CN112740039A - 免疫层析试验片 - Google Patents

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Abstract

本发明要解决的问题是提供一种试验片，其能够避免在免疫层析试验片中发生所谓的漂白现象，从而能够实现更好的检测和可视性。本发明要解决的另一个问题是提供一种能够防止测试线上的检测值的变异的免疫层析试验片。本发明通过至少包括多孔膜并且具有样品施加区域、展开区域和固定有特异性结合物质的检测区域的免疫层析试验片来解决前述问题，其中该检测区域固定在多孔膜的表面上，并且其中在所述多孔膜的背面上设置有厚度为30μm以上且200μm以下的不透明基材。

Description

免疫层析试验片
技术领域
本发明涉及免疫层析试验片及使用该试验片的免疫层析检测方法。
背景技术
随着用于患者附近处理的POCT(护理点测试，point of care testing)的普及，使用由硝酸纤维素膜等制成的试验片的侧流式免疫层析检测方法已经广泛用作使用抗原-抗体反应的简单免疫测定法。
基于免疫层析的试验片(本文称为免疫层析试验片)通常由位于多孔膜上的样品施加区域、展开区域和检测区域构成。膜被构造成使得靶向特定分析物的检测抗体与样品结合并且能够沿着展开区域向下到达检测区域。负责分析物检测的抗体固定在称为检测区域的展开区域上的某个位置。
当将样品滴加到样品施加区域上且样品包含分析物时，则该分析物特异性地与标记的抗体结合以形成复合体。该复合体在展开区域的下游方向上展开，并与固定抗体结合以在检测区域中进行检测。因此，通过在检测区域中检测标记抗体、分析物和固定抗体的夹心复合体，可以定性或定量地分析分析物。
在具有上述构造的免疫层析试验片的检测区域中检测分析物与缀合物的复合体的方法包括测量来自标记的反射光的强度以计算吸光度(反射吸光度)的方法。通过使用在分析物的检测线上测得的反射光强度与检测区域两侧的两个相邻区域的比值来计算反射吸光度。如果使用此方法，则可能由于在检测复合体的检测区域的上游侧或下游侧附近反射光强度的非特异性增加而干扰测量波形。在这种情况下，当分析物的浓度较低时，不能忽略测量波形的干扰并且不能减去基线，不能精确地检测到特定信号(峰值)，这可能导致测量本身无法进行。
由于测量波形中的干扰频率和测量波形中的扰动程度不是恒定的，因此降低了每个测量的可重复性，并且在每次测量中必须校正为合适的测量值(换言之，确认测量波形)。
在使用白色膜的常规免疫层析检测方法中，测量波形的干扰可以以下现象在视觉上观察到，即膜上的特定位置看起来比周围的颜色相对更白，好像该位置被漂白了(所谓的漂白现象；以下也简称为漂白)。这妨碍了对标记产生的颜色的视觉确认，并可能导致测试结果准确性下降。
尽管这种漂白的原因尚不清楚，但据推测是由于试验片的制造量不同，试验片的保存条件不同，以及试验片的制造条件(例如预处理条件)不同而引起的。
关于消除这种漂白现象的方法，已知以下文件。
专利文件1公开了一种使用样品稀释剂的测定法，该稀释剂中添加了甲醇，以防止在长期保存免疫层析试验片时经常观察到的漂白。
专利文件2公开了通过用特定的表面活性剂例如正辛基-β-D-葡糖苷处理免疫层析试验片的固定有抗体的膜来防止漂白和测量波形的干扰的方法。
引文清单
专利文献
专利文件1：WO 2015/080286
专利文件2：WO 2010/001598
发明内容
技术问题
本发明要解决的问题是提供一种试验片，其能够通过与现有技术完全不同的方法避免在免疫层析试验片中发生所谓的漂白现象，以更好的可视性进行检测。本发明要解决的另一个问题是提供一种能够防止测试线上的检测值变异的免疫层析试验片。
解决问题的方案
本发明人试图改变免疫层析试验片的各种要素以解决该问题，并且惊讶地发现，在包括多孔膜的免疫层析试验片中，通过在表面上固定有诸如抗体之类的特异性结合物质的多孔膜背面上设置不透明基材，可以避免在测试线附近的漂白并且可以防止检测值的变异，由此完成了本发明。具体地，本发明具有以下构造。
(1)一种至少包括多孔膜的免疫层析试验片，所述免疫层析试验片包括样品施加区域，展开区域和检测区域，其中所述检测区域固定在所述多孔膜的表面上，并且其中在所述多孔膜的背面上设置有不透明基材。
(2)根据(1)的免疫层析试验片，其中所述不透明基材是白色基材。
(3)根据(1)或(2)的免疫层析试验片，其中所述不透明基材的厚度为30μm以上且200μm以下。
(4)根据(1)至(3)中任一项的免疫层析试验片，其中所述不透明基材被设置用于所述多孔膜的内衬，并且其中在所述不透明基材的下方设置有衬片。
(5)根据(1)至(4)中任一项的免疫层析试验片，进一步包括用作样品施加区域的样品垫，和包含用胶体金或有色乳胶标记的特异性结合物质的缀合物垫。
(6)根据(1)至(5)中任一项的免疫层析试验片，其中所述特异性结合物质是抗体。
(7)根据(1)至(6)中任一项的免疫层析试验片，其中所述免疫层析试验片是用于通过光学手段检测的试验片。
(8)一种免疫层析检测试剂盒，其包括：根据(1)至(7)中任一项的免疫层析试验片。
(9)一种免疫层析检测方法，包括：使用以下的试验片：
一种包括多孔膜的免疫层析试验片，所述多孔膜至少包括检测区域，该多孔膜具有设置在所述多孔膜的背面上的不透明基材。
