DE68923907T2

DE68923907T2 - Verfahren zur immunochromatographischen Analyse.

Info

Publication number: DE68923907T2
Application number: DE68923907T
Authority: DE
Inventors: Vartan Ghazarossian; Armen B Shanafelt; Carl N Skold; Edwin F Ullman
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1988-05-17
Filing date: 1989-05-16
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2009-05-17
Also published as: JP3009155B2; EP0342913A3; CA1334164C; ES2075851T3; DE68923907D1; ATE126893T1; EP0342913B1; US5039607A; US5468647A; EP0342913A2; US5248619A; JPH0249161A

Description

Die Fähigkeit, natürlich vorkommende Rezeptoren oder Antikörper, die gegen spezifische Verbindungen gerichtet sind, beim Testen auf die Anwesenheit einer interessierenden Verbindung zu verwenden, hat ein blühendes Immunassay-Geschäft hervorgerufen. An jedem der Assays ist ein komplementäres Paar von spezifischen Bindungspaar("sbp")- Mitgliedern beteiligt, gewöhnlich ein immunologisches Paar, das einen Liganden und einen Rezeptor (Antiliganden) beinhaltet, wobei eines der sbp-Mitglieder mit einem Marker markiert ist, der für ein nachweisbares Signal sorgt. Das Immunassay-Verfahren hat eine Verteilung des Signalmarkers zwischen Signalmarker, der in einem Komplex der sbp-Mitglieder gebunden ist, und ungebundenem Signalmarker zur Folge. Die Unterscheidung zwischen gebundenem und ungebundenem Signalmarker kann das Ergebnis einer physikalischen Trennung von gebundenem und ungebundenem Signalmarker oder einer Modulation des nachweisbaren Signals zwischen gebundenem und ungebundenem Signalmarker sein.
Meistens sind Immunassays auf eine quantitative Bestimmung einer großen Vielfalt von interessierenden Verbindungen in klinischen Labors gerichtet worden, welche eine relativ komplizierte Ausrüstung und eine sorgfältige Technik erforderten. Immunassays haben eine weniger breite kommerzielle Anwendung gefunden, wenn halbquantitative oder qualitative Ergebnisse annehmbar wären und an der Bestimmung kein Laborpersonal beteiligt wäre, wie zu Hause oder in der Praxis eines praktischen Arztes. Selbst im klinischen Labor könnten einfache und schnelle Durchmusterungstests, an denen unerfahrenes Personal beteiligt wäre, dazu dienen, für beträchtliche Einsparungen zu sorgen.
Bei der Entwicklung eines Immunassays sind viele Überlegungen zu berücksichtigen. Eine Überlegung besteht darin, für einen wesentlichen Unterschied zwischen dem beobachteten Signal, das aus einem Signalmarker hervorgeht, wenn er gebunden ist, im Vergleich zu ungebundenem so sorgen. Eine andere Überlegung besteht darin, den störenden Einfluß von endogenen Materialien in der Probe zu minimieren, von der man annimmt, daß sie die interessierende Verbindung enthält. Eine weitere Überlegung betrifft die Leichtigkeit, mit der das beobachtete Signal nachgewiesen werden kann und dazu dienen kann, zwischen Konzentrationen im interessierenden Konzentrationsbereich zu unterscheiden. Eine andere Überlegung betrifft die Konzentration der interessierenden Verbindung in einer Probe. Andere Faktoren schließen die Leichtigkeit der Herstellung der Reagenzien, die Genauigkeit, mit der Proben und Reagenslösungen hergestellt und gemessen werden müssen, die Lagerfähigkeit der Reagenzien, die im Protokoll erforderte Anzahl der Schritte und die Fertigkeit und Genauigkeit ein, mit der jeder der Schritte durchgeführt werden muß. Deshalb sollte bei der Entwicklung eines Assays, der bei ungeübtem Personal Anwendung finden kann, wie Assays, die zu Hause, in der forensischen Medizin, von praktischen Ärzten oder dgl. durchgeführt werden sollen, das beobachtete Ergebnis minimal durch Schwankungen in der Weise, in der das Protokoll durchgeführt wird, beeinflußt werden, und die Techniken zur Durchführung der verschiedenen Schritte sollten einfach sein.
Im allgemeinen war es schwierig, Immunassays zu entwerfen, die die Bestimmung eines verdünnten Analyten in einer Probe gestatteten, und diejenigen, die aufgezeigt worden sind, erfordern zahlreiche Schritte und lange Zeitspannen.
Frontalanalyse (oder Durchbruch-Analyse) ist ein bekanntes Verfahren zur quantitativen Bestimmung von aktiven Gruppen auf einem festen Träger in einer Chromatographiesäule (C.R. Lowe und P.D.G. Dean, Affinity Chromatography, John Wiley & Sons, Ltd., New York, 1974). Bei der Frontalanalyse wird eine Lösung der reagierenden Spezies mit einer bekannten Konzentration auf die Säule aufgetragen. Eine Messung des Volumens, das erforderlich ist, die Säule so zu sättigen, daß die reagierende Spezies im Säulenausfluß nachgewiesen wird (das Durchbruch-Volumen) gestattet die Bestimmung der Konzentration der aktiven Gruppe auf der Säule.
Eine Testvorrichtung zur Bestimmung einer Charakteristik einer Probe, insbesondere zur Bestimmung von Substanzen in flüssigen Proben, ist im US-Patent Nr. 4,094,647 offenbart. Ein Dünnschichtchromatographie-Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung eines Chromatographietests ist im US-Patent Nr. 4,384,958 offenbart. Ein Immunassay, in dem markierter Antikörper von einem immobilisierten Analytenanalogon verdrängt wird, ist im US-Patent Nr. 4,434,236 offenbart. Eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis von Myoglobin sind im US-Patent Nr. 4,189,304 offenbart. Teststreifen für die Analyse von Substanzen, die in Flüssigkeiten gelöst sind, sind im US-Patent Nr. 4,438,067 offenbart. Eine Mehrschichten- Testvorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit einer Komponente einer flüssigen Probe und das Verfahren zur Verwendung einer derartigen Vorrichtung sind im US-Patent Nr. 4,160,008 offenbart. Ein Verfahren zum Messen von Antigen durch markiertes Antigen unter Verwendung von unlöslichem Antikörper ist in der japanischen Patentanmeldungs- Offenlegungsschrift Nr. 5925/73 - 25. Januar 1973, offenbart.
Ein konzentrierendes Zonen-Verfahren in heterogenen Immunassays ist im US-Patent Nr. 4,366,241 offenbart. Das US-Patent Nr. 4,168,146 beschreibt einen Immunassay-Teststreifen. Die US-Patente Nr. 3,990,850 und 4,055,394 beschreiben diagnostische Testkarten. Ein automatisiertes Verfahren zur quantitativen Analyse von biologischen Flüssigkeiten ist im US-Patent Nr. 4,327,073 offenbart. Ein chromogener Träger-Immunassay ist in der internationalen Anmeldung Nr. PCT/U583/01887 offenbart.
Eine große Vielfalt von Patenten und Patentanmeldungen stellen eine umfangreiche Literatur für verschiedene Techniken zur Erzeugung von nachweisbaren Signalen in Immunassays bereit. Die folgende Liste ist lediglich erläuternd für einige dieser Techniken, die in dieser Erfindung Anwendung finden können. Das folgende ist eine Liste von US-Patenten und -Patentanmeldungen und eine allgemeine Aufführung des beteiligten Marker-Typs:
US-Patente Nr. 3,646,346, radioaktive Marker; 3,654,090, 3,791,932 und 3,817,838, Enzym-Marker; 3,996,345, Fluoreszenzlöschende Marker; 4,062,733, radioaktiver Marker; 4,067,959, Fluoreszenzstoff- oder Enzym-Marker; 4,104,029, chemilumineszierender Marker; und 4,160,645, nicht-enzymatischer Katalysator-Marker. Siehe die US-Patente Nr. 3,966,879 bezüglich einer elektrophoretischen Technik, die eine Antikörper-Zone verwendet, und 4,120,945 bezüglich eines RIA, in dem markierter Analyt anfänglich durch Antikörper an einen festen Träger gebunden wird. Das US-Patent Nr. 4,233,402 verwendet Enzym-Paar-Marker; das US-Patent Nr. 4,720,450 chemisch induzierte fluoreszierende Marker; und das US-Patent Nr. 4,287,300 anionisch geladene Enzym-Marker.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind bei der Durchführung von Assays nützlich. Ein derartiges Verfahren zur Durchführung eines Assays umfaßt das Bereitstellen einer ersten Zone eines saugfähigen Elements ("ersten Zone") und eines flüssigen Mediums, das eine Komponente enthält, in Kombination. Die erste Zone weist nicht-diffundierbar daran gebunden ein Reagens auf, das mit der Komponente reagiert. Es werden Bedingungen verwendet, bei denen das flüssige Medium und mindestens ein Teil der darin enthaltenen Komponente durch Kapillarwanderung die gesamte erste Zone durchwandern und in eine zweite Zone eines saugfähigen Elements ("zweite Zone") mit einer von der ersten Zone verschiedenen Zusammensetzung hineinwandert. Die Strecke, die die Komponente in die zweite Zone hineingewandert ist, oder der Unterschied in den Strecken, die das Medium und die Komponente in die Zone hineingewandert sind, wird bestimmt. Die Strecke oder der Unterschied wird zu der Menge an Komponente in dem flüssigen Medium oder der Menge des Reagens in Beziehung gesetzt.
Ein anderes derartiges Verfahren zur Bestimmung der Menge einer Komponente in einem flüssigen Medium umfaßt das Inkontaktbringen einer ersten Zone eines saugfähigen Elements ("ersten Zone") mit einem flüssigen Medium, das eine Komponente enthält. Die erste Zone weist nicht-diffundierbar daran gebunden ein Reagens auf, das mit der Komponente reagiert. Das Inkontaktbringen wird unter Bedingungen durchgeführt, bei denen das flüssige Medium und mindestens ein Teil der darin enthaltenen Komponente mittels Kapillarwanderung die gesamte erste Zone durchwandern und in eine zweite Zone eines saugfähigen Elements ("zweite Zone") mit einer von der ersten Zone verschiedenen Zusammensetzung hineinwandern. Die Strecke, welche die Komponente in die zweite Zone hingewandert ist, oder der Unterschied in der Strecke, welche das Medium und die Komponente in die zweite Zone hineingewandert sind, wird gemessen. Die Strecke oder der Unterschied wird zu der Menge der Komponente in dem flüssigen Medium oder der Menge des Reagens in Beziehung gesetzt.
Ein anderes derartiges Verfahren zur Durchführung eines Assays umfaßt das Vereinigen einer Lösung eines Analyten mit einem ersten saugfähigen Element, wobei ein Reagens, das mit dem Analyten reagieren kann, nicht-diffundierbar an das erste saugfähige Element gebunden ist oder wird. Ein flüssiges Medium, das eine Komponente enthält, wird mit dem ersten saugfähigen Element vereinigt, wobei die Komponente mit dem Reagens reagiert. Das zweite saugfähige Element steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Element mit einer von dem ersten saugfähigen Element verschiedenen Zusammensetzung, oder es liegt als räumlich getrennter Teil desselben vor. Es werden Bedingungen gewählt, bei denen das flüssige Medium und die Komponente zuerst das erste saugfähige Element und dann mindestens einen Teil des zweiten saugfähigen Elements mittels Kapillarwirkung durchwandern. Auf dem zweiten saugfähigen Element wird eine Grenze bestimmt, die durch verschiedenen Konzentrationen der Komponente oder eines Reaktionsprodukts derselben erzeugt wird. Die Lage der Grenze wird zu der Menge an Analyt in der Lösung oder der Menge an Reagens auf dem ersten saugfähigen Element in Beziehung gesetzt.
Ein anderes Verfahren zur Durchführung eines Assays umfaßt das Bereitstellen (1) eines ersten saugfähigen Elements und (2) eines Analyten in Kombination in einem ersten flüssigen Medium, wobei ein Reagens für den Analyten in dem Medium oder auf dem ersten saugfähigen Element anwesend ist. Das erste saugfähige Element steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element. Es werden Bedingungen gewählt, bei denen das erste Medium mittels Kapillarwirkung durch das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements fließt und der Analyt nicht-diffundierbar an das saugfähige Element gebunden wird. Die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem saugfähigen Element und dem absorbierenden Element wird beendet. Eine andere Kombination wird bereitgestellt, die in einem zweiten flüssigen Medium einen Teil des ersten saugfähigen Elements und eine Komponente bereitstellt, die mit dem Reagens reagiert, wobei das erste saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Element steht. Die Kombination wird unter Bedingungen bereitgestellt, bei denen das zweite Medium mittels Kapillarwirkung das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des zweiten saugfähigen Elements durchwandert, mit der Maßgabe, daß das erste saugfähige Element zu wesentlich verschiedenen Zeitpunkten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem zweiten saugfähigen Element steht. Eine Grenze wird auf dem zweiten saugfähigen Element bestimmt, wobei die Lage der Grenze zu der Menge an Analyt im ersten Medium oder der Menge an Reagens oder der Menge der Komponente im zweiten flüssigen Medium in Beziehung steht.
Ein anderes derartiges Verfahren ist beim Testen auf die Anwesenheit eines Analyten in einer Probe nützlich, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält. In einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird ein Teil eines ersten saugfähigen Elements mit einem ersten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium oder einer derartigen Lösung in Kontakt gebracht, der bzw.
die ein Reagens, wie ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars (sbp) enthält, um zu veranlassen, daß das Reagens an das erste saugfähige Element gebunden wird. Das erste saugfähige Element kann in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit einem absorbierenden Element gebracht werden. Der Kontakt wird unter Bedingungen durchgeführt, bei denen das erste Medium mittels Kapillarwirkung durch das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements wandert oder fließt. Als nächstes wird das erste saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Element gebracht. Ein Teil des ersten saugfähigen Elements wird mit dem zweiten, gewöhnlich wäßrigen Medium unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen das zweite wäßrige Medium mittels Kapillarwirkung das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des zweiten saugfähigen Elements durchwandert. Auf diese Weise wird eine Komponente im zweiten Medium in Beziehung zu der Anwesenheit eines Analyten im ersten Medium durch das zweite saugfähige Element absorbiert und vorzugsweise nicht-diffundierbar an das zweite saugfähige Element gebunden. Die Anwesenheit der Komponente auf mindestens einem Teil des zweiten saugfähigen Elements wird bestimmt und zeigt die Anwesenheit von Analyt an.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Kombination in einem ersten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium oder einer derartigen Lösung bereitgestellt. Die Kombination schließt (1) mindestens einen Teil eines ersten saugfähigen Elements, bei dem mindestens ein Teil desselben ein erstes Reagens, beispielsweise ein sbp-Mitglied, nicht diffundierbar daran gebunden aufweist, und (2) eine Probe ein, von der man annimmt, daß sie einen Analyten enthält. Wenn sich der Analyt nicht an das erste Reagens binden kann, ist ein zweiten Reagens, das den Analyten und das erste Reagens binden kann, in dem Medium oder auf dem ersten saugfähigen Element anwesend. Das erste saugfähige Element steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element. Es werden solche Bedingungen gewählt, daß das erste Medium oder die erste Lösung mittels Kapillarwirkung durch das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements wandert oder fließt. Das erste saugfähige Element wird dann in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Element gebracht. Eine andere Kombination wird in einem zweiten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium bereitgestellt. Diese Kombination schließt mindestens einen Teil des ersten saugfähigen Elements und eine Komponente ein, die sich in Beziehung zu der Anwesenheit des Analyten im ersten Medium an das erste oder zweite Reagens binden kann. Das zweite saugfähige Element weist vorzugsweise einen spezifischen Bindungspartner für die Komponente nicht-diffundierbar an mindestens einen Teil desselben gebunden auf. Die Kombination wird unter Bedingungen bereitgestellt, bei denen das zweite flüssige Medium mindestens einen Teil des ersten saugfähigen Elements und mindestens einen Teil des zweiten saugfähigen Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert. Die Strecke, welche die Komponente das zweite saugfähige Element durchwandert, wird bestimmt und in Beziehung zu der Menge an Analyt in der Probe gesetzt.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem ersten saugfähigen Element und einem absorbierenden Element vor dem Inkontaktbringen des ersten saugfähigen Elements mit einem zweiten saugfähigen Element beendet.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das zweite saugfähige Element ein chromatographisches Element, wie beispielsweise ein immunchromatographisches Element, und eine Grenze wird auf dem chromatographischen Element bestimmt. Die Lage der Grenze wird mit der Menge an Analyt im ersten Medium oder der Menge an Komponente in dem flüssigen Medium oder der Menge an Reagens auf dem ersten saugfähigen Element in Beziehung gesetzt.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines Assays für einen Analyten, bei dem in Kombination in einem ersten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium (1) ein Teil eines saugfähigen Elements, an das zumindest an einem Teil ein Mitglied eines ersten spezifischen Bindungspaars (sbp) nicht-diffundierbar gebunden ist, und (2) eine Probe bereitgestellt wird, von der man annimmt, daß sie einen Analyten enthält. Ein erstes Reagens kann ein Konjugat einschließen, das ein zweites sbp-Mitglied, das den Analyten binden kann, und ein drittes sbp-Mitglied umfaßt, das komplementär zum ersten sbp-Mitglied ist, das im Medium oder auf dem saugfähigen Element anwesend ist. Das saugfähige Element steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element. Das erste Medium durchwandert das saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements mittels Kapillarwirkung, und das Konjugat wird nicht-diffundierbar an das saugfähige Element gebunden. Die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem saugfähigen Element und dem absorbierenden Element wird beendet. Eine andere Kombination wird in einem zweiten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium bereitgestellt, die einen Teil des ersten saugfähigen Elements und eine Komponente einschließt. Die Komponente umfaßt ein Analytenanalogon, das an ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems gebunden ist oder gebunden werden kann. Das saugfähige Element steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem immunchromatographischen Element, das nicht-diffundierbar daran gebunden einen Bindungspartner für die Komponente aufweist. Unter den verwendeten Bedingungen durchwandert das zweite Medium mittels Kapillarwirkung das saugfähige Element und mindestens einen Teil des immunchromatographischen Elements. Das saugfähige Element steht zu wesentlich verschiedenen Zeitpunkten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem immunchromatographischen Element. Es wird eine Grenze auf dem immunchromatographischen Element bestimmt, wobei die Lage der Grenze mit der Menge an Analyt im ersten Medium in Beziehung steht.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines Assays für einen Analyten, bei dem in Kombination in einem ersten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium oder einer derartigen Lösung (1) ein Teil eines ersten saugfähigen Elements, an das nicht-diffundierbar ein erstes Reagens, wie beispielsweise ein Analytenanalogon, gebunden ist, und (2) eine Probe bereitgestellt wird, von der man annimmt, daß sie einen Analyten enthält. Ein zweites Reagens, das den Analyten binden kann, ist in der Lösung oder auf dem saugfähigen Element anwesend. Das saugfähige Element steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element. Das erste Medium oder die erste Lösung wandert oder fließt mittels Kapillarwirkung durch das saugfähige Element und mindestens einen Teil eines absorbierenden Elements, und das zweite Reagens wird in umgekehrter Beziehung zu der Menge des Analyten in dem ersten Medium oder der ersten Lösung nichtdiffundierbar an das saugfähige Element gebunden. Die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem saugfähigen Element und dem absorbierenden Element wird beendet. Eine andere Kombination wird in einem zweiten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium bereitgestellt, die einen Teil des saugfähigen Elements und eine Komponente einschließt. Die Komponente schließt ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems ein oder kann daran gebunden werden, und sie kann an das erste oder zweite Reagens, das an das saugfähige Element gebunden ist, gebunden werden. Das saugfähige Element steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem immunchromatographischen Element, das nicht-diffundierbar daran gebunden einen spezifischen Bindungspartner für die Komponente aufweist. Unter den verwendeten Bedingungen durchwandert das zweite Medium das saugfähige Element und mindestens einen Teil des immunchromatographischen Elements mittels Kapillarwirkung. Das saugfähige Element steht zu wesentlich verschiedenen Zeitpunkten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem immunchromatographischen Element. Es wird eine Grenze auf dem immunchromatographischen Element bestimmt, wobei die Lage der Grenze zu der Menge an Analyt in dem ersten Medium in Beziehung steht.
In einer anderen Ausführungsform wird eine Kombination bereitgestellt, die (1) ein saugfähiges Element, an das nichtdiffundierbar ein Antikörper gegen einen Analyten gebunden ist, und (2) ein erstes flüssiges, gewöhnlich wäßriges Medium oder eine derartige Lösung umfaßt, von dem bzw. der man annimmt, daß sie einen Analyten enthält. Das saugfähige Element steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element. Es werden Bedingungen gewählt, die gestatten, daß das erste Medium das saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert. Die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem saugfähigen Element und dem absorbierenden Element wird beendet. Eine andere Kombination wird in einem zweiten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium bereitgestellt, welche einen Teil des saugfähigen Elements und eine Komponente umfaßt. Die Komponente ist an ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems gebunden oder kann daran gebunden werden und ist in der Lage, den Antikörper gegen den Analyten zu binden. Das saugfähige Element steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem immunchromatographischen Element, das nicht-diffundierbar daran gebunden einen spezifischen Bindungspartner für die Komponente aufweist. Unter den Verfahrensbedingungen durchwandert das zweite Medium mittels Kapillarwirkung das saugfähige Element und mindestens ein Teil des immunchromatographischen Elements, mit der Maßgabe, daß das saugfähige Element zu wesentlich verschiedenen Zeitpunkten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem immunchromatographischen Element steht. Es wird eine Grenze auf dem immunchromatographischen Element bestimmt. Die Lage der Grenze steht mit der Menge an Analyt im ersten Medium oder der ersten Lösung, der Menge an Reagens oder der Menge an Komponente im zweiten Medium in Beziehung.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines Assays für Digoxin. Das Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen eines Endteils eines saugfähigen Streifens mit einer Zone, die distal zu dem Endteil liegt und einen Antikörper (Ab&sub1;) gegen ein organisches Molekül mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500 nicht-diffundierbar daran gebunden aufweist, mit einem ersten wäßrigen Medium oder einer ersten > wäßrigen Lösung, von dem bzw. der man annimmt, daß sie Digoxin enthält. Ein Konjugat, das einen Antikörper gegen Digoxin an das organische Molekül konjugiert oder gebunden aufweist, ist im ersten Medium oder auf dem saugfähigen Streifen anwesend. Unter den gewählten Bedingungen durchwandert das erste Medium oder die erste Lösung mittels Kapillarwirkung den saugfähigen Streifen und mindestens einen Teil eines absorbierenden Elements, das in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem Streifen steht, und das Konjugat wird nicht-diffundierbar an Ab&sub1; gebunden, und Digoxin, falls anwesend, wird an das Konjugat gebunden. Die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem saugfähigen Element und dem absorbierenden Element wird beendet. Es wird eine Kombination in einem zweiten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium bereitgestellt, welche den Endteil des saugfähigen Streifens und eine Komponente umfaßt, die ein Digoxin-Analogon an ein Enzym gebunden einschließt. Der saugfähige Streifen steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem immunchromatographischen Streifen, der nicht-diffundierbar daran gebunden einen Antikörper gegen Digoxin enthält. Man läßt das zweite Medium mittels Kapillarwirkung den saugfähigen Streifen und mindestens einen Teil des immunchromatographischen Elements durchwandern, mit der Maßgabe, daß der Streifen zu wesentlich verschiedenen Zeitpunkten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem immunchromatographischen Streifen steht. Wieder wird eine Grenze auf dem immunchromatographischen Streifen bestimmt, wobei die Lage der Grenze zu der Menge an Analyt in der Probe in Beziehung steht.
In einer anderen Ausführungsform eines Assays für Digoxin wird ein Endteil eines saugfähigen Streifens, an das nicht-diffundierbar ein Digoxin-Analogon gebunden ist, mit einem ersten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium oder einer derartigen Lösung in Kontakt gebracht, das bzw. die eine Probe enthält, von der man annimmt, daß sie Digoxin enthält. Ein Antikörper gegen Digoxin (AbD) ist im ersten Medium oder auf dem saugfähigen Streifen anwesend. Der saugfähige Streifen steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element, und es werden Bedingungen gewählt, bei denen das erste Medium mittels Kapillarwirkung das saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements durchwandert und der Antikörper AbD nicht-diffundierbar an das Digoxin-Analogon gebunden wird, falls Digoxin nicht in der Probe anwesend ist. Die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem saugfähigen Streifen und dem absorbierenden Element wird beendet. Es wird eine Kombination in einem zweiten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium bereitgestellt, die den Endteil des saugfähigen Streifens und eine Konjugat einschließt, das einen Antikörper gegen Digoxin an ein Enzym gebunden umfaßt. Der saugfähige Streifen steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem immunchromatographischen Streifen, der nichtdiffundierbar daran gebunden einen Rezeptor für den Antikörper gegen Ab&sub2; aufweist. Unter den Bedingungen des Assays durchwandert das zweite Medium mittels Kapillarwirkung den saugfähigen Streifen und mindestens einen Teil des immunchromatographischen Streifens. Der saugfähige Streifen steht zu wesentlich verschiedenen Zeitpunkten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem immunchromatographischen Streifen. Es wird eine Grenze auf dem immunchromatographischen Streifen bestimmt. Die Lage der Grenze steht zu der Menge an Analyt im ersten Medium in Beziehung.
In einer anderen Ausführungsform eines Verfahrens gemäß der Erfindung wird ein Endteil eines saugfähigen Elements, an das nichtdiffundierbar ein Antikörper gegen Digoxin gebunden ist, mit einem ersten wäßrigen Medium oder einer derartigen Lösung in Kontakt gebracht, das bzw. die eine Probe enthält, von der man annimmt, daß sie Digoxin enthält. Der saugfähige Streifen steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element, und es werden Bedingungen gewählt, bei denen das erste Medium mittels Kapillarwirkung das saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements durchwandert. Die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem saugfähigen Element und dem absorbierenden Element wird beendet. Eine Kombination des Endteils des saugfähigen Streifens und eines Konjugats, das ein Digoxin-Analogon an ein Enzym gebunden umfaßt, wird in einem zweiten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium gebildet. Der saugfähige Streifen steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem immunchromatographischen Streifen, der nicht-diffundierbar daran gebunden einen Rezeptor für das Konjugat aufweist. Das zweite Medium durchwandert mittels Kapillarwirkung den saugfähigen Streifen und mindestens einen Teil des immunchromatographischen Streifens. Der saugfähige Streifen steht zu wesentlich verschiedenen Zeitpunkten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem immunchromatographischen Streifen. Wieder wird eine Grenze auf dem immunchromatographischen Streifen bestimmt, deren Lage zu der Menge an Analyt im ersten Medium in Beziehung steht.
Die Erfindung schließt weiter eine Vorrichtung zum Testen auf die Anwesenheit oder Menge eines Analyten, eines Reagens oder einer Komponente in einem flüssigen Medium ein. Die Vorrichtung umfaßt ein erstes saugfähiges Element, ein absorbierendes Element und ein zweites saugfähiges Element. Das saugfähige Element ist in der Lage, abwechselnd mit dem absorbierenden Element und dem zweiten saugfähigen Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung zu stehen. Testsätze zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
In den begleitenden Zeichnungen ist:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
Wie oben erwähnt, richtet sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren, Vorrichtungen und Testsätze zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge bei oder oberhalb einer vorbestimmten minimalen nachweisbaren Menge einer Komponente in einem flüssigen Medium, eines Reagens und/oder eines Analyten in einer Probe, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere auf die Bestimmung von relativ verdünnten Komponenten in einem Medium, Reagenzien auf einer Oberfläche oder Analyten in einer Probe anwendbar. Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel zur Vermeidung eines störenden Einflusses der Probe bereit und hat eine gesteigerte Empfindlichkeit und ein schnelleres Verfahren als diejenigen des Standes der Technik zur Folge. Die vorliegende Erfindung stellt auch Mittel für ein größeres Gleichgewicht zwischen der Anzahl der Analytenmoleküle in der Probe und der Anzahl der Moleküle bereit, die letztlich eine Signalbildung zur Folge haben.
Bevor weiter mit der Beschreibung der speziellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgeschritten wird, wird eine Anzahl von Ausdrücken definiert.
Analyt - eine zu messende Verbindung oder Zusammensetzung, die sich spezifisch an ein bindendes Mitglied, wie einen Antikörper oder ein Chelatisierungsmittel, binden kann, gewöhnlich ein Antigen oder ein(e) Arzneistoff/Droge oder eine Zusammensetzung, die chemisch reaktiv ist, wie ein Molekül oder Ion, das zur Oxidation oder Reduktion in der Lage ist.
Die genaue Natur von Antigen- und Arzneistoff/Drogen-Analyten zusammen mit zahlreichen Beispielen dafür ist im US-Patent 4,299,916 von Litman et al, insbesondere in Spalten 16 bis 23, und im US- Patent Nr. 4,275,149, Spalten 17 und 18, offenbart.
Die Analyten schließen Liganden und Rezeptoren ein, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie einzelne Bindungsstellen (einwertig) oder mehrere Bindungsstellen (mehrwertig) aufweisen. Bei den mehrwertigen Analyten handelt es sich normalerweise um Poly(aminosäuren), d. h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren und Kombinationen derselben. Derartige Kombinationen oder Ansammlungen schließen Bakterien, Viren, Chromosomen, Gene, Mitochondrien, Zellkerne, Zellmembranen und dgl. ein.
Eine große Vielfalt von Proteinen kann in Betracht gezogen werden, wie beispielsweise die Familie der Proteine mit ähnlichen strukturellen Merkmalen, der Proteine mit speziellen biologischen Funktionen, der Proteine, die mit speziellen Mikroorganismen, insbesondere krankheitsverursachenden Mikroorganismen in Beziehung stehen, usw.
Die monoepitopen Liganden-Analyten weisen gewöhnlich ein Molekulargewicht von 100 bis 2000, gewöhnlicher von 125 bis 1000 auf. Die interessierenden Analyten schließen Arzneistoffe/Drogen, Metaboliten, Pestizide, umweltverschmutzende Stoffe und dgl. ein. Unter den interessierenden Arzneistoffen/Drogen sind die Alkaloide enthalten. Unter den Alkaloiden befinden sich Morphinalkaloide, einschließlich Morphin, Kodein, Heroin, Dextromethorphan, deren Derivate und Metaboliten; Kokainalkaloide, die Kokain und Benzoylecogonin, deren Derivate und Metaboliten einschließen; Ergotalkaloide, die das Diethylamid der Lysergsäure einschließen; Steroidalkaloide; Imidazoylalkaloide; Chinazolinalkaloide, Isochinolinalkaloide; Chinolinalkaloide, die Chinin und Chinidin einschließen; Diterpenalkaloide, deren Derivate und Metaboliten.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen/Drogen schließt Steroide, einschließlich der Östrogene, Gestagene, Androgene, andreokortikalen Stereoide, Gallensäuren, kardiotonische Glykoside und Aglykone, einschließlich Digoxin und Digoxigenin, Saponine und Sapogenine, deren Derivate und Metaboliten ein. Auch eingeschlossen sind die Steroidnachahmenden Substanzen, wie z. B. Diethylstilböstrol.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Lactame mit 5 bis 6 Ringmitgliedern, die die Barbiturate, z. B. Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantoin, Primidon, Ethosuximid und deren Metaboliten einschließen.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Aminoalkylbenzole mit Alkyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, die die Amphetamine, Catecholamine, einschließlich Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin, Narcein, Papaverin, und deren Metaboliten einschließen.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Benzheterocyclen, die Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin, deren Derivate und Metaboliten einschließen, wobei die heterocyclischen Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine sind.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Purine, einschließlich Theophyllin, Koffein, deren Metaboliten und Derivate.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen/Drogen schließt diejenigen ein, die von Marihuana abgeleitet sind, einschließlich Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen/Drogen schließt die Vitamine ein, wie z. B. A, B, z. B. B&sub1;&sub2;, C, D, E und K, Folsäure und Thiamin.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Prostaglandine, die sich durch den Grad und die Stellen der Hydroxylierung und Unsättigung unterscheiden.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Antibiotika, die Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin, die Metaboliten und Derivate einschließen.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um die Nukleoside und Nucleotide, die ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidin mit ihren angemessenen Zucker- und Phosphatsubstituenten einschließen.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um verschiedene individuelle Arzneistoffe/Drogen, die Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin, Nortriptylin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propranolol, Griseofulvin, Valpronsäure, Butyrophenone, Antihistaminika, anticholinerge Arzneistoffe/Drogen, wie z. B. Atropin, deren Metaboliten und Derivate einschließen.
Metaboliten, die mit Krankheitszuständen in Beziehung stehen, schließen Spermin, Galaktose, Phenylbrenztraubensäure und Porphyrin Typ 1 ein.
Bei der nächsten Gruppe von Arzneistoffen/Drogen handelt es sich um Aminoglykoside, wie z. B. Gentamicin, Kanamicin, Tobramycin und Amikacin.
Unter den interessierenden Pestiziden befinden sich polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide, deren Metaboliten und Derivate.
Bei Rezeptoranalyten liegen die Molekulargewichte im allgemeinen im Bereich von ungefähr 10 000 bis 2 · 10&sup8;, gewöhnlicher von 10 000 bis 10&sup6;. Bei Immunglobulinen, IgA, IgG, IgE und IgM, variieren die Molekulargewichte im allgemeinen von ungefähr 160 000 bis ungefähr 106. Das Molekulargewicht von Enzyme liegt normalerweise im Bereich von ungefähr 10 000 bis 1 000 000. Natürliche Rezeptoren variieren in weitem Bereich, wobei sie im allgemeinen ein Molekulargewicht von mindestens ungefähr 25 000 aufweisen und eines von 10&sup6; oder größer aufweisen können, einschließlich solcher Materialien wie Avidin, DNA, RNA, Thyroxin-bindendes Globulin, Thyroxin-bindendes Präalbumin, Transcortin usw.

