특이적으로 결합하는 반응 및 피분석 물질-표지 시약의 복합체와 포착 시약이 특이적으로 결합하는 반응의 조건을 고상 지지체 상에서 연속적으로 최적화하도록 고상 지지체를 구성하고, 전처리한 검체를 고상 지지체 상에서 상기 반응에 적합하게 함으로써 간편하고, 감도ㆍ특이성이 우수한 면역 크로마토그래피 검출 장치, 검사법 및 이것을 응용한 키트, 및 그의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 시트상의 고상 지지체 상에 적어도 피분석 물질을 포함하는 것으로 추정되는 검체 또는 상기 검체와 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약의 혼합물을 공급하는 검체 공급 부위 및 상기 피분석 물질-상기 표지 시약 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있는 포착 시약을 고정화한 포착 시약 부위를 포함하는 크로마토그래피식 검출 장치이며, 검체 공급 부위와 포착 시약 부위 사이에 소정의 기능 중 하나 또는 복수의 기능을 갖는 하나 이상의 기능 부위를 설치한 크로마토그래피식 검출 장치를 제공한다.
크로마토그래피식 검출 장치, 특이성, 기능 부위, 고감도, 고상 지지체

Description

크로마토그래피식 검출 장치, 검사법 및 이것을 응용한 키트 {Chromatographic Detection Apparatus, Method of Testing and Kit Utilizing the Same}
본 발명은 시료 중의 피분석 물질을 특이적으로 정성 및 정량하는 크로마토그래피식 검출 장치, 검사법 및 이것을 응용한 키트에 관한 것이다.
면역 반응의 특이성을 이용하여 시료 중의 분석 대상물을 검출 또는 정량하는 분석 방법으로서 면역 확산법, 효소 측정법, 응집법 등 여러가지 방법론이 실용화되어 있다. 특히 최근 면역 크로마토그래피식 검사(검출)법(측면 플로우식, 접선 플로우식, 일본 특허 공고 (평)7-13640호 공보, 일본 특허 제2131938호 공보, 일본 특허 제2890384호 공보)에 의한 검사법은 그 간편성으로 급속하게 보급되고 있다.
이하, 이들 검사법의 원리를 간단히 설명한다. 시판되고 있는 대부분의 면역 크로마토그래피 검사법은 시트상의 고상 지지체를 갖고, 고상 지지체 상의 길이 방향에 대하여 끝에서부터 순서대로 1. 검체 공급 부위, 2. 피분석 물질(예: 항원)에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약(예: 가시 가능한 금 콜로이드 입자 또는 효소)을 멤브레인 상에서 전개 가능하도록 유지한 표지 시약 부위, 및 3. 피분석 물질(예: 항원) 또는 표지 항체 또는 피분석 물질과 표지 시약의 복합체를 포착하기 위한 포착 시약(예: 항체)을 고정화한 포착 시약 부위를 용액이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동하도록 구성되어 있다. 우선, 피분석 물질을 포함하는 검체를 검체 부유액에 부유시킨 시료를 시료 첨가 부위에 소정량 사용하면, 시료가 고상 지지체를 전개 이동하는 과정에서 표지 시약 부위에 침입하고, 피분석 물질이 표지 시약과 결합하여 피분석 물질-표지 시약의 복합체가 형성된다. 피분석 물질-표지 시약 복합체는 그대로 멤브레인 상에서 전개 이동하고, 멤브레인 상의 포착 시약 부위에 침입하면, 고상 지지체 상에 고정화된 포착 시약에 포착되어 포착 시약-피분석 물질-표지 시약의 복합체가 포착 시약 위치에 형성된다. 또한, 표지 시약을 임의의 방법(가시 가능한 금 콜로이드 입자의 경우에는 그 응집상, 효소의 경우에는 기질을 첨가함에 따른 발색 반응)으로 검출함으로써 피분석 물질의 존재를 판정할 수 있다. 도 7에 종래의 면역 크로마토그래피식 검출 장치를 나타낸다.
면역 크로마토그래피식 검출 장치는, 그 구성상, 검체를 고상 지지체 상에 공급하여 전개시킴으로써, A. 피분석 물질과 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약이 특이적으로 결합하는 반응, 및 B. 피분석 물질-표지 시약의 복합체와 포착 시약이 특이적으로 결합하는 반응이 연속적으로 고상 지지체 상에서 자동적으로 실시되어 간편성이 우수한 검사법이다. 그러나, 실제로는 대부분의 검사에 있어서, 피분석 물질을 포함하는 검체에는 불순물이 많고, 그것을 제거하기 위해 검사를 행하기 전에 여러가지 화학적ㆍ물리적 처리에 의해 검체로부 터 피분석 물질을 분리 및 추출하는 전처리가 필요하였다. 이 때, 전처리가 항원과 항체의 결합 반응에 적당하지 않은 조건에서 행해지는 경우가 많아, 전처리 후에 검체를 결합 반응에 적합한 조건으로 할 필요가 있었다. 또한, 피분석 물질과 표지 시약이 특이적으로 쉽게 결합하도록 반응계에서 pH 및 염 농도 등을 조절할 필요가 있었다. 그러나, 반드시 상기 A 및 B의 각 반응의 pHㆍ염 농도 등의 최적 반응 조건이 일치하는 것은 아니기 때문에, ELISA 등의 복수의 반응을 나누어 반응시키는 다른 검사법에 비하여 간편성이나 감도ㆍ특이성이 떨어지는 면도 있었다.
특허 문헌 1: 일본 특허 공고 (평)7-13640호 공보
특허 문헌 2: 일본 특허 제2131938호 공보
특허 문헌 3: 일본 특허 제2504923호 공보
특허 문헌 4: 일본 특허 제2890384호 공보
<발명의 개시>
본 발명은 면역 크로마토그래피식 검사법에서의 피분석 물질과, 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약이 특이적으로 결합하는 반응 및 피분석 물질-표지 시약의 복합체와 포착 시약이 특이적으로 결합하는 반응의 조건을 고상 지지체 상에서 연속적으로 최적화하도록 고상 지지체를 구성하고, 전처리한 검체를 고상 지지체 상에서 상기 반응에 적합하게 함으로써 간편하고, 감도ㆍ특이성이 우수한 면역 크로마토그래피 검출 장치, 검사법 및 이것을 응용한 키트, 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 고상 지지체 상에서 검체를 전처리할 수 있는 면역 크로마토그래피 검출 장치, 검사법 및 이것을 응용한 키 트, 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자는 면역 크로마토그래피식 검사 장치의 고상 지지체 상에서 피분석 물질과, 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약이 특이적으로 결합하는 반응 및 피분석 물질-표지 시약의 복합체와 포착 시약이 특이적으로 결합하는 반응의 조건을 고상 지지체 상에서 연속적으로 최적화하고, 또한 전처리한 검체를 고상 지지체 상에서 상기 반응에 적합하게 하도록 고상 지지체를 구성함으로써, 신속하고, 간편하며 또한 감도ㆍ특이성이 우수한 면역 크로마토그래피 검출 장치를 개발하기 위해 예의 검토를 행하였다. 그 결과, 검체를 공급부에 첨가하고 나서 연속적으로 상기 각 반응이 발생할 때, 각 반응마다 반응 조건을 최적화하는 수단을 고상 지지체 상에 포함시킴으로써 간편하고, 또한 감도ㆍ특이성이 우수한 면역 크로마토그래피 검사법을 실시할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 반응 조건을 최적화하는 수단으로서 고상 지지체 상에 반응 조건을 최적화하는 기능을 갖는 부재 및/또는 시약을 포함하는 기능 부위를 설치함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한, 본 발명자는 고상 지지체에 검체 처리 수단을 갖는 부재 및/또는 시약을 포함하는 기능 부위를 설치하고, 검체를 공급부에 첨가하기 전에 검체의 전처리를 필요로 하지 않고 검출을 행할 수 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
[1] 시트상의 고상 지지체 상에 적어도 피분석 물질을 포함하는 것으로 추정되는 검체 또는 상기 검체와, 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하 는 표지 시약의 혼합물을 공급하는 검체 공급 부위, 및 상기 피분석 물질-상기 표지 시약 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있는 포착 시약을 고정화한 포착 시약 부위를 포함하는 크로마토그래피식 검출 장치이며, 검체 공급 부위와 포착 시약 부위 사이에 하기 기능 (a) 내지 (c) 중 어느 하나 또는 복수의 기능을 갖는 하나 이상의 기능 부위를 설치한 크로마토그래피식 검출 장치.
(a) 검체를 전처리하는 기능,
(b) 검체 중의 피분석 물질과, 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약이 특이적으로 결합하는 반응의 조건을 최적화하는 기능, 및
(c) 피분석 물질-표지 시약의 복합체와 포착 시약이 특이적으로 결합하는 반응의 조건을 최적화하는 기능.
[2] 상기 [1]에 있어서, 시트상의 고상 지지체 상에 적어도 피분석 물질을 포함하는 것으로 추정되는 검체를 공급하는 검체 공급 부위, 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약을 고상 지지체 상에서 전개 가능하게 유지한 표지 시약 부위, 및 상기 피분석 물질-상기 표지 시약 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있는 포착 시약을 고정화한 포착 시약 부위를 포함하는 크로마토그래피식 검출 장치.
[3] 상기 [1]에 있어서, 피분석 물질과 표지 시약이 고상 지지체와 분리된 부위에서 미리 접촉하고, 피분석 물질을 포함하는 것으로 추정되는 검체와 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약의 혼합물이 검체 공급 부위에 공급되는 크로마토그래피식 검출 장치.
[4] 상기 [1] 또는 [2]에 있어서, 검체 공급 부위와 표지 시약 부위가 공간적으로 떨어져 설치되어 있는 크로마토그래피식 검출 장치.