(10)根据(9)的免疫层析检测方法，其中所述不透明基材是白色基材。
(11)根据(9)或(10)的免疫层析检测方法，其中所述不透明基材的厚度为30μm以上且200μm以下。
(12)根据(9)至(11)中任一项的免疫层析检测方法，其中所述不透明基材被设置用于所述多孔膜的内衬，并且其中在所述不透明基材的下方设置有衬片。
(13)根据(9)至(12)中任一项的免疫层析检测方法，其中所述试验片进一步包括用作样品施加区域的样品垫，和包含用胶体金或有色乳胶标记的特异性结合物质的缀合物垫。
(14)根据(9)至(13)中任一项的免疫层析检测方法，其中所述特异性结合物质是抗体。
(15)根据(9)至(14)中任一项的免疫层析检测方法，包括通过光学手段检测源自标记物质的光学参数的步骤。
(16)根据(9)至(15)中任一项的免疫层析检测方法，包括通过视觉观察确定源自标记物质的显色的步骤。
(17)一种用于减小免疫层析检测方法中的测量值变异的方法，所述方法包括：使用以下试验片：
一种至少包括多孔膜的免疫层析试验片，其中所述免疫层析试验片包括样品施加区域、展开区域和检测区域，其中所述检测区域固定在所述多孔膜的表面上，并且其中
在所述多孔膜的背面上设置有不透明基材。
(18)根据(17)的减小变异的方法，其中所述不透明基材是白色基材。
(19)根据(17)或(18)的减小变异的方法，其中所述不透明基材的厚度为30μm以上且200μm以下。
(20)根据(17)至(19)中任一项的减小变异的方法，其中所述不透明基材是被设置用于所述多孔膜的内衬的部件，并且其中在所述不透明基材的下方设置有衬片。
(21)一种用于减少使用试验片的免疫层析检测方法中的试验片的漂白的方法，该方法包括：使用以下试验片：
一种至少包括多孔膜的免疫层析试验片，其中所述免疫层析试验片包括样品施加区域、展开区域和检测区域，其中所述检测区域固定在所述多孔膜的表面上，并且其中在所述多孔膜的背面上设置有不透明基材。
(22)根据(21)的减少试验片的漂白的方法，其中所述不透明基材是白色基材。
(23)根据(21)或(22)的用于减少试验片的漂白的方法，其中所述不透明基材的厚度为30μm以上且200μm以下。
(24)根据(21)至(23)中任一项的减少试验片的漂白的方法，其中所述不透明基材被设置用于所述多孔膜的内衬，并且其中在所述不透明基材的下方设置有衬片。
发明的有益效果
本发明可以提供一种免疫层析试验片，其能够避免测试线附近的漂白，并且因此在视觉检测时具有优秀的可视性，并且导致通过光学手段测量的值的变异较小。
附图说明
[图1]图1是显示当利用使用多孔膜的免疫层析试验片进行免疫层析测量时的测量值的变化的图，其中衬里由透明基材(比较例)或白色基材(本发明)制成。(试验例2，分析物在中等浓度侧)
[图2]图2是显示当利用使用多孔膜的免疫层析试验片进行免疫层析测量时的测量值的变化的图，其中衬里由透明基材(比较例)或白色基材(本发明)制成。(试验例3，分析物在低浓度侧)
[图3]图3是显示当利用使用多孔膜的免疫层析试验片进行免疫层析测量时的测量值的变化的图，其中衬里由透明基材(比较例)或白色基材(本发明)制成。(试验例4，分析物在高浓度侧)
[图4]图4是显示本发明的免疫层析试验片的透视图。A显示整个免疫层析试验片，B显示多孔膜。
[图5]图5是本发明的免疫层析检测装置的俯视图。
[图6]图6显示当沿虚线切割图5所示的装置时的切割截面。
具体实施方式
(免疫层析试验片)
本发明的免疫层析试验片至少包括多孔膜内的“样品施加区域”、“展开区域”和“检测区域”。与分析物结合的标记的特异性结合物质以允许样品被洗脱然后流过展开区域并到达检测部位的方式被保持。此外，用于检测的特异性结合物质固定在构成检测区域的展开区域的特定部分上。
体现这些要素的试验片的一个实例是一种试验片，其包括用作样品施加区域的样品垫，保持可洗脱的与分析物结合的标记的特异性结合物质的缀作为展开区域一部分的合物垫以及能将检测用特异性结合物质固定到膜上的特定部位，并用作展开区域和检测区域的多孔膜。具体而言，本发明的用于免疫层析的典型试验片具有以下构造：
(1)装载样品的样品垫；
(2)设置在样品垫下游并且将被第一特异性结合物质敏化的缀合物以可洗脱的方式保持在胶体金表面上的缀合物垫；
(3)设置在缀合物垫的下游并且在表面上具有检测区域的多孔膜，其中第二特异性结合物质与由缀合物和分析物形成的复合体结合，从而使分析物被固定，所述多孔膜具有设置在背面上的不透明基材。
样品垫，缀合物垫和多孔膜可以各自构成单独的载体，或者它们中的两个可以构成一个载体，并且可以使用任何形式，只要样品垫、缀合物垫和多孔膜从上游到下游按此顺序设置即可。
除了上述构成之外，免疫层析试验片还可具有进一步设置并安装在其上的一个或多个吸收垫和第三垫。
通常将试验片布置在固相支撑物上，例如塑料粘合片(在下文中也称为衬片)上。
为了增加固定有特异性结合物质的多孔膜的机械强度并防止测定中的水分蒸发(干燥)，可以在试验片上层叠聚酯膜等。
使用本发明的免疫层析试验片的检测方法如下进行。
当将样本滴到样品施加区域上并且样本包含分析物时，分析物特异性地结合到标记的特异性结合物质上，从而形成复合体。该复合体在下游方向上的展开区域中展开，并与固定在检测区域中的特异性结合物质结合。在检测区域中，形成了标记的特异性结合物质、分析物和固定化的特异性结合物质的夹心型复合体，因此，可以通过检测该复合体来定性或定量地分析分析物。检测的实例包括通过视觉观察确定显色的方法和通过光学手段检测源自标记的光学参数的方法。当使用光学手段时，可以手动或自动进行检测，并且还可以进行连续测量。