Mitglied eines spezifischen Bindungspaars ("sbp-Mitglied")

Eines von zwei verschiedenen Molekülen, das auf der Oberfläche oder in einer Vertiefung einen Bereich aufweist, der sich spezifisch an eine spezielle räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär definiert ist. Die Mitglieder des spezifischen Bindungspaars werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Diese sind gewöhnlich Mitglieder eines immunologischen Paars, wie Antigen-Antikörper, obwohl andere spezifische Bindungspaare, wie z. B. Biotin-Avidin, Hormone- Horiaonrezeptoren, Nukleinsäure-Duplexe, IgG-Protein A, DNA-DNA, DNA- RNA und dgl. keine immunologischen Paare sind, aber in der Definition eingeschlossen sind. Ein Analyt kann ein sbp-Mitglied sein und ist dies gewöhnlich auch.

Ligand

Irgendeine organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich existiert oder hergestellt werden kann.

Rezeptor ("Antiligand")

Irgendeine Verbindung oder Zusammensetzung, die eine spezielle räumliche und polare Organisation eines Moleküls, z. B. Epitopen- oder Determinantenstelle, erkennen kann. Erläuternde Rezeptoren schließen natürlich vorkommende Rezeptoren, z. B. Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lectine, Nukleinsäuren, Protein A, die Komplementkomponente Clq usw., ein.

Markiertes sbp-Mitglied

Ein Marker, im allgemeinen in der Lage zum elektrochemischen Nachweis oder zur Absorption oder Emission von elektromagnetischer Strahlung, ein Katalysator, häufig ein Enzym, der an ein sbp-Mitglied gebunden ist. Das markierte sbp-Mitglied ist im allgemeinen ein Mitglied des signalerzeugenden Systems.

Antikörper

Ein Immunglobulin oder ein Derivat oder Fragment desselben mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einer Vertiefung, der sich spezifisch an eine spezielle räumliche und polare Organisation eines anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär definiert ist. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und kann durch Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, beispielsweise Immunisierung eines Wirts und Sammeln von Seren oder Hybridzellinien-Technologie.

Antikörper gegen den Analyten

Ein Antikörper, der spezifisch für einen Analyten ist.

Analog-Analyt

Ein modifizierter Analyt oder ein Analytenanalogon oder -surrogat, das mit dem analogen Analyten um die Bindung an ein sbp-Mitglied konkurrieren kann, gewöhnlich ein Rezeptor oder Antikörper, wobei die Modifikation Mittel bereitstellt, um das Analytenanalogon an einen Marker zu binden, so daß ein markiertes sbp-Mitglied bereitgestellt wird. Das Analytenanalogon unterscheidet sich gewöhnlich vom Analyten durch mehr als den Ersatz eines Wasserstoffs durch eine Bindung, die das Analytenanalogon an einen Reaktivitätskern oder Marker bindet, muß dies aber nicht. Der Ausdruck Analytensurrogat bezeichnet eine Verbindung mit der Fähigkeit, den Antikörper gegen den Analyten zu binden. Demgemäß kann das Analyten-Surrogat auf ähnliche Weise wie der Analyt den Antikörper gegen den Analyten binden. Andererseits könnte das Surrogat beispielsweise ein Antikörper sein, der gegen den Idiotyp eines Antikörpers gegen den Analyten gerichtet ist.