[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 검체를 전처리하는 기능이 검체로부터 불순물을 제거하는 기능 및/또는 검체로부터 피분석 물질을 추출하는 기능인 크로마토그래피식 검출 장치.
[6] 상기 [5]에 있어서, 검체를 전처리하는 기능이 피분석 물질을 추출하는 기능이고, 검체를 전처리하는 기능을 갖는 기능 부위가 검체로부터 피분석 물질을 추출하기 위한 시약을 포함하는 것인 크로마토그래피식 검출 장치.
[7] 상기 [6]에 있어서, 검체로부터 피분석 물질을 추출하기 위한 시약이, 생물 매트릭스를 포함하는 검체 중의 생물 매트릭스로부터 알칼리 처리, 산 처리 또는 계면활성제 처리에 의해 피분석 물질을 추출하기 위한 염기성 물질, 산성 물질 또는 계면활성제인 크로마토그래피식 검출 장치.
[8] 상기 [5] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 검체를 전처리하는 기능이 검체로부터 불순물을 제거하는 기능이고, 검체를 전처리하는 기능을 갖는 기능 부위가 검체 중의 불순물을 여과, 흡착 또는 응집하는 기능을 갖는 것인 크로마토그래피식 검출 장치.
[9] 상기 [8]에 있어서, 검체를 전처리하는 기능을 갖는 기능 부위가 필터를 포함하고, 상기 필터에 의해 검체 중의 불순물이 여과되는 크로마토그래피식 검출 장치.
[10] 상기 [8] 또는 [9]에 있어서, 검체를 전처리하는 기능을 갖는 기능 부 위가, 불순물을 흡착하는 시약 또는 불순물을 응집시키는 시약을 포함하는 것인 크로마토그래피식 검출 장치.
[11] 상기 [10]에 있어서, 검체를 전처리하는 기능을 갖는 기능 부위가 불순물을 흡착하는 시약 또는 불순물을 응집시키는 시약을 포함하고, 불순물을 흡착하는 시약 또는 불순물을 응집시키는 시약이 고상 지지체 중에 포함되어 있는 크로마토그래피식 검출 장치.
[12] 상기 [11]에 있어서, 불순물을 흡착하는 시약 또는 불순물을 응집시키는 시약이 고상 지지체 상의 검체 공급 부위와 표지 시약 부위 사이에 포함되어 있는 크로마토그래피식 검출 장치.
[13] 상기 [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 있어서, 반응의 조건을 최적화하는 기능을 갖는 기능 부위가, 반응 조건을 최적화하기 위한 시약을 포함하는 것인 크로마토그래피식 검출 장치.
[14] 상기 [13]에 있어서, 반응 조건을 최적화하기 위한 시약에 의해, 반응계의 pH가 반응에 최적인 범위로 조정되는 크로마토그래피식 검출 장치.
[15] 상기 [13]에 있어서, 반응 조건을 최적화하기 위한 시약에 의해, 반응계의 염 농도가 반응에 최적인 범위로 조정되는 크로마토그래피식 검출 장치.
[16] 상기 [13] 내지 [15] 중 어느 하나에 있어서, 시약이 완충액, 산성 시약, 염기성 시약 및 계면활성제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 크로마토그래피식 검출 장치.
[17] 상기 [13] 내지 [16] 중 어느 하나에 있어서, 미리 전처리한 검체 중의 피분석 물질이 리간드 또는 포착 물질과 결합하는 반응의 조건을 최적화하기 위한 기능 부위를 갖는 크로마토그래피식 검출 장치.
[18] 상기 [13] 내지 [17] 중 어느 하나에 있어서, 상이한 피분석 물질을 포착할 수 있는 복수의 포착 시약 부위를 포함하는 크로마토그래피식 검출 장치이며, 적어도 하나의 포착 시약 부위의 상류에 상기 포착 물질과 피분석 물질의 결합 반응 조건을 최적화하기 위한 시약을 포함하는 크로마토그래피식 검출 장치.
[19] 상기 [18]에 있어서, 상이한 피분석 물질과 각각의 피분석 물질에 대한 포착 시약 사이에서 교차 반응이 생길 수 있으며, 결합 반응의 조건을 최적화함으로써 교차 반응을 억제하는 크로마토그래피식 검출 장치.
[20] 상기 [5] 내지 [19] 중 어느 하나에 있어서, 검체가 세균 또는 바이러스를 포함하는 검체이며, 검체를 전처리하는 기능을 갖는 기능 부위가 세균 또는 바이러스로부터 피분석 물질을 추출하는 기능을 갖는 것인 크로마토그래피식 검출 장치.
[21] 상기 [20]에 있어서, 전처리한 검체 중의 피분석 물질이 리간드 또는 포착 물질과 결합하는 반응의 조건을 최적화하기 위한 기능 부위를 더 포함하는 크로마토그래피식 검출 장치.
[22] 상기 [5] 내지 [21] 중 어느 하나에 있어서, 검체가 비강 또는 인두 채취물(swab)이며, 검체를 전처리하는 기능을 갖는 기능 부위가 비강 또는 인두 채취물 중의 다당류를 응집시키는 시약을 포함하고, 여과 기능에 의해 응집된 다당류를 제거하는 필터를 포함하는 크로마토그래피식 검출 장치.
[23] 상기 [5] 내지 [21] 중 어느 하나에 있어서, 피분석 물질이 A형 인플루엔자 바이러스 항원 및 B형 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하고, A형 인플루엔자 바이러스 항원을 포착하는 포착 시약 부위 및 B형 인플루엔자 바이러스 항원을 포착하는 포착 시약 부위를 포함하는 크로마토그래피식 검출 장치이며, A형 인플루엔자 바이러스 항원과 B형 인플루엔자 바이러스 항원을 포착할 수 있는 포착 시약의 교차 반응에 의한 결합 및/또는 B형 인플루엔자 바이러스 항원과 A형 인플루엔자 바이러스 항원을 포착할 수 있는 포착 시약의 교차 반응에 의한 결합을 억제할 수 있는 시약을 포함하는 기능 부위를 포함하는 크로마토그래피식 검출 장치.
[24] 상기 [1] 내지 [23] 중 어느 하나에 있어서, 표지 시약이 효소 또는 불용성 입상 물질에 의해 표지된 리간드인 크로마토그래피식 검출 장치.
[25] 상기 [1] 내지 [24] 중 어느 하나에 있어서, 피분석 물질과 리간드의 결합 및 피분석 물질-리간드 복합체와 포착 시약의 결합이 항원-항체 반응에 의해 생기는 것인 크로마토그래피식 검출 장치.
[26] 상기 [1] 내지 [25] 중 어느 하나에 있어서, 고상 지지체가 니트로셀룰로오스, 아세트산 셀룰로오스, 나일론 및 폴리에테르술폰으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 크로마토그래피식 검출 장치.
<발명의 효과>
본 발명의 면역 크로마토그래피 장치를 이용함으로써, 면역 크로마토그래피식 검출 장치의 고상 지지체 상에서 피분석 물질과, 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약이 특이적으로 결합하는 반응, 및 피분석 물질 -표지 시약의 복합체와 포착 시약이 특이적으로 결합하는 반응의 조건이 연속적으로 최적화되기 때문에, 신속하고, 간편하며, 또한 감도ㆍ특이성이 우수한 검출을 행할 수 있다. 또한, 전처리에 의해 반응에 부적절하게 된 검체도 고상 지지체 상에서 최적화될 수 있기 때문에 신속한 검출이 가능하게 된다. 또한, 본 발명의 장치는 검체 처리 수단 및 처리한 검체를 반응에 적합하게 하는 수단을 구비하고 있으며, 보다 신속하고 또한 고감도의 검출을 행할 수 있다.
본 명세서는 본원의 우선권 일본 특허 출원 제2004-169200호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1은 본 발명의 검출 장치의 일례를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 검출 장치의 일례를 나타내는 도면이다.
도 3은 불순물 여과 기능을 갖는 부재를 이용한 검출 장치를 나타내는 도면이다.
도 4는 복수의 피분석 물질을 검출할 수 있는 본 발명의 멀티 검출 장치이며, 각 피분석 물질의 반응 조건을 최적으로 조절할 수 있는 검출 장치를 나타내는 도면이다.
도 5는 미리 전처리한 검체를 최적화할 수 있는 검출 장치를 나타내는 도면이다.
도 6은 미리 전처리한 검체를 최적화할 수 있는 검출 장치를 나타내는 도면이다.
도 7은 종래의 면역 크로마토그래피 검출 장치를 나타내는 도면이다.
도 8은 불순물 흡착 물질을 고상 지지체에 설치한 검출 장치를 나타내는 도면이다.
