CN103033615B

CN103033615B - 用于检测肺炎支原体抗体的方法、检测用的试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN103033615B
Application number: CN201210568379.7A
Authority: CN
Inventors: 杨致亭; 杨金红; 邓旭; 李升香; 武国威; 石中强; 丁兆明; 尚永明
Original assignee: QINGDAO HIGHTOP BIOTECH CO Ltd
Current assignee: QINGDAO HIGHTOP BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2012-12-24
Publication date: 2015-02-11
Anticipated expiration: 2032-12-24
Also published as: CN103033615A

Abstract

本发明涉及生物学技术领域，具体一种检测肺炎支原体抗体的方法、采用此方法进行检测的试剂盒，以及该试剂盒的制备方法，将抗人IgM与抗人IgG分别固定在膜上，加入待检血清，待检血清中的肺炎支原体抗体和固定到膜上的抗人IgM与抗人IgG结合后，加入酶标记肺炎支原体抗原溶液，最后加入显色液显色显示结果。本发明可使酶标肺炎支原体抗原的过程快速高效，延长试剂盒的保质期，提高检测灵敏度，降低试剂盒成本。

Description

用于检测肺炎支原体抗体的方法、检测用的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种检测肺炎支原体抗体的方法、采用此方法进行检测的试剂盒、以及该试剂盒的制备方法。

背景技术

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，Mp）是人类原发性非典型肺炎的病原体，还可以引起其他呼吸道感染性疾病甚至机体其它组织疾病，且发病率日益增加并有流行趋势。由于Mp无细胞壁，故其引起感染的治疗与其它细菌和病毒感染在治疗方法上有所不同，因此，Mp感染的病原学诊断对于疾病的及时正确治疗有重要意义。

目前检测肺炎支原体的方法虽然很多，但缺乏更为快速简易而又可靠的方法。X线征象均缺乏特异性，且须与病毒性肺炎、军团菌肺炎相鉴别，只能通过实验室检查病原体分离阳性和血清学试验进行鉴别诊断、确诊。血清中特异性IgM及IgG抗体可通过冷凝集试验（CAT）、明胶颗粒凝集实验（PLA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、金标免疫斑点法(DIM)等方法进行测定。

CAT特异度和敏感度均为最低，因此其临床诊断价值不大；金标斑点法虽操作简便快捷，但敏感度略低，有漏诊的可能；明胶颗粒凝集试验试剂准备与操作过程较为繁琐费时，且需要专业操作人员。酶联免疫吸附法（ELISA）具有特异、敏感和简便等优点，已用于检查各种抗体或抗原，但此方法存在以下问题：（1）每一批试验从加样、温育及洗板等步骤较多，操作繁琐，时间较长，且需专门操作人员及专用仪器，难以在基层医疗单位开展。（2）检测中需分别加入显色成分A液与B液，一定程度上增加了劳动强度与试剂盒成本。专利申请号200710075306.3公开了一种可在一定时间使生色物与过氧化物内共存的显色体系，但此体系中的关键组分—生色物保护剂硫代硫酸钠，在此发明的pH低于6.0的酸性环境下不利于长期的稳定，溶液体系若存在CO2、微生物或长期暴露在光照环境下也都不利于硫代硫酸钠的稳定，因此不能对生色物如TMB等起到有效的抗氧化保护作用。其中用于吸收紫外线的巴松-1789虽可以起到对紫外线的防护作用，但它遇金属离子即变红，干扰试验结果，因此增加了配制过程中对试剂纯度及操作的额外要求。（3）ELISA法无法做到对两种抗体的快速同时检测。

目前利用HRP标记抗体技术大多采用的过碘酸钠法，少数学者利用HRP标记抗原的技术过程与标记抗体过程基本类似，但此标记过程存在以下问题：（1）标记中需反复调节pH，且pH值调节范围较宽，不可避免地影响酶活性；（2）标记过程繁琐、操作耗时；（3）标记过程中不可避免发生酶自身的交联；（4）标记物不够稳定不易保存，反复冻融又会使标记物活性下降。因此，以此传统标记方法制备的肺炎支原体检测试剂盒的质量与稳定性不能得到保证。

目前常规的酶标记物稀释缓冲液对酶标记物不能起到最大限度的保护作用，浓度较高的酶标记物在低温下相对稳定，但制备工作液时需复溶或再稀释，稀释后保存期较短，且增加了工作量。如果在运输过程中遇到持续高温气候，试剂盒中免疫酶标记物的活性将受到很大影和从而影响到试剂盒的质量，造成经济损失。专利申请号200910143637.5公开了一种维护酶标记物稳定性的稀释液，但此溶液系统中所添加的木糖是一种带有醛基的还原性糖，同时此系统中还存在大量带有氨基基团的甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、酶及其其它生物分子，此种混合溶液中易发生美拉德反应—即羰基化合物（还原糖类）和氨基化合物（氨基酸和蛋白质）间的反应，经过复杂的历程最终生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精或称拟黑素，所以又称羰胺反应（法国化学家L.C.Maillard在1912年提出）。美拉德反应在高温条件下进行较快，但在长期室温储存条件下也可以缓慢进行这种非酶促反应；且此稀释液诸多添加物都是动物源性，使用非动物源性的稳定剂以减少动物源性原辅料的潜在危害已引起生产厂家的广泛关注。因此以上保护性稀释液不利于长期保存酶标记物。某些诊断试剂盒的保存缓冲液出于商业原因等并未给出具体组分，给试剂盒的开发应用带来不便。因此应根据酶标抗原的分子量、酸碱性质、疏水性等寻找有效的保存缓冲液。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种用于检测肺炎支原体抗体的方法、试剂盒及其制备方法，使酶标抗原的过程更加快速高效，提高灵敏度，延长酶标记物及试剂盒的有效期。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种用于检测肺炎支原体抗体的方法，将抗人IgM与抗人IgG分别固定在膜上，加入待检血清，待检血清中的肺炎支原体抗体和固定到膜上的抗人IgM与抗人IgG结合后，加入酶标记肺炎支原体抗原溶液，最后加入显色液显色显示结果；