(样品垫)
在本发明中使用的样品垫是用作接收样品的样品施加区域的部位，并且任何物质和形式都可以使用，只要处于模制成垫的状态的那些物质可以吸收液体样品并允许液体和分析物的成分通过即可。
可以对本发明的样品垫进行预处理以提高渗透性。
当测量全血时，可以添加红细胞凝集剂。在这种情况下，试剂可以包含在样品垫的至少一部分中，或者可以包含在整个样品垫中。
适用于样品垫的材料的具体实例包括但不限于玻璃纤维、丙烯酸纤维、亲水性聚乙烯材料、干纸、纸浆、织物等。优选地，使用玻璃纤维垫。样品垫还可以具有后述的缀合物垫的功能。在不偏离本发明的期望功能的情况下，样品垫还可以按需要以不影响检测机制的反应的方式包含封闭剂。
(缀合物)
在本发明的缀合物中，与分析物结合的特异性结合物质或对照物质被固定在标记上。
本发明中使用的标记可以是能够通过缀合(固定化)诸如抗体的特异性结合物质来构成缀合物的任何标记，并且能够在使标记与样品接触以检测样品中的对象(例如抗原)的方法中用作标记，其实例包括胶体金颗粒、胶体铂颗粒、有色乳胶颗粒和磁性颗粒，其中胶体金和有色乳胶是理想的，并且胶体金是更理想的。可以调节其粒径，从而根据每种类型来获得期望的测量对象的检测灵敏度，例如，胶体金颗粒的粒径优选为20至100nm，更优选为30至100nm，最优选60nm。
在本发明的缀合物中，胶体金颗粒上未与特异性结合物质结合的区域可以用封闭剂封闭。
关于缀合物的形式，缀合物可以以作为缀合物垫存在的形式存在，即，以被包含在除样品垫、第三垫和多孔膜之外的专用垫(缀合物垫)中的状态(A型)存在，也可以作为样品垫的一部分中的缀合物部分存在(B型)。或者，缀合物可以作为与试验片分开的单独的缀合物试剂存在，以便与样本混合(C型)。
下文将描述具有A型存在形式的缀合物的试验片。
样品垫、缀合物垫、第三垫和多孔膜以在样品的流动方向上从上游到下游的这种顺序布置，并且布置成使得上层和下层至少部分地彼此重叠。这种布置实例的试验片如图4所示。
当将包含分析物的样品装载到这种试验片的样品垫上时，分析物通过样品垫流到下游侧的结合垫。在缀合物垫中，分析物和缀合物彼此接触并穿过垫，同时形成复合体。随后，复合体穿过与缀合物垫的下表面接触设置的第三垫，并在多孔膜中展开。
由于多孔膜具有与固定在其一部分上的分析物结合的特异性结合物质，因此复合体被结合并固定在该膜上。通过检测源自标记物质的吸光度、反射光、荧光、磁性等的手段来检测固定化的复合体。
然后将描述具有B型存在形式的缀合物的试验片。
与A型试验片的区别在于，样品垫和缀合物垫是一体的，即，样品施加区域和缀合物部分形成在样品垫的一部分中。
样品施加区域是装载含有分析物的样品的部位，缀合物部分是含有缀合物的部位，样品施加区域位于缀合物部分的上游。
然后将描述具有C型存在形式的缀合物的试验片。
与A型试验片的区别在于，试验片中不存在缀合物垫，并且缀合物作为单独的缀合物试剂存在。例如，可以包括具有结合在过滤器中的缀合物的过滤器芯片。通过使用这种过滤器芯片以利用过滤器过滤样本，保持在过滤器中的缀合物与分析物结合以形成复合体(聚集体)。该复合体可以在没有缀合物垫的情况下装载到与A型试验片相同的试验片上，以检测分析物。
(检测试剂)
在本发明中，“检测试剂”具体是至少包含缀合物的溶液。
检测试剂可以包含例如一种或多种类型的稳定剂、增溶剂等，以将缀合物维持在稳定状态，以便当与样品混合时促进固定在缀合物上的特异性结合物质(例如抗体)与分析物的特异性反应，或快速有效地溶解和流化缀合物。稳定剂、增溶剂等的实例包括牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖、酪蛋白和氨基酸。
为了提高检测灵敏度，检测试剂也可以根据需要含有已知的敏化剂和螯合剂，例如EDTA和EGTA。
在本说明书中，术语“检测”或“测量”必须以最广义的方式来解释，包括分析物的存在性证明和/或定量，并且绝不能在任何意义上以受限的方式来解释。
(样品稀释剂)
对于本发明，当样品中分析物的浓度需要稀释时，可以使用稀释剂。稀释剂可用于以下情况，例如分析物与特异性结合物质之间存在抑制作用或反应加速导致检测标记物聚集和毛细管流动受损，只要分析物浓度保持在可以与特异性结合物质反应并产生阳性信号的水平即可。
(缀合物垫)
在本发明中，“缀合物垫”是指通过干燥适用于后述的缀合物垫的材料而获得的垫，该材料中浸有与分析物特异性反应的检测试剂。缀合物垫具有当样品通过缀合物垫时允许检测试剂和分析物形成复合体的功能。缀合物垫本身可以被设置成与固定有特异性结合物质的多孔膜接触。或者，可以将缀合物垫设置成与样品垫接触，以接收经由毛细管流动通过样品垫样本，然后通过毛细管流动将样本转移至第三垫，该第三垫与不同于样品垫的接触表面的表面接触。
适用于缀合物垫的材料的实例包括但不限于纸、纤维素混合物、硝酸纤维素、聚酯、丙烯腈共聚物、玻璃纤维和非织造纤维(例如人造丝)。优选地，使用玻璃纤维垫。
缀合物垫可包含用于确保免疫层析检测方法的可靠性的“对照试剂”，例如，用标记物标记且不与样本成分反应的抗体，和根据需要用标记物标记的诸如KLH(keyholelimpet hemocyanin，匙孔血蓝蛋白)之类的高抗原蛋白。这些对照试剂是不可能在样品中存在的组分(物质)，并且可以适当地选择。