<부호의 설명>
1: 기능 부위 2: 검체 공급 부위
3: 표지 시약 부위 4: 포착 시약(포착 항체) 부위
5: 대조 부위(컨트롤 부위) 6: 고상 지지체(니트로셀룰로오스막)
7: 흡수 부위(흡수 패드) 8: 톱 라미네이트 또는 하우징
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명은 검체 중의 피분석 물질을 검출하는 장치이며, 면역 크로마토그래피식 검출 장치, 검사법 및 이것을 응용한 키트이다. 본 발명의 검출 장치는 시트상의 고상 지지체 상에 적어도 피분석 물질을 포함하는 것으로 추정되는 검체 또는 이 검체와 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약의 혼합물을 공급하는 검체 공급 부위, 및 상기 피분석 물질-상기 표지 시약 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있는 포착 시약을 고정화한 포착 시약 부위를 포함한다. 검체 공급 부위에 피분석 물질을 포함하는 것으로 추정되는 검체를 공급하면, 검체는 표지 시약 부위, 포착 시약 부위의 순으로 통과하도록 구성되어 있다. 본 발명의 장치는, 또한 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약을 고상 지지체 상에서 전개 가능하게 유지하는 표지 시약 부위를 포함할 수도 있으며, 이 경우 검체와 표지 시약의 결합은 고상 지지체 상에서 행해지기 때문에, 검체 공급 부위에는 검체만을 공급하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 장치는 고상 지지체 상에서 발생하는 항원 항체 반응 등의 결합 반응을 최적화하는 수단을 구비하고 있다. 구체적으로는, 검체가 검체 공급 부위에 공급되어 고상 지지체 상에서 전개하여 표지 시약 부위로 이동하고, 검체 중의 피분석 물질과 표지 시약이 특이적으로 결합하여 피분석 물질-표지 시약 복합체를 형성하는 과정에서, 미리 고상 지지체 상의 검체 공급 부위와 표지 시약 부위 사이에 배치된 1개 이상의 부재 또는 시약을 포함하는 기능 부위에 의해 검체로부터 피분석 물질을 분리하고, 또한 피분석 물질과 표지 시약이 특이적으로 결합하기 쉬운 상태로 조절된다. 또한, 상기 복합체가 포착 시약과 특이적으로 결합하여 피분석 물질-표지 시약-포착 시약 복합체를 형성하는 과정에서, 상기 복합체는 미리 고상 지지체 상의 표지 시약 부위와 포착 시약 부위 사이에 배치된 1개 이상의 부재 또는 시약을 포함하는 기능 부위와 접촉함으로써, 상기 복합체가 고상 지지체 상에서 전개하여 포착 시약 부위로 이동하는 과정에서, 상기 복합체와 포착 시약이 특이적으로 결합하기 쉬운 상태로 조절된다. 또한, 본 발명의 장치는 산 처리나 알칼리 처리 등의 전처리에 의해, pH 등의 조건이 항원 항체 반응 등의 결합 반응에 적합하지 않은 검체의 조건을 최적화하는 수단을 구비하고 있다. 구체적으로는, 검체가 검체 공급 부위로 공급되어 고상 지지체 상에서 전개하여 표지 시약 부위로 이동하고, 검체 중의 피분석 물질과 표지 시약이 특이적으로 결합하여 피분석 물질-표지 시약 복합체를 형성하는 과정에서, 미리 고상 지지체 상의 검체 공급 부위와 표지 시약 부위 사이에 배치된 1개 이상의 부재 또는 시약을 포함하는 기능 부위에 의해 최적화된다. 또한, 본 발명의 장치는 검체를 전처리하는 수단을 구비하고 있다. 여기서, 전처리란 검체 중에서 피분석 물질을 추출 또는 단리하는 것, 및 검체 중의 불순물을 제거하는 것을 말한다.
본 발명의 장치에 있어서, 상기한 고상 지지체 상에서 발생하는 항원 항체 반응 등의 결합 반응을 최적화하는 수단, 검체의 조건을 최적화하는 수단 및 검체를 전처리하는 수단은, 각각 고상 지지체 상에서 발생하는 항원 항체 반응 등의 결합 반응을 최적화하는 기능, 검체의 조건을 최적화하는 기능 및 검체를 전처리하는 기능을 갖는 부재 또는 시약을 포함하는 기능 부위를 포함한다.
본 발명의 장치에 있어서, 검체 공급 부위는 고상 지지체의 한쪽단을 그대로 사용할 수도 있으며, 고상 지지체와는 별도의 부재, 예를 들면 니트로셀룰로오스, 아세트산 셀룰로오스, 나일론, 폴리에테르술폰, 폴리비닐알코올, 폴리에스테르, 유리 섬유, 폴리올레핀, 셀룰로오스, 폴리스티렌 등의 천연 또는 합성 중합체, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 부재로 구성하고, 일단 검체 또는 검체와 표지 시약의 혼합물을 흡수하고, 이어서 흡수한 검체 또는 혼합물을 고상 지지체에 공급하며 고상 지지체 상에서 모관류에 의해 용액이 전개 이동 가능하도록 배치된다. 검체 공급 부위가 상기 반응 조건을 조절, 최적화하는 시약을 함유, 즉 검체 공급 부위가 기능 부위를 겸할 수도 있으며, 검체 공급 부위를 직접 전개액에 침지하는 경우에는 검체 공급 부위에 함유된 상기 시약이 전개액 상으로 방출되기 때문에, 바람직하게는 독립적으로 설치한다. 또한, 표지 시약 부위의 배치는 고상 지지체 상에 표지 시약을 도포하여 건조시킬 수도 있고, 고상 지지체와는 별도의 상술한 부재에 함침시켜 건조시킨 것을 고상 지지체 상 또는 고상 지지체와 연속적으로 연결시킬 수도 있다. 포착 시약 부위의 배치도 마찬가지로 고상 지지체 상에 포착 시약을 도포하여 건조시킬 수도 있고, 고상 지지체와는 별도의 상술한 부재에 함침시켜 건조시킨 것을 고상 지지체 상 또는 고상 지지체와 연속적으로 연결시킬 수도 있다(도 1 및 2).
본 발명의 방법에 있어서는, 우선 피분석 물질을 포함하는 것으로 추정되는 검체를 검체 공급 부위에 공급한다. 본 발명의 방법에 있어서 분석하고자 하는 피분석 물질은 한정되지 않지만, 통상은 항원 또는 항체이다. 검체도 한정되지 않으며, 전혈, 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 객담, 비강 또는 인두 채취물, 땀, 대변 등의 생체 시료 외에, 육류, 식물 등의 음식물 추출물, 오수, 흙탕물, 토양 등의 환경 유래의 시료, 균, 바이러스 등의 미생물 배양액 또는 부유액 등, 균이나 바이러스 등의 추출물이 포함된다.
검체를 공급할 때에는 희석 등의 처리를 행하지 않고, 검체를 검체 공급 부위에 직접 공급할 수도 있다. 또한, 점성 등에 의해 고상 지지체 상에서 용이하게 전개 이동할 수 없는 검체에 대해서는 미리 전개액으로 희석하거나, 검체를 채취한 면봉 등의 채취 기구를 직접 검체 공급 부위에 접촉시켜, 전개액을 상기 채취 기구에 공급함으로써 면봉에 부착된 검체를 세정하면서, 검체 공급 부위에 그 세정액을 공급할 수도 있다. 전개액은 피분석 물질을 검출 공정상 지장이 없을 정도로 고상 지지체 상에 전개시킬 수 있다면, 산성 물질, 염기성 물질, 계면활성제, 변성제 등을 포함하는 각종 완충액일 수도 있으며, 어떠한 조성의 용액이어도 상관없다.
상술한 방법으로 검체 공급 부위에 공급된 검체 중의 피분석 물질은, 고상 지지체 상에서 전개 이동하여 표지 시약을 유지한 부위(표지 시약 부위)에서 피분석 물질-상기 표지 시약 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 포착 시약 부위에서 포착 시약에 포착되어 고상 지지체 상에 고정화된다.
이 때, 검체 공급 부위와 표지 시약 부위는 동일한 부위일 수도 있거나, 공간적으로 떨어져 존재하는 다른 부위일 수도 있다. 양쪽 부위가 상이한 부위인 경우, 검체 공급 부위와 표지 부위가 부분적으로 접촉하여 모관류에 의해 소통될 수도 있거나, 접촉하지 않고 양쪽 부위 사이에 고상 지지체 또는 기능 부위가 존재하여 상기 고상 지지체 또는 기능 부위를 통해 모관류에 의해 소통될 수도 있다. 여기서, 「모관류에 의해 소통」이란, 소통 부위 사이에서 검체 등의 유체가 모관 현상에 의해 이동할 수 있는 것을 말한다. 또한, 본 발명의 장치는 그 피분석 물질과 표지 시약이 고상 지지체와 분리된 부위에서 미리 접촉하는 구성을 취할 수도 있다. 「피분석 물질과 표지 시약이 고상 지지체와 분리된 부위에서 미리 접촉한다」란, 표지 시약이 고상 지지체에 포함되어 있지 않거나, 또는 고상 지지체와 접촉되어 있어 액체가 고상 지지체와 소통할 수 있는 부위, 예를 들면 검체 공급 부위 등에도 포함되어 있지 않은 것을 말한다. 이 경우, 피분석 물질과 표지 시약은 고상 지지체 및 고상 지지체와 접촉하고 있는 부위 이외에서 미리 접촉한다. 예를 들면, 종래의 면역 크로마토그래피식 검출 장치에 있어서는, 고상 지지체와 표지 시약을 포함하는 다공질 지지체가 접촉하는 형태로 구성되어 있는 것이 있으며, 상기 종래의 장치에 있어서는 표지 시약을 포함하는 다공질 지지체가 검체 공급 부위를 겸하고, 상기 검체 공급 부위에 검체를 첨가함으로써 검체와 표지 시약이 접촉하고, 검체와 표지 시약의 혼합물은 즉시 고상 지지체로 이동한다. 즉, 이 종래의 장치에 있어서는, 검체와 표지 시약의 접촉은 고상 지지체와 접촉한 부위에서 행해지는 것이며, 고상 지지체와 분리된 부위에서는 행해지지 않는다. 본 발명에 있어서는 검체와 표지 시약의 접촉 시간 등을 조절하기 위해, 이 종래의 장치와는 달리 검체와 표지 시약의 혼합물을 고상 지지체 및 고상 지지체와 접촉하고 있는 부위 이외의 부위, 즉 고상 지지체와 분리된 부위에서 접촉한다. 표지 시약과 검체의 접촉은, 예를 들면 검체 공급용 장치 중에서 행할 수도 있다. 검체 공급용 장치는 검출 장치 밖의 부속 부품이며, 채취한 검체를 넣어 특정한 처리를 행하기 위한 용기이다. 상기 장치에는 바이알, 실린지, 튜브 등이 포함된다. 또한, 상기 장치는 용기뿐만 아니라, 검체를 검출 장치에 첨가 공급할 때 검체를 여과하기 위한 여과 수단을 포함할 수도 있다. 검체 첨가용 장치는, 검체를 수용하는 용기 부분과 용기 내의 검체를 검출 장치에 첨가 공급하는 부분을 포함한다. 후자의 검체를 첨가 공급하는 부분은 검체를 용기 내에서 배출하기 위한 노즐(개구부)을 갖는 부분을 갖고, 상기 부분은 용기 부분의 뚜껑을 겸할 수도 있다. 후자의 검체를 검출 장치에 첨가 공급하는 부분은 노즐 부분 또는 뚜껑 부분이라고도 한다. 또한, 검체 첨가용 장치가 여과 수단을 포함하는 경우, 검체 공급용 장치는 여과 필터를 포함하는 필터 하우징을 포함하는 노즐 부분과 용기 부분의 2개의 부품으로 구성되어 있을 수도 있다. 이 경우의 필터 하우징은 검체를 필터에 통과시키는 개구부와 필터를 통과한 검체를 배출하는 개구부를 가지며, 양 개구부 사이에 필터가 존재한다. 용기는, 예를 들면 검체를 필터에 압력을 가하여 통과시킬 수 있는 실린지 등을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 장치에 있어서, 피분석 물질이 고상 지지체 상에서 전개 이동하여 표지 시약 부위에서 피분석 물질-상기 표지 시약 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 포착 시약 부위에서 포착 시약에 포착되어, 고상 지지체 상에 고정화될 때까지의 과정에 있어서, 피분석 물질은 미리 고상 지지체 상의 임의의 장소에 배치된 하나 이상의 반응 조건을 조정, 최적화하는 부재 또는 시약, 또는 양자를 포함하는 기능 부위에 접촉하거나, 또는 기능 부위를 통과한다. 상기 부재 또는 시약을 포함하는 기능 부위는 그 목적에 따라 검체 공급 부위와 표지 시약 부위의 사이, 또는 표지 시약 부위와 포착 시약 부위의 사이에 설치하는 것이 바람직하다. 「검체 공급 부위와 표지 시약 부위의 사이」의 경우, 장치는 검체 공급 부위 또는 표지 시약 부위를 포함하고, 이 경우 검체 공급 부위 또는 표지 시약 부위가 상기 부재 또는 시약을 포함하는 기능 부위를 겸하게 된다. 구체적으로는 검체 공급 부위 또는 표지 시약 부위를 특정한 기능을 갖는 부재를 이용하여 구성하거나, 또는 검체 공급 부위 또는 표지 부위에 특정한 기능을 갖는 시약을 포함시키는 것이 바람직하다.