所述酶标记肺炎支原体抗原溶液采用辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液，并采用以下步骤制备：

（1）将1g辣根过氧化物酶溶于25ml～30ml的0.01M磷酸盐缓冲液中，加入70～85mg乙二胺，用0.1M盐酸将pH值调节至5.0，所得溶液再与115～125mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用0.01M磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；

（2）将步骤（1）制得的溶液配制成1ml、浓度为5～5.2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60～85μl交联剂，混匀后于室温下反应25～35min；

（3）将所述反应物加入截留分子量为10K的超滤管，并对反应物进行离心处理8～12min，再以0.01M的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8～12min，以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至1ml；

（4）加入700～900μl浓度为1.6mg/ml的肺炎支原体抗原溶液，并于室温下反应25～35min；

（5）使步骤（4）制得的溶液通过SephadexG-200层析柱，收集第一峰的产物，即为酶标肺炎支原体抗原溶液。

优选的，所述膜为硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。

优选的，所述辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原所用交联剂分子结构如下：

优选的，所述显色液包括四甲基联苯胺、过氧化脲、抗氧化剂绿原酸、还原剂抗坏血酸、紫外线吸收剂2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、pH5.0的乙酸钠缓冲溶液体系。

优选的，所述显色液采用如下方法制得：

⑴将8.3～8.5g三水合乙酸钠晶体溶于600ml超纯水中，振荡混匀，并调整溶液pH至5.0；

⑵再将0.4～1.0g四甲基联苯胺溶于3ml无水乙醇中，制得四甲基联苯胺乙醇溶液；

⑶将上述两种溶液混合，振荡混匀；

⑷分别将70～90mg绿原酸与70～90mg抗坏血酸、8～12ml2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、2.5～2.9g磷酰甘氨酸及0.2～0.8g过氧化脲加入到步骤（3）所得到的混合溶液中，振荡混匀，得到所述显色液。

优选的，所述酶标肺炎支原体抗原的稳定稀释缓冲液采用以下方法制备：

⑴褐藻提取物的制备：新鲜海藻样品采集后，除去附生生物，用蒸馏水反复冲洗后取藻体顶部，称量后用组织捣碎机破碎，然后加入乙醇提取液提取，提取液用减压蒸馏的方法除去乙醇，加入磷酸盐缓冲液，高速离心后取上清液，即制得褐藻乙醇提取物。

⑵酶标记物稳定性缓冲液的配制：向0.01M的磷酸盐生理盐水缓冲液中加入0.02-0.04wt%的甲基异噻唑啉酮与诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入2～8wt%海藻糖、0.01～0.07wt%黄原胶、0.9wt%甘氨酸与0.7wt%丝氨酸，混匀后再加入0.3～1.2wt%褐藻提取物、0.1～0.6wt%基因重组的类人胶原蛋白，最后加入1.8wt%的硫酸镁与0.9wt%氯化锌、0.1%维生素B1及3%体积比的甘油，混合均匀，得到所述酶标记物稳定性缓冲液。

用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒，包括检测盒、辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液瓶、洗涤液瓶和显色液瓶，所述辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液采用如权利要求1所述方法制备，所述检测盒包括可以扣合在一起的盒体和盒盖，所述盒盖上开有反应窗口，所述反应窗口处由上至下依次固定设有包被膜与吸水垫，所述包被膜上包被有两个检测点与质控点，所述两个检测点上分别包被有抗人IgM与抗人IgG抗体，所述质控点包被有抗肺炎支原体抗体。

优选的，所述包被膜为硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。

制备所述用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒的方法，采用以下步骤制备：

⑴采用如权利要求1所述方法制备辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液；

⑵制备包被膜：选用适合孔径的包被膜，裁成方片备用；

⑶制备包被抗体：将选用的抗人IgM与抗人IgG、抗肺炎支原体抗体，离心备用；

⑷组装检测盒：将盒盖、包被膜、吸水垫和盒体按照从上到下的顺序组装并扣紧，使上盖的窗口扣在包被膜中心位置，组成检测盒。

⑸包被：用添加了3wt%海藻糖的0.01M磷酸盐缓冲液稀释离心后的各抗体至100～500μg/ml，在包被膜的检测点位置分别包被0.5μl浓度为0.1～1.0mg/ml的抗人IgM、0.5μl浓度为0.1～1.0mg/ml抗人IgG，质控点位置包被0.6μl浓度为0.5～1.0mg/ml的抗肺炎支原体抗体。

⑹干燥：检测盒在湿度10%～40%的环境下室温干燥1小时；

⑺包装：干燥后的检测盒用铝箔带包装，并在袋内放置干燥剂，封口。

采用上述技术方案后，本发明的有益效果是：本发明从酶及待标记物的氨基酸序列特点的水平上设计了最优标记路线：根据构成HRP的氨基酸序列成分无游离巯基且游离羧基较多、游离氨基相对少的特点，设计了先氨基化修饰酶，再利用抗原游离巯基基团标记的独特标记方法，使酶标肺炎支原体抗原的过程快速高效,3～5小时内即可完成标记且标记中无酶的自身交联，而且经过适当修饰的HRP仍具有较高活性、耐受pH范围较宽，且可以长期保存备用；相比较同类产品对IgM抗体的捕获法检测，很大程度上消除了样本中类风湿因子对结果的假阳性干扰，敏感性较高，降低了试剂盒的成本。

进一步地，本发明的显色液通过严格筛选具有特定功能的化合物组分，使显色液中的A、B组分（即过氧化物与生色物TMB）可长期共存同一体系中（常温14个月），检测时无需临时混匀，直接添加即可，简化了试剂盒检测步骤并节约了成本。

更进一步地，本发明经设计筛选并验证了可使酶标抗原长期稳定的保护性稀释缓冲液组分，相比较目前现有的公开配方，该体系组分含动物源物质较少，且各成分间不会发生生化反应，能最大限度发挥对酶标记物的保护与稳定作用；酶标抗原保护剂可使酶标记物常温下或2-8℃稳定较长时间（20个月），加速破坏试验证明可于37℃稳定至少11天，理论上也可用于其它酶标记物的长期稳定性保存。