Saugfähiges Element

Ein poröses Material mit Poren von mindestens 0,1 um, vorzugsweise mindestens 1,0 um, das als Antwort auf Kapillarkräfte von einem wäßrigen Medium durchflossen oder durchwandert werden kann. Derartige Materialien sind im allgemeinen hydrophil oder können hydrophil gemacht werden und sind vorzugsweise Cellulosematerialien und Materialien, die von Cellulose abgeleitet sind, wie z. B. faserhaltige Papiere, z. B. Filterpapier, Chromatographiepapier usw., können aber anorganische Pulver, wie z. B. Kieselerde, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; und andere natürliche polymere Materialien und synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere, wie z. B. Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat usw.; entweder als solche oder in Verbindung mit anderen Materialien verwendet; keramische Materialien und dgl. einschließen. Das saugfähige Element kann an einem Träger angebracht sein. Andererseits kann das saugfähige Element seinen eigenen Träger bereitstellen. Das saugfähige Element kann polyfunktionell sein oder polyfunktionalisiert werden, um eine kovalente Bindung von Reagenzien, wie Rezeptoren, Antikörpern, chelatisierenden Mitteln, Oxidantien, Reduktionsmittel und dgl., zu gestatten sowie die Bindung von anderen Verbindungen zu gestatten, die einen Teil des signalerzeugenden Systems bilden.
Die Bindung von Rezeptorliganden und Nachweismitteln an das saugfähige Element kann durch wohlbekannte Techniken bewerkstelligt werden, die allgemein in der Literatur verfügbar sind. Siehe z. B. "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Bio. Chem., 245 : 3059 (1970).
Bei dem Stück saugfähigen Material, das das saugfähige Element umfaßt, kann es sich um eine einzige Struktur handeln, wie z. B. ein in Streifen geschnittenes Blatt, oder es kann sich um mehrere Streifen oder um teilchenförmiges Material handeln, das an einen Träger oder eine feste Oberfläche gebunden ist, wie es z. B. in der Dünnschichtchromatographie gefunden wird, und es kann ein absorbierendes Kissen entweder als integralen Teil oder in Flüssigkeitskontakt aufweisen. Das saugfähige Element kann mehrere Segmente umfassen, die in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung stehen und vorzugsweise an einen Träger gebunden sind. Das saugfähige Element kann auch ein Blatt sein, das Bahnen darauf aufweist oder in der Lage ist, betüpfelt zu werden, um eine Bahnbildung zu induzieren, wobei in jeder Bahn ein gesonderter Assay durchgeführt werden kann.
Das saugfähige Element kann eine Form aufweisen, die rechteckig, kreisförmig, oval, dreieckig oder dergleichen ist, vorausgesetzt, daß mindestens eine Richtung für den Durchfluß oder die Durchwanderung eines wäßrigen Mediums mittels Kapillarwanderung vorhanden ist. Andere Durchwanderungsrichtungen können vorkommen, z. B. in einem ovalen oder kreisförmigen Stück, das im Zentrum mit der Testlösung in Kontakt gebracht wird. Die Hauptüberlegung ist jedoch, daß es mindestens eine Flußrichtung gibt. In der folgenden Diskussion werden Streifen aus saugfähigem Material erläuternd und nicht limitierend beschrieben.
Der Träger für das saugfähige Material ist, wenn ein Träger gewünscht oder notwendig ist, normalerweise wasserunlöslich, nichtporös und starr und weist gewöhnlich die gleiche Länge und Breite wie der saugfähige Streifen auf, kann aber länger oder kleiner sein. Eine große Vielfalt von organischen und anorganischen Materialien, sowohl natürlichen als auch synthetischen, und Kombinationen davon, kann verwendet werden, lediglich vorausgesetzt, daß der Träger nicht die Kapillarwirkung des saugfähigen Elements beeinträchtigt oder sich nicht-spezifisch mit den Assaykomponenten verbindet oder das signalerzeugende System stört. Erläuternde Polymere schließen Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat), Glas, Keramiken, Metalle und dgl. ein.

Absorbierendes Element

Irgendein poröses, hydrophiles saugfähiges Material, wie poröse Polymere, z. B. Porex® usw., Papier, Schwamm, Vlies und dgl., das eine im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Flüssigkeit absorbieren kann. Das absorbierende Element ist vorzugsweise ein nicht-quellbares poröses Polymer. Das absorbierende Element stellt eine Mehrzahl von Funktionen bereit. Die erste Funktion ist es, als Aufnahme- oder Speicherfläche für die Flüssigkeit zu dienen, die durch das erste saugfähige Element aufgesaugt wird. Eine zweite Funktion, die ausgeübt werden kann, dies aber nicht muß, ist es, die Geschwindigkeit zu steuern, mit der die Flüssigkeit das erste saugfähige Element durchwandert. Wenn das absorbierende Element eine kleine Abmessung aufweist oder aus einem vom ersten saugfähigen Element verschiedenen Material besteht, kann es so wirken, daß es die Geschwindigkeit steuert, mit der eine Flüssigkeit durch das erste saugfähige Mitglied wandert. Wenn es unregelmäßige Abmessungen aufweist, kann es weiter so wirken, daß es für verschiedene Geschwindigkeiten sorgt, abhängig davon, ob die Probe oder Reagenslösungen aufgesaugt werden.
Eine weitere Funktion des absorbierenden Elements kann es sein, die Menge an Flüssigkeit zu messen, die aufgesaugt wird. Vorzugsweise nimmt das absorbierende Element ein definiertes Flüssigkeitsvolumen auf. Indem Graduierungen an aufeinanderfolgenden Positionen vorgesehen werden, die sich von den ersten saugfähigen Elementen weg und entlang des absorbierenden Mitglieds erstrecken, kann man bestimmen, wann die Flüssigkeitsfront an einer bestimmten Stelle angelangt ist, und die Vorrichtung aus dem Medium entfernen. Alternativ kann man Farbstoffe vorsehen, die bei Auflösung in oder bei Kontakt mit der Flüssigkeitsfront gefärbt werden, um für ein klares Signal zu sorgen, daß die Vorrichtung entfernt werden sollte. Beispielsweise könnten pH-Indikatoren verwendet werden. Jede Technik, die eine klare Anzeige der Anwesenheit der Flüssigkeitsfront anzeigt, kann verwendet werden.
In Streifenformat weist das absorbierende Element gewöhnlich eine Länge von mindestens 1,5, gewöhnlich 2 cm und nicht mehr als ungefähr 30 cm, gewöhnlich nicht mehr als ungefähr 20 cm auf. Die Breite kann von ungefähr 0,1 mm bis ungefähr 3 cm variieren. Diese Abmessungen dienen primär zur Steuerung der Geschwindigkeit und Menge der aufgesogenen Lösung und zur Bequemlichkeit bei der Handhabung und zur Bereitstellung einer leichten Beobachtung der Lösungsmittelfront. Die Dicke beträgt im allgemeinen ungefähr 0,1 mm bis 5 mm, gewöhnlicher ungefähr 0,5 bis 3 mm. In Kissenformat weist das absorbierende Element gewöhnlich eine Dicke von 0,5 bis 10 mm und eine Fläche von 25 bis 150 mm² auf.
Das absorbierende Element kann teilweise oder im wesentlichen vollständig in ein Schutzgehäuse eingeschlossen sein, bequemerweise eine klare oder teilweise oder in einigen Situationen vollständige opake Umhüllung. Das absorbierende Element sollte nicht direkt mit der Probenlösung in Kontakt stehen. Es ist gewöhnlich notwendig, daß mindestens ein minimales und normalerweise spezifisches Volumen an Lösung, die einen Analyten enthält, durch das erste saugfähige Element wandert. Dies kann am besten dadurch erreicht werden, daß man einen wesentlichen Kontakt des absorbierenden Elements mit der Assayprobenlösung vermeidet.
Abhängig von den speziellen beteiligten Protokollen und der Bauart der Vorrichtung kann die Umhüllung entfernbar oder nichtentfernbar sein, kann nur das absorbierende Element einschließen oder kann zusätzlich das erste und zweite saugfähige Element einschließen, kann ein oder mehrere Fenster bereitstellen und ist normalerweise aus einem robusten, inerten, undurchdringlichen Material, das für einen mechanischen Schutz des saugfähigen Materials sorgt und auf die Leistung des Assays nicht störend einwirkt. Normalerweise ist eine Luftöffnung vorgesehen, um einen Lufteinschluß innerhalb der Umhüllung zu verhindern.

Marker

Ein Marker kann irgendein Molekül sein, das an ein sbp-Mitglied gebunden ist, von dem gefordert wird, daß es ein Signal erzeugt. In der vorliegenden Erfindung kann der Marker inert sein und lediglich als Bindungsstelle für ein Mitglied des signalerzeugenden Mittels dienen, oder er kann spontan ein nachweisbares Signal erzeugen oder er kann in Verbindung mit einem signalerzeugenden Mittel ein nachweisbares Signal erzeugen. Der Marker kann isotop oder nicht-isotop, bevorzugt nicht-isotop sein. Jedoch kann ein isotoper Marker zum Erreichen einer hohen Empfindlichkeit bevorzugt werden, wenn radio-autographische Nachweise mit photographischen Filmen verwendet werden.

Signalerzeugendes Mittel

Ein Mittel, das in der Lage ist, mit dem Marker wechselzuwirken, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Derartige Mittel schließen z. B. elektromagnetische Strahlung, Wärme, chemische Reagenzien und dgl. ein. Wenn chemische Reagenzien verwendet werden, können einige der chemischen Reagenzien als Teil einer Entwicklerlösung enthalten sein. Die chemischen Reagenzien können Substrate, Coenzyme, Beschleuniger, zweite Enzyme, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Abfänger, Metallionen, spezifische bindende Substanzen, die zum Binden von signalerzeugenden Substanzen erforderlich sind, und dgl. einschließen. Einige der chemischen Reagenzien, wie Coenzyme, Substanzen, die mit Enzymprodukten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren und dgl. können an den Streifen gebunden sein.

Signalerzeugendes System

Das signalerzeugende System kann eine oder mehrere Komponenten aufweisen. Das signalerzeugende System schließt alle Reagenzien ein, die erforderlich sind, um ein meßbares Signal zu erzeugen, was einen Marker und ein signalerzeugendes Mittel einschließen kann, das mit dem Marker wechselwirken kann, um ein Signal zu erzeugen.
Das signalerzeugende System liefert ein Signal, das durch äußere Mittel, normalerweise durch Messung elektromagnetischer Strahlung, wünschenswerterweise durch visuelle Überprüfung, nachweisbar ist. Meistens schließt das signalerzeugende System ein chromophores Substrat und ein Enzym ein, wobei chromophore Substrate enzymatisch in Farbstoffe, die Licht im ultravioletten oder sichtbaren Bereich absorbieren, Phosphore oder Fluoreszenzfarbstoff, chromophore Indikatoren, wie chelatisierende Mittel, Redox-Indikatoren, pH- Indikatoren oder dgl., überführt werden.
Das signalerzeugende System kann mindestens einen Katalysator als Marker, gewöhnlich ein Enzym, und mindestens ein Substrat einschließen und kann zwei oder mehr Katalysatoren und eine Mehrzahl von Substraten einschließen und kann eine Kombination von Enzymen einschließen, worin das Substrat eines Enzyms das Produkt des anderen Enzyms ist. Die Wirkungsweise des signalerzeugenden Systems ist es, ein Produkt zu erzeugen, das ein nachweisbares Signal liefert, welches mit der Anwesenheit oder Menge des Analyten in der Probe in Beziehung steht.
Zwei Katalysatoren können verwendet werden, entweder eine Kombination eines Enzym- und eines Nicht-Enzymkatalysators oder zwei Enzyme, wobei die beiden Katalysatoren so in Beziehung stehen, daß das Produkt des einen das Substrat-des anderen ist. In diesem System muß nur ein Substrat vorhanden sein, welches aufeinanderfolgende, von den Katalysatoren katalysierte Veränderungen eingehen kann, was in der Verbindung, die an der Erzeugung eines nachweisbaren Signals beteiligt ist, resultiert. Meistens liegen jedoch normalerweise ein Substrat für das erste Enzym in der Reihe und eine zweite Verbindung vor, die als Vorläufer- für die an der Erzeugung des Signals beteiligten Verbindung dient, welcher normalerweise die Verbindung bereitstellt, die das Signal erzeugt. Demgemäß kann das Produkt des ersten Enzyms mit dem Vorläufer der signalerzeugenden Verbindung reagieren, um Verbindungen zu liefern, die das Signal erzeugen.
Wenn zwei Enzyme verwendet werden, sind die beteiligten Reaktionen meistens Hydrolyse- oder Redoxreaktionen. Im Fall von Hydrolyse sind ein derivatisierter Farbstoffvorläufer, der eine hydrolytisch labile Bindung aufweist, das hydrolytische Enzym und ein Enzym, das die Überführung des freigesetzten Farbstoffvorläufers in ein Farbüberführungsprodukt katalysiert, erläuternd für diesen TYP von System. Bei Redox-Reaktionen kann ein erstes Enzym ein wesentliches oxidierendes Substrat erzeugen, das für das zweite Enzym erforderlich ist, wenn das zweite Enzym die Reaktion zwischen dem oxidierenden Substrat und einem Farbstoffvorläufer katalysiert.
Wenn zwei Enzyme verwendet werden, kann die erste enzymatische Reaktion eine hydrolytische Spaltung oder eine Redox-Reaktion des Substrats beinhalten, um zu einem Produkt zu führen, das das Substrat eines anderen Enzyms ist. Die erste Situation kann durch Glucose-6- phosphat erläutert werden, welches katalytisch durch alkalische Phosphatase zu Glucose hydrolysiert wird, wobei Glucose ein Substrat für Glucoseoxidase ist. Die zweite Situation kann durch Glucose erläutert werden, welche von Glucoseoxidase oxidiert wird, um Wasserstoffperoxid zu liefern, das enzymatisch mit einem Leucofarbstoff reagieren würde, um einen Signalerzeuger bereitzustellen.
An gekuppelten Katalysatoren kann auch ein Enzym mit einem nicht-enzymatischen Katalysator beteiligt sein. Das Enzym kann einen Reaktanten erzeugen, welcher eine durch den nicht-enzymatischen Katalysator katalysierte Reaktion eingeht, oder der nichtenzymatische Katalysator kann ein Substrat (einschließlich Coenzymen) für das Enzym erzeugen. Eine große Vielfalt von nicht-enzymatischen Katalysatoren, die verwendet werden können, wird im US-Patent Nr. 4,160,645 gefunden.
Es können verschiedene Kombinationen von Enzymen verwendet werden, um eine signalerzeugende Verbindung bereitzustellen. Insbesondere können Kombinationen von Hydrolasen verwendet werden, um einen unlöslichen Signalerzeuger herzustellen. Alternativ können Kombinationen von Hydrolysen und Oxidoreduktasen die signalerzeugende Verbindung bereitstellen. Auch Kombinationen von Oxidoreduktasen können verwendet werden, um eine unlösliche signalerzeugende Verbindung herzustellen.
Bei Kombinationen von Enzymen kann ein Enzym nicht-diffundierbar an das saugfähige Material, entweder das erste oder zweite saugfähige Element, gebunden sein, während das andere Enzym ein an den Analyten konjugierter Marker sein kann. Zusätzlich können ein oder mehrere andere Mitglieder des signalerzeugenden Systems an das saugfähige Material gebunden sein, abhängig vom speziell gewählten signalerzeugenden System oder dem speziellen befolgten Protokoll.
In einigen Assays ist es, um ein nachweisbares Signal vorliegen zu haben, notwendig, ein Mittel zur Verstärkung des Signalmitglieds, das durch die Anwesenheit eines Markers erzeugt wird, an einer Zone auf einer saugfähigen Stelle bereitzustellen. Deshalb wird es gewöhnlich bevorzugt, daß der Marker ein Katalysator oder eine lumineszierende Verbindung oder ein Radioisotop ist, am bevorzugtesten ein Katalysator. Vorzugsweise handelt es sich bei Katalysatoren um Enzyme und Coenzyme, die aus einem einzigen Marker eine Vielzahl von signalerzeugenden Molekülen erzeugen können.
Man verwendet ein Enzym oder Coenzym, das für die gewünschte Verstärkung durch Erzeugung eines Produkts sorgt, das Licht absorbiert, z. B. ein Farbstoff, oder Licht nach Bestrahlung emittiert, z. B. ein Fluoreszenzfarbstoff. Alternativ kann die katalytische Reaktion zu direkter Lichtemission führen, z. B. Chemilumineszenz. Eine große Anzahl von Enzymen und Coenzymen zur Bereitstellung derartiger Produkte ist im US-Patenten Nr. 2,275,149, Spalten 19 bis 23, und im US-Patent Nr. 4,318,980, Spalten 10 bis 14, angegeben.
Eine Anzahl von Enzymkombinationen ist im US-Patent Nr. 275149, Spalten 23 bis 28, aufgeführt, wobei diese Kombinationen in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können.
Von speziellem Interesse sind Enzyme, die die Erzeugung von Wasserstoffperoxid und die Verwendung des Wasserstoffperoxids zur Oxidation eines Farbstoffvorläufers zu einem Farbstoff beinhalten. Spezielle Kombinationen umschließen Saccharidoxidasen, z. B. Glukose- und Galaktose-Oxidase, oder heterocyclische Oxidasen, wie Urikase und Xanthinoxidase, die mit einem Enzym gekoppelt sind, das das Wasserstoffperoxid zur Oxidation eines Farbstoffvorläufers verwendet, d. h., einer Peroxidase, wie Meerrettichperoxidase, Lactoperoxidase oder Mikroperoxidase. Zusätzliche Enzymkombinationen können im Gegenstand der oben aufgeführten Patente gefunden werden. Wenn ein einzelnes Enzym als Marker verwendet wird, können andere Enzyme verwendet werden, wie Hydrolasen, Transferasen und Oxidoreduktasen, vorzugsweise Hydrolasen, wie alkalische Phosphatase und ß- Galaktosidase. Alternativ können Luciferasen, wie Glühwürmchenluciferase und bakterielle Luciferase, verwendet werden.
Erläuternde Coenzyme, die Verwendung finden, umschließen NAD[H]; NADP[H], Pyridoxalphosphat; FAD[H]; FMN[H] usw., gewöhnlich Coenzyme, an denen cyclische Reaktionen beteiligt sind, siehe insbesondere das US-Patent Nr. 4,318,980.
Das Produkt der Enzymreaktion ist gewöhnlich ein Farbstoff oder Fluoreszenzfarbstoff. Eine große Zahl von erläuternden Fluoreszenzfarbstoffen ist im US-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 30 und 31, angegeben.