미리 고상 지지체 상에 배치되는 기능 부위를 구성하는 부재는, 예를 들면 니트로셀룰로오스, 아세트산 셀룰로오스, 나일론, 폴리에테르술폰, 폴리비닐알코올, 폴리에스테르, 유리 섬유, 폴리올레핀, 셀룰로오스, 이들 혼합 섬유를 포함하는 인공 중합체를 들 수 있다. 단, 이것들로 한정되지 않으며, 예를 들면 기능 부위에 여과 기능을 갖게 하는 경우, 필터로서 작용할 수 있는 모든 부재를 사용할 수 있다. 상기 부재는 고상 지지체 상에서 전개하는 액체를 여과하는 것뿐만 아니라, 반응 조건을 조정하는 시약을 포함할 수 있다. 상기 기능 부위는 고상 지지체와 모관류에 의해 소통하고, 용액이 기능 부위를 통과하여 고상 지지체 상에서 전개 이동할 수 있도록 배치된다. 또한, 기능 부위가 포함하는 시약은 산성 물질, 염기성 물질, 계면활성제, 변성제 등 각종 화학 약품이나 효소ㆍ항체ㆍ비오틴ㆍ아비딘ㆍ프로테인 A 등 각종 생화학 시약을 들 수 있다. 시약의 배치 방법으로서는 검체가 고상 지지체 상에서 전개하는 과정에서 접촉하도록 구성된다면, 고상 지지체 상에 도포하여 건조시킬 수도 있고, 상기 부재에 함침시켜 건조한 것을 고상 지지체 상 또는 고상 지지체 사이에 고상 지지체가 상기 부재를 통해 모관류에 의해 소통하도록 연속적으로 연결시킬 수도 있다. 도 1 및 도 2는 본 발명의 장치의 일례를 나타내는 도면이다. 도면에 나타낸 바와 같이, 기능 부위로서 복수의 기능 부위를 설치할 수 있다. 기능 부위를 설치하는 위치도 적절하게 설정할 수 있다. 기능 부위의 설치 방법도, 도 1의 우측 기능 부위와 같이 고상 지지체 상에 얹어 설치할 수도 있고, 도 2의 우측 기능 부위와 같이 고상 지지체 사이에 고상 지지체를 모관류에 의해 소통하도록 설치할 수도 있다. 이 경우, 기능 부위의 부재가 되는 소재(재료)는 고상 지지체의 소재와 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 도 2의 우측 기능 부위의 경우, 전개 이동하는 검체 등의 유체 모두가 기능 부위와 접촉하여, 기능 부위를 통과할 수 있기 때문에 보다 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 기능 부위를 구성하는 부재를 사용하지 않고, 기능 부위를 고상 지지체에 직접 포함시킬 수도 있다. 예를 들면, 후술하는 불순물을 흡착 제거할 수 있는 물질을 고상 지지체 상에 도포하거나 함침시킴으로써 포함시키는 것이 바람직하다. 고상 지지체 상의 기능 부위를 포함시키는 부위로서는, 검체 공급 부위와 표지 시약 부위의 사이, 또는 표지 시약 부위와 포착 시약 부위의 사이가 있는데, 검체 공급 부위와 표지 시약 부위의 사이가 바람직하다.
상기 기능 부위의 기능 중 하나는 검체의 전처리 기능이며, 예를 들면 여과 기능 또는 기능 부위의 부재를 형성하는 소재에 의한 소수적, 정전기적 흡착 등 물리적 흡착에 의한 검체 중의 불순물 제거이다. 여기서, 불순물이란 고상 지지체 상에서의 검체의 전개 이동을 저해하거나, 또는 고상 지지체 상에서 피분석 물질과, 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약이 특이적으로 결합하는 반응 및 피분석 물질-표지 시약의 복합체와 포착 시약이 특이적으로 결합하는 반응을 저해할 수 있는 물질을 말한다. 상술한 바와 같이, 검체로서는 여러 종의 것을 사용할 수 있지만, 검체에 의해 특유의 불순물이 포함되는 경우가 있다. 예를 들면, 혈액 검체에는 피브린이나 적혈구가 존재하고, 비강이나 인두 채취물 등에는 콘드로이틴 황산 등의 다당류가 존재하며, 대변 등에는 여러가지 고형물이 존재한다. 기능 부위의 부재로서 다공성 섬유를 사용하면, 상기 부재는 필터로서 여과 기능을 발휘하여 검체 중의 불순물을 제거할 수 있다. 불순물의 제거에 의해 피분석 물질 또는 피분석 물질-표지 시약 복합체가 단리되어 각각 표지 시약 또는 포착 시약과 특이적으로 결합할 수 있는 상태가 된다. 또한, 상기 기능 부위의 별도의 작용으로서, 상기 시약을 함침시킨 경우에는 상기 시약의 안정된 유지를 들 수 있다. 또한, 기능 부위와 고상 지지체의 용액 전개 속도, 용액 흡수량의 차에 의한 상기 기능 부위에 포함되는 시약의 작용 효과의 시간 및 농도 구배를 조절하는 기능도 갖는다.
상기 기능 부위의 기능 중 하나인 전처리 기능은, 검체로부터 피분석 물질의 추출도 포함한다. 임상 검체 중의 피분석 물질을 검출하는 경우에, 피분석 물질은 미생물이나 세포 등의 세포막, 세포벽, 세포내 소기관 등 또는 세포간 물질 등의 생체 유래 매트릭스에 존재하는 경우가 많다. 예를 들면, 세균 감염증이나 바이러스 감염증을 검출하는 경우, 검체 중의 세균이나 바이러스의 존재를 검출하기 위해 세균의 세포벽 등에 존재하는 단백질 등의 물질을 검출한다. 종래의 검출법에 있어서는, 미리 검체를 산, 알칼리 용액이나 계면활성제로 전처리하고, 세포막이나 세포벽에 존재하는 상기 물질을 가용화함으로써 추출하여 추출물을 검체 공급 부위에 공급하여 검출하였다. 본 발명의 장치에 있어서는, 고상 지지체 상에서 피분석 물질의 추출도 행할 수 있다. 즉, 고상 지지체 상에 전개 이동하고 있는 검체가, 기능 부위에 포함되는 산ㆍ염기ㆍ계면활성제 등 각종 화학 약품이나 효소ㆍ항체ㆍ비오틴ㆍ아비딘ㆍ프로테인 A 등 각종 생화학 시약과 접촉하여 미생물 및 세포 매트릭스가 파괴되고, 또한 파괴된 불순물이 흡착 등에 의해 검체 중에서 제거되어 피분석 물질만이 단리되어 전개 이동한다.