本发明试剂盒具有以下优点：a、首次实现了以结合高灵敏度酶标肺炎支原体抗原为特征的对肺炎支原体IgM与IgG抗体的快速同时检测；b、本发明所述肺炎支原体抗体检测试剂盒相比较同类产品的捕获法检测IgM，不易受类风湿因子干扰，假阳性率较低；c、检测的操作过程简单快速、无需专门仪器设备，灵敏度与准确度较高，可用于肺炎支原体抗体的检测及预后回复性调查，也可用于医院诊所、血站、防疫站、卫生检疫部门、大专院校和科研机构的疾病诊断研究。

采用本发明制得的稳定稀释缓冲液与显色液，可以使试剂盒保存期达到16个月以上。

附图说明

图1为氨基化修饰后HPR活性对比温度曲线图；

图2为氨基化修饰后HPR活性对比PH值曲线图；

图3为本发明实施例中试剂盒的结构示意图；

图4为本发明实施例中检测盒的剖视图；

图5为检测盒正向的结构图；

其中，1、检测盒；2、辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液瓶；3、洗涤液瓶；4、显色液瓶；5、盒体；6、盒盖；7、反应窗口；8、包被膜；9、吸水垫；10、质控点；11、IgM抗体检测点；12、IgG抗体检测点。

具体实施例

为使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附表及实施例进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

辣根过氧化物酶的氨基化修饰

1、主要原料：辣根过氧化物酶HRP；乙二胺、EDC-HCl（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐）；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、苯甲酸、甘油均；海藻糖。

2、主要仪器：精密电子天平；冰箱；pH计；振荡器；磁力搅拌器；冻干机。

3、步骤如下：

将1.0g辣根过氧化物酶溶于25ml0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液中，加入80.0mg乙二胺，用HCl调节pH值至5.0，所得溶液与120.0mgEDC混合，室温振荡反应1h，然后装入透析袋采用预先配制的PBS透析2小时。

将上述制得的溶液加入10%体积比的甘油、质量比为3%的海藻糖及0.05%苯甲酸，再置于冷藏即用或浓缩后用冻干机制得冻干粉备用。

4、实验原理与结果分析：在本发明中，在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（以下简称EDC）存在的条件下，利用乙二胺与HRP分子中羧基间的酰胺化反应将更多的氨基接到HRP分子上，从而增加其氨基含量，具体反应机理如下：

上述分子修饰对辣根过氧化物酶活性有一定影响，通过以下试验对比修饰前后酶活性的变化：取干净离心管，加入1.0ml新配制的10mg/L HRP及960μl新配置的250μM TMB溶液，再加入120μl新配置的75μM的H₂O₂溶液，将此溶液混匀并立即分别分装出400μl置于20℃、25℃、30℃、37℃及45℃条件下温育30min，再用0.2M H₂SO₄终止反应，在450nm处比色测定。结果如下所示：

由图1可知，HRP修饰前后最适催化温度均为37℃，且修饰后酶的活性没有得到提高，但酶活损失较小（小于3%），说明此种修饰是可行的。

室温下，在不同pH值的缓冲液中分别保存2小时后测酶活性，结果如图2所示：

由图2可知，修饰酶在pH=5～6范围时，活性变化较小，而未修饰的酶活性有所下降。说明经过修饰的酶可在较宽pH范围内保持较高的活性。

以未经处理且正常保存的HRP干粉酶活性为对照，定期测定氨基化HRP相对酶活性，结果如下：

表1

测试时间（月）	1	3	5	7	9	11	13
								相对酶活	97.8%	97.5%	97.0%	97.0%	96.8%	96.3%	96.2%

由上表可知，氨基化HRP冻干粉可在至少13个月内保持较高的酶活性，可做大批量氨基化处理，即用即溶，为酶标抗原及其相关试剂盒的制备打下基础。

实施例2

酶标肺炎支原体抗原溶液的制备

1、原料：MP抗原；4.8mg/ml Sulfo-SMCC，即4-(N--马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐；截留分子量MWCO为10K的超滤管；氨基化HRP自制或商品化天然HRP；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠。

2、主要仪器：高速离心机；冰箱；pH计。

3、操作步骤如下：

（1）取一定量氨基化辣根过氧化物酶溶于1ml双蒸水中，配成5mg/ml的溶液；同时配制0.01M的磷酸盐缓冲液（以下简称PBS）备用。

（2）向新配制的5mg/ml的氨基化HRP溶液1ml中加入70μl交联剂Sulfo-SMCC，混匀并于室温下反应30min。

（3）将反应物加入MWCO为10K超滤管，以15000rpm离心10min后，以0.01MPBS复溶滞留结合物至1ml，再次以同样离心力离心10min并再次复溶滞留物至1ml。

（4）加入800μl浓度为1mg/ml的肺炎支原体抗原溶液并于室温反应30min；

为利于保存，可向上述酶标肺炎支原体抗原溶液中加入适量酶保护剂缓冲液置于-20℃避光保存备用。

本发明所述的标记过程，主要是利用具有双功能交联剂通过酶分子的氨基及待标记物的巯基间进行连接标记；所述辣根过氧化物酶HRP既可以选择上述已部分氨基化的HRP进行肺炎支原体抗原的标记，也可选择天然HRP进行标记；所述肺炎支原体抗原，可以是细胞培养后纯化的蛋白抗原，也可以是基因工程表达的重要外膜蛋白组分；所述交联物，主要采用以下结构交联物（Sulfo-SMCC）或具有类似结构性质的交联物：

利用HRP蛋白分子上无游离巯基的特点，将相应抗原的巯基与HRP的氨基通过以上交联物或类似交联物实现标记过程。此标记过程较为简单快速，参与标记过程的组分主要为一定浓度的酶、待标记蛋白分子及交联物，再辅助以除杂质器具即可。