Flüssigkeitsaufnehmende Beziehung

Zwei saugfähige Elemente stehen in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung, wenn Flüssigkeit von einem saugfähigen Element zum anderen wandern kann. Diese Beziehung kann entweder direkt oder indirekt sein. Eine direkte flüssigkeitsaufnehmende Beziehung kann hergestellt werden, indem man zwei Elemente in Kontakt miteinander vorliegen hat, so daß Flüssigkeit mittels Kapillarwirkung von einem Element zum anderen Element wandert und von einem Element zum anderen gezogen werden kann. Eine indirekte flüssigkeitsaufnehmende Beziehung kann hergestellt werden, indem man zwei Elemente in großer Nähe vorliegen hat, so daß Flüssigkeit von einem zum anderen wandern kann. Die beiden Elemente können durch poröse Abstandshalter getrennt vorliegen, welche inert und für den Flüssigkeitsfluß im wesentlichen nicht hemmend sind. Andererseits oder in Verbindung mit porösen Abstandshaltern können den Flüssigkeitsfluß behindernde Elemente verwendet werden, um die Geschwindigkeit des Flüssigkeitsflusses zwischen den beiden Elementen zu steuern. Die räumliche Orientierung der beiden Elemente kann verwendet werden, um eine flüssigkeitsaufnehmende Beziehung herzustellen.

Immunchromatograph

Der Immunchromatograph weist ein sbp- Mitglied, entweder Ligand oder Rezeptor, in einem Bereich an einen saugfähigen Träger gebunden auf, der die Bewegung einer Flüssigkeit mittels Kapillarität durch den Bereich unter Transport des Analyten und, falls angezeigt, irgendwelcher Mitglieder des signalerzeugenden Systems gestattet. Das sbp-Mitglied ist nicht-diffundierbar an den Träger gebunden, entweder kovalent oder nicht-kovalent. Der Bereich, an den das sbp-Mitglied gleichförmig gebunden ist, wird als "immunsorbierende Zone" bezeichnet. Zusätzlich können ein oder mehrere Mitglieder des signalerzeugenden Systems nicht-diffundierbar an den saugfähigen Träger gebunden sein, entweder kovalent oder nicht-kovalent. Weiter kann ein Reaktant für einen Marker, wie ein Enzymsubstrat, an den Träger gebunden sein.

Komponente

Ein interessierendes Molekül, dessen Menge gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung zu bestimmen ist. Bei der Komponente kann es sich um eine anorganische Verbindung, wie ein anorganisches Ion, entweder Kation oder Anion, beispielsweise Metallionen, einschließlich Alkalimetallionen, wie Lithium, Kalium, Natrium usw., Erdalkalimetallionen, wie Magnesium, Calcium usw., Kupfer, Kobalt, Mangan, Aluminium, Eisen (II oder III), Chrom, Nickel, Zink, Cadmium usw., und um nicht-metallische Ionen, wie Halogenide (Chlorid, Bromid, Fluorid, Iodid usw.), Oxide, Sulfide, Sulfate, Phosphite, Phosphate, Selenide, oxidierte Halogene, wie Iodate, Periodate, Chlorate, Chlorite usw. handeln. Im allgemeinen kann jedes anorganische Molekül [nachgewiesen werden], für das ein reagierendes Reagens existiert und das spektroskopisch nachweisbar ist, vorzugsweise durch Reaktion mit einer Verbindung, die mit dem anorganischen Molekül so reagieren kann, daß eine spektroskopische Veränderung stattfindet, welche gemäß der vorliegenden Erfindung qualitativ bestimmt werden kann.
Bei der Komponente kann es sich auch um ein organisches Molekül handeln, für das ein reagierendes Reagens, wie ein Bindungspartner, beispielsweise ein sbp-Mitglied, existiert und das spektroskopisch nachweisbar ist, vorzugsweise durch Umsetzung mit einer Verbindung, die mit der organischen Verbindung so reagieren kann, daß eine spektroskopische Veränderung stattfindet. Die Komponente kann selbst im Assay gemessen werden oder eine Verbindung sein, die in einem Assay für einen Analyten verwendet wird. Typische organische Molekül- Komponenten schließen Enzymsubstrate, wie Glukose, Ethanol, Cholesterin, Arabinit, Harnstoff, Lactate, Aminosäuren, Triglyceride usw.; Reduktionsmittel, wie Ascorbat, Harnsäure, Mercaptane, Hydrochinone usw.; Oxidationsmittel, wie Chinone und Disulfide; Liganden-Marker-Konjugate; Rezeptor-Marker-Konjugate; usw. ein. Es ist ein wichtiges Merkmal eines Aspekts der vorliegenden Erfindung, daß ein Analyt sowie eine Komponente und ein Reagens, das mit der Komponente reagiert, alle quantitativ bestimmt werden können.
Reagens, das mit der Komponente reagiert - eine Substanz, die in der Lage ist, stöchiometrisch entweder chemisch oder physikalisch mit einer Komponente zu reagieren und an eine Zone eines ersten saugfähigen Elements gebunden ist oder daran gebunden werden kann. Chemische Reaktion bedeutet im allgemeinen, daß das Reagens die Komponente durch Aufbrechen oder Bilden von chemischen Bindungen in eine andere Substanz überführen kann und dadurch selbst in eine neue Verbindung überführt wird. Physikalische Reaktion bedeutet gewöhnlich, daß das Reagens stöchiometrisch auf nicht-chemischem Weg mit der Komponente reagiert. Beispielsweise kann das Reagens ein Ligand oder Rezeptor sein, der sich durch Bildung von Wasserstoff- Brückenbindungen, elektrostatische Wechselwirkung, hydrophobe Wechselwirkung usw. spezifisch mit der Komponente verbindet. Das Reagens kann auch ein anorganisches oder organisches Molekül sein. Beispiele für anorganische Moleküle sind metallische und nichtmetallische Ionen, Oxidationsmittel und Reduktionsmittel, Übergangsmetallhalogenide, Organoquecksilberhalogenide usw. Beispielhaft für organische Moleküle sind chelatisierende Mittel, sbp-Mitglieder, Diazoniumsalze, Chinone, Iodoso-Verbindungen, Disulfide, Iodacetamide, Hydrochinone, Hydroxyaniline, Benzidine, Hydrazide, Paraquat usw.
Die Reaktion kann eine Oxidation oder Reduktion beinhalten, wie beispielsweise die Oxidation oder Reduktion von anorganischen Molekülen, eine direkte kovalente Bindungsbildung oder die Bildung einer koordinativen Metall-Liganden-Bindung, einschließlich Chelatisierung, elektrophiler oder nukleophiler Substitution, Cycloaddition usw.
Mit von der ersten Zone verschiedener Zusammensetzung - Die Zusammensetzung des zweiten saugfähigen Elements oder der zweiten Zone sollte von derjenigen des ersten saugfähigen Elements oder der ersten Zone verschieden sein. Das folgende ist eine Beschreibung zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung von Situationen, in der eine verschiedene Zusammensetzung realisiert werden kann. Andere Situationen werden dem Fachmann nahegelegt. Ein derartiges Beispiel liegt vor, wenn das zweite saugfähige Element keine Substanz gebunden aufweist, die mit einer Verbindung oder einem Analyten reagiert. Ein anderes Beispiel liegt vor, wenn das zweite saugfähige Element eine Substanz enthält, die mit einer Komponente oder einem nach einer Reaktion einer Komponente mit dem Reagens erzeugten Produkt reagiert, wobei die Substanz von dem Reagens auf dem ersten saugfähigen Element verschieden ist. Ein anderes Beispiel betrifft die Situation, in der das Reagens des ersten saugfähigen Elements auch auf dem zweiten Element gefunden wird, aber die Konzentrationen auf den Elementen jeweils verschieden sind.