(第三垫)
在本发明中，可以添加第三垫以去除检测样本中分析物所不需要的反应性成分和检测试剂，从而反应所必需的成分可以在固定有特异性结合物质的多孔膜上成功地展开。例如，期望去除作为检测所不需要的成分的血细胞和不溶性血细胞部分。第三垫还可以具有另外的作用，即预先去除由于分析物和特异性结合物质之间的反应而产生的聚集体，该聚集体已经生长到阻止向固定有特异性结合物质的膜移动并通过该膜顺利展开的大小。
第三垫可以由允许液体和待测成分以及检测试剂通过的任何材料并以任何形式制成。具体实例包括但不限于玻璃纤维、丙烯酸纤维、亲水性聚乙烯材料、干纸、纸浆、织物等。当用于分离血细胞时，第三垫可被称为血细胞分离膜。在本发明中，在将全血用作样本的情况下，当不能仅通过样品垫来完成血细胞的分离和去除时，期望使用血细胞分离膜。
(红细胞凝集剂)
在本发明中，当将全血用作样本时，除了使用第三垫以外，还期望一起使用红细胞凝集剂或红细胞结合成分。尽管对要一起使用的红细胞凝集剂或红细胞结合成分没有特别限制，其已知实例包括凝集素、多克隆抗体和单克隆抗体，并且也可以使用聚阳离子红细胞凝集剂。已知的聚阳离子红细胞凝集剂的实例包括聚凝胺(polybrene)、聚赖氨酸、聚丙烯酸胺和聚丙氨酸，其中聚凝胺是优选的。聚凝胺的化学名称为海美溴铵(hexadimethrinebromide)，是一种阳离子聚合物之一，分配的CAS号为28728-55-4。
红细胞凝集剂或红细胞结合成分可以以将试剂或成分添加到用于稀释样本的稀释剂中或直接添加到样本中的形式使用，或者可以包含在免疫层析试验片的样品施加区域(样品垫)中。在这种使用形式中，全血中的红细胞被凝集。
(多孔膜)
本发明的免疫层析试验片中使用的多孔膜的特征在于，用于检测的特异性结合物质被固定在其表面上，而背面上设置有不透明基材。
由于膜是多孔的，设置在多孔膜的背面上的本发明的不透明基材被设置为内衬该膜，并且是不可渗透的膜。本发明的这种不透明基材也可以称为所谓的“内衬材料”。可以将基材固定在多孔膜的背面上以用于内衬，或者可以预先将多孔膜层压在不可渗透膜的上表面上。
本发明的不透明基材可以设置在多孔膜的背面，并且可以通过粘合层与膜接触，或者如果确保粘合性，则可以不具有粘合层而与膜接触。当设置后述的衬片时，衬片设置在本发明的不透明基材(内衬材料)的下方。
在本发明中，不透明基材像常规透明基材那样用在多孔膜背面上，从而避免了所谓的“漂白现象”(以下也简称为漂白)，其中膜上相应的位置看起来比周围的颜色相对更白，好像该位置已被漂白。
可以设定本发明的不透明基材(不包括粘合剂层等)的厚度，使得该基材可以用作多孔膜的内衬材料，并且优选为30μm以上且200μm以下，更优选60μm以上且140μm以下，最优选80μm以上且120μm以下。
不透明意味着不是透明的或无法看清另一面，尽管不需要完全不透明，但更优选完全不透明。
不透明基材优选是具有与多孔膜的颜色相似的颜色的基材，并且当多孔膜为白色时，本发明的基材优选为接近白色的乳白色或灰色，最优选白色。
不透明基材可以是任何不透水的不透明基材，并且可以由任何材料制成。材料的实例包括聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、尼龙等。
通过将本发明的不透明基材设置在多孔膜的背面，可以抑制测试线上的测量值的变异。尽管其原因尚不清楚，但可以推测，膜的上表面和背面上的颜色匹配会导致表面成分(硝酸纤维素)的不均匀外观减少或由设置在膜的下层下方的衬片的反射光引起的干涉减少等，从而导致再现性的提高。
多孔膜(以下也简称为膜)可以由任何材料制成。其实例包括但不限于聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、玻璃、诸如纤维素和纤维素衍生物的多糖、或陶瓷。具体实例可包括购自Merck Millipore，Toyo Roshi Kaisha，GE Healthcare等的玻璃纤维滤纸和硝酸纤维素膜。通过适当地选择多孔膜的孔径和结构，可以控制流经膜的由标记的特异性结合物质和分析物组成的免疫复合体的速率。由于可以通过控制膜中的流速来调节与固定在膜上的特异性结合物质结合的标记的特异性结合物质的量，考虑与本发明的免疫层析试验片的其他组成材料的组合，期望优化膜的孔径和结构。
(在多孔膜上固定特异性结合物质)
可以通过众所周知的方法将特异性结合物质(例如本发明的分析物的抗体)固定在多孔膜上。例如，在流通(flow-through)型的情况下，将特异性结合物质调节至预定浓度，并且以一定的符号形状(例如点或+)将恒定量的其溶液施加至多孔膜。在这种情况下，为了确保免疫层析检测方法的可靠性，通常将能够与缀合物结合的蛋白质或化合物固定在不同于与分析物结合的特异性结合物质的位置，以形成“对照线”。可以将上述与对照试剂结合的特异性结合物质固定在不同于与分析物结合的特异性结合物质的位置，以形成“对照线”。