直接交联法：直接采用未经处理的HRP标记肺炎支原体抗原：

向新配制的浓度5mg/ml的1ml天然HRP溶液中加入70μl交联剂Sulfo-SMCC，混匀并于室温下反应30min。后续纯化与标记步骤同上述优选操作步骤。

过碘酸钠法：采用目前较为常用的过碘酸钠法标记肺炎支原体抗原：称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml纯水中，再缓慢滴加0.3ml新配制的0.1mol/L的NaIO₄溶液，室温下避光轻柔搅拌40min，将上述溶液装入透析袋中，以1mmol/L pH4.5的醋酸钠溶液透析，4℃过夜，然后加入20μl0.2mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0-9.5，然后立即加入1mg/ml的肺炎支原体抗原0.5ml，室温下避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4mg/ml的硼氢化钠（NaBH₄）溶液，混匀，再置4℃下2小时。将以上酶标抗原混合液过SephadexG-200层析柱，收集第一峰的产物，即为酶标肺炎支原体抗原溶液。加入适量酶保护剂缓冲液置于-20℃避光保存备用。

4、对上述酶标抗原进行如下试验以确定研制试剂盒的最优参数：

4.1定量比较3种标记方法产物活性及对样本的检测效果：将三种标记物稀释成相同的终浓度，采用ELISA定量检测OD值的方法分别检测3种酶标抗原对于IgG、IgM的检测效果。

4.1.1对Mp IgG的检测：采用Mp IgG抗体包被聚乙烯微孔板，酶标抗原用PBS进行倍比稀释，按照ELISA基本方法操作。用TMB底物显色并以硫酸作为终止液测定OD值，酶标仪450nm波长读取OD值。结果如下：

表23种酶标抗原不同稀释度的OD值

4.1.2对Mp IgM的检测：采用Mp IgM抗体包被聚乙烯微孔板，酶标抗原用PBS进行倍比稀释，按照ELISA基本方法操作。用TMB底物显色并以硫酸作为终止液测定OD值。酶标仪450nm波长读取OD值。结果如下：

表33种酶标抗原不同稀释度的OD值

由以上试验可看出，本发明所述标记抗原方法相比较传统的过碘酸钠法检测肺炎支原体抗体时，灵敏度较高，尤其是HRP经修饰后标记抗原的方法更为灵敏。因为传统的过碘酸钠法标记过程中存在一定的酶自身交联，反复调整pH值也不利于酶的稳定及其催化作用的发挥。HRP分子中第11、44、49、91、97、177、209、301位氨基酸为半胱氨酸残基，其中11-91、44-49、97-301和177-209之间形成4个二硫键，因此HRP分子中没有游离巯基，所以无论HRP有没有经过预先活化，用本发明中所述方法也不会致使HRP标记抗原时发生自身交联，且标记效率较高。HRP经氨基化修饰后，在不影响酶本身活性的前提下，提供了较多可参与反应的氨基基团，因此与抗原巯基交联反应时标记效率有较大提高，直接提高了检测相应抗体的敏感度。

4.2酶标肺炎支原体抗原特异性检测：采用抗人IgG抗体及抗人IgM抗体分别包被硝酸纤维素膜，用该酶标抗原分别检测肺炎衣原体抗体阳性标本、生殖道支原体抗体阳性标本以及嗜肺军团菌抗体阳性标本各28例，结果均为阴性。

4.3酶标肺炎支原体抗原最佳工作液浓度确定：

分别采用抗人IgG抗体及抗人IgM抗体分别包被硝酸纤维素膜，用Mp IgG及IgM抗体中阳性的血清标本以及阴性血清测定不同稀释度的酶标抗原，采用TMB显色系统，以背景颜色最浅、阴性对照血清的检测点不显色、阳性血清的检测点显色作为酶标抗原工作浓度，结果如下所示：

表4

稀释度

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1000

1:1200

1:1400

1:1600

1:1800

IgM阳性

+++

++

+

—

IgG阳性

+++

++

+

—

阴性血清

—

背景颜色

****

***

**

*

备注：+++为强阳性；++为中阳性；+为弱阳性；—为阴性；“*”的数量表示颜色的深浅

由上表可知，采用1:1000的酶标抗原浓度时，背景颜色较浅，阳性血清显色明显清晰，且阴性血清呈阴性，因此采用1:1000作为酶标抗原最佳工作浓度。

实施例3～5

显色液的制备

1、主要原料：三水合乙酸钠、四甲基联苯胺TMB、过氧化脲、抗坏血酸、绿原酸；2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯（奥克立林）；磷酰甘氨酸。

2、配制方法：

（1）称取8.3g三水合乙酸钠晶体加入到600ml超纯水中，振荡混匀，用0.1mol/L的盐酸调整溶液pH至5.0，即配成0.05mol/L的乙酸--乙酸钠缓冲液。

（2）称取四甲基联苯胺（以下简称TMB）0.4～1.0g，溶于3ml无水乙醇中，再将已溶解的TMB溶液加入到上述乙酸—乙酸钠缓冲液中，振荡混匀，备用。

（3）称取绿原酸80mg与抗坏血酸80mg，加入到缓冲液中，振荡混匀。

（4）量取2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯（奥克立林）10ml加入到缓冲液中，混匀。

（5）称取磷酰甘氨酸2.8g加入到缓冲液中振荡混匀。称取过氧化脲0.2～0.8g，加入以上溶液并振荡混匀。

3、实验原理与分析

本发明由于使用了具有抗氧化作用的绿原酸与具有还原性的抗坏血酸作为TMB的保护剂，能保护其不受分解的过氧化物氧化，使用2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯（奥克立林）可以吸收紫外线，减少光照对显色体系的破坏作用；磷酰甘氨酸对过氧化物具有稳定作用，其中磷酰甘氨酸既可以给过氧化物提供酸性条件，又可将显色体系中的金属离子络合，消除金属离子对过氧化物的催化分解作用，从而稳定过氧化物。本发明提供的二合一显色液体系可在常温下稳定较长时间，试剂配制过程较简单，易于保存且灵敏度不变，可广泛应用于酶免试剂盒及相关诊断试剂。