Ergänzende Materialien

Im erfindungsgemäßen Assay werden häufig verschiedene ergänzende Materialien verwendet. Zum Beispiel sind normalerweise Puffer sowie Stabilisatoren im Assaymedium anwesend. Häufig können zusätzlich zu diesen Additiven zusätzliche Proteine, wie z. B. Albumine, oder Tenside, insbesondere nichtionische Tenside, Bindungsbeschleuniger, z. B. Polyalkylenglykole, oder dgl. eingeschlossen sein.
Wie oben erwähnt, stellt ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Durchführung eines Assays in Kombination eine erste Zone eines saugfähigen Elements ("erste Zone") in einem flüssigen Medium bereit, das eine Komponente enthält. Die erste Zone weist nicht diffundierbar daran gebunden ein Reagens auf, das mit der Komponente reagiert. Es werden Bedingungen gewählt, bei denen das flüssige Medium die ganze erste Zone durchwandert und mindestens ein Teil der darin enthaltenen Komponente mit dem ganzen Reagens reagiert und deshalb auch die erste Zone durchwandert und durch Kapillarwanderung des flüssigen Mediums in eine zweite Zone eines saugfähigen Elements ("zweite Zone") mit einer von der erste Zone verschiedenen Zusammensetzung befördert wird. Die Strecke, welche die Komponente in die zweite Zone hineinwandert, oder der Unterschied in den Strecken, welche das flüssige Medium und die Komponente in die zweite Zone hineinwandern, wird bestimmt. Die Strecke oder der Unterschied wird zu der Menge der Komponente in dem flüssigen Medium oder der Menge des Reagens in Beziehung gesetzt. Wenn es gewünscht wird, die Menge von einer dieser Substanzen zu bestimmen, wird die Menge der anderen Substanzen vorbestimmt, und die Strecke der Wanderung steht mit den Strecken in Beziehung, die mit bekannten Kalibratoren erhalten werden. Die Strecken der Wanderung können durch Inkontaktbringen der zweiten Zone mit einem geeigneten Nachweismittel, durch die Anwesenheit oder das Gebundensein eines geeigneten Nachweismittels auf der zweiten Zone, welches ein nachweisbares Signal auf der zweiten Zone in Beziehung zu der Anwesenheit zu der Komponente erzeugt, oder durch direkten Nachweis der Komponente auf der zweiten Zone nachgewiesen werden.
Der Assay kann so beschaffen sein, daß die Konzentration der Komponente oder die Konzentration des Reagens gemessen wird.
Wie oben beschrieben, kann vor der Vereinigung des flüssigen Mediums und der ersten Zone veranlaßt werden, daß sich das Reagens nicht-diffundierbar und die erste Zone bindet, indem man die erste Zone mit einer Lösung in Kontakt bringt, die das Reagens enthält. Der Unterschied oder die Strecke, wie oben definiert, können dann mit der Menge des Reagens in der Lösung in Beziehung gesetzt werden. Weiter kann die Menge des Reagens dann mit der Menge an Analyt in einer Lösung des Reagens in Beziehung gesetzt werden.
Ein neues Merkmal dieses Aspekts der Erfindung beruht auf der Weise, in der das zuvor erwähnte Durchbruch-Volumen gemessen wird. Die Flüssigkeit, die durch die erste Zone hindurchgetreten ist, dringt in eine zweite Zone ein, in der die Volumenaufnahme mit der Strecke der Flüssigkeitswanderung entlang der Zone in Beziehung steht. Nachdem ein geeignetes Flüssigkeitsvolumen in die zweite Zone eingedrungen ist, wird die Grenze festgestellt, die den Bereich markiert, der die Komponente enthält, sowie den Bereich, der keine signifikante Konzentration der Komponente aufweist. Das Messen der Strecke entlang der Zone, durch die die Flüssigkeit gewandert ist, und der Strecke entlang der Zone, durch die die Komponente gewandert ist, wie es durch die Grenze angezeigt ist, gestattet die Bestimmung des Durchbruch-Volumens. Wenn die Länge der zweiten Zone bei allen Assays die gleiche ist und das Volumen, das durch die erste Zone hindurchgedrungen ist, gerade die zweite Zone füllt, ist die Messung der Wanderungsstrecke, welche die Strecke bis zur Grenze ist, ausreichend für eine Bestimmung des Durchbruch-Volumens.
Die Strecke der Wanderung kann durch direkten Nachweis der Komponente auf der zweiten Zone oder durch Inkontaktbringen der zweiten Zone mit einem geeigneten Nachweismittel bestimmt werden, wenn dieses Nachweismittel nicht bereits anwesend ist, wobei das Nachweismittel auf der zweiten Zone ein nachweisbares Signal in Beziehung zu der Anwesenheit der Komponente erzeugt. Das Nachweismittel kann eine Substanz sein, die chemisch mit der Komponente wechselwirkt, wobei sie gewöhnlich ein visuelles Signal, wie eine Farbe, erzeugt. Das Nachweismittel kann ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems sein. Im allgemeinen sind Nachweismittel mit einer Assaykomponente oder dem Produkt einer Reaktion einer Assaykomponente und eines Reagens reaktiv und erzeugen bei der Reaktion eine spektroskopisch nachweisbare Veränderung. Typische Nachweismittel sind Chelatbildner, wie Phenanthroline, Carboxypyridone, Phenole, β-Diketone usw.; Oxidationsmittel, wie Chinone, das Cerion, Mangandioxid, Periodate, Chromate, Disulfide, Tetrazoliumsalze usw.; Reduktionsmittel, wie Leuko-Farbstoffe, Mercaptane, Thiosulfate, Hydrochinone, Benzidine usw.; Katalysatoren, wie Enzyme, Coenzyme, prostetische Gruppen, Medola-Blau usw.; Enzymsubstrate usw.
Die erste Zone und die zweite Zone können als Einheit in einem einzigen saugfähigen Element vorliegen, mit der Maßgabe, daß die zwei Zonen so in Beziehung stehen, daß das flüssige Medium die erste Zone durchwandert, bevor sie in Kontakt mit der zweiten Zone kommt, und daß die beiden Zonen verschiedene Zusammensetzungen aufweisen müssen. Andererseits kann die erste Zone mit einem ersten saugfähigen Element eine Einheit bilden, und die zweite Zone kann mit einem zweiten saugfähigen Element eine Einheit bilden. Die erste Zone kann dann beispielsweise in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit der zweiten Zone gebracht werden, bevor die Vereinigung der ersten Zone und des flüssigen Mediums bereitgestellt wird. Eine bequeme Vorrichtung für diesen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 1 dargestellt.
Die Komponente und das Reagens können jeweils ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars sein. Beispielsweise kann die Komponente ein Enzym-markiertes Ligandenanalogon sein, und das Reagens kann ein Antikörper gegen den Liganden sein. Das Verfahren kann auch die Bestimmung der Menge eines Analyten einschließen, der ein Ligand ist. Wie oben erwähnt, können die Komponente und das Reagens chemisch oder physikalisch miteinander reagieren. Das Verfahren kann auf die Bestimmung sowohl anorganischer als auch organischer Moleküle angewendet werden.
Ein anderer Ansatz bei diesem quantitativen Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Inkontaktbringen einer ersten Zone eines saugfähigen Elements ("ersten Zone") mit einem flüssigen Medium, das eine Komponente enthält. Die erste Zone weist nichtdiffundierbar daran gebunden ein Reagens auf, das mit der Komponente reagiert. Das Inkontaktbringen findet unter Bedingungen statt, bei denen das flüssige Medium und mindestens ein Teil der darin enthaltenen Komponente mittels Kapillarwanderung die ganze erste Zone durchqueren und in eine zweite Zone eines saugfähigen Elements ("zweite Zone") mit einer von der ersten Zone verschiedenen Zusammensetzung hineinwandern. Das Messen der Strecke, welche die Komponente in die zweite Zone hineingewandert ist, oder des Unterschiedes in den Strecken, welche das Medium und die Komponente in die zweite Zone hineingewandert sind, gestattet die Bestimmung der Menge der Komponente in dem flüssigen Medium.
Ein anderer Ansatz gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Vereinigen einer Lösung eines Analyten mit einem ersten saugfähigen Element, wobei ein Reagens, das mit dem Analyten reagieren kann, nicht-diffundierbar an das saugfähige Element gebunden ist oder daran gebunden wird. Als nächstes wird ein flüssiges Medium, das eine Komponente enthält, mit dem ersten saugfähigen Element vereinigt, wobei die Komponente mit dem Reagens reagiert. Das erste saugfähige Element steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Element. Es werden Bedingungen gewählt, bei denen das flüssige Medium mittels Kapillarwirkung das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des zweiten saugfähigen Elements durchwandert. Die Bestimmung einer Grenze auf dem zweiten saugfähigen Element wird vorgenommen. Die Lage der Grenze wird mit der Menge an Analyt in der Lösung oder der Menge an Reagens auf dem ersten saugfähigen Element oder der Menge der Komponente in dem flüssigen Medium in Beziehung gesetzt. Beispielsweise kann der Analyt ein(e) Arzneistoff/Droge sein, das Reagens kann ein Antikörper gegen den bzw. die Arzneistoff/Droge sein, und die Komponente kann ein Enzym-markiertes Arzneistoff/- Drogen-Analogon sein.
Bei einem anderen Ansatz wird eine Kombination in einem ersten flüssigen Medium bereitgestellt. Die Kombination umfaßt (1) ein erstes saugfähiges Element und (2) einen Analyten, wobei in dem Medium oder auf dem ersten saugfähigen Element ein Reagens für den Analyten anwesend ist. Das erste saugfähige Element steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element. Es werden Bedingungen gewählt, bei denen das erste Medium mittels Kapillarwirkung durch das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements fließt und das Reagens und gewöhnlich der Analyt nicht-diffundierbar an das saugfähige Element gebunden werden. So kann das erste flüssige Medium mit dem ganzen ersten Element auf einmal in Kontakt gebracht werden, um einen Durchfluß zu erreichen, oder das erste flüssige Medium kann nur mit einem Teil des ersten saugfähigen Elements in Kontakt gebracht werden. Im letztgenannten Fall durchwandert das Medium den Rest des Elements durch Kapillarwirkung. Die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem saugfähigen Element und dem absorbierenden Element wird dann beendet. In einem zweiten flüssigen Medium wird eine Kombination bereitgestellt, die einen Teil des ersten saugfähigen Elements und eine Komponente umfaßt, die mit dem Reagens reagiert, wobei das erste saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Element steht. Es werden Bedingungen gewählt, bei denen das zweite Medium mittels Kapillarwirkung das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des zweiten saugfähigen Elements durchwandern, mit der Maßgabe, daß das erste saugfähige Element zu wesentlich verschiedenen Zeitpunkten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem zweiten saugfähigen Element steht. Als nächstes wird auf dem zweiten saugfähigen Element eine Grenze bestimmt. Die Lage der Grenze wird zu der Menge an Analyt in dem ersten Medium oder der Menge an Reagens oder der Menge der Komponente in dem zweiten flüssigen Medium in Beziehung gesetzt.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt das Verfahren, daß man veranlaßt, daß ein Reagens, wie ein sbp-Mitglied, in einem ersten flüssigen Medium oder einer Lösung an ein erstes saugfähiges Element gebunden wird, indem man das erste saugfähige Element mit dem Medium in Kontakt bringt. Das erste saugfähige Element steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element. Es werden Bedingungen gewählt, bei denen das erste Medium mittels Kapillarwanderung durch das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements fließt oder wandert. Die Funktion des ersten saugfähigen Elements ist es, das Reagens quantitativ und fest zu binden. Das Reagens muß in definierter oder vorbestimmter Menge in Abhängigkeit von der vorbestimmten minimalen nachweisbaren Menge des interessierenden Analyten gebunden werden. Im allgemeinen wird die Menge des Reagens, die gebunden wird, nicht mehr als die 20-fach geringere oder 20-fach größere Menge des Analyten oder der Komponente sein, der bzw. die das erste saugfähige Element durchwandert. Häufig wird das gesamte Reagens im ersten Medium oder in der ersten Lösung gebunden.
Bei einem Ansatz der vorliegenden Erfindung wird in einem ersten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium oder einer derartigen Lösung eine Kombination vorgesehen. Die Kombination schließt (1) ein erstes saugfähiges Element, das an einem Teil davon ein erstes Reagens, wie ein sbp-Mitglied, nicht-diffundierbar daran gebunden aufweist, und (2) eine Probe umfaßt, von der man annimmt, daß sie einen Analyten enthält. Wenn sich der Analyt nicht an das erste Reagens binden kann, ist ein zweites Reagens, das sich an den Analyten und das erste Reagens binden kann, in dem Medium oder auf dem ersten saugfähigen Element anwesend.
Es kann in einer von einer Anzahl von Reihenfolgen eine Kombination gebildet werden. Zum Beispiel kann das erste saugfähige Element das erste Reagens daran gebunden aufweisen. Ein Teil des ersten saugfähigen Elements ("Kontaktteil") wird mit dem ersten Medium oder der ersten Lösung, das bzw. die den Analyten enthält, in Kontakt gebracht. Wenn die Probe ein wäßriges Medium ist, das den Analyten enthält, kann es sich bei der Probe um einen Teil oder die Gesamtheit des ersten Mediums oder der ersten Lösung handeln. Die primäre Überlegung besteht darin, daß in einem ersten Medium eine Kombination der Probe und des ersten Reagens auf einem Teil eines ersten saugfähigen Elements, beispielsweise eines Streifens, bereitgestellt wird und das Element mittels Kapillarwirkung durchflossen oder durchwandert wird. Diese Bewegung kann nach oben, nach unten, horizontal oder auf eine kombinierte Weise stattfinden. Die Bewegung des ersten Mediums entlang dem ersten saugfähigen Element oder durch dasselbe hindurch kann durch das absorbierende Element angetrieben werden, das in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem ersten saugfähigen Element steht. Eine solche Antriebs- oder Dochtwirkung sorgt für eine bessere Steuerung der Flüssigkeit, die mit dem chemisch aktiven Teil des ersten saugfähigen Elements in Kontakt tritt.
Wenn der Analyt das erste Reagens nicht binden kann, ist ein zweites Reagens, das den Analyten und das erste Reagens binden kann, in dem ersten Medium oder der ersten Lösung oder auf dem ersten saugfähigen Element anwesend. Wenn sich das zweite Reagens auf dem ersten saugfähigen Element befindet, ist es im allgemeinen diffundierbar daran gebunden, so daß es der Kontakt mit dem wäßrigen Medium gestattet, daß das zweite Reagens in das erste Medium hineindiffundiert. Diese Diffusion kann während der Bewegung des ersten Mediums entlang dem ersten saugfähigen Element stattfinden.
Das zweite Reagens besitzt, wie oben erwähnt, die Eigenschaft, den Analyten und das erste Reagens zu binden. Wenn der Analyt und das erste Reagens gleich oder analog sind, kann das zweite Reagens ein Bindungspartner, wie ein sbp-Mitglied, für den Analyten oder das Analytenanalogon sein. Jedoch kann das erste sbp-Mitglied vom Analyten oder einem Analytenanalogon verschieden sein. Die Funktion des ersten Reagens besteht darin, entweder den Analyten oder ein zweites Reagens in Beziehung zu der Menge an Analyt in der Probe zu binden. Demgemäß kann, wenn das erste Reagens den Analyten oder das Analytenanalogon nicht bindet, das erste Reagens so gewählt werden, daß es ein Bindungspartner für das zweite Reagens ist. In diesem Fall weist das zweite Reagens zwei Komponenten auf, eine Komponente, die sich an den Analyten, beispielsweise ein zweites sbp-Mitglied, binden kann, und eine Komponente, die sich an das erste Reagens, beispielsweise ein drittes sbp-Mitglied, binden kann. Die Komponente, die sich an den Analyten binden kann, kann komplementär zum Analyten sein, wie beispielsweise ein sbp-Mitglied für den Analyten, wie ein Antikörper. Der andere Teil des zweiten Reagens kann ein kleines organisches Molekül mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500 und vorzugsweise mehr als 250 sein. In dieser Situation kann das erste Reagens ein sbp-Mitglied sein, das entweder zu der zum Analyten komplementären Komponente oder dem kleinen organischen Molekül komplementär ist. Demgemäß kann es sich bei dem ersten Reagens beispielsweise um einen Antikörper gegen einen Antikörper oder um einen Antikörper gegen das kleine organische Molekül handeln. Beispiele für kleine organische Moleküle sind Biotin, Fluorescein, LSD, Morphin, Benzoylecgonin und dgl.
Die Menge des zweiten Reagens, die an das saugfähige Element gebunden wird, steht mit der Anwesenheit des entsprechenden Analyten in der Probe in einer Menge, die größer als oder gleich der vorbestimmten minimalen nachweisbaren Menge des Analyten ist, in Beziehung. Diese minimale nachweisbare Menge ist im allgemeinen die Menge, oberhalb der man annimmt, daß der Analyt anwesend ist. Beispielsweise kann man bei einem bzw. einer Arzneistoff/Droge nur daran interessiert sein, ob der bzw. die Arzneistoff/Droge in einem gewissen Konzentrationsbereich anwesend ist. Obwohl der bzw. die Arzneistoff/Droge unterhalb des Bereichs in der Probe oder Testlösung anwesend sein könnte, würde er bzw. sie nicht als anwesend angesehen werden, da seine bzw. ihre Konzentration nicht bei oder oberhalb der minimalen nachweisbaren Menge liegt.
Das wäßrige Medium oder die wäßrige Lösung und das flüssige Medium können bis zu 40 Gew.-% aus anderen polaren Lösungsmitteln bestehen, insbesondere sauerstoffhaltigen Lösungsmitteln mit 1 bis 6, gewöhnlicher 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einschließlich Alkoholen, Ethern und dgl. Gewöhnlich sind die Cosolvenzien zu weniger als ungefähr 20 Gew.-% vorhanden. Unter diesen Umständen könnte ein Teil oder die Gesamtheit des wäßrigen Mediums durch die Probe selbst bereitgestellt werden, abhängig von der Natur der Probe. Unter gewissen Umständen kann eine nicht-wäßrige Lösung oder ein nichtwäßriges flüssiges Medium unter Verwendung eines polaren oder nichtpolaren organischen Lösungsmittels verwendet werden. Ein solcher Umstand kann beispielsweise eintreten, wenn Wasser für die Reaktion der Materialien in einem Assay nicht benötigt wird oder wenn Wasser für die Aktivität derartiger Materialien schädlich wäre.
Wenn ein wäßriges Medium verwendet wird, liegt der pH des Mediums gewöhnlich im Bereich von 4-11, gewöhnlicher 5-10 und vorzugsweise im Bereich von ungefähr 6-9. Der pH wird so gewählt, daß er die beteiligte Reaktion im Assay erleichtert, so daß beispielsweise ein signifikantes Maß an Bindungsaffinität der Bindungsmitglieder und eine optimale Signalerzeugung durch das signalerzeugende System beibehalten werden. Verschiedene Puffer können verwendet werden, um den gewünschten pH zu erreichen und den pH während des Assays beizubehalten. Erläuternde Puffer schließen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dgl. ein. Der spezielle verwendete Puffer ist nicht kritisch, aber in einzelnen Assays kann ein Puffer einem anderen vorgezogen werden.
Es kann in einigen Fällen wünschenswert sein, ungefähr 0,05 bis 0,5 Gew.-% nicht-ionisches Detergens in der Probe einzuschließen. Verschiedene Polyoxyalkylen-Verbindungen mit ungefähr 200 bis 20 000 Dalton können verwendet werden.
Normalerweise werden mäßige und wünschenswerterweise im wesentlichen konstante Temperaturen für die Durchführung des Assays verwendet. Die Temperaturen für den Assay und die Erzeugung eines nachweisbaren Signals liegen gewöhnlich im Bereich von ungefähr 4- 50ºC, gewöhnlicher im Bereich von ungefähr 10-40ºC, und häufiger sind es Umgebungstemperaturen, d. h. ungefähr 15-25ºC.
Die Konzentration der Komponente oder des Analyten im ersten wäßrigen Medium oder in der ersten wäßrigen Lösung, die getestet werden kann, variiert im allgemeinen von ungefähr 10&supmin;&sup4; bis ungefähr 10&supmin;&sup5; M, gewöhnlicher von ungefähr 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;¹&sup4; M. Erwägungen wie die Konzentration der interessierenden Komponente oder des interessierenden Analyten und das Protokoll bestimmen normalerweise die Konzentration der anderen Reagenzien.
Während die Konzentrationen von vielen der verschiedenen Reagenzien in der Probe und den Reagenslösungen im allgemeinen durch den interessierenden Konzentrationsbereich der Komponente und/oder des Analyten festgelegt werden, wird die Endkonzentration zumindest von einigen der Reagenzien normalerweise empirisch festgelegt, um die Empfindlichkeit des Assays über den interessierenden Bereich zu optimieren. Bei bestimmten Protokollen können einzelne Reagenzien in beträchtlichem Überschuß verwendet werden, ohne daß sie die Empfindlichkeit des Assays nachteilig beeinflussen.
Wenn ein Streifen als erstes saugfähiges Element verwendet wird, hängt die Größe des Streifens von mehreren Überlegungen ab. Die primäre Überlegung besteht darin, daß eine ausreichende Menge an Analyt oder Reagens oder Komponente eingefangen wird, um anschließend ein ausreichendes Signal zum Erreichen eines empfindlichen und genauen Assays zu erhalten. In dieser Beziehung sorgt der qualitative Aspekt der vorliegenden Erfindung für eine gesteigerte Empfindlichkeit, da Analyt oder Reagens auf einem ersten saugfähigen Element so konzentriert werden kann, daß er bzw. es alle verfügbaren Bindungsstellen absättigt, indem ein Medium durch ein derartiges Element in ein absorbierendes Element fließt, bevor das erste Element in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit dem zweiten saugfähigen Element gebracht wird. Im allgemeinen beträgt das flüssigkeitsaufnehmende Volumen bei Streifen mit Aufwärtsfluß mehr als ein 1 ul, vorzugsweise mindestens 5-200 ul. Bei Streifen mit Abwärtsfluß können Aufnahmevolumina von so wenig wie 1-20 ul verwendet werden, aber Volumina von 5-200 ul sind vorzuziehen.
Die Dicke des Streifens ist nicht kritisch und beträgt normalerweise 0,05-2 mm, gewöhnlich 0,1-1 mm, vorzugsweise 0,2-0,7 mm. Allgemein wird die minimale Dicke durch die Festigkeit des Materials und das Erfordernis, ein leicht nachweisbares Signal zu erzeugen, diktiert, während die maximale Breite durch die Bequemlichkeit der Handhabung und die Kosten der Reagenzien diktiert wird.
Um die Einsparung von Reagenzien zu gestatten und für Proben begrenzter Größe zu sorgen, ist die Breite des Streifens im allgemeinen relativ schmal, gewöhnlich weniger als 20 mm, vorzugsweise weniger als 10 mm. Im allgemeinen beträgt die Breite des Streifens nicht weniger als ungefähr 1,0 mm, und sie liegt gewöhnlich im Bereich von 2 mm bis 12 mm, vorzugsweise von ungefähr 4 mm bis 8 mm.
Die Länge des Streifens hängt von der Konzentration des Analyten oder der Komponente oder des Reagens und von praktischen Überlegungen ab, wie der Leichtigkeit der Handhabung und der Anzahl der Stellen auf dem Streifen, und beträgt ungefähr 0,5 cm bis 40 cm, gewöhnlich ungefähr 1 cm bis 25 cm, vorzugsweise ungefähr 4 bis 20 cm, kann aber von irgendeiner praktischen Länge sein. Die Struktur des Streifens kann in weitem Bereich variieren und schließt fein, mittelfein, mittel, mittelgrob und grob ein. Im allgemeinen sorgen eine geringere Porengröße und ein feineres Material für einen langsamen Kapillarfluß und ein wirksames Einfangen des gewünschten Reagens auf dem Streifen. Gröbere, porösere Materialien sorgen für einen schnelleren Fluß, aber die Wirksamkeit des Einfangs ist verringert. Die Wahl der Porosität des Materials hängt von der Geschwindigkeit der Bindung der Komponenten bei einem gegebenen Assay ab. Vorzugsweise sollte die Porengröße nicht so gering sein, daß sie den Fluß beschränkt, und nicht so groß sein, daß Serum okkludiert wird, wenn es sich bei der interessierenden Probe um Serum handelt. Diese Situation bringt einen der Vorteile der vorliegenden Erfindungen mit sich, nämlich das Vermeiden der Notwendigkeit eines Waschschritts.
Die Querschnittsabmessungen des Streifens sind in der vorangehenden Besprechung zum Zweck der Erläuterung und nicht zur Begrenzung am Beispiel eines Rechtecks beschrieben worden. Wie oben erwähnt, können andere Formen, wie rund, dreieckig, oval usw., ebenfalls in den Bereich dieser Erfindung fallen. Die Abmessungen derselben können vom Fachmann mit Bezug auf die vorliegende Offenbarung festgelegt werden.
Andere Reagenzien, die Mitglieder des Nachweissystems sind, beispielsweise des signalerzeugenden Systems, können bezüglich der Konzentration in weitem Bereich variieren, abhängig vom speziellen Protokoll und ihrer Rolle bei der Signalerzeugung. Gewöhnlich wird die Menge eines Reagens, z. B. eines ersten sbp-Mitglieds, auf dem ersten saugfähigen Element homogen oder gleichförmig auf mindestens einem Teil desselben zwischen dem Kontaktteil und dem absorbierenden Element gebunden und mit Bezug auf die vorbestimmte minimale nachweisbare Menge der Komponente oder des Analyten festgelegt. Gewöhnlich überschreitet diese Menge nicht das 10&sup4;-fache der maximalen Menge der Komponente oder des zu testenden Analyten und ist nicht geringer als ungefähr die minimale Menge des Reagens, wie beispielsweise des ersten Reagens, das im Assay verwendet wird. Die minimale Konzentration des Reagens wird mit Bezug auf die minimale nachweisbare Menge der Komponente festgelegt. Diese Menge hängt von der Empfindlichkeit des Nachweises ab und kann von 10&supmin;¹&sup9; Mol bis 10&supmin;&sup6; Mol, gewöhnlich 10&supmin;¹&sup8; bis 10&supmin;¹&sup0; Mol, variieren. Wenn das erste Reagens dazu verwendet wird, ein zweites Reagens einzufangen, kann die Menge des ersten Reagens auf dem ersten saugfähigen Element so gewählt werden, daß nur eine vorbestimmte Menge des zweiten Reagens gebunden wird.
Bei der Durchführung eines Assays für einen Analyten beinhaltet das Protokoll gewöhnlich die Bildung einer Vereinigung der Probe, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält, und des ersten Reagens in einem wäßrigen Medium. Die Probe kann aus einer großen Vielfalt von Quellen abstammen, wie physiologischen Flüssigkeiten, erläutert durch Speichel, Blut, Serum, Plasma, Urin, Augenlinsenflüssigkeit, Spinalflüssigkeit usw., Nahrungsmittelprodukten, wie Milch und Wein, chemischen Prozeßströmen, Nahrungsmittelabwasser usw.
Der Kontaktteil oder die Gesamtheit des ersten saugfähigen Elements wird mit dem ersten Medium in Kontakt gebracht, gewöhnlich durch Eintauchen, wie beispielsweise durch Eintauchen des Kontaktteils in das Medium. Jedoch kann das Inkontaktbringen des ersten saugfähigen Elements mit dem ersten flüssigen Medium oder der ersten Lösung mittels anderer Techniken durchgeführt werden, wie des Auftüpfelns des ersten Mediums auf dem ersten saugfähigen Element. Diese Technik findet speziell Anwendung bei einem ersten saugfähigen Element, das streifenartig, rund, oval, blattartig usw. ist. Gewöhnlich läßt man die Befeuchtung des ersten saugfähigen Elements durch Kapillarwirkung solange andauern, bis ein definiertes Volumen des Mediums das saugfähige Element durchwandert hat. Allgemein durchwandern mindestens 20 ul, gewöhnlich mindestens 50 ul, häufig mindestens 100 ul des ersten Mediums das saugfähige Element. Die obere Grenze des ersten Mediums, das das saugfähige Element durchwandert, wird im allgemeinen durch praktische Überlegungen, wie die Größe der Vorrichtung und dgl., bestimmt.
Aus praktischen Gründen sind relativ kurze Zeitspannen für die Durchwanderung des ersten Mediums durch das erste saugfähige Element erwünscht. Gewöhnlich dauert die Durchwanderung des ersten Mediums durch das erste saugfähige Element mindestens 30 Sekunden und nicht mehr als 1 Stunde, gewöhnlicher ungefähr 1 Minute bis 30 Minuten, aber so lange Zeitspannen wie 24 Stunden können verwendet werden.
Nachdem das erste Medium das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements durchwandert hat' oder nach Inkontaktbringen des gesamten ersten saugfähigen Elements mit dem ersten Medium wird das erste saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Element gebracht. In einer bevorzugten Ausführungsform steht das erste saugfähige Element zu wesentlich verschiedenen Zeitpunkten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und einem chromatographischen Element, das einen Flüssigkeitsdurchfluß mittels Kapillarwirkung gestattet, wie einem immunchromatographischen Element. Bevorzugter wird die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem ersten saugfähigen Element und dem absorbierenden Element beendet, bevor die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem zweiten saugfähigen Element und dem zweiten Medium aufgenommen wird. Die Beziehung zwischen dem ersten saugfähigen Element und dem absorbierenden Element einerseits und dem zweiten saugfähigen Element andererseits kann durch physikalische oder mechanische Mittel oder eine Kombination derselben aufgenommen oder beendet werden.