在侧流(lateral-flow)型的情况下，将特异性结合物质调节至预定浓度，并使用装置等将其溶液以线状施加在多孔膜上，所述装置具有能够使喷嘴在水平方向上移动同时以恒定的速率从中排出溶液的机构。在这种情况下，特异性结合物质的浓度优选为0.1至5mg/mL，更优选为0.5至3mg/mL。在流通型的情况下，固定在多孔膜上的特异性结合物质的量可以通过调节滴到多孔膜上的施加量来优化，在侧流型的情况下，可以通过调节上述装置的喷嘴的排出速率来优化。特别地，在侧流型的情况下，优选0.5至2μL/cm。
在本发明中，术语“流通膜测定”是指其中样本溶液等被展开以垂直通过多孔膜的方法，术语“侧流膜测定”是指其中样品溶液等被展开以在平行于多孔膜的方向上移动的方法。
在本发明中，关于与对象结合的特异性结合物质在多孔膜上的施加位置，在侧流的情况下，可以将位置布置成使得检测试剂由于毛细作用从缀合物垫上展开，依次通过施加有相应特异性结合物质的线。优选地，通过施加与分析物结合的特异性结合物质形成的线位于上游，并且通过施加对照特异性结合物质形成的线优选位于其下游。在这种情况下，期望线以足够的距离间隔开，使得可以检测标记物的信号。即使在流通型的情况下，也可以布置与对象结合的特异性结合物质的施加位置，从而可以检测标记物的信号。
通常可以通过使用预定的缓冲溶液来制备施加到多孔膜上的特异性结合物质溶液。缓冲溶液类型的实例包括常用的缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲溶液，Tris缓冲溶液和Good′s缓冲溶液。缓冲溶液的pH优选在6.0至9.5的范围内，并且可以根据所使用的特异性结合物质的性质适当地调节。
例如，可以将pH为8.0的缓冲溶液用于后述的抗cTnI抗体。缓冲溶液可进一步包含例如NaCl的盐类，例如蔗糖的稳定剂和保存剂，例如ProClin的防腐剂等。盐类包括用于调节离子强度的盐，例如NaCl，以及在调节缓冲溶液pH值的步骤中添加的盐，例如氢氧化钠。在将特异性结合物质固定在多孔膜上之后，可以通过用通常使用的变成溶液或蒸气形式的封闭剂涂覆除特异性结合物质固定位点以外的区域来进一步进行封闭。在本说明书中，将如上所述固定有特异性结合物质的多孔膜称为“固定有特异性结合物质的膜”。
(吸收垫)
在本发明中，吸收垫是具有液体吸收能力的部位，用于通过吸收已经移动并通过多孔膜的样本来控制样本的展开。在侧流型中，吸收垫可以设置在试验片的最下游侧，而在流通型中，吸收垫可以设置在例如固定有特异性结合物质的膜的下部。对于吸收垫，例如可以使用滤纸；然而，本发明不限于此。
(衬片)
在本发明中，衬片是用于支撑试验片的固相，并且通常使用附着有粘合材料的塑料片。衬片材料的实例包括但不限于聚苯乙烯、聚酯、聚丙烯、氯乙烯等。尽管衬片的颜色没有特别限制，但是该颜色优选为与膜相同的颜色，当膜为白色时，衬片也优选为白色。
可以调节本发明的衬片的厚度(不包括粘合剂层等)，使得衬片可以用作试验片的支撑构件，并且优选为10μm以上且600μm以下，更优选为150μm以上且350μm以下，最优选为200μm以上且320μm以下。
(顶膜)
在本发明中，顶膜是指覆盖试验片的最上表面的片状构件，并且用于增加固定有特异性结合物质的多孔膜的机械强度并防止测定过程中的水分蒸发(干燥)的目的。顶膜的材料可以是能够达到目的的任何材料，例如聚酯，并且可以通过使用粘合材料涂覆试验片或者可以被层压。在本发明中，发现通过使膜的背衬部件不透明，可以减弱由于用顶膜覆盖试验片而增强的漂白现象。因此，本发明的效果在具有顶膜的试验片中更加显著。
可以调节本发明的顶膜的厚度(不包括粘合剂层等)，使得实现在测定过程中保护膜和防止水分蒸发的功能，并且优选为10μm以上且150μm以下，更优选20μm以上且80μm以下。
(检测装置)
考虑到试验片的尺寸，样本的添加方法和位置，特异性结合物质在固定有特异性结合物质的膜上的固定位置，信号检测方法等，可以将本发明的用于免疫层析的试验片存储/安装并使用在合适的容器(外壳)中，以这种方式存储/安装的状态称为“装置”。图5和图6以俯视图和截面图显示了本发明的装置的实例。
(其他)
在本说明书中，“多孔膜”可以表示为“固相”，并且物理或化学地将特异性结合物质例如抗原或抗体支持在多孔膜上，或支撑状态可以表示为“固定”、“固定化的”、“固相化”、“敏化”或“吸附”。
(样品)
在本发明的检测方法中，含有分析物的“样本”是指诸如血液、尿液、痰、唾液、鼻腔分泌物、鼻腔拭子、咽喉拭子、其他体液和粪便的生物样品。生物样品可以直接用作样本，并且用稀释剂适当稀释或提取和/或过滤的样品也包括在本发明的样本中。血液样本的实例包括全血、红细胞、血浆、血清等。
血液样本还包括通过血液收集管收集的样本，在血液收集时向其中添加了抗凝剂(例如EDTA或肝素)。
(分析物)
本发明的分析物是存在于生物样本中的物质，例如血液(全血)、红细胞、血清、血浆、尿液、唾液或痰，并且其实例包括：与炎症有关的标记物，例如CRP(C反应蛋白)、IgA、IgG和IgM；凝血或纤维蛋白溶解标记物，例如纤维蛋白降解产物(例如D-二聚体)、可溶性纤维蛋白、TAT(凝血酶-抗凝血酶复合体)和PIC(纤溶酶-纤溶酶抑制剂复合体)；与循环有关的标记物，例如氧化的LDL、BNP(脑利钠肽)、H-FABP(心脏脂肪酸结合蛋白)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)；代谢相关标记物，如脂联蛋白；肿瘤标记物，例如CEA(癌胚抗原)、AFP(甲胎蛋白)、CA19-9、CA125和PSA(前列腺特异性抗原)；与传染病相关的标记物，例如HBV(乙型肝炎病毒)、HCV(丙型肝炎病毒)、沙眼衣原体和淋球菌；过敏原特异性IgE(免疫球蛋白E)、激素和药物。其中，更优选与将全血用作样本的强烈愿望相关的D-二聚体、CRP、BNP、H-FABP、cTnI等。