또한, 기능 부위의 별도의 기능으로서, 피분석 물질과 표지 시약이 항원-항체 반응할 경우, 특이적 결합 반응을 쉽게 일으키게 하기 위해 pHㆍ무기염류 농도를 최적 범위로 조정하고, 특이 반응을 증강시키는 기능을 들 수 있다. 여기서, 최적 범위란 일정한 변동성을 갖는 범위이며, 반응이 진행하는 데 바람직한 범위를 말한다. 이러한 기능을 갖는 시약으로서 계면활성제, 고분자 중합체, 산성 화합물, 염기성 화합물 등의 시약이 예시된다. 예를 들면, 상술한 바와 같이 검체를 검출 장치에 공급하는 전단계에서, 또는 고상 지지체 상에서 전처리한 경우, 전처리에 사용한 산, 알칼리, 계면활성제 등에 의해 항원-항체 반응이 저해된다. 이 경우, 본 발명의 장치에 의해 산성화 또는 염기성화된 검체를 중화할 수 있거나, 또는 계면활성제를 제거하여 반응을 최적 조건에서 진행시키는 것이 가능해진다. 또한, 비특이 반응을 경감하는 작용도 들 수 있으며, 이 경우에는 계면활성제나 고분자 중합체, 염기성 화합물 등의 시약이 사용된다. 또한, 복수의 피분석 물질을 검출하는 멀티 분석의 경우, 고상 지지체 상에 복수의 표지 시약 부위 및 복수의 포착 시약 부위를 갖고, 각각의 포착 시약 부위에서의 반응 조건을 최적화하거나, 또는 각 반응 성분의 교차 반응을 경감하는 기능을 갖는 기능 부위를 설치할 수 있다. 이 경우에는 각각의 포착 시약 부위에 있어서 pHㆍ무기 염류 농도를 조정하는 계면활성제, 고분자 중합체, 산성 화합물, 염기성 화합물 등의 시약을 기능 부위에 포함시킨다.
도 1의 장치의 경우, 예를 들면 3개의 기능 부위 중, 좌측 기능 부위는 검체 공급 부위 상에 위치하여 검체 공급 부위와 중첩되어 있고, 중앙 기능 부위는 검체 공급 부위 및 표지 시약 부위와 부분적으로 접촉하여 모관류에 의해 소통하고 있다. 또한, 우측 기능 부위는 고상 지지체 상의 표지 시약 부위와 포착 시약 부위에 위치한다. 예를 들면, 좌측 기능 부위에서 검체를 전처리하고, 중앙 기능 부위에서 전처리한 검체의 pH 등의 조건을 피분석 물질과 표지 시약의 결합 반응을 최적화하도록 조정하고, 우측 기능 부위에서 피분석 물질과 포착 시약의 결합 반응을 최적화하도록 조정할 수 있다. 도 1의 장치의 경우, 검체 공급 부위와 표지 시약 부위는 공간적으로 떨어져 존재하고 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 양태를 도면에 기초하여 설명한다.
도 3은 불순물 여과 기능을 갖는 기능 부위를 이용한 본 발명의 장치를 나타내고, 일례로서 비강 또는 인두 채취물로부터 인플루엔자 바이러스를 검출하는 경우를 들 수 있다. 이 경우, 검체 공급 부위 (2)와 표지 시약 부위 (3) 사이에, 비강 또는 인두 채취물 중에 포함되는 비특이적 반응 성분인 콘드로이틴 황산 등의 점액 다당류를 응집시키는 DEAE-덱스트란 등의 시약을 포함시켜 건조시킨 다공질이고, 여과 기능을 겸비한 기능 부위 (1)을 배치한다. 검체인 인두 채취물을 임의의 부유액에 부유하여, 부유액을 검체 공급 부위에 첨가하거나 또는 검체 공급 부위 (2)만을 상기 부유액에 침지함으로써 검체 공급 부위 (2)에 검체를 공급한다. 검체는 검체 공급 부위 (2)로부터 기능 부위 (1)로 전개 이동하고, 시약과 접촉함으로써 콘드로이틴 황산 등의 점액 다당류가 응집되고, 여과 기능을 겸비한 기능 부위에서 포착되어, 표지 시약 부위 (3)으로 전개 이동할 수 없기 때문에 비특이적 반응을 억제할 수 있다. 도 3에 나타낸 장치의 경우, 기능 부위가 특정한 부재를 포함하고, 특정한 시약을 더 포함함으로써 검체 중의 불순물을 제거하는 전처리 기능을 갖는다.
대변 등의 고형물이 많이 포함되는 검체의 경우, 필터 등의 여과 기능을 갖는 부재를 기능 부위로서 이용하는 것이 바람직하다. 필터로서 작용할 수 있는 부재는 당업자라면 용이하게 선택할 수 있다. 또한, 특정한 불순물이 포함되는 검체의 경우에는, 상기 불순물을 흡착 또는 응집시켜 전개 이동을 저지할 수 있는 부재를 사용하는 것이 바람직하다. 검체 중의 불순물을 제거할 수 있게 하기 위해서는, 불순물을 흡착 또는 응집시킬 수 있는 물질을 기능 부위 부재에 침윤시켜 건조시켜 두는 것이 바람직하다. 도 3에 있어서는 기능 부위로서 고상 지지체와는 별도의 부재를 사용하고 있지만, 도 8과 같이 불순물을 흡착 또는 응집시키는 물질을 고상 지지체에 흡착 등에 의해 포함시킬 수도 있다. 도 8에 나타낸 장치의 경우, 검체 공급 부위 (2)와 표지 시약 부위 (3) 사이의 고상 지지체에 물질을 포함시키고 있다. 이러한 예로서 황색 포도구균(Staphylococcus aureus)의 존재가 의심되는 균 혼합액으로부터의 대장균(E. coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 등의 세균의 항원, 특히 상기 균 혼합액으로부터의 다제 내성 포도구균(MRSA) 세포벽에 존재하는 페니실린 결합 단백질(PBP2') 검출의 경우를 들 수 있다. 황색 포도구균의 세포벽 중에 포함되는 프로테인 A는 면역글로불린 G의 Fc 부분과 특이적으로 결합하기 때문에, 표지 시약 또는 포획 시약과 비특이적 반응을 일으킬 것이 예상된다.
검체로부터 피분석 물질을 추출 또는 단리하는 등의 목적으로, 채취한 검체를 검체 공급 부위에 공급하기 전에 전처리액으로 처리하는 경우에는, 비특이적 반응을 피하기 위해 전처리에 사용하는 전처리액 중에 불순물 흡착 물질을 첨가하는 방법이 고려된다. 그러나, 이 방법에서는 채취한 검체와 전처리액을 반응시킨 후의 반응액에 존재하는 물질 중, 검체 공급 부위에 공급되지 않고 최종적인 시험 판정에 영향을 주지 않는 불순물에 대해서도 불순물 흡착 물질을 준비할 필요가 있기 때문에, 과량의 불순물 흡착 물질을 필요로 한다는 문제가 있다. 또한, 불순물 흡착 물질의 첨가로 인해, 장기 보존시 전처리액에 염석 효과 등에 의한 침전이나 탁함, 불순물 흡착 물질의 분해, 변성에 의한 비특이적 흡착 효율의 저하 등을 일으킬 가능성이 있다는 문제가 있다. 한편, 본 발명의 방법에 있어서는, 검체 공급 부위 (2)와 표지 시약 부위 (3) 사이에 불순물을 흡착하는 물질을 포함하는 부위를 기능 부위 (1)로서 설치함으로써 반응액 중의 시험 판정에 영향을 주는 불순물에 대해서만 불순물 흡착 물질을 준비하면 되기 때문에, 불순물 흡착 물질의 삭감을 도모하는 것이 가능하다. 따라서, 장기 보존시의 전처리액의 필요없는 침전이나 탁함, 불순물 흡착 물질의 분해, 변성에 의한 비특이적 흡착 효율의 저하 등을 피할 수 있다.
구체적으로는, 상기 균 혼합액을 이용하는 경우, 검체 공급 부위 (2)와 표지 시약 부위 (3) 사이에 프로테인 A를 흡착하는 물질을 기능 부위 (1)로서 설치함으로써 상기 문제를 피할 수 있고, 사용하는 불순물 흡착 물질을 감소시키는 것이 가능해진다. 예를 들면, 상기 프로테인 A를 흡착하는 물질로서 면역글로불린 G를 들 수 있다. 면역글로불린 G와 프로테인 A의 친화도는 면역글로불린 G의 유래와 서브클래스에 의해 강약의 차가 보이기 때문에, 프로테인 A와의 친화도가 강한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로 인간 유래의 면역글로불린 G에서는 IgG1, IgG2, IgG4의 서브클래스가 프로테인 A와 강한 친화도를 나타내고, 마우스 유래의 면역글로불린 G에서는 IgG2a, IgG2b, IgG3의 서브클래스가 프로테인 A와 강한 친화도를 나타내며, IgG1의 서브클래스는 약한 친화도를 나타낸다. 래트 유래의 면역글로불린 G는 서브클래스에 상관없이 거의 결합하지 않는다. 검체인 균 현탁액을 검체 공급 부위에 첨가, 또는 검체 공급 부위 (2)만을 상기 균 현탁액에 침지함으로써 검체 공급 부위 (2)에 검체를 공급한다. 전처리가 필요한 경우에는 전처리를 끝낸 균 현탁액을 검체 공급 부위에 첨가하거나, 또는 검체 공급 부위 (2)만을 전처리를 끝낸 균 현탁액에 침지한 후, 검체 공급 부위 (2)에 검체를 공급한다. 검체는 검체 공급 부위 (2)로부터 기능 부위 (1)로 전개 이동하고, 항체 등의 불순물 흡착 물질과 접촉함으로써 프로테인 A를 흡착하고, 표지 시약 부위 (3) 및 포획 시약 부위 (4)로 전개 이동하지 못함으로써 비특이적 반응을 억제할 수 있다. 그룹 G의 연쇄구균의 세포벽 중에 포함되는 프로테인 G도 면역글로불린 G의 Fc 부분과 특이적으로 결합하기 때문에, 표지 시약 또는 포획 시약과 비특이적 반응을 일으키는 것이 예상되고, 이 비특이적 반응의 회피에도 상기 방법을 마찬가지로 이용할 수 있다. 또한, 프로테인 A는 면역글로불린 G의 Fc 부분과 특이적으로 결합하기 때문에, 불순물 흡착 물질로서 상기 친화도가 강한 항체의 Fc 부분을 사용하고, 포착 시약 및/또는 표지 시약으로서 Fc 부분을 제외한 항체를 사용함으로써, 더욱 비특이적 반응을 억제한 검출계를 조합할 수 있다. 또한, 포착 항체 및 표지 시약에 사용하는 항체에 대한 항체를 포함하는 검체의 가능성도 고려할 수 있지만, 이 경우, 이들 포착 항체 및 표준 시약으로서 사용되는 항체에 대한 항체와 특이적으로 흡착하는 물질을 불순물 흡착 물질로서 사용하여 기능 부위 (1)에 설치함으로써 비특이적 반응을 억제할 수 있다. 예를 들면, 마우스에 대한 이호성 항체 HAMA(human anti-mouse antibody)는 몇％ 내지 수십％의 빈도로 인간 혈청 중에 존재하는 것이 보여지고 있으며, HAMA에 대한 항체를 불순물 흡착 물질로서 사용하여 기능 부위 (1)에 설치함으로써 비특이적 반응을 억제할 수 있다.