按本发明分别配制实施例为3-5及作为对比例的1-3显色底物组合液，各编号配制如下：

表5各显色底物组合配方

编号

TMB

过氧化脲

绿原酸

抗坏血酸

奥克立林

磷酰甘氨酸

实施例3

0.8g

0.5g

80mg

10ml

2.8g

实施例4

0.4g

0.2g

80mg

10ml

2.8g

实施例5

1.0g

0.8g

80mg

10ml

2.8g

对比例1

0.8g

0.5g

——

10ml

2.8g

对比例2

0.8g

0.5g

80mg

——

对比例3

0.8g

0.5g

——

10ml

——

各个编号显色底物组合液在室温下不避光放置1个月、2个月直至14个月后稳定性情况如下表：（表中“↑”表示澄清无沉淀；“↓”表示有沉淀；“+”表示发生自显色；“-”表示未发生自显色）

表6各显色底物组合液稳定性状况

为观察显色物体系稳定性情况，不同时间测定混合体系650nm的OD值，结果如下：

表7各显色底物组合液吸光度情况

时间（月）	配制时	1	3	5	7	9	11	12	13	14
											实施例3	0.020	0.021	0.025	0.024	0.025	0.020	0.021	0.021	0.022	0.023
实施例4	0.024	0.020	0.028	0.027	0.029	0.028	0.027	0.028	0.028	0.029
											实施例5	0.024	0.023	0.022	0.025	0.024	0.022	0.023	0.025	0.026	0.028
对比例1	0.021	0.038	0.101	0.343	0.449	0.568	0.995	1.987	2.014	2.046
											对比例2	0.022	0.041	0.124	0.458	0.573	0.759	0.983	1.862	2.042	2.063
对比例3	0.020	0.050	0.131	0.512	0.684	0.905	1.552	2.014	2.017	2.021

为检测本发明所述的显色底物组合物对过氧化物酶检测的可靠性，进行以下试验：

采用抗人IgM抗体包被硝酸纤维素膜，以1000倍酶标抗原工作液以及酶免法确定的33份Mp IgM抗体阳性血清标本及15份阴性标本，检测本发明所述显色底物混合液的灵敏度，并采用临时混合的TMB底物显色系统作为对照，检测结果如下所示：

表8显色底物组合液及临时混匀的对照组结果

血清阴阳性	实施例1	实施例2	实施例3	对比例
					强阳性血清（11）	11/11(+++)	11/11(+++)	11/11(+++)	11/11(+++)
中阳性血清（10）	10/10(++)	10/10(++)	10/10(++)	10/10(++)
					弱阳性血清（12）	12/12(+)	12/12(+)	12/12(+)	12/12(+)
阴性血清（15）	15（-）	15（-）	15（-）	15（-）

从以上试验可以看出，本发明提供的二合一显色液体系可以稳定较长时间，易于保存且灵敏度不变。

实施例6～16

酶标肺炎支原体抗原稳定稀释缓冲液的制备

本发明实施例酶标记物稳定性稀释液的制备方法，包括如下步骤：

1.褐藻提取物的制备：新鲜海藻样品采集后，除去附生生物，用蒸馏水反复冲洗多次后，取藻体顶部，称取50g用组织捣碎机破碎，然后加入80%的乙醇提取液提取，提取液用减压蒸馏的方法除去乙醇，加入25ml的pH7.4PBS，高速离心后取上清液，即为褐藻（鼠尾藻）的乙醇提取物。

2.酶标记物稳定性缓冲液的配制：

在0.01M PBS中加入0.02wt%甲基异噻唑啉酮及0.06wt%PROCLIN300诊断试剂防腐剂和2～8wt%海藻糖以及0.01～0.07wt%黄原胶，再加入0.9wt%甘氨酸、0.7wt%丝氨酸，溶解后混匀；然后加入0.3～1.2wt%褐藻提取物、0.1～0.6wt%类人胶原蛋白（基因重组）、1.8wt%硫酸镁、0.9wt%氯化锌、0.1wt%维生素B₁；最后加入体积比3%甘油，混匀即可使用。

本发明实施例提供的酶标记物稳定体系，含有保护性糖、氨基酸、褐藻提取物、基因重组的类人胶原蛋白、硫酸镁及其它辅助性成分等。本发明实施例提供的酶标记物稳定体系，含有保护性糖、氨基酸、褐藻提取物、基因重组的类人胶原蛋白、硫酸镁及其它辅助性成分等。其主要特征在于，该稳定性保护体系除了含有甘油、稳定性离子等常规性保护性成分，还添加有非还原性保护性糖、可调节溶液流动性的黄原胶、以及天然藻类提取物，以保证酶标记物体系的稳定。其中：

海藻糖是天然双糖中最稳定的糖质，海藻糖不具有还原性，与各种氨基酸、蛋白质长久共存不会产生美拉德反应。海藻糖可以有效提高酶蛋白的热稳定性，且对生物大分子具有非特异性保护即防腐性能。海藻糖在稳定性溶液中终浓度为2%—8%，最佳浓度为5%。

黄原胶可调节溶液体系的流动性，且黄原胶分子上的疏水基团与酶标抗原分子表面疏水区域相互作用，增加了酶标抗原表面的亲水性，间接提高了酶标抗原的稳定性。黄原胶在组合物中终浓度为0.01%—0.07%，最好为0.03%。

本发明人尝试过多种植物源性提取物作为稳定剂组分，发现鼠尾藻（Sargassum thunbergii）（褐藻门马尾藻属）提取物与上述组分混匀后能对整个标记物体系具有不可替代的稳定性作用，可能与鼠尾藻等褐藻提取物中含有可清除自由基成分及高效抗氧化性能有关，其在稳定性酶标记物体系中终浓度为0.3%—1.2%，最佳浓度为0.8%。

上述基因重组的类人胶原蛋白可提高标记物稳定性，具有抗各种辐射的作用，进而起到保护生物大分子稳定性作用。其在稳定体系溶液中工作浓度为0.1%—0.6%，最佳为0.3%。