Ein Teil des zweiten saugfähigen Elements wird mit einem zweiten flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium in Kontakt gebracht. Das zweite Medium durchwandert mittels Kapillarwirkung das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des zweiten saugfähigen Elements. Eine Komponente in dem zweiten Medium wird nicht-diffundierbar in Beziehung zu der Anwesenheit an Analyt im ersten Medium an das zweite saugfähige Element gebunden. Das zweite saugfähige Element kann ein Nachweismittel daran gebunden aufweisen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können entweder ein qualitatives Ergebnis oder eine quantitative Bestimmung eines Analyten, eines Reagens oder einer Komponente bereitstellen. Bei einem qualitativen Ergebnis wird in der vorliegenden Erfindung eine flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem ersten saugfähigen Element und dem zweiten saugfähigen Element erst aufgenommen, nachdem die Komponente oder der Analyt auf dem ersten saugfähigen Element konzentriert worden ist. Bei einer quantitativen Bestimmung kann das zweite saugfähige Element ein chromatographisches Element sein, wie ein immunchromatographisches Element. Wenn ein Reagens verwendet wird, kann in einer Ausführungsform die Komponente beispielsweise ein Konjugat eines Enzyms und eines Analytenanalogons sein. Abhängig von der Anwesenheit oder Menge an Analyt in der Probe wird die Komponente an Reagens gebunden, das nicht-diffundierbar an das erste saugfähige Element gebunden ist. Falls Analyt in der Probe oberhalb einer minimalen nachweisbaren Menge vorhanden ist, wird die Menge des Reagens so gewählt, daß eine proportionale Menge der Komponente sich nicht an das erste saugfähige Element bindet, sondern zum zweiten saugfähigen Element wandert. In einigen Fällen kann das zweite saugfähige Element einen Bindungspartner für die Komponente enthalten. In dem Fall, in dem die Komponente ein Enzym-markiertes Analytenanalogon ist, kann sich dieser Bindungspartner an den Enzym- Teil des Konjugats oder den Analytenanalogon-Teil des Konjugats binden. Demgemäß kann dieser Bindungspartner ein Antikörper gegen das Enzym oder ein Antikörper gegen das Analytenanalogon sein. Die Komponente kann einen Marker einschließen oder in der Lage sein, sich an einen Marker zu binden. Bei dem Bindungspartner auf dem zweiten saugfähigen Element kann es sich in dem Fall, in dem das erste Reagens ein Antigen ist, das für ein Immunglobulin spezifisch ist, um einen Rezeptor für einen Antikörper, beispielsweise Protein A, handeln.
Beispiele für immunchromatographische Verfahren sind in den US- Patenten Nr. 4,168,146 und 4,435,504 beschrieben. Auf die vorliegende Erfindung angewendet, durchquert die Komponente im zweiten wäßrigen Medium die immunsorbierende Zone des immunchromatographischen Elements, wobei sie mit der Flüssigkeit aus dem ersten saugfähigen Element mitgeschleppt wird. Die Komponente kann beispielsweise durch die Vermittlung einer sbp-Mitglied-Komplexbildung an das zweite saugfähige Element gebunden werden. Für ein qualitatives Ergebnis kann die immunsorbierende Zone ein schmales Band oder eine kleine Stelle sein, die für eine Anzeige der Anwesenheit oder Abwesenheit des Analyten in der Probe sorgt. Der Teil des zweiten saugfähigen Elements, der vom zweiten Medium durchwandert wird, hängt vom speziellen verwendeten Protokoll ab, ist aber vorzugsweise das gesamte saugfähige Element. Jedoch durchquert als allgemeine Regel sowohl bei qualitativen als auch bei quantitativen Bestimmungen das Medium mindestens den Teil des zweiten saugfähigen Elements mit der immunsorbierenden Zone. Die Abmessungen des zweiten saugfähigen Elements können gemäß den gleichen Erwägungen wie denjenigen festgelegt werden, die oben für das erste saugfähige Element beschrieben wurden. Das Verhältnis der Größe der immunsorbierenden Zone zum Rest des zweiten saugfähigen Elements ist derart, daß eine ausreichende Menge der Komponente durch die immunsorbierende Zone wandern kann, so daß ein genauer Assay erreicht wird.
Im Anschluß an die Wanderung des ersten und zweiten saugfähigen Elements durch das zweite Medium wird in einem qualitativen Assay die Anwesenheit der Komponente bestimmt, die sich auf dem zweiten saugfähigen Element befindet oder daran gebunden ist. Die Anwesenheit der Komponente auf dem zweiten saugfähigen Element steht mit der Menge an Analyt in der Probe in Beziehung. Wenn die Komponente einen Marker enthält, kann das zweite saugfähige Element auf die Anwesenheit eines nachweisbaren Signals überprüft werden. Falls das Signal das Ergebnis eines radioaktiven Markers oder dgl. ist, kann das Signal direkt auf dem zweiten saugfähigen Element nachgewiesen werden. Wenn chemische Mittel den Teil des signalerzeugenden Mittels bilden, der den Marker einschließt, kann der Kontaktteil des ersten saugfähigen Elements in eine Entwicklerlösung getaucht werden oder auf andere Weise damit in Kontakt gebracht werden, welche die verbleibenden Mitglieder des signalerzeugenden Systems enthält. Wenn nur ein Teil des zweiten saugfähigen Elements kontaktiert wird, läßt man diese Entwicklerlösung entlang dem ersten saugfähigen Element durch das zweite saugfähige Element fließen. Abhängig vom Protokoll kann ein Waschschritt verwendet werden oder auch nicht. Alternativ kann das zweite saugfähige Element direkt mit der Entwicklerlösung in Kontakt gebracht werden, wie z. B. durch vollständiges Eintauchen, Besprühen und dgl.
Abhängig vom Protokoll kann es wünschenswert sein, zuerst das zweite saugfähige Element mit einer Entwicklerlösung in Kontakt zu bringen und dann anschließend das zweite saugfähige Element mit irgendwelchen verbleibenden Mitgliedern des signalerzeugenden Systems in Kontakt zu bringen, die nicht in der Entwicklerlösung oder dem ersten und zweiten Medium oder auf dem ersten oder zweiten saugfähigen Element anwesend sind.
Im allgemeinen läßt man vor dem Messen des Signals genügend Zeit verstreichen, so daß eine Menge der signalerzeugenden Verbindung erzeugt wird, die erforderlich ist, den Bereich des zweiten saugfähigen Elements zu definieren, in dem die Komponente gefunden wird oder gebunden wird. Wenn das nachweisbare Signal erzeugt worden ist, ist die Anwesenheit oder Abwesenheit des Analyten oder die Menge des Analyten in der Probe und/oder die Menge des Reagens oder der Komponente bekannt. Bei quantitativen Bestimmungen stellt das signalerzeugende System die Art und Weise bereit, mit der der Bereich auf dem zweiten saugfähigen Element, in dem der Analyt oder die Komponente gefunden wird oder gebunden wird, von dem Bereich, in dem diese(r) abwesend ist, unterschieden werden kann. Auf diese Weise ist die Strecke von einem vorbestimmten Punkt auf dem Chromatographen ein Maß für die Menge des Analyten in der Probe und/oder der Komponente oder des Reagens. In einer Ausführungsform ist der Bereich des zweiten saugfähigen Elements, der von der Komponente durchwandert wurde, aufgrund der Erzeugung eines im wesentlichen gleichförmigen nachweisbaren Signals über den ganzen Bereich hinweg beobachtbar, in dem die Komponente anwesend ist. In einer anderen Ausführungsform ist das nachweisbare Signal vor allem an einer Grenze beobachtbar, die mit dem Bereich auf dem zweiten saugfähigen Element in Beziehung steht, der von dem zweiten Reagens besetzt wird.
In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein wäßriges Medium hergestellt, das eine Probe, von der man annimmt, daß sie einen Analyten enthält, und ein erstes Reagens umfaßt, das ein Konjugat eines Antikörpers gegen den Analyten und eines kleinen organischen Moleküls ist. Das wäßrige Medium wird mit einem Kontaktteil eines saugfähigen Streifens in Kontakt gebracht, der nicht-diffundierbar daran gebunden entweder einen Antikörper gegen das kleine organische Molekül oder einen Antikörper daran gebunden aufweist, welcher den Antikörper gegen den Analyten erkennt. Ein Endteil eines saugfähigen Streifens wird mit einem absorbierenden Streifen in Kontakt gebracht. Die Lösung durchwandert den saugfähigen Streifen und einen Teil des absorbierenden Streifens. Der Antikörper auf dem saugfähigen Streifen fängt das erste Reagens ein. Falls Analyt im wäßrigen Medium anwesend ist, wird der Analyt durch den Antikörper des ersten Reagens eingefangen.
Die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem saugfähigen Streifen und dem absorbierenden Element wird beendet, und der saugfähige Streifen wird in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Streifen gebracht. Ein zweites flüssiges Medium, das eine Komponente enthält, bei der es sich um ein Enzymmarkiertes Analytenanalogon handelt, wird mit dem Kontaktteil des ersten saugfähigen Streifens in Kontakt gebracht. Der zweite saugfähige Streifen enthält Antikörper, der sich entweder an das Analytenanalogon oder den Enzym-Teil des zweiten Reagens oder an das Konjugat selbst bindet. Der Antikörper auf dem zweiten saugfähigen Material ist nicht-diffundierbar und gleichförmig an einen wesentlichen Teil des zweiten saugfähigen Streifens gebunden, um einen Immunchromatographen zu bilden. Das zweite wäßrige Medium durchwandert den ersten saugfähigen Streifen und den zweiten saugfähigen Streifen.
Falls Analyt in der Probe anwesend ist, besetzt der Analyt die Bindungsstellen an dem Antikörper gegen den Analyten, welcher an den ersten saugfähigen Streifen gebunden ist. Folglich bindet sich das Enzym-markierte Analytenanalogon nicht an die besetzten Bindungsstellen auf dem ersten saugfähigen Element und wandert so zum zweiten saugfähigen Streifen, wo es durch den Antikörper auf dem zweiten saugfähigen Streifen eingefangen wird. Die Mengen des ersten Reagens und der verwendeten Komponente müssen deshalb vorbestimmte Mengen auf der Grundlage des interessierenden vermuteten Konzentrationsbereichs des Analyten sein. Falls kein Analyt oder eine Menge an Analyt unterhalb einer vorbestimmten interessierenden Konzentration in der Probe anwesend ist, wird die Komponente vollständige an das erste saugfähige Element gebunden, so daß keine Komponente zum zweiten saugfähigen Streifen wandert. Falls jedoch Analyt in der Probe anwesend ist, wandert die Komponente im Verhältnis zu der Menge an Analyt in der Probe zum zweiten saugfähigen Element. Vorgesehene Mengen werden so gewählt, daß mindestens etwas Komponente zum zweiten saugfähigen Streifen wandert, selbst wenn kein Analyt in der Probe anwesend ist, und die Komponente eine Strecke entlang dem zweiten saugfähigen Element durchwandert, die im Verhältnis zu der Menge an Analyt in der Probe steht.
Nachdem das zweite flüssige Medium den ersten saugfähigen Streifen und den zweiten saugfähigen Streifen durchwandert hat, wird der Kontakt zwischen dem ersten saugfähigen Element und dem zweiten wäßrigen Medium beendet. Der zweite saugfähige Streifen wird dann mit einer Entwicklerlösung in Kontakt gebracht, um die Position des Enzym-Konjugats zu bestimmen, das an den zweiten saugfähigen Streifen gebunden ist. Dazu kann der erste und zweite saugfähige Streifen in eine Entwicklerlösung eingetaucht werden, oder der zweite saugfähige Streifen kann von der flüssigkeitsaufnehmenden Beziehung mit dem ersten saugfähigen Streifen entfernt werden und mit der Entwicklerlösung in Kontakt gebracht werden, welche die verbleibenden Mitglieder des signalerzeugenden Systems enthält. Auf diese Weise wird die Wanderungsstrecke der Komponente auf dem zweiten saugfähigen Streifen bestimmt und für ein quantitatives Ergebnis mit der Menge an Analyt in der Probe korreliert. Diese Korrelation kann das Ergebnis einer Durchführung des obigen Verfahrens bei bekannten Proben sein, um Wanderungsstrecken zu bestimmen und die Wanderungsstrecke in der unbekannten Probe mit bekannten Werten zu vergleichen, um die Menge des in der Probe anwesenden Analyten zu bestimmen.
Die Entwicklerlösung kann die verbleibenden Mitglieder des signalerzeugenden Systems enthalten, oder einige der Mitglieder des signalerzeugenden Systems, beispielsweise ein zweites Enzym, können auf dem zweiten saugfähigen Streifen anwesend sein. Siehe z. B. die US-Patentanmeldung Nr. 602,297, eingereicht am 20. April 1984 (die der europäischen Patentanmeldung Nr. 85302761.3, der kanadischen Patentanmeldung SN 479,634 und der japanischen Patentanmeldung Nr. 60-085297 entspricht) und die US-Patentanmeldung Nr. 733,013, eingereicht am 10. Mai 1985 (die der europäischen Patentanmeldung Nr. 86303533.3, der kanadischen Patentanmeldung SN 508833 und der japanischen Patentanmeldung Nr. 61-107524 entspricht).
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein erster saugfähiger Streifen, der ein Analytenanalogon daran gebunden aufweist, an einem Kontaktteil mit einem wäßrigen Medium, das eine Probe enthält, von der man vermutet, daß sie einen Analyten enthält, und mit einem Antikörper gegen den Analyten in Kontakt gebracht. Der erste saugfähige Streifen steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element, und man läßt das Medium den ersten saugfähigen Streifen und einen Teil des absorbierenden Elements durchwandern. Die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem absorbierenden Element und dem ersten saugfähigen Streifen wird beendet, und der erste saugfähige Streifen wird in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Streifen gebracht. Der Kontaktteil des ersten saugfähigen Streifens wird mit einem zweiten wäßrigen Medium in Kontakt gebracht, welches ein Antikörper-Enzym-Konjugat enthält, das sich an den Antikörper gegen den Analyten bindet. Der zweite saugfähige Streifen enthält einen Rezeptor für einen Antikörper gegen den Analyten, beispielsweise Protein A.
Falls Analyt in der Probe anwesend ist, bindet sich der Analyt an seinen komplementären Antikörper, und folglich wird dieser Komplex nicht an den ersten saugfähigen Streifen gebunden. Wenn jedoch kein Analyt in der Probe anwesend ist oder dieser nur unterhalb einer vorbestimmten nachweisbaren Menge anwesend ist, bindet sich der Antikörper gegen den Analyten an das Analytenanalogon auf dem ersten saugfähigen Element. Wenn der erste saugfähige Streifen mit dem zweiten wäßrigen Medium in Kontakt gebracht wird, welches das Antikörper-Enzym-Konjugat enthält, wird das Konjugat an den ersten saugfähigen Streifen gebunden, falls Antikörper gegen Analyt gebunden ist. Abhängig von der Menge des Antikörpers gegen den Analyten, der an das erste saugfähige Element gebunden ist, welche ihrereseits mit der in der Probe anwesenden Menge des Analyten in Beziehung steht, wandert eine Menge des Konjugats zum zweiten saugfähigen Streifen, wo sie durch den Rezeptor für den Antikörper eingefangen wird.
Nachdem das Medium den ersten saugfähigen Streifen und den zweiten saugfähigen Streifen durchwandert hat, wird der zweite saugfähige Streifen, wie oben in der vorigen Ausführungsform beschrieben, behandelt, um die Enzymaktivität auf dem zweiten saugfähigen Streifen zu bestimmen. Wieder steht die Wanderungsstrecke des Konjugats auf dem zweiten saugfähigen Streifen mit der Menge an Analyt in der Probe in Beziehung.
In einer anderen Ausführungsform wird ein erster saugfähiger Streifen mit einem Teil, der einen Antikörper gegen den Analyten daran gebunden aufweist, mit einem wäßrigen Medium in Kontakt gebracht, das die interessierende Probe enthält. Man läßt die Probe, angetrieben durch Kapillarwanderung, das erste saugfähige Element in ein absorbierendes Element hinein durchwandern, das in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem ersten saugfähigen Element steht. Nachdem die Durchwanderung stattgefunden hat, wird die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem ersten saugfähigen Element und dem absorbierenden Element beendet, und das erste saugfähige Element wird in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Element gebracht, das einen Antikörper gegen den Analyten daran gebunden aufweist. Das erste saugfähige Element wird dann mit einem wäßrigen Medium in Kontakt gebracht, das Enzym-markiertes Analytenanalogon enthält. Dieses zweite wäßrige Medium durchwandert das erste saugfähige Element und das zweite saugfähige Element.
Falls Analyt in der Probe anwesend ist, bindet sich der Analyt bei der ersten Durchwanderung an das erste saugfähige Element, und die Antikörper-Bindungsstellen auf dem ersten saugfähigen Element werden besetzt. Demgemäß bindet sich, wenn das zweite wäßrige Medium das erste saugfähige Element durchwandert, das Enzym-markierte Analytenanalogon nicht an das erste saugfähige Element, sondern wandert vielmehr in direkter Beziehung zu der in der Probe anwesenden Menge an Analyt zum zweiten saugfähigen Element. Wiederum wird das zweite saugfähige Element behandelt, um die Enzymaktivität nachzuweisen und die Bestimmung der Wanderungsstrecke zu gestatten, welche dann mit der Menge an Analyt in der Probe in Beziehung gesetzt wird.
Die vorliegende Erfindung findet auf eine große Vielfalt von Protokollen zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Menge eines oder mehrerer Analyten in einer Probe Anwendung. Ein Beispiel gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft ein sbp-Mitglied in einem ersten wäßrigen Medium, welches man veranlaßt, sich durch Inkontaktbringen eines Teils des saugfähigen Elements mit dem Medium an das erste saugfähige Element zu binden. Das erste saugfähige Element steht in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element. Das Medium durchwandert mittels Kapillarwirkung das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements. Als nächstes läßt man das erste saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Element kommen. Eine Komponente in einem zweiten wäßrigen Medium wird veranlaßt, nichtdiffundierbar in Beziehung zu der Anwesenheit an Analyt in dem ersten Medium an ein zweites saugfähiges Element gebunden zu werden. Ein Teil des ersten saugfähigen Elements wird mit dem zweiten wäßrigen Medium unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen das zweite Medium mittels Kapillarwirkung das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des zweiten saugfähigen Elements durchwandert. Die Anwesenheit der Komponente auf mindestens einem Teil des zweiten saugfähigen Elements oder die Strecke, welche die Komponente darauf durchwandert hat, wird dann bestimmt, um die Anwesenheit und/oder Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen. Protokolle, wie diejenigen, die in der US-Patentanmeldung Serial No. 904,597, eingereicht am 5. September 1986 (die der europäischen Patentanmeldung Nr. 87307776.2 und der kanadischen Patentanmeldung SN 546,080 entspricht); der US-Patentanmeldung Serial Nr. 928,233, eingereicht am 7. November 1986 (die der europäischen Patentanmeldung Nr. 87309723.3, der kanadischen Patentanmeldung SN 551,172 und der japanischen Patentanmeldung Nr. 62-281921 entspricht); und in der US-Patentanmeldung Serial Nr. 928,771, eingereicht am 7. November 1986 (die der europäischen Patentanmeldung Nr. 87309724.0, der kanadischen Patentanmeldung SN 551,171 und der japanischen Patentanmeldung Nr. 62-281922 entspricht) beschrieben werden, können gemäß der vorliegenden Erfindung abgeändert werden, um einen oder mehrere Analyten in einer Probe zu bestimmen.
Bei der Durchführung eines Assays zur Bestimmung der Menge einer Komponente, beispielsweise eines Metallions, oder eines Analyten in einem flüssigen, gewöhnlich wäßrigen Medium, beinhaltet das Protokoll im allgemeinen die Bildung einer Vereinigung der Komponente und einer ersten Zone eines saugfähigen Elements ("ersten Zone") in einem flüssigen Medium. Die interessierende Komponente kann in einer großen Vielfalt von Quellen gefunden werden, wie chemischen Prozeßströmen, Medien, die umweltverschutzende Stoffe enthalten, Abwasser, physiologischen Flüssigkeiten usw. Die erste Zone enthält nichtdiffundierbar daran gebunden eine vorbestimmte Konzentration eines Reagens, das mit der Komponente reagiert, beispielsweise einen Chelatbildner für das Metallion oder ein sbp-Mitglied gegen einen Analyten. Bei einer Vorgehensweise wird ein Kontaktteil der ersten Zone mit dem flüssigen Medium in Kontakt gebracht. Man läßt das Befeuchten der ersten Zone durch Kapillarwirkung andauern, bis das Medium und die Komponente die ganze erste Zone durchquert haben und in eine zweite Zone eines saugfähigen Elements ("zweite Zone") gewandert sind. Die zweite Zone kann ein Teil des gleichen saugfähigen Elements wie desjenigen der ersten Zone sein, vorausgesetzt jedoch, daß die Zusammensetzung der an die zwei Zonen gebundenen Reagenzien verschieden sind. Alternativ kann die zweite Zone ein Teil eines gesonderten saugfähigen Elements sein, das mit der ersten Zone in Kontakt gebracht wird, um das Medium und die Komponente durch Kapillarwanderung in die zweite Zone hineinwandern zu lassen.
Als nächstes wird die zweite Zone überprüft, um die Wanderungsstrecken des Mediums und der Komponente zu bestimmen. Im allgemeinen kann dies bewerkstelligt werden, indem man die Zone mit einem Nachweismittel in Kontakt bringt, falls die Komponente nicht auf andere Weise direkt nachweisbar ist oder das Nachweismittel an die Zone gebunden ist. Das Nachweismittel kann eine Entwicklerlösung sein, die beispielsweise ein Enzmysubstrat bereitstellt, wenn die Komponente ein Enzym enthält, wie es der Fall ist bei einem Enzymmarkierten Ligandenanalogon. Wenn die Komponente ein anorganisches Molekül ist, kann das Nachweismittel eine Substanz sein oder eine Substanz, die mit der Komponente wechselwirkt, um ein Signal, wie beispielsweise eine Farbe, zu erzeugen. Beispielsweise können Oxidations-Reduktions-Reaktionen verwendet werden, die als ein Mitglied derselben eine Komponente aufweisen, bei der die Reaktion die Erzeugung eines gefärbten Produkts zur Folge hat.
Das Nachweismittel ist häufig im einem wäßrigen Medium anwesend, das beispielsweise durch Eintauchen der zweiten Zone in das Medium, das das Nachweismittel enthält, oder durch Auftragen des Mediums, das das Nachweismittel enthält, beispielsweise mittels Aufsprühen und dgl. auf die zweite Zone, usw. mit dem zweiten Medium in Kontakt gebracht wird.
Man läßt genügend Zeit verstreichen, damit die geeignete Wechselwirkung zum erforderlichen Ausmaß stattfinden kann. Die Zeit hängt von der Natur der Wechselwirkung, wie beispielsweise chemisch oder physikalisch, der Reaktion der beteiligten Moleküle und dgl. ab.
Nachdem sich der geeignete Signalpegel entwickelt hat, kann die Wanderungsstrecke der Komponente in die zweite Zone hinein oder der Unterschied in den Wanderungsstrecken des Mediums und der Komponente in die zweite Zone hinein gemessen werden. Diese Strecke oder dieser Unterschied steht mit der Menge der Komponente in dem flüssigen Medium oder der Menge an Reagens in Beziehung. Beispielsweise können Standardkurven erstellt werden, indem man bekannte Mengen an Komponenten und Reagenzien verwendet, und unbekannte Mengen können durch Vergleich der Strecke oder des Unterschieds, auf den oben Bezug genommen wurde, mit der Standardkurve erhalten werden.
Nach der Wanderung des ersten und zweiten saugfähigen Elements durch das zweite Medium wird in einem qualitativen Assay die Strecke, welche die Komponente zum zweiten saugfähigen Element hin durchwandert hat, bestimmt und mit der Menge an Analyt in der Probe in Beziehung gesetzt. Wenn die Komponente einen Marker enthält, kann die durchwanderte Strecke aus der Anwesenheit eines nachweisbaren Signals in der durchwanderten Fläche bestimmt werden. Wenn der Marker beispielsweise ein Fluorophor ist, kann das Signal direkt auf dem zweiten saugfähigen Element nachgewiesen werden. Wenn ein Nachweismittel einen Teil des signalerzeugenden Mittels darstellen, das den Marker einschließt, kann das Nachweismittel an das zweite saugfähige Element gebunden sein, oder das Element kann mit einer Lösung des Entwicklermittels in Kontakt gebracht werden.
Im allgemeinen läßt man vor dem Messen des Signals genügend Zeit verstreichen, so daß eine Menge der signalerzeugenden Verbindung erzeugt wird, die erforderlich ist, um die Strecke entlang des zweiten saugfähigen Elements zu definieren, durch welche die Komponente gewandert ist. Wenn das nachweisbare Signal erzeugt worden ist, kann die Menge des Analyten in der Probe oder die Menge an Reagens oder Komponente bestimmt werden. Demgemäß ist die Strecke zwischen dem weitesten Punkt der Durchwanderung des Medium und dem weitesten Punkt der Durchwanderung der Komponente auf dem Chromatographen ein Maß für die Menge an Analyt in der Probe oder der Komponente oder des Reagens. Der Bereich des zweiten saugfähigen Elements, der von der Komponente durchwandert worden ist, wird gewöhnlich als ein im wesentlichen einheitlich nachweisbares Signal über den Bereich hinweg beobachtet, in dem die Komponente anwesend ist.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Vorrichtungen für die Analyse auf die Anwesenheit oder Menge eines interessierenden Analyten oder Reagens oder einer interessierenden Komponente ein. Mit Bezug auf Fig. 1 umfassen die Vorrichtungen ein erstes saugfähiges Element (10), ein absorbierendes Element (18) und ein zweites saugfähiges Element (20). Das erste saugfähige Element kann in abwechselnder flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem zweiten saugfähigen Element stehen. In einer alternativen Ausführungsform umfaßt die vorliegende Vorrichtung weiter ein Mittel für die abwechselnde flüssigkeitsaufnehmende Beziehung. Wie oben erwähnt, kann dieses Mittel physikalisch oder mechanisch sein, und es kann automatisiert oder nichtautomatisiert sein. In einer Ausführungsform einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist das zweite saugfähige Element ein Immunchromatograph.
Aus Bequemlichkeitsgründen können die Reagenzien und Vorrichtungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, in einem Testsatz in abgepackter Kombination in vorbestimmten Mengen für die Verwendung bei der Durchführung des vorliegenden Verfahrens beim Testen auf einen Analyten in der Probe vorgesehen sein. Zum Beispiel kann ein Testsatz, der beim vorliegenden Verfahren nützlich ist, in abgepackter Kombination eine wie oben beschriebene Vorrichtung und eine Komponente oder eine Komponente und ein erstes Reagens, wie oben beschrieben, umfassen. Wenn ein Enzym als Marker verwendet wird, können die Reagenzien Enzym-markiertes Analytenanalogon und eine Entwicklerlösung, die Substrat für das Enzym oder Vorläufer dafür enthalten kann, einschließlich irgendwelcher zusätzlicher Substrate, Enzyme und Cofaktoren, und irgendwelche Reaktionspartner des Enzymprodukts einschließen, die erforderlich sind, um den nachweisbaren Chromophor oder Fluorophor bereitzustellen. Zusätzlich können andere Additive, wie beispielsweise ergänzende Reagenzien, z. B. Stabilisatoren, Puffer und dgl., eingeschlossen sein. Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien können in weitem Bereich variiert werden, um für Konzentrationen der Reagenzien in Lösung zu sorgen, die die Empfindlichkeit des Assays wesentlich optimieren. Eines oder mehrere der Reagenzien können als trockene Pulver, gewöhnlich lyophilisiert, einschließlich Hilfsstoffen, bereitgestellt werden, die bei der Auflösung für eine Reagenslösung mit den geeigneten Konzentrationen zur Durchführung des Assays sorgen. Jedes Reagens kann in gesonderten Behältern abgepackt sein, oder einige Reagenzien können in einem Behälter zusammengegeben sein, wenn die Reaktivität und die Haltbarkeit dies gestatten.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden erläuternden Beispiele erklärt. Teile und Prozentsätze beziehen sich auf Gewicht zu Volumen, falls es nicht anders angegeben ist.