(特异性结合物质)
在本发明中，由不溶性载体颗粒如胶体金和多孔膜支撑的分析物的特异性结合物质的实例包括蛋白质、肽、氨基酸、脂质、糖、DNA、RNA、受体和半抗原，尽管对于分子量的大小或来源(例如天然或合成的)没有特别限制，但其实例包括可用于利用免疫应答的免疫学测量方法中的抗体或抗原。
(本发明中使用的抗体)
本发明中使用的针对分析物的抗体不受制备方法的限制，只要该抗体与分析物特异性反应即可，并且可以是多克隆抗体或单克隆抗体。更优选地，抗体是单克隆抗体。通常，可以根据Kohler和Milstein的方法(参见Nature，Vol.256，p.495(1975))，通过使用分析物作为免疫原免疫的动物的脾细胞与相同物种的骨髓瘤细胞之间的细胞融合来制备产生抗体的杂交瘤。
本发明的抗体可以是完整的抗体分子，也可以是具有抗原-抗体反应活性的抗体的功能性片段。该抗体可以是通过普通动物(小鼠、山羊、绵羊等)的免疫步骤获得的抗体，以及通过基因重组技术将氨基酸序列改变为与用免疫原(分析物)免疫的动物不同的动物物种的氨基酸序列的抗体(例如嵌合体特异性结合物质、人源化抗体或完全人源化抗体)等。抗体的功能片段的实例包括具有抗原-抗体反应活性的片段F(ab′)2或Fab′以及单链抗体(scFv)。这些功能片段可通过用蛋白水解酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)处理如上所述获得的抗体来产生。
当在通过所谓的三明治形成法检测分析物的测定方法中使用的抗体为单克隆抗体时，标记物上固定的抗体(第一抗体)与多孔膜上固定的抗体(第二抗体)之间的关系中，当第一抗体的表位为单价时，所使用的第二抗体的表位与第一抗体的表位不同，当第一抗体的表位为多价时，所使用的第二抗体的表位可以与第一抗体的表位相同或不同。
(试剂盒)
利用本发明的免疫层析试验片的检测试剂盒可以是包括免疫层析试验片的试剂盒，该免疫层析试验片至少包括多孔膜并具有样品施加区域、展开区域和固定有抗体的检测区域，免疫层析试验片的特征在于，在多孔膜的背面设置有不透明基材。
检测试剂盒可以包括检测所需的另一种试剂(例如，包含缀合物的检测试剂)、样本稀释剂、试管、用于收集粪便的棉签、说明书、用于存储试验片的壳体等。
在下文中将描述本发明的具体实施例；然而，这些仅出于说明的目的，并且本发明不限于此。
实施例
[试验例1]避免漂白现象的效果的确认测试
将使用本发明的衬有白色基材的抗体固定膜的情况下避免漂白现象的效果与衬有常规透明基材的情况进行了比较。
1.本发明的免疫层析检测装置的制作
1)胶体金标记的抗cTnI单克隆抗体(抗cTnI抗体缀合物)的制备
(i)胶体金溶液(60nm)的制备
向加热至93℃的5000mL纯化水中，添加10mL的7％(w/v)柠檬酸三铵水溶液，并通过搅拌混合。随后，添加10mL的5％(w/v)四氯金(III)酸水溶液，并在搅拌下反应10分钟，然后将反应溶液煮沸。随后，将该溶液在冰水中冷却以制备平均粒径为60nm的胶体金溶液。
用纯化水将该平均粒径为60nm的胶体金溶液调整为在胶体金的最大吸收波长下具有1OD/mL的吸光度。
(ii)抗cTnI抗体缀合物的制备
向200mL 1OD/mL 60nm胶体金溶液(pH 8.0)中，加入用2mM Tris-盐酸缓冲溶液(pH 7.0)稀释至69.3μg/mL的10mL抗cTnI单克隆抗体，并在室温下搅拌10分钟。向胶态金和抗体的混合液中，添加10mL的含有0.5％(w/v)的Neo Protein Saver(Toyobo，No.NPS-301)的纯化水，并在室温下搅拌5分钟。随后，将混合物在10℃下以11900×g离心45分钟。除去上清液后，将10mL的0.2％(w/v)的Neo Protein Saver水溶液添加至获得的沉淀物中以悬浮缀合物，从而获得抗cTnI抗体缀合物。
(iii)胶体金溶液(40nm)的制备
向加热至73℃的5000mL纯化水中，添加10mL的5％(w/v)柠檬酸三铵水溶液，并通过搅拌混合。随后，添加10mL的5％(w/v)四氯金(III)酸水溶液，并在搅拌下反应10分钟，然后将反应溶液煮沸。随后，将该溶液在冰水中冷却以制备平均粒径为40nm的胶体金溶液。
用纯化水将该平均粒径为40nm的胶体金溶液调整为在胶体金的最大吸收波长下具有1OD/mL的吸光度。
(iv)用于对照线的胶体金标记的KLH(KLH缀合物)的制备
向200mL的1OD/mL 40nm胶体金溶液(pH 6.1)中，加入2.67mL溶于2mM磷酸盐缓冲液(pH 6.1)至375μg/mL的KLH(由Sigma制造)，在室温下搅拌10分钟。向胶体金和KLH的混合液中，添加20mL的10％牛血清白蛋白(BSA)水溶液，并在室温下搅拌5分钟。随后，将混合物在10℃下离心45分钟，在去除上清液之后，将10.7mL的缀合物稀释缓冲液(Scripps)添加至获得的沉淀物中以悬浮缀合物，从而获得KLH缀合物。
2)缀合物垫的制作