검체가 혈액인 경우, 피브린이나 적혈구가 불순물로서 예시되며, 이들의 제거를 위해서는 항피브린 항체나 항적혈구 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 검체가 대변인 경우에는 근 조직, 골편, 근체의 사해, 지방 등이 예시되며, 이들의 제거를 위해서는 카올린 광물이나 벤토나이트 광물 등을 이용하는 것이 바람직하다.
도 4는 복수의 피분석 물질을 검출할 수 있는 멀티 검출 장치에 있어서, 각 피분석 물질의 반응 조건을 최적으로 조정할 수 있는 장치를 나타내고, 일례로서 인플루엔자 바이러스의 A형 항원 및 B형 항원을 검출하는 경우를 들 수 있다. 이 경우에는 A형 표지 시약 복합체 및 B형 표지 시약 복합체가 포함되는 표지 시약 부위 (3)와, A형 항원-A형 표지 시약 복합체를 포착하는 포착 시약 부위 (4) 및 B형 항원-B형 표지 시약 복합체를 포착하는 포착 시약 부위 (4')를 고상 지지체 상에 설치하고, 포착 시약 부위 (4)와 포착 시약 부위 (4')의 사이에 A형 항원-A형 표지 시약 복합체와 포착 시약 부위 (4')와의 결합을 억제하는 NaCl 등의 시약을 포함시켜 건조시킨 부재를 기능 부위 (1)로서 배치한다. 이 경우, 시약을 고상 지지체에 직접 포함시킬 수도 있다. 검체 공급 부위 (2)에는 미리 A형 항원이 결합하기 쉽고, B형 항원이 결합하기 어렵도록 구성된 부유액에 부유된 검체가 공급되고, A형 항원 및 B형 항원은 전개 이동하여 표지 시약 부위 (3)로 A형 항원-A형 표지 시약 복합체 및 B형 항원-B형 표지 시약 복합체가 형성된다. 상기 A형 항원-A형 표지 시약 복합체는 포착 시약 부위 (4)에 포착되지만, 일부의 상기 A형 항원-A형 표지 시약 복합체와 B형 항원-B형 표지 시약 복합체가 포착 시약 부위 (4')로 전개 이동할 때, 상기 기능 부위 (1)를 통과함으로써 전개액에 A형 항원-A형 표지 시약 복합체와 포착 시약 부위 (4')와의 결합을 억제하는 NaCl 등의 시약이 방출되고, A형 항원-A형 표지 시약 복합체와 포착 시약 부위 (4')의 교차 반응이 억제된다. 교차 반응을 억제하는 물질로서는 NaCl 등의 염류 외에, 이온성 계면활성제를 들 수 있다. 또한, pH를 조정할 수도 있으며, 이 경우에는 완충액, 산성 물질, 염기성 물질, 무기염, 유기염, 아미노산 등을 시약으로서 기능 부위에 포함시키는 것이 바람직하다. 기능 부위에 포함시키는 이들 시약의 농도나 염은 검체의 종류나 최적 조건에 따라 적절하게 결정하는 것이 바람직하다. 일반적으로는 반응시에 염 농도가 최적 범위인 1.5 M 내지 50 mM가 되도록, pH가 5.5 내지 8.5가 되도록, 아미노산이 5 ％(w/vol) 내지 10 ％(w/vol)가 되도록 설정하는 것이 바람직하다.
또한, 교차 반응이 생길 수 없는 복수의 피분석 물질을 한번에 검출하는 경우에도, 물질에 따라 항원-항체 반응의 최적 조건이 상이한 경우가 있다. 이 경우, 각각의 피분석 물질에 대한 포착 시약 부위의 상류에 반응 조건을 최적화하는 시약을 포함하는 기능 부위를 설치하는 것이 바람직하다.
도 5는 미리 전처리한 검체를 최적 조건으로 할 수 있는 본 발명의 장치를 나타내고, 예를 들면 MRSA의 세포벽에 존재하는 PBP2'를 검출하는 경우를 들 수 있다. 이 경우, PBP2'의 추출은 염기성 용액으로 행해지기 때문에 검체는 강염기성이며, 그 상태로는 항원-항체 반응이 저해된다. 따라서, 검체 공급 부위 (2)와 표지 시약 부위 (3) 사이에 알칼리 조건의 pH를 중성으로 하는 산성 시약을 포함시킨 부재를 기능 부위 (1)로서 배치한다. 부재를 사용하는 대신에 고상 지지체에 산성 시약을 포함시켜 기능 부위를 설치할 수도 있다. 세포벽을 파괴하기 때문에 MRSA 균체를 강알칼리 조건하의 부유액에 부유한 후, 검체 공급 부위 (2)로 공급한다. 검체는 검체 공급 부위 (2)로부터 기능 부위 (1)로 전개 이동하고, 시약과 접촉함으로써 전개 중 부유액의 pH가 중성으로 조정됨으로써, PBP2'는 중성 조건하에서 표지 시약 부위 (3)으로 전개 이동하여, 안정된 상태로 표지 시약과 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명의 장치는 검체를 전처리하는 기능을 가질 수도 있다. 이 경우, 검체 공급 부위 (2)와 표지 시약 부위 (3) 사이에 검체를 처리하기 위한 시약, 예를 들면 염기성 물질, 산성 물질, 계면활성제 등을 포함하는 기능 부위 (1)을 배치한다. 이 경우, 전처리에 의해 pH 등의 조건이 바뀐 검체를 반응에 최적인 조건으로 할 필요가 있으며, 고상 지지체 상의 전처리하기 위한 부위의 하류에, 상기 조건을 최적으로 하는 다른 기능 부위를 설치하는 것이 바람직하다.
예를 들면, 대장균, 살모넬라(Salmonella) 등의 세균 항원, 특히 가열 처리에 약한 편모(H 항원)를 검출하는 경우, 검체 공급 부위 (2)와 표지 시약 부위 (3) 사이에 포르말린 등의 시약을 포함시켜 건조시킨 다공질이고, 여과 기능을 겸비한 기능 부위 (1)을 배치한다. 검체인 인두 채취물을 임의의 부유액에 부유하여 부유액을 검체 공급 부위에 첨가하거나 또는 검체 공급 부위 (2)만을 상기 부유액에 침지함으로써, 검체 공급 부위 (2)에 검체를 공급한다. 검체는 검체 공급 부위 (2)로부터 기능 부위 (1)로 전개 이동하며, 시약과 접촉함으로써 균체 표면이 포르말린에 의해 H 항원이 파괴되지 않고 안정적으로 불활성화됨으로써 H 항원을 검출할 수 있다.
예를 들면, 대장균, 용혈 연쇄 구균(hemolytic streptococci), 레지오넬라(Legionella), 캄피로박터(Campylobacter) 등의 당쇄 항원을 검출하는 경우, 당쇄 항원의 추출은 산성 용액에서 행해지기 때문에 검체는 산성이며, 그 상태로는 항원-항체 반응이 저해된다. 따라서, 검체 공급 부위 (2)와 표지 시약 부위 (3) 사이에 산성 조건의 pH를 중성으로 하는 염기성 시약을 포함시킨 부재를 기능 부위 (1)로서 배치한다. 부재를 사용하는 대신에 고상 지지체에 염기성 시약을 포함시켜 기능 부위를 설치할 수도 있다. 균체로부터 당쇄 항원을 박리하기 위해 균체를 산성 조건하의 부유액에 부유한 후, 검체 공급 부위 (2)로 공급한다. 검체는 검체 공급 부위 (2)로부터 기능 부위 (1)로 전개 이동하고, 시약과 접촉함으로써 전개 중 부유액의 pH가 중성으로 조정되어, 당쇄 항원은 중성 조건하에서 표지 시약 부위 (3)로 전개 이동하고, 안정된 상태로 표지 시약과 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 도 6은 당쇄 항원의 추출을 아질산에 의해 행하는 경우에는 아질산 자체가 산성이 강하여 위험하기 때문에, 검체 공급 부위 (2)와 기능 부위 (1) 사이에 아질산나트륨을 포함시킨 부재를 기능 부위 (1')로서 배치한다. 부재를 사용하는 대신에 고상 지지체에 아질산나트륨을 포함시킨 기능 부위를 설치할 수도 있다. 균체를 아세트산 등의 부유액에 부유한 후, 검체 공급 부위 (2)로 공급한다. 검체는 검체 공급 부위 (2)로부터 기능 부위 (1')로 전개 이동하고, 시약과 접촉함으로써 전개 중의 부유액의 아세트산과 아질산나트륨의 반응에 의해 유리된 아질산이 발생하고, 그 아질산의 작용에 의해 균체로부터 당쇄 항원을 박리할 수 있다. 또한, 아질산에 의해 박리된 당쇄 항원은 기능 부위 (1')로부터 기능 부위 (1)로 전개 이동하고, 중화 시약과 접촉함으로써 전개 중 부유액의 pH가 중성으로 조정되어, 당쇄 항원은 중성 조건하에서 표지 시약 부위 (3)로 전개 이동하고, 안정된 상태로 표지 시약과 특이적으로 결합할 수 있다.