BEISPIEL I

Definitionen:
PVA - Polyvinylalkohol
MES-Puffer - 2-Morpholinoethansulfonsäure
TNBS - Trinitrobenzolsulfonsäure
HEPES-Puffer - Hydroxyethylpiperazinethansulfonsäure
DMF - Dimethylformamid
PBS - Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung - 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7
NHS - N-Hydroxysuccinimid
Ig - Immunglobuline
IgG - Immunglobulin G

Materialien

Nitrocellulose-Membran (Porengröße 12 um) wurde von Schleicher und Schuell erhalten. Affinitäts-gereinigtes Kaninchen-Anti-Maus-IgG wurde von Zymed erhalten. Glutaraldehyd (25%-ig, wäßrig) wurde von Sigma erhalten, Rinder-IgG wurde von Miles Diagnostics erhalten. Monoklonales Anti-Fluorescein 11H7 und monoklonales Anti-Digoxin 2H6 wurden gemäß den Standardverfahren, Galfre et al, Nature (1977) 266 : 550, unter Verwendung von Fluorescein-markiertem Rinder-IgG bzw. Digoxin-markiertem Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin als Immunogene hergestellt. Bei dem Phosphatpuffer handelt es sich um 0,1 M Natriumphosphat, 0,2 M Natriumchlorid, pH 7,3. Bei Natriumsulfat-Puffer handelte es sich um Phosphat-Puffer, der zusätzlich 9% (Gew./Gew.) Natriumsulfat enthielt. Meerrettichperoxidase (HRP) wurde von Shinko American erhalten. Blotting-Papier wurde von Bio-Rad erhalten (Katalog Nr. 1650921). Das Carboxyfluorescein war von Kodak.

Herstellung von immobilisiertem Anti-Fluorescein

Nitrocellulose-Membran (7,5 · 9 cm) wurde mit 50 ml einer Lösung von 40 ug/ml Kaninchen-Anti-Maus-Ig und 1 mg/ml Rinder-IgG in Natriumsulfat-Puffer 30 Minuten inkubiert. Die Membran wurde 15 Minuten lang mit 50 ml Natriumsulfat-Puffer gewaschen, dann durch Inkubieren mit 50 ml Glutaraldehyd zu 62 ug/ml in Natriumsulfat- Puffer über 2 Stunden fixiert. Die Membran wurde jeweils 15 Minuten lang zweimal mit 50 ml Phosphat-Puffer gewaschen, dann mit 50 ml monoklonalem Anti-Fluorescein 11H7 zu 100 ug/ml und Rinder-IgG zu 1 mg/ml in Phosphat-Puffer 1 Stunde lang inkubiert. Die Membran wurde 15 Minuten lang mit 50 ml Phosphat-Puffer gewaschen, 15 Minuten lang mit 50 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit 50 ml 20/30 PVA zu 0,2 mg/ml inkubiert. Die Membran wurde dann 15 Minuten bei 50ºC getrocknet.

Herstellung von immobilisiertem Anti-Digoxin

Nitrocellulose-Membran (27,5 · 9 cm) wurde unter Verwendung von 3M 9460 Transfer-Klebstoff auf einen 3 mil-Vinylacetatfilm laminiert und dann mit 250 ml einer Lösung von 1 ug/ml Kaninchen-Anti-Maus-Ig und 1 mg/ml Rinder-IgG in Natriumsulfat-Puffer 30 Minuten lang inkubiert. Die Membran wurde 15 Minuten lang mit 250 ml Natriumsulfat-Puffer gewaschen, dann durch 2-stündiges Inkubieren mit 250 ml Glutaraldehyd zu 62 ug/ml in Natriumsulfat-Puffer fixiert. Die Membran wurde jeweils 15 Minuten lang zweimal mit 250 ml Phosphat-Puffer gewaschen, dann 1 Stunde mit 250 ml monoklonalem Anti-Digoxin 2H6 zu 1 ug/ml und Rinder-IgG zu 1 mg/ml in Phosphat- Puffer inkubiert. Die Membran wurde 15 Minuten mit 250 ml Phosphat- Puffer gewaschen, 15 Minuten mit 250 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit 250 ml 20/30 PVA zu 0,2 mg/ml inkubiert. Die Membran wurde dann 15 Minuten bei 50ºC getrocknet.

Herstellung einer inaktivierten Nitrocellulose-Membran

Nitrocellulose-Membran (7,5 · 9 cm) wurde mit 50 ml einer Lösung von 1 mg/ml Rinder-IgG in Natriumsulfat-Puffer 30 Minuten lang inkubiert. Die Membran wurde 15 Minuten lang mit 50 ml Natriumsulfat- Puffer gewaschen, dann durch 2-stündiges Inkubieren mit 50 ml Glutaraldehyd zu 62 ug/ml in Natriumsulfat-Puffer fixiert. Die Membran wurde jeweils 15 Minuten lang zweimal mit 50 ml Phosphat- Puffer gewaschen, dann 1 Stunde mit 50 ml Rinder-IgG zu 1 mg/ml in Phosphat-Puffer inkubiert. Die Membran wurde 15 Minuten lang mit 50 ml Phosphat-Puffer gewaschen, 15 Minuten lang mit 50 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit 50 ml 20/30 PVA zu 0,2 mg/ml inkubiert. Die Membran wurde dann 15 Minuten bei 50ºC getrocknet.

Herstellung von Digoxin-markierter HRP

Ethylendiamin (3 M, pH 5,0; 3,33 ml) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (1 M, 0,1 ml) wurden zu einer Lösung von HRP (50 mg in 6,6 ml 138 mM MES-Puffer, pH 5,0) gegeben, und die Mischung wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die resultierende aminierte HRP wurde durch Chromatographie auf Sephadex G-25 unter Verwendung von 0,02%-igem wäßrigem Natriumazid als Eluens gereinigt, und man fand, daß sie durchschnittlich 11 Aminogruppen pro HRP aufwies (TNBS-Titration). Aminierte HRP (37,9 mg) in HEPES- Puffer (200 mM, pH 8,0; 7 ml) wurden mit drei 95 ul-Portionen Bernsteinsäureanhydrid (2 M in DMF) behandelt, die in 10-minütigen Abständen zugesetzt wurden, und 5 Minuten nach jeder Zugabe wurde eine 190 ul-Portion von 1 M Natriumhydroxid zugesetzt, um den pH bei 8 zu halten. Die succinylierte aminierte HRP wurde durch Chromatographie auf Sephadex G-25 unter Verwendung von 0,02%-igem Natriumazid als Eluens gereinigt. Die succinylierte aminierte HRP wurde durch Behandlung des Materials (30,8 mg) in MES-Puffer (70 mM, pH 5,0; 4,1 ml) mit Ethylendiamin (3M, pH 5,0; 2,07 ml) und 1-(3- Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (1 M, 0,062 ml) über 6 Stunden bei Raumtemperatur reaminiert. Die reaminierte HRP wurde durch Chromatographie auf Sephadex G-25 unter Verwendung von 0,02 %igem wäßrigem Natriumazid als Eluens gereinigt, und man fand, daß sie 15,5 Aminogruppen pro HRP aufwies (TNBS-Titration). Die reaminierte HRP (2 mg/ml in PBS, pR 7,0) wurde mit einem 200-fachen Überschuß des NRS-Esters von 3-Digoxigenin-O-carboxymetbyloxim umgesetzt und dann erschöpfend dialysiert. Die resultierende Digoxinmarkierte HRP wies 12 Digoxine/HRP auf (aufgrund der Titration von Rest-Aminogruppen mit TNBS).

Herstellung von Fluorescein-markiertem Anti-Digoxin 2H6

Monoklonales Anti-Digoxin 2R6 (7,3 m/ml, 0,2 ml) in Phosphat- Puffer wurde mit dem NHS-Ester von 6-Carboxyfluorescein (20 mM in DMF; 5 ul) behandelt und 5 Minuten bei Raumtemperatur, dann 16 Stunden bei 4ºC inkubiert. Das Fluorescein-markierte Anti-Digoxin wurde durch Chromatographie auf Sephadex G-25 unter Verwendung von Phosphat-Puffer als Eluens gereinigt, und man fand, daß es 3,6 Fluoresceine pro Antikörper aufwies.