其它所述成分如甘氨酸、甘油、硫酸镁等其它成分也是维持整个稳定体系的常规性重要组分。

实施例6～16：此实施例系列中稳定剂配制过程与上述实施例相同，仅在配制过程的指定特效添加物环节加入对应量物质（终浓度见表9），其它组分使用量同以上过程。对比例4～10中不同组分浓度溶液体系配制过程与实施例相同，仅在配制过程中相应环节加入对应量该物质即可。各组分在实施例溶液体系中终浓度如下表所示：

表9各实施例与对比例组分

为考察上述实施例与对比例溶液体系性能，进行如下试验：

（1）将酶标记物分别置于上述实施例与对比例稀释液体系中在室温下放置，定期检查，直至20个月，溶液体系情况如表（表中“↓”表示有沉淀，“↑”表示无沉淀，“+”表示有悬浮微粒，“-”表示无悬浮微粒，“C”表示有颜色变化，“C”表示无颜色变化，“∕”表示pH值有变动“√”表示pH值无变动）

表10稳定性酶标记物溶液随时间变化情况

（2）验证此酶标记物稳定性体系的可靠性：

将酶标记物用上述各编号稳定性稀释缓冲液配成工作液浓度并置室温保存，定期按照如下操作进行试验：用pH9.6碳酸盐缓冲液包被抗肺炎支原体IgG抗体，每孔100μl，同时用PBS作为阴性对照，每孔100μl，置4℃冰箱过夜。取出后用pH7.4PBS-tween20缓冲液洗涤3次，每次3min，甩干后每孔加入各编号稳定剂的酶标记物100μl，置37℃40min，取出后用pH7.4PBS-tween20缓冲液洗涤3次，每次3min。甩干后滴加底物液每孔100μl，置室温避光存放5-10min，每孔加入终止液50μl，采用酶标仪测得各自OD值。检测结果如下表所示：

表11酶标记物稳定性体系显色性能结果

（3）加速破坏试验：将以上最佳稳定剂组分作为酶标抗原缓冲液，按照如上ELISA试验步骤，检测37℃条件下放置的酶标记肺炎支原体抗原稳定性（表中“↓”表示有沉淀，“↑”表示无沉淀，“+”表示有悬浮微粒，“-”表示无悬浮微粒，“C”表示有颜色变化，“C”表示无颜色变化，“∕”表示pH值有变动“√”表示pH值无变动）结果如下所示：

表12酶标记物稳定性体系加速破坏结果

天数（d）	1	3	5	7	9	10	11
								吸光度	2.223	2.231	2.189	2.205	2.169	2.201	2.176
物理性状	↑-C√	↑-C√	↑-C√	↑-C√	↑-C√	↑-C√	↑-C√

经试验在37℃可稳定至少11天。

酶标抗原保护剂原则上可直接用于其它酶标记物，例如酶标抗体等，本发明的酶标记物稀释液中增加了有效的保护性成分，能使酶标记物长久保持稳定。

实施例17

一种用于检测肺炎支原体抗体的方法，将抗人IgM与抗人IgG分别固定在硝酸纤维素膜上，加入待检血清，待检血清中的肺炎支原体抗体和固定到膜上的抗人IgM与抗人IgG结合后，加入酶标记肺炎支原体抗原溶液，最后加入显色液显色显示结果,其中:

1、酶标记肺炎支原体抗原溶液采用辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液，并采用以下步骤制备：

（1）将1g辣根过氧化物酶溶于25ml的0.01M磷酸盐缓冲液中，加入70乙二胺，用0.1M盐酸将pH值调节至5.0，所得溶液再与115mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用0.01M磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；

（2）将步骤（1）制得的溶液配制成1ml、浓度为5mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60μl交联剂，混匀后于室温下反应25min；

（3）将反应物加入截留分子量为10K的超滤管，并对反应物进行离心处理8min，再以0.01M的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8min，以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至1ml；

（4）加入800μl浓度为1mg/ml的肺炎支原体抗原溶液，并于室温下反应25min；

辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原所用交联剂分子结构如下：

2、显色液包括四甲基联苯胺、过氧化脲、抗氧化剂绿原酸、还原剂抗坏血酸、紫外线吸收剂2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、pH5.0的乙酸钠缓冲溶液体系,显色液采用如下方法制得：

⑴将8.3g三水合乙酸钠晶体溶于600ml超纯水中，振荡混匀，并调整溶液pH至5.0；

⑵再将0.8g四甲基联苯胺溶于3ml无水乙醇中，制得四甲基联苯胺乙醇溶液；

⑶将上述两种溶液混合，振荡混匀；

⑷分别将70mg绿原酸与70mg抗坏血酸、8ml2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、2.5g磷酰甘氨酸及0.4g过氧化脲加入到步骤（3）所得到的混合溶液中，振荡混匀，得到显色液。

3、酶标肺炎支原体抗原的稳定稀释缓冲液采用以下方法制备：

⑵酶标记物稳定性缓冲液的配制：向0.01M的磷酸盐生理盐水缓冲液中加入0.02wt%的甲基异噻唑啉酮与诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入2wt%海藻糖、0.01wt%黄原胶、0.9wt%甘氨酸与0.7wt%丝氨酸，混匀后再加入0.3wt%褐藻提取物、0.1wt%基因重组的类人胶原蛋白，最后加入1.8wt%的硫酸镁与0.9wt%氯化锌、0.1%维生素B1及3%体积比的甘油，混合均匀，得到酶标记物稳定性缓冲液。

实施例18

（1）将1g辣根过氧化物酶溶于30ml的0.01M磷酸盐缓冲液中，加入85mg乙二胺，用0.1M盐酸将pH值调节至5.0，所得溶液再与125mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用0.01M磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；

（2）将步骤（1）制得的溶液配制成1ml、浓度为5.2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入85μl交联剂，混匀后于室温下反应35min；

（3）将反应物加入截留分子量为10K的超滤管，并对反应物进行离心处理12min，再以0.01M的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心12min，以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至1ml；