通过将抗cTnI抗体缀合物(3OD)，KLH缀合物(0.75OD)，0.5％LipidureBL-1301、0.25mg/ml Heteroblock，2.4％乳糖，2.0％NPS，20mMMOPS(pH值7.2)，基于总量的1/6量的缀合物稀释缓冲液混合来制备缀合物溶液，将具有固定体积的玻璃纤维垫(MerckMillipore)用相对于其体积的1.2倍的该溶液浸渍。通过在70℃的干燥炉中加热45分钟来干燥垫，以获得缀合物垫。
3)抗cTnI单克隆抗体固定化膜的制备(固定有抗体的膜)
对于测试线，将抗cTnI单克隆抗体用含有2.5％蔗糖的10mM PB(含有0.09％NaN3)(pH 8.0)稀释至3mg/mL。
对于对照线，将兔抗KLH多克隆抗体(由Bethyl制造)用含有2.5％蔗糖的10mM PB(含有0.09％NaN3)(pH 7.2)稀释至1mg/mL。
在表1所示的衬有透明或白色基材的硝酸纤维素膜的短边位置，将抗cTnI单克隆抗体设定为1μL/cm，使用免疫层析分配器“XYZ3050”(BIO DOT)以线状施加，从而形成测试线。类似地，从测试线的位置以约4mm的间隔施加抗KLH多克隆抗体以形成对照线。将该膜在烘箱中在70℃下干燥45分钟以获得固定有抗体的膜。
4)样品垫的制作
通过调节含有0.5％乳糖和2％聚凝胺的20mM MOPS(pH 7.2)获得样品垫预处理溶液。
将玻璃纤维垫(Lydall)切成合适的尺寸，注入相对于垫体积1.5倍量的样品垫预处理溶液，并在70℃的干燥炉中干燥45分钟，然后用作样品垫。
5)免疫层析试验片的制作
将衬有每种基材(b-2)的固定有抗体的多孔膜(b-1)固定在衬片(a)上，布置施加部分使得展开上游侧的抗cTnI抗体(c)后面是抗KLH抗体(d)，然后将血细胞分离膜(第三垫)(e)安装在该膜上。随后，布置并安装在2)中制造的缀合物垫(f)；将4)中制造的样品垫(g)布置并安装成与缀合物垫重叠；将吸收垫(h)布置并安装在相对侧的一端。
最后，用顶膜(i)覆盖吸收垫和固定有抗体的膜的表面，使得固定有抗体的膜的一部分暴露。通过切成具有以这种方式相互重叠的组成要素的结构，制造了免疫层析试验片。图4显示了免疫层析试验片的示意性构造图。
试验片可以以免疫层析测试检测装置的形式存储/安装在专用塑料外壳中。图5和图6显示了免疫层析检测装置(k)的示意性俯视图和示意性截面图。附图标记(n)表示样品添加窗部分，(o)表示检测窗部分，(L)和(m)表示外壳，(j)表示免疫层析试验片。
2.通过免疫层析法检测或测量
向如上所述制备的免疫层析测试检测装置的样品垫窗部分中，添加120μL血浆样本溶液，该血浆样本溶液含有浓度范围为0至10ng/mL的心肌肌钙蛋白I(cTnI)，15分钟后在测试线附近进行视觉观察以评估漂白的存在或不存在。结果示于表1中。
<漂白评价标准>
通过视觉评估12个或20个样品，即使在一个样品中发现漂白，也认为漂白“存在”，而当没有样品具有漂白时，则认为漂白“不存在”。
[表1]
Figure BDA0002984855390000191
3.结果
在每种情况下，将衬有透明基材的硝酸纤维素膜用作固定有抗体的膜时，在测试线前不久会观察到漂白现象；但是，将衬有本发明的白色基材的硝酸纤维素膜用作固定有抗体的膜时，未观察到漂白现象。因此，在免疫层析测试的视觉评估中提高了可视性，从而可以进行更准确的评估。
尽管在该实施例中通过视觉观察确定/评估了漂白，但是如果通过使用设备进行光学测量，则可以避免波形的干扰，并且可以正确地设置基线。
[试验例2]CV降低效果的确认测试
将使用本发明的衬有白色基材的固定有抗体的膜进行光学测量时的测量值的变异与衬有常规透明基材的情况进行了比较。
1.免疫层析设备的制造
除了使用衬有透明基材的膜(HF180，CN140)和本发明的衬有白色基材的多孔膜(CN150)这两种以外，与试验例1同样地制作免疫层析试验片。
2.通过免疫层析法检测或测量
向上述制备的免疫层析测试设备的样品垫窗中，添加120μL包含40或60pg/mL心肌肌钙蛋白I(cTnI)的血浆样本溶液，15分钟后，使用免疫层析读取器Rapid Pia(SekisuiMedical Co.，Ltd.)测量测试线的着色量(吸光度)，计算各自的CV值(变异)。CV是指变异系数(coefficient of variation)，可以通过将标准偏差除以平均值来计算。结果如图1所示。
3.结果
当本发明的衬有白色基材的多孔膜用作固定有抗体的膜时，与衬有透明基材的膜用作抗体固定的膜时相比，CV值降低，提高了测量的再现性。
[试验例3]CV降低效果的确认测试(低浓度侧)
进行测试以检查即使当分析物具有低浓度时试验例2的变异降低效果是否出现。
1.免疫层析设备的制造
除了使用衬有透明基材的膜(CN150)和本发明的衬有白色基材的两个批次的多孔膜(CN150)以外，与试验例1同样地制作免疫层析试验片。
2.通过免疫层析法检测或测量
除了使用含有15pg/mL的心肌肌钙蛋白I(cTnI)的血浆样本溶液以外，与试验例2同样地进行测定，并计算各自的CV值(变异)。结果如图2所示。
3.结果
当将本发明的衬有白色基材的多孔膜用作固定有抗体的膜时，与使用衬有透明基材的膜作为固定有抗体的膜时相比，即使分析物的浓度低，CV值也降低，提高了测量的再现性。即使使用两个不同的批次，也获得了相似的结果。
[试验例4]CV降低效果的确认测试(高浓度侧)