면역 크로마토그래피 장치에 있어서, 피분석 물질이 표지 시약 및 포착 물질과 결합한다. 피분석 물질에 결합하는 리간드는, 전형적으로 피분석 물질이 항원인 경우에는 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체이고, 피분석 물질이 항체인 경우에는 상기 항체가 특이적으로 결합하는 항원 또는 항체이고, 피분석 물질이 핵산인 경우에는 상기 핵산에 특이적으로 결합하는 핵산, 항체 또는 결합 단백질이며, 그 밖에 피분석 물질-리간드의 조합으로서 수용체-리간드, 리간드-수용체 등의 조합을 들 수 있다. 표지 시약이란, 상기 리간드와 적당한 표지 물질을 결합시킨 콘쥬게이트이며, 표지 물질로서 금 콜로이드 등의 금속 콜로이드, 셀레늄 콜로이드 등의 비금속 콜로이드, 착색 수지 입자, 염료 콜로이드 및 착색 리포솜 등의 불용성 입상 물질이나 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제 등의 발색 반응을 촉매하는 효소, 형광 색소, 방사선 동위체 등을 들 수 있다. 포착 시약과 표지 시약은 동일한 물질일 수도 있지만, 피분석 물질 중에 상기 물질과 결합하는 부위가 하나만 존재하는 경우에는 표지 시약-피분석 물질-포착 시약 복합체가 형성되지 않는다. 따라서, 이 경우 포착 시약과 표지 시약은 각각 피분석 물질의 다른 부위에 결합할 필요가 있다. 고상 지지체는 모관 현상에 의해 시료 검체가 흡수되어 유동할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 좋다. 예를 들면, 지지체는 니트로셀룰로오스, 아세트산 셀룰로오스, 나일론, 폴리에테르술폰, 폴리비닐알코올, 폴리에스테르, 유리 섬유, 폴리올레핀, 셀룰로오스, 폴리스티렌 등의 천연 또는 합성 중합체, 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 고상 지지체는 바람직하게는 단책상의 스트립 형상을 갖는다. 상기 포착 시약의 고상 지지체에의 고정화는 흡착에 의한 방법, 아미노기, 카르복실기 등의 관능기를 이용하여 화학적으로 결합시키는 방법 등, 공지된 방법으로 행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 이용하는 검출 장치는, 대조용 시약을 더 포함할 수도 있으며, 흡수부를 더 포함할 수도 있다. 대조용 시약은 한정되지 않지만, 예를 들면 표지 시약 중의 리간드가 결합하는 물질을 사용할 수 있다. 대조용 시약은 포착 시약 부위의 하류에 고정화되는 것이 바람직하다. 흡수부는 포착부를 통과한 검체를 흡수함으로써, 검체의 흐름을 제어하는 액체 흡수성을 갖는 부위이며, 검출 장치의 최하류에 설치하는 것이 바람직하다. 흡수부는, 예를 들면 종이로 제조된 흡수부를 흡수 패드로서 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 장치는 시약을 건조 등의 외부 환경으로부터 보호하기 위해 수지제의 라미네이트로 전면 또는 일부가 피복되어 있을 수도 있고, 또한 용기(하우징)에 수납될 수도 있다.
본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로만 한정되는 것이 아니다.
<실시예 1> A형 인플루엔자 바이러스 검출에서 콘드로이틴 황산의 비특이적 반응의 제거(도 3)
(1) 금 콜로이드 항체의 제조
10 mL의 금 콜로이드를 취하고, 100 mM의 탄산칼륨으로 pH를 7.0으로 조정한다. 2 mM의 붕산 용액으로 투석하고, 원심 분리하고, 정제한 항-A형 인플루엔자 바이러스 모노클로날 항체를 2 mM의 붕산 용액을 사용하여 100 ㎍/mL의 농도가 되도록 제조한다. 제조한 항-A형 인플루엔자 바이러스 모노클로날 항체의 최종 농도가 10 ㎍/mL가 되는 양을 충분히 교반시키면서 금 콜로이드에 첨가한다. 5 분 후 10 ％의 BSA를 1 mL 첨가하고, 천천히 10 분간 로테이터로 교반한다. 전량을 원심관으로 옮겨 14000 rpm으로 30 분 동안 4 ℃에서 원심한다. 원심 후 상청을 흡인 폐기하고, 침전되어 있는 금 콜로이드와 항-A형 인플루엔자 바이러스 모노클로날 항체가 감작된 것에 10 mM의 붕산 완충액 1 mL를 첨가하여 부유액을 제조한다.
(2) 금 콜로이드 항체의 건조화
상기 항에서 제조한 금 콜로이드 항체를 양압 분무 장치(BioDot사 제조, BioJet)를 이용하여 6.0의 OD520, 10 μL/cm의 속도 및 양으로 10 mm×300 mm의 폴리스티렌제 부직포에 분무한다. 이어서, 감압 장치 내에서 1 시간 감압 건조하여 건조 금 콜로이드 항체 패드를 제조하였다. 사용시에는 4 mm 간격으로 재단하여 표지 시약 부위 (3)로서 사용하였다.
(3) DEAE-덱스트란 패드의 제조
유리 섬유 여과지를 2 내지 10 ％ DEAE-덱스트란 용액에 침지하고, 45 ℃에서 하룻밤 건조시켜 10 mm×4 mm로 재단하여 기능 부위 (1)로서 사용하였다.
(4) 고상 지지체 (6), 포착 시약 부위 (4) 및 대조 부위 (5)의 설정
포착 시약으로서 항-인플루엔자 바이러스 모노클로날 항체를 2.0의 OD280이 되도록 함유하는 10 mM의 트리스 완충액(pH 7.5) 및 대조용 시약으로서 항-마우스 IgG(다코사)를 3.8 mg/㎖가 되도록 함유하는 10 mM의 인산 용액(pH 7.5)을 각각 양압 분무 장치(BioDot사 제조, BioJet)를 이용하여 1.04 ㎕/cm로 20 mm×200 mm의 밀리포어 하이플로우(Millipore Highflow) HF12004(Millipore)에 도포하고, 45 ℃에서 60 분간 건조시켜 20 mm×4 mm로 재단하여 고상 지지체 (6)로서 사용하였다.
(5) 면역 크로마토그래피식 검출 장치의 제조
톱 라미네이트 (8) 상에 포착 시약 부위 (4) 및 대조 부위 (5)를 포함하는 고상 지지체 (6)를 배치하고, 표지 시약 부위 (3), 기능 부위 (1), 검체 공급 부위 (2)로서 유리 섬유 여과지 및 흡수 부위 (7)로서 두꺼운 여과지를 사용하여 임의의 장소에 배치하였다. 또한, 종래품으로서 기능 부위 (1)가 없는 면역 크로마토그래피식 검출 장치를 제조하여 비교 대조예로 하였다(도 7).
(6) 검출 방법
양성 검체로서 A형 인플루엔자 바이러스 항원을 인산 완충액에 부유시킨 것을 사용하였다. 또한, 비특이적 검체로서 콘드로이틴 황산을 2 ％가 되도록 인산 완충액에 부유한 것을 사용하였다. 상기 항에서 제조한 기능 부위 (1)를 포함하는 본 발명의 장치와 기능 부위 (1)를 포함하지 않는 종래품의 검체 공급 부위 (2)를 각각 검체 150 ㎕에 침지하여 콘드로이틴 황산에 의한 비특이적 반응을 비교 시험하였다.
(7) 시험 결과
종래품은 양성 검체에 대하여 양성 반응을 나타냈지만, 비특이적 검체에 대해서도 양성 반응을 나타내었다. 한편, 본 발명의 장치에 있어서는 양성 검체에 대하여 양성 반응을 나타내고, 비특이적 검체에 대해서는 음성을 나타내었다.
<실시예 2> MRSA의 PBP2'의 검출(도 5)
(1) 금 콜로이드 항체의 제조
10 mL의 금 콜로이드를 취하여 100 mM의 탄산칼륨으로 pH를 8.0으로 조정한다. 2 mM의 붕산 용액으로 투석하고, 원심 분리하고, 정제한 항-PBP2' 항체를 2 mM의 붕산 용액을 사용하여 40 ㎍/mL의 농도가 되도록 제조한다. 제조한 항-PBP2' 항체의 최종 농도가 2 ㎍/mL가 되는 양을 충분히 교반시키면서 금 콜로이드에 첨가한다. 5 분 후 10 ％의 BSA를 1 mL 첨가하고, 천천히 10 분간 로테이터로 교반한다. 전량을 원심관으로 옮겨 14000 rpm으로 30 분 동안 4 ℃에서 원심한다. 원심 후 상청을 흡인 폐기하고, 침전되어 있는 금 콜로이드와 항-PBP2' 항체가 감작된 것에 10 mM의 붕산 완충 용액 1 mL를 첨가하여 부유액을 제조한다.
(2) 금 콜로이드 항체의 건조화
상기 항에서 제조한 금 콜로이드 항체를 양압 분무 장치(BioDot사 제조, BioJet)를 이용하여 0.5의 OD520, 10 μL/cm의 속도 및 양으로 10 mm×300 mm의 폴리스티렌 부직포에 분무한다. 이어서, 감압 장치 내에서 1 시간 감압 건조하여 건조된 금 콜로이드 항체 패드를 제조하였다. 사용시에는 4 mm 간격으로 재단하여 표지 시약 부위 (3)로서 사용하였다.
(3) 중화 패드의 제조
여과지를 0.5 ％의 비이온성 계면활성제가 들어간 인산 완충 용액에 침지하고, 45 ℃에서 하룻밤 건조시켜 1.8 mm×4 mm로 재단하여 기능 부위 (1)로서 사용하였다.