（4）加入1000μl浓度为1mg/ml的肺炎支原体抗原溶液，并于室温下反应35min；

⑴将8.5g三水合乙酸钠晶体溶于600ml超纯水中，振荡混匀，并调整溶液pH至5.0；

⑵再将0.83g四甲基联苯胺溶于3ml无水乙醇中，制得四甲基联苯胺乙醇溶液；

⑶将上述两种溶液混合，振荡混匀；

⑷分别将90mg绿原酸与90mg抗坏血酸、12ml2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、2.9g磷酰甘氨酸及0.6g过氧化脲加入到步骤（3）所得到的混合溶液中，振荡混匀，得到显色液。

实施例19

（2）将步骤（1）制得的溶液配制成1ml、浓度为5.2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入70μl交联剂，混匀后于室温下反应25～35min；

（3）将反应物加入截留分子量为10K的超滤管，并对反应物进行离心处理10min，再以0.01M的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8～12min，以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至1ml；

（4）加入900μl浓度为1mg/ml的肺炎支原体抗原溶液，并于室温下反应25～35min；

2、酶标肺炎支原体抗原的稳定稀释缓冲液采用以下方法制备：

⑵酶标记物稳定性缓冲液的配制：向0.01M的磷酸盐生理盐水缓冲液中加入0.02-0.04wt%的甲基异噻唑啉酮与诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入6wt%海藻糖、0.05wt%黄原胶、0.9wt%甘氨酸与0.7wt%丝氨酸，混匀后再加入0.6wt%褐藻提取物、0.3wt%基因重组的类人胶原蛋白，最后加入1.8wt%的硫酸镁与0.9wt%氯化锌、0.1%维生素B1及3%体积比的甘油，混合均匀，得到酶标记物稳定性缓冲液。

实施例20

用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒

如图3、图4和图5所示的用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒，包括检测盒1、辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液瓶2、洗涤液瓶3和显色液瓶4，检测盒1包括可以扣合在一起的盒体5和盒盖6，盒盖6上开有反应窗口7，反应窗口7处由上至下依次固定设有包被膜8与吸水垫9，包被膜8为硝酸纤维素膜，包被膜8上包被有两个检测点与质控点10，两个检测点上分别包被有抗人IgM抗体与抗人IgG抗体，即IgM抗体检测点11与抗人IgG抗体检测点12，质控点10包被有抗肺炎支原体抗体。

其中，辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液采用实施例1～2中的方法制备，显色液采用实施例3～5中的方法制备，酶标肺炎支原体抗原稳定稀释缓冲液采用实施例6～16中的方法制备。

实施例21

用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒，其中，辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液采用实施例1～2中的方法制备，显色液采用实施例3～5中的方法制备，其余同实施例20。

实施例22

用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒，其中，辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液采用实施例1～2中的方法制备，酶标肺炎支原体抗原稳定稀释缓冲液采用实施例6～16中的方法制备，其余同实施例20。

实施例23

用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒，其中，辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液采用实施例1～2中的方法制备，其余同实施例20。

实施例24

用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒的制备方法

制备实施例20的检测盒，包括以下步骤：

（1）包被膜的准备：选用孔径为0.45μm的硝酸纤维素膜，裁成1.0cm×1.0cm的方片备用。

（2）包被抗体的准备：选用高纯度的抗人IgM与抗人IgG、抗肺炎支原体抗体，离心备用。

（3）检测盒体的组装：将盒盖、硝酸纤维素膜、吸水垫和盒体按照从上到下的顺序组装并扣紧，使上盖的窗口扣在包被膜中心位置，组成检测盒。

（4）包被抗体：用包被缓冲液稀释抗体，在包被膜的检测点位置分别包被0.5μl0.4mg/ml的抗人IgM、0.5μl0.3mg/ml抗人IgG，质控点位置包被0.6μl0.6mg/ml抗肺炎支原体抗体。包被缓冲液为pH7.4的PBS，添加3%的海藻糖。

（5）检测盒在湿度10%-40%的环境下室温干燥1小时。干燥后的检测盒用铝箔带包装，并在袋内放置干燥剂，封口。

本发明所述的液体组分包括：

（1）酶标肺炎支原体抗原溶液：其制备同实施例1与2，溶液内也可以含按实施例4所述方法制备的酶标记物稳定性缓冲液，酶标液瓶中成分为1:1000的酶标肺炎支原体抗原溶液；

（2）洗涤液：成分为加有0.06%Tween-20的0.01mol/L pH7.4PBS；

（3）显色液：成分为TMB、过氧化脲及相关稳定保护性成分，制备方法也可以同实施例3。

将以上检测盒与液体成分瓶以合理形式组装，即为肺炎支原体检测试剂盒。

试剂盒的使用方法：

（1）样本收集：将静脉血置干净、未加抗凝剂的容器内，静置使血自然收缩，离心，取血清检测。

（2）检测：滴加3滴待测血清于加样孔中，待液体完全渗入。

滴加3滴酶标液于加样孔中，待液体充分渗入。

滴加4滴洗涤液于加样孔中，待液体充分渗入。

滴加3滴显色液于加样孔中，待液体充分渗入。3-5min观察显色结果。

（3）结果判断

阳性：

1.Mp IgM阳性：在IgM检测点和质控点出现两个蓝色斑点；

2.Mp IgG阳性：在IgG检测点和质控点出现两个蓝色斑点；

3.Mp IgM、IgG同时阳性：在IgM检测点、IgG检测点和质控点出现三个蓝色斑点。

上述阳性结果的强中弱程度与显色点强度成正比。

阴性：只在质控点出现一个蓝色斑点。

质控点不显色，表明操作失误或试剂实效，试验结果无效。

检测实例：

采用已通过国内注册的深圳市安群生物工程有限公司的肺炎支原体IgM抗体检测试剂盒（ELISA法）、深圳亚辉龙生物科技有限公司的肺炎支原体抗体IgG测定试剂盒（ELISA法）作为对照试剂盒，与本发明试剂盒同时检测阴阳性血清。临床血清从相关医院获得，其中肺炎支原体IgM抗体阳性标本320份；肺炎支原体IgG抗体阳性标本280份；两种抗体全为阴性的正常标本480份。检测结果如下：