进行测试以检查即使当分析物具有高浓度时试验例2的变异降低效果是否出现。
1.免疫层析设备的制造
除了使用衬有透明基材的膜(CN150)和本发明的衬有白色基材的多孔膜(CN150)以外，与试验例1同样地制作免疫层析试验片。
2.通过免疫层析法检测或测量
除了使用含有400pg/mL的心肌肌钙蛋白I(cTnI)的血浆样本溶液以外，与试验例2同样地进行测定，并计算各自的CV值(变异)。结果如图3所示。
3.结果
当将本发明的衬有白色基材的多孔膜用作固定有抗体的膜时，与使用衬有透明基材的膜作为固定有抗体的膜时相比，即使分析物的浓度高，CV值也显著降低，显著提高了测量的再现性。
工业适用性
根据本发明的免疫层析试验片，其至少包括多孔膜并且具有样品施加区域、展开区域和其中固定有特异性结合物质的检测区域，其中所述检测区域固定在多孔膜的表面上，并且在多孔膜的背面设置有不透明基材，可以避免在测试线附近的漂白。
另外，可以生产引起测量值变异较小的免疫层析试验片。
根据本发明，避免试验片的漂白不仅明显改善了视觉确定的可视性，而且减小了光学测量中测量值的变异，从而可以在任何检测方法中实现更精确的测量。
附图标记列表
(a)衬片
(b)抗体固定膜
(b-1)多孔膜
(b-2)基材
(c)抗cTnI抗体(测试线)
(d)抗KLH抗体(对照线)
(e)血细胞分离膜(第3垫)
(f)缀合物垫
(g)样品垫
(h)吸收垫
(i)顶膜
(j)免疫层析试验片
(k)免疫层析检测装置
(L)上壳体
(m)下壳体
(n)样品添加窗区域
(o)检测窗区域

Claims (24)

1.一种至少包括多孔膜的免疫层析试验片，所述免疫层析试验片包括样品施加区域，展开区域和检测区域，其中所述检测区域固定在所述多孔膜的表面上，并且其中在所述多孔膜的背面上设置有不透明基材。
2.根据权利要求1的免疫层析试验片，其中所述不透明基材是白色基材。
3.根据权利要求1或2的免疫层析试验片，其中所述不透明基材的厚度为30μm以上且200μm以下。
4.根据权利要求1至3中任一项的免疫层析试验片，其中所述不透明基材被设置用于所述多孔膜的内衬，并且其中在所述不透明基材的下方设置有衬片。
5.根据权利要求1至4中任一项的免疫层析试验片，进一步包括用作样品施加区域的样品垫，和包含用胶体金或有色乳胶标记的特异性结合物质的缀合物垫。
6.根据权利要求1至5中任一项的免疫层析试验片，其中所述特异性结合物质是抗体。
7.根据权利要求1至6中任一项的免疫层析试验片，其中所述免疫层析试验片是用于通过光学手段检测的试验片。
8.一种免疫层析检测试剂盒，其包括：根据权利要求1至7中任一项的免疫层析试验片。
9.一种免疫层析检测方法，所述方法包括使用以下试验片：
一种包括多孔膜的免疫层析试验片，所述多孔膜至少包括检测区域，所述多孔膜的背面设置有不透明基材。
10.根据权利要求9的免疫层析检测方法，其中所述不透明基材是白色基材。
11.根据权利要求9或10的免疫层析检测方法，其中所述不透明基材的厚度为30μm以上且200μm以下。
12.根据权利要求9至11中任一项的免疫层析检测方法，其中所述不透明基材被设置用于所述多孔膜的内衬，并且其中在所述不透明基材的下方设置有衬片。
13.根据权利要求9至12中任一项的免疫层析检测方法，其中所述试验片进一步包括用作样品施加区域的样品垫，和包含用胶体金或有色乳胶标记的特异性结合物质的缀合物垫。
14.根据权利要求9至13中任一项的免疫层析检测方法，其中所述特异性结合物质是抗体。
15.根据权利要求9至14中任一项的免疫层析检测方法，所述方法包括通过光学手段检测源自标记物质的光学参数的步骤。
16.根据权利要求9至15中任一项的免疫层析检测方法，所述方法包括通过视觉观察确定源自标记物质的显色的步骤。
17.一种用于减小免疫层析检测方法中的测量值变异的方法，所述方法包括使用以下试验片：
一种至少包括多孔膜的免疫层析试验片，其中所述免疫层析试验片包括样品施加区域、展开区域和检测区域，其中所述检测区域固定在所述多孔膜的表面上，并且其中在所述多孔膜的背面上设置有不透明基材。
18.根据权利要求17的减小变异的方法，其中所述不透明基材是白色基材。
19.根据权利要求17或18的减小变异的方法，其中所述不透明基材的厚度为30μm以上且200μm以下。
20.根据权利要求17至19中任一项的减小变异的方法，其中所述不透明基材是被设置用于所述多孔膜的内衬的部件，并且其中在所述不透明基材的下方设置有衬片。
21.一种用于减少使用试验片的免疫层析检测方法中的试验片的漂白的方法，该方法包括使用以下试验片：
一种至少包括多孔膜的免疫层析试验片，其中所述免疫层析试验片包括样品施加区域、展开区域和检测区域，其中所述检测区域固定在所述多孔膜的表面上，并且其中在所述多孔膜的背面上设置有不透明基材。
22.根据权利要求21的减少试验片的漂白的方法，其中所述不透明基材是白色基材。
23.根据权利要求21或22的减少试验片的漂白的方法，其中所述不透明基材的厚度为30μm以上且200μm以下。
24.根据权利要求21至23中任一项的减少试验片的漂白的方法，其中所述不透明基材被设置用于所述多孔膜的内衬，并且其中在所述不透明基材的下方设置有衬片。
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