(4) 고상 지지체 (6), 포착 시약 부위 (4) 및 대조 부위 (5)의 설정
포착 시약으로서 항-PBP2' 항체를 7.2 ㎍/m가 되도록 조정한 10 mM의 인산 완충액(pH 7.5) 및 대조용 시약으로서 항-마우스 lgG(다코사)를 3.8 mg/mL가 되도록 제조한 10 mM의 인산 용액(pH 7.5)을 각각 양압 분무 장치(BioDot사 제조, BioJet)를 이용하여 1.04 ㎕/cm로 20 mm×200 mm의 밀리포어 하이플로우 HF12004(Millipore)에 도포하고, 45 ℃에서 60 분간 건조시켜 20 mm×4 mm로 재단하여 고상 지지체 (6)로서 사용하였다.
(5) 면역 크로마토그래피식 검출 장치의 제조
톱 라미네이트 (8) 상에 포착 시약 부위 (4) 및 대조 부위 (5)를 포함하는 고상 지지체 (6)를 배치하고, 표지 시약 부위 (3), 기능 부위 (1), 검체 공급 부위 (2)로서 유리 섬유 여과지 및 흡수 부위 (7)로서 두꺼운 여과지를 이용하여 임의의 장소에 배치하였다. 또한, 종래품으로서 기능 부위 (1)가 없는 면역 크로마토그래피식 검출 장치를 제조하여 비교 대조예로 하였다(도 7).
(6) 검출 방법
양성 검체로서 MRSA, 음성 검체로서 MSSA를 각각 2 백금이로 채취하고, 0.1 N의 NaOH 150 ㎕에 부유하여 95 ℃에서 3 분간 가열하였다. 냉각 후, 상기 항에서 제조한 기능 부위 (1)를 포함하는 본 발명의 장치와 기능 부위 (1)를 포함하지 않는 종래품의 검체 공급 부위 (2)를 검체에 침지하여 중화 패드의 기능을 비교 시험하였다.
(7) 시험 결과
종래품은 음성 검체에 대하여 음성 반응을 나타냈지만, 양성 검체에 대해서도 음성 반응을 나타내었다. 한편, 본 발명의 장치에 있어서는 음성 검체에 대하여 음성 반응을 나타내고, 양성 검체에 대해서는 양성 반응을 나타내었다.
<실시예 3> MRSA의 PBP2'의 검출에서 프로테인 A에 의한 비특이적 반응의 회피(도 8)
(1) 금 콜로이드 항체의 제조
10 mL의 금 콜로이드를 취하여 100 mM의 탄산칼륨으로 pH를 8.0으로 조정한다. 2 mM의 붕산 용액으로 투석, 원심 분리하고, 정제한 항-PBP2' 항체를 2 mM의 붕산 용액을 사용하여 40 ㎍/mL의 농도가 되도록 제조한다. 제조한 항-PBP2' 항체의 최종 농도가 2 ㎍/mL이 되는 양을 충분히 교반시키면서 금 콜로이드에 첨가한다. 5 분 후 10 ％의 BSA를 1 mL 첨가하고, 천천히 10 분간 로테이터로 교반한다. 전량을 원심관으로 옮겨 14000 rpm으로 30 분 동안 4 ℃에서 원심한다. 원심 후 상청을 흡인 폐기하고, 침전되어 있는 금 콜로이드와 항-PBP2' 항체가 감작된 것에 10 mM의 붕산 완충 용액 1 mL를 첨가하여 부유액을 제조한다.
(2) 금 콜로이드 항체의 건조화
상기 항에서 제조한 금 콜로이드 항체를 양압 분무 장치(BioDot사 제조, BioJet)를 이용하여 0.5의 OD520, 10 ㎕/cm의 속도 및 양으로 10 mm×300 mm의 폴리스티렌 부직포에 분무한다. 이어서, 감압 장치 내에서 1 시간 감압 건조하여 건조된 금 콜로이드 항체 패드로 하였다. 사용시에는 4 mm 간격으로 재단하여 표지 시약 부위 (3)로서 사용하였다.
(3) 고상 지지체 (6), 기능 부위 (1), 포착 시약 부위 (4) 및 대조 부위 (5)의 설정
기능 부위 (1)로서, PBP2'를 인식하지 않고, 프로테인 A와의 친화도가 높은 마우스 IgC2a를 3.8 mg/mL가 되도록 조정한 10 mM의 인산 완충액(pH 7.5) 및 포착 시약으로서, 항-PBP2' 항체를 7.2 ㎍/mL가 되도록 조정한 10 mM의 인산 완충액(pH 7.5), 및 대조용 시약으로서, 항-마우스 IgG(다코사)를 3.8 mg/mL가 되도록 조정한 10 mM의 인산 용액(pH 7.5)을 각각 양압 분무 장치(BioDot사 제조, BioJet)를 이용하여 1.04 ㎕/cm로 20 mm×200 mm의 밀리포어 하이플로우 HF12004(Millipore)에 도포하고, 45 ℃에서 60 분간 건조시켜 20 mm×4 mm로 재단하여 고상 지지체 (6)로서 사용하였다.
(4) 면역 크로마토그래피식 검출 장치의 제조
톱 라미네이트 (8) 상에 기능 부위 (1), 및 포착 시약 부위 (4) 및 대조 부위 (5)를 포함하는 고상 지지체 (6)를 배치하고, 표지 시약 부위 (3), 검체 공급 부위 (2)로서 유리 섬유 여과지 및 흡수 부위 (7)로서 두꺼운 여과지를 사용하여 임의의 장소에 배치하였다. 또한, 종래품으로서 기능 부위 (1)가 없는 면역 크로마토그래피식 검출 장치를 제조하여 비교 대조예로 하였다(도 8).
(5) 검출 방법
양성 검체로서 MRSA, 음성 검체로서 MSSA를 각각 2 백금이로 채취하고, 희석 알칼리 용액 150 ㎕에 부유하여 95 ℃에서 3 분간 가열하였다. 냉각 후, 인산 완충액으로 중화하고, 상기 항에서 제조한 기능 부위 (1)를 포함하는 본 발명의 장치와 기능 부위 (1)를 포함하지 않는 종래품의 검체 공급 부위 (2)를 각 검체에 침지하여 프로테인 A에 의한 비특이적 반응을 비교 시험하였다.
(6) 시험 결과
종래품은 양성 검체에 대하여 양성 반응을 나타냈지만, 음성 검체에 대해서도 양성 반응을 나타내었다. 한편, 본 발명의 장치에 있어서는 양성 검체에 대하여 양성 반응을 나타내고, 음성 검체에 대해서는 음성을 나타내었다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 삽입하기로 한다.

Claims (26)

  1. 시트상의 고상 지지체 상에 적어도 피분석 물질을 포함하는 것으로 추정되는 검체 또는 상기 검체와, 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약의 혼합물을 공급하는 검체 공급 부위, 및 상기 피분석 물질-상기 표지 시약 복합체를 특이적으로 결합 포착할 수 있는 포착 시약을 고정화한 포착 시약 부위를 포함하고, 검체 공급 부위와 포착 시약 부위 사이에
    (a) 검체를 전처리하는 기능,
    (b) 검체 중의 피분석 물질과, 피분석 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 표지 시약이 특이적으로 결합하는 반응의 조건을 최적화하는 기능, 및
    (c) 피분석 물질-표지 시약의 복합체와 포착 시약이 특이적으로 결합하는 반응의 조건을 최적화하는 기능
    중 어느 하나 또는 복수의 기능을 갖는 하나 이상의 기능 부위가 설치된 크로마토그래피식 검출 장치이며,
    상기 검체를 전처리하는 기능이 검체로부터 불순물을 제거하는 기능, 검체로부터 피분석 물질을 추출하는 기능, 또는 검체로부터 불순물을 제거하고 검체로부터 피분석 물질을 추출하는 기능이고,
    상기 검체가 비강 또는 인두 채취물(swab)이며,
    상기 검체를 전처리하는 기능을 갖는 기능 부위가 비강 또는 인두 채취물 중의 다당류를 응집시키는 시약을 포함하고,
    여과 기능에 의해 응집된 다당류를 제거하는 필터를 포함하는 크로마토그래피식 검출 장치.
  2. 제1항에 있어서, 피분석 물질이 A형 인플루엔자 바이러스 항원 및 B형 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하고,
    상기 크로마토그래피식 검출 장치가 A형 인플루엔자 바이러스 항원을 포착하는 포착 시약 부위 및 B형 인플루엔자 바이러스 항원을 포착하는 포착 시약 부위를 포함하며,
    (i) B형 인플루엔자 바이러스 항원을 포착할 수 있는 포착 시약과 A형 인플루엔자 바이러스 항원의 교차 반응에 의한 결합;
    (ii) A형 인플루엔자 바이러스 항원을 포착할 수 있는 포착 시약과 B형 인플루엔자 바이러스 항원의 교차 반응에 의한 결합; 또는
    (iii) B형 인플루엔자 바이러스 항원을 포착할 수 있는 포착 시약과 A형 인플루엔자 바이러스 항원의 교차 반응에 의한 결합 및 A형 인플루엔자 바이러스 항원을 포착할 수 있는 포착 시약과 B형 인플루엔자 바이러스 항원의 교차 반응에 의한 결합 양자 모두
    를 억제할 수 있는 시약을 포함하는 기능 부위를 포함하는 것인 크로마토그래피식 검출 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표지 시약이 효소 또는 불용성 입상 물질에 의해 표지된 리간드인 크로마토그래피식 검출 장치.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피분석 물질과 리간드의 결합 및 피분석 물질-리간드 복합체와 포착 시약의 결합이 항원-항체 반응에 의해 생기는 것인 크로마토그래피식 검출 장치.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 고상 지지체가 니트로셀룰로오스, 아세트산 셀룰로오스, 나일론 및 폴리에테르술폰으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 크로마토그래피식 검출 장치.
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