表13本试剂盒与对照试剂盒对血清检测结果

试验表明，本试剂盒的灵敏度与特异性较高，且与对照试剂盒无显著差别。

试剂盒稳定性研究:

将肺炎支原体抗体检测试剂盒置于37℃放置9天，并每天进行检测；将肺炎支原体抗体检测试剂盒置于常规性（2~8℃）放置16个月，并定期进行检测，检测标准：

（1）物理检测：包装袋无变形破损，检测板平整洁净、装配严密，检测孔内膜片无划痕、破损和污点；试剂瓶瓶体无变形，瓶内液体透明，无浑浊、沉淀现象。

（2）特异性：用10份Mp抗体阴性质控品检测，检测结果不得出现阳性。

（3）准确性：用33份Mp抗体阳性（酶联免疫法确定的强、中、弱阳性质控品各11份）检测，检测结果不得出现阴性。

试剂盒稳定性检测结果如下表所示（+++为强阳性；++为中阳性；+为弱阳性；—为阴性）

表1437℃放置9天加速试验检测结果

表1516个月常规性放置（2-8℃）试验检测结果

由上表可知，本发明中的肺炎支原体抗体检测试剂盒在37℃下放置9天及在2-8℃放置16个月的过程中，物理检测均符合要求；阴性质控品检测结果全呈阴性、阳性质控品检测结果全部呈阳性（强、中、弱阳性检测结果与酶免法确定的质控品基本相符），各项性能指标基本没有发生变化，可满足临床检验要求。

本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒，其特征在于，包括设置在所述试剂盒内的检测盒、辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液瓶、洗涤液瓶和显色液瓶，所述检测盒内设有包被膜，所述包被膜上包被有两个检测点与质控点，所述两个检测点上分别包被有抗人IgM与抗人IgG抗体，所述质控点包被有抗肺炎支原体抗体；

所述辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液瓶中的酶标记肺炎支原体抗原溶液采用辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液，并采用以下步骤制备：

(1)将1g辣根过氧化物酶溶于25ml～30ml的0.01M磷酸盐缓冲液中，加入70～85mg乙二胺，用0.1M盐酸将pH值调节至5.0，所得溶液再与115～125mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用0.01M磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；

(2)将步骤(1)制得的溶液配制成1ml、浓度为5～5.2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60～85μl交联剂，混匀后于室温下反应25～35min；

(3)将步骤(2)的反应物加入截留分子量为10K的超滤管，并对反应物进行离心处理8～12min，再以0.01M的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8～12min，以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至1ml；

(4)加入700～900μl浓度为1.6mg/ml的肺炎支原体抗原溶液，并于室温下反应25～35min；

(5)使步骤(4)制得的溶液通过SephadexG-200层析柱，收集第一峰的产物，即为酶标肺炎支原体抗原溶液；

所述显色液瓶中的显色液为包括四甲基联苯胺、过氧化脲、抗氧化剂绿原酸、还原剂抗坏血酸、紫外线吸收剂2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯和pH5.0的乙酸钠缓冲溶液体系；

所述显色液采用如下方法制得：

⑶将上述两种溶液混合，振荡混匀；

⑷分别将70～90mg绿原酸与70～90mg抗坏血酸、8～12ml 2-氰基-3,3-二苯基丙烯酸异辛酯、2.5～2.9g磷酰甘氨酸及0.2～0.8g过氧化脲加入到步骤(3)所得到的混合溶液中，振荡混匀，得到所述显色液；

辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原使用前，加入酶标记物稳定性缓冲液，所述酶标记物稳定性缓冲液采用以下方法制备：

⑴褐藻提取物的制备：新鲜海藻样品采集后，除去附生生物，用蒸馏水反复冲洗后取藻体顶部，称量后用组织捣碎机破碎，然后加入乙醇提取液提取，提取液除去乙醇，加入磷酸盐缓冲液，离心后取上清液，即制得褐藻提取物；

⑵酶标记物稳定性缓冲液的配制：向0.01M的磷酸盐生理盐水缓冲液中加入0.02～0.04wt％的甲基异噻唑啉酮与0.04～0.08wt％诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入2～8wt％海藻糖、0.01～0.07wt％黄原胶、0.9wt％甘氨酸与0.7wt％丝氨酸，混匀后再加入0.3～1.2wt％褐藻提取物、0.1～0.6wt％基因重组的类人胶原蛋白，最后加入1.8wt％的硫酸镁与0.9wt％氯化锌、0.1wt％维生素B1及3％体积比的甘油，混合均匀，得到所述酶标记物稳定性缓冲液。

2.如权利要求1所述的用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒，其特征在于，所述包被膜为硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。

3.如权利要求1所述的用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原所用交联剂分子结构如下：

4.制备如权利要求1所述的用于检测肺炎支原体抗体的试剂盒的方法，其特征在于，采用以下步骤制备：

⑴采用如权利要求1所述试剂盒中制备酶标记肺炎支原体抗原溶液的方法制备辣根过氧化物酶标记肺炎支原体抗原溶液；

⑵制备包被膜：选用适合孔径的包被膜，裁成方片备用；

⑶制备包被抗体：将抗人IgM、抗人IgG与抗肺炎支原体抗体离心备用；

⑷组装检测盒：将盒盖、包被膜、吸水垫和盒体按照从上到下的顺序组装并扣紧，使上盖的窗口扣在包被膜中心位置，组成检测盒；

⑸包被：用添加了3wt％海藻糖的0.01M磷酸盐缓冲液稀释离心后的各抗体至100～500μg/ml，在包被膜的检测点位置分别包被0.5μl浓度为0.1～1.0mg/ml的抗人IgM、0.5μl浓度为0.1～1.0mg/ml抗人IgG，质控点位置包被0.6μl浓度为0.5～1.0mg/ml的抗肺炎支原体抗体；

⑹干燥：检测盒在湿度10％～40％的环境下室温干燥1小时；