Vorrichtung (Mit Bezug auf Fig. 1)

Erstes saugfähiges Element (10) - ein Endteil, der aus einem 6 mm · 6 mm-Stück inaktivierter Nitrocellulose-Membran (12) bestand, und ein Einfangkissen, das aus einem 6 mm · 10 mm-Stück aus immobilisiertem Anti-Fluorescein (14) bestand, wurden auf einen 3 mil-Acetatfilm (16) so laminiert, daß sich die beiden Abschnitte um 1 mm überlappten.
Absorbierendes Element (18) - ein 12 mm · 50 mm-Streifen Blotting-Papier.
Zweites saugfähiges Element (20) (Streifen zur quantitativen Bestimmung) - ein 6 mm · 90 mm-Streifen aus immobilisiertem Anti- Digoxin.
Während des Assays wurde das erste saugfähige Element zuerst in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung (Überlappung 1 mm) mit dem absorbierenden Element gebracht (nachstehend als Proben- Aufnahmeschritt bezeichnet) und dann mit dem zweiten saugfähigen Element in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung gebracht (nachstehend als Schritt zur quantitativen Bestimmung bezeichnet).

Assay-Protokoll

Der Assay wurde in zwei Schritten durchgeführt - einem Proben- Aufnahmeschritt und einem Schritt zur quantitativen Bestimmung. Bei dem Proben-Aufnahmeschritt wurden Probe (100 ul) und Fluoresceinmarkiertes Anti-Digoxin 2H6 (1,25 ug/ml, 50 ul) auf dem Boden eines 16 · 100 mm-Teströhrchens abgesetzt und gemischt. Ein Endteil des ersten saugfähigen Elements einer Assay-Vorrichtung, wie derjenigen, die in Fig. 1 dargestellt ist, wurde in das Teströhrchen gegeben, und man ließ die Flüssigkeit entlang dem ersten saugfähigen Element und in das absorbierende Element hinaufsteigen. Nachdem alle Flüssigkeit durch die Vorrichtung aufgenommen worden war, wurde der Kontakt zwischen dem absorbierenden und dem ersten saugfähigen Element beendet. Für den Schritt der quantitativen Bestimmung wurde der Streifen zur quantitativen Bestimmung mit dem oberen Rand des Einfangkissens in Kontakt gebracht. Der Endteil des ersten saugfähigen Elements der Assayvorrichtung wurde dann in ein Teströhrchen gegeben, das Digoxin-markierte HRP (250 ng/ml, 100 ul) enthielt, und man ließ Flüssigkeit durch das Einfangkissen in den Streifen zur quantitativen Bestimmung hineinwandern, bis der Streifen zur quantitativen Bestimmung mit Flüssigkeit gefüllt war. Der Streifen zur quantitativen Bestimmung wurde dann aus der Vorrichtung entfernt und in eine Entwicklerlösung gegeben (die 0,5 mg/ml Dicarboxidin, 10 mM Wasserstoffperoxid in 100 mM Natriumcitrat, pH 5,0, enthielt), bis sich eine blaue Farbe auf einem Teil des Streifens zur quantitativen Bestimmung entwickelt hatte. Die Länge (Wanderungshöhe) der blauen Fläche wurde gemessen und mit der Konzentration an Digoxin in der Probe in Beziehung gesetzt.

Assay-Ergebnisse

Eine Reihe von Assays wurde unter Verwendung von Serumproben durchgeführt, die bekannte Konzentrationen an Digoxin enthielten (Säulen-Digoxin-Kalibratoren, Syva Company). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

TABELLE 1

Digoxin-Konzentration Wanderungshöhe
(ng/ml) (mm)
0 20
0,5 24
1 29
2 39
Digoxin-Konzentration Wanderungshöhe
(ng/ml) (mm)
3 48
4 55.
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß unter Verwendung des Verfahrens und der Vorrichtungen in der vorliegenden Erfindung ein genauer und empfindlicher Assay für Digoxin durchgeführt werden kann. Zunehmende Konzentrationen an Digoxin haben eine größere Wanderungshöhe zur Folge, die auf dem Streifen zur quantitativen Bestimmung beobachtet wird.

BEISPIEL 2

Messung der Konzentration von Digoxin-markierter HRP

Unter Verwendung der oben in Beispiel 1 beschriebenen Vorrichtungen wurden 100 ul einer 400 mg/ml-Lösung von Fluoresceinmarkiertem Anti-Digoxin mittels Kapillarwirkung durch das erste saugfähige Element in das Absorbens geführt. Lösungen von Digoxinmarkierter HRP mit variierenden Konzentrationen wurden mit dieser Vorrichtung analysiert, indem man sie mittels Kapillarwirkung durch das erste saugfähige Element in das zweite saugfähige Element wandern ließ. Die Wanderungsstrecken waren eine Funktion der Konzentration der Digoxin-markierten HRP, wie in der folgenden Tabelle gezeigt (Tabelle 2).

TABELLE 2

Konzentration von Digoxin-markierter HRP Wanderungsstrecke
(ng/ml) (mm)
100 0
150 7
200 14
250 18
300 23

BEISPIEL 3

Messung der Konzentration von Fluorescein-markiertem Anti-Digoxin

Unter Verwendung der in Beispiel 1 oben beschriebenen Vorrichtungen wurden 120 ul von Lösungen von Fluorescein-markiertem Anti-Digoxin mit variierenden Konzentrationen mittels Kapillarwirkung durch das erste saugfähige Element in das Absorbens geführt. Die Analysen wurden beendet, indem man Lösungen von 275 ng/ml Digoxinmarkierter HRP mittels Kapillarwirkung durch das erste saugfähige Element in das zweite saugfähige Element wandern ließ. Die Wanderungsstrecken waren eine Funktion der Fluorescein-markierten Anti-Digoxin-Konzentrationen, wie in der folgenden Tabelle angegeben (Tabelle 3).

TABELLE 3

Konzentration von Fluorescein-markiertem Anti-Digoxin Wanderungsstrecke
(ng/ml) (mm)
660 35
1000 10

BEISPIEL 4

Messen einer Magnesiumchlorid-Konzentration

Es werden gemäß Fig. 1 Vorrichtungen hergestellt, bei denen die zweiten saugfähigen Elemente Stücke (0,5 · 10 cm) aus unbehandelter Nitrocellulose-Membran sind (12 um Porengröße). Das erste saugfähige Element (0,5 · 1,0 cm) wird durch aufeinanderfolgende Behandlung von Whatman IC-Chromatographiepapier mit Carbonyldiimidazol (R.F. Zuk, V.K. Ginsberg, T. Houts et al. (1986) Clin. Chem., 31 : 1144-1150), Ethylendiamin und dem Anhydrid von Diethylentriaminpentaessigsäure in Methylenchlorid hergestellt. Die Elemente werden getrocknet, wiederholt mit Wasser gewaschen und nochmals getrocknet.
Unter Verwendung dieser Vorrichtungen werden mittels Kapillarwirkung Lösungen mit verschiedenen Magnesiumchlorid- Konzentrationen durch das erste saugfähige Element in das zweite saugfähige Element geführt. Das Magnesiumion wird durch die chelatisierende Gruppe auf dem ersten saugfähigen Element aufgenommen. Die Magnesiumchlorid-haltigen Zonen auf dem zweiten saugfähigen Element werden durch Besprühen der Streifen mit einer verdünnten, bei pH 9 gepufferten Lösung von Eriochrome Black T sichtbar gemacht. Die Wanderungsstrecken sind eine Funktion der Mangesiumchlorid-Konzentration.

BEISPIEL 5

Messung einer Natriumiodat-Konzentration

Das erste saugfähige Element von Vorrichtungen, die denjenigen des vorangehenden Beispiels ähnlich waren, wird mit überschüssigem wäßrigen Eisen(II)chlorid behandelt und dann gewaschen und getrocknet. Wäßrige Lösungen von Natriumiodat mit verschiedenen Konzentrationen werden mittels Kapillarwirkung durch das erste saugfähige Element in das zweite saugfähige Element geführt. Natriumiodat wird durch das chelatisierte Eisen(II)ion zu Natriumiodid reduziert. Nachdem das zweite saugfähige Element mit Flüssigkeit gefüllt ist, werden die nicht-reduzierten Natriumiodathaltigen Zonen durch Inkontaktbringen des zweiten saugfähigen Elements mit einer Entwicklerlösung sichtbar gemacht, die Stärke und Natriumiodid enthält. Die Wanderungsstrecken sind eine Funktion der Natriumiodat-Konzentration.

BEISPIEL 6

Messung einer Eisen (II)chlorid-Konzentration

Unter Verwendung von Vorrichtungen, die den in Beispiel 4 beschriebenen ähnlich sind, werden 50 ul von wäßrige Eisen(II)chlorid-Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen mittels Kapillarwirkung durch das erste saugfähige Element in die absorbierenden Streifen geführt. Man läßt dann Lösungen von 0,10 mM Natriumiodat mittels Kapillarwirkung durch das erste saugfähige Element in das zweite saugfähige Element wandern. Die Zone auf dem zweiten saugfähigen Element, die unreduziertes Natriumiodat enthält, wird wie im vorangehenden Beispiel sichtbar gemacht. Die Wanderungsstrecken sind eine Funktion der Eisen(II)chlorid-Konzentration.

BEISPIEL 7

Alternatives Verfahren zur Messung einer Eisen(II)chlorid-Konzentration

Das oben in Beispiel 6 beschriebene Verfahren zur Messung einer Eisen(II)chlorid-Konzentration wird befolgt, außer daß 5 ul-Proben der wäßrigen Eisen(II)chlorid-Lösung direkt auf das erste saugfähige Element aufgetragen werden, anstatt sie durch das erste saugfähige Element wandern zu lassen. Die Wanderungsstrecken sind eine Funktion der Eisen(II) chlorid-Konzentration.

Claims

1. Verfahren zur Durchführung eines Assays für einen Analyten, welches umfaßt:

das Veranlassen, daß ein Reagens in einem ersten flüssigen Medium in Beziehung zu der Anwesenheit oder Menge an Analyt nicht-diffundierbar an eine Zone eines ersten saugfähigen Elements gebunden wird, indem man die Zone des ersten saugfähigen Elements mit dem Medium unter Bedingungen in Kontakt bringt, bei denen das erste Medium mittels Kapillarwirkung die Zone des ersten saugfähigen Elements durchfließt oder durchwandert;

das Verursachen, daß eine Komponente in einem zweiten flüssigen Medium in Beziehung zu der Anwesenheit des Analyten in dem ersten Medium durch eine Zone eines zweiten saugfähigen Elements absorbiert wird, indem man einen Teil des ersten saugfähigen Elements unter Bedingungen, bei denen das zweite Medium die Zone des ersten saugfähigen Elements und mindestens einen Teil der Zone des zweiten saugfähigen Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert, mit dem zweiten Medium in Kontakt bringt; wobei die Zone des zweiten saugfähigen Elements von anderer Zusammensetzung als die Zone des ersten saugfähigen Elements ist; und

das Bestimmen der Strecke, welche die Komponente die Zone des zweiten saugfähigen Elements durchwandert, um die Menge des Analyten zu bestimmen, oder das Bestimmen der Anwesenheit der Komponente auf mindestens einem Teil des zweiten saugfähigen Elements, um die Anwesenheit des Analyten zu bestimmen, mit der Maßgabe, daß, wenn nur die Anwesenheit des Analyten bestimmt wird, die Zone des ersten saugfähigen Elements veranlaßt wird, in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit der Zone des zweiten saugfähigen Elements zu kommen, nachdem das Reagens veranlaßt worden ist, an das erste saugfähige Element gebunden zu werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Zone des ersten saugfähigen Elements und die Zone des zweiten saugfähigen Elements vor dem Inkontaktbringen der Zone des ersten saugfähigen Elements mit dem zweiten Medium in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung gebracht werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, in dem ein Bindungspartner, der das Reagens binden kann, nicht-diffundierbar an mindestens einen Teil der Zone des ersten saugfähigen Elements gebunden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Komponente als Antwort auf die Anwesenheit des Analyten in dem ersten Medium an die Zone des zweiten saugfähigen Elements gebunden wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, in dem sich das Reagens und der Analyt verbinden, um einen Komplex zu bilden, und der Komplex an die Zone des ersten saugfähigen Elements gebunden wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, in dem ein Bindungspartner für die Komponente nicht-diffundierbar an die Zone des zweiten saugfähigen Elements gebunden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der Analyt ein sbp- Mitglied ist.

8. Verfahren zur Durchführung eines Assays für die Bestimmung einer Komponente oder eines Reagens, umfassend:

das Bereitstellen in Kombination einer ersten Zone eines saugfähigen Elements ("erste Zone") und einer Flüssigkeit und eines flüssigen Mediums, das eine Komponente enthält, wobei die erste Zone nicht-diffundierbar daran gebunden ein Reagens aufweist, das mit der Komponente unter Bedingungen reaktiv ist, bei denen das flüssige Medium und mindestens ein Teil der darin enthaltenen Komponente die ganze erste Zone durchwandern und mittels Kapillarwirkung in eine zweite Zone eines saugfähigen Elements ("zweite Zone") wandern, die von anderer Zusammensetzung als die erste Zone ist und die Komponente nicht spezifisch binden kann, außer wenn die Komponente zu der Anwesenheit oder Menge eines Analyten in Beziehung steht, in welchem Fall das Verfahren weiter das Veranlassen umfaßt, daß das Reagens in Beziehung zu der Menge an anwesendem Analyt an die erste Zone gebunden wird, und

das Bestimmen der Strecke, welche die Komponente in die zweite Zone hineingewandert ist, oder des Unterschieds in den Strecken, welche das Medium und die Komponente in die zweite Zone hineingewandert sind, wobei die Strecke oder der Unterschied zu der Menge der Komponente in dem flüssigen Medium oder der Menge des Reagens in Beziehung stehen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, in dem vor der Kombination das Reagens veranlaßt wird, sich nicht-diffundierbar an die erste Zone zu binden, indem man die erste Zone mit einer Lösung in Kontakt bringt, die das Reagens enthält, und der Unterschied oder die Strecke zu der Menge des Reagens in Beziehung steht.

10. Verfahren nach Anspruch 9, in dem die Menge des Reagens zu der Menge an Analyt in der Lösung des Reagens in Beziehung steht.

11. Verfahren nach Anspruch 8, in dem die erste Zone und die zweite Zone als Einheit mit einem einzigen saugfähigen Element vorliegen.

12. Verfahren nach Anspruch 8, in dem die erste Zone als Einheit mit einem ersten saugfähigen Element vorliegt und die zweite Zone als Einheit mit einem zweiten saugfähigen Element vorliegt und die erste Zone während des Assays und vor der Bereitstellung der Kombination in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit der zweiten Zone gebracht wird.

13. Verfahren nach Anspruch 8, in dem die Komponente und das Reagens jeweils ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares sind.

14. Verfahren nach Anspruch 8, in dem das Bestimmen der Strecke, die die Komponente in die zweite Zone hineingewandert ist, eine Oxidations-Reduktions-Reaktion beinhaltet.

15. Verfahren nach Anspruch 8, in dem die Komponente ein Enzym-markiertes Ligandenanalogon ist und das Reagens ein Antikörper gegen den Liganden ist.

16. Verfahren nach Anspruch 8, in dem der Unterschied in den Strecken, die das Medium und die Komponente in die zweite Zone hineingewandert sind, bestimmt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 8 zur Bestimmung der Menge einer Komponente oder eines Reagens in einem flüssigen Medium, umfassend:

das Inkontaktbringen einer ersten Zone eines saugfähigen Elements ("erste Zone") mit einem flüssigen Medium, das eine Komponente enthält, wobei die erste Zone nichtdiffundierbar daran gebunden ein Reagens aufweist, das mit der Komponente unter Bedingungen reagiert, bei denen das flüssige Medium und mindestens ein Teil der darin enthaltenen Komponente die ganze erste Zone durchwandern und mittels Kapillarwanderung in eine zweite Zone eines saugfähigen Elements ("zweite Zone") wandern, die von anderer Zusammensetzung als die erste Zone ist und die Komponente nicht spezifisch binden kann, und

das Messen der Strecke, die die Komponente in die zweite Zone hineingewandert ist, oder des Unterschieds in der Strecke, die das Medium und die Komponente in das zweite Medium hineingewandert sind, wobei die Strecke oder der Unterschied zu der Menge der Komponente in dem flüssigen Medium oder der Menge des Reagens in Beziehung steht.

18. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend:

das Vereinigen einer Lösung eines Analyten mit einem ersten saugfähigen Element, wobei ein Reagens, das mit dem Analyten reagieren kann, nicht-diffundierbar an das saugfähige Element gebunden ist oder wird,

das Vereinigen eines flüssigen Mediums, das eine Komponente enthält, mit dem ersten saugfähigen Element, wobei die Komponente mit dem Reagens reaktiv ist, wobei das erste saugfähige Element mit einem zweiten saugfähigen Element von anderer Zusammensetzung als das erste saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung steht oder ein Teil desselben ist, unter Bedingungen, bei denen das flüssige Medium das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des zweiten saugfähigen Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert, und

das Bestimmen einer Grenze auf dem zweiten saugfähigen Element, wobei die Lage der Grenze zu der Menge an Analyt in der Lösung oder der Menge an Reagens auf dem ersten saugfähigen Element in Beziehung steht.

19. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend:

das Bereitstellen (1) eines ersten saugfähigen Elements und (2) eines Analyten in Kombination in einem ersten flüssigen Medium, wobei in dem Medium oder auf dem ersten saugfähigen Element ein Reagens für den Analyten anwesend ist, wobei das erste saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element steht, unter Bedingungen, bei denen das erste Medium mittels Kapillarwirkung durch das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements fließt und der Analyt nichtdiffundierbar an das saugfähige Element gebunden wird;

das Beendigen der flüssigkeitsaufnehmenden Beziehung zwischen dem saugfähigen Element und dem absorbierenden Element;

das Bereitstellen eines Teils des ersten saugfähigen Elements und einer Komponente, die mit dem Reagens reaktiv ist, in Kombination in einem zweiten flüssigen Medium, wobei das erste saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Element steht, unter Bedingungen, bei denen das zweite Medium das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des zweiten saugfähigen Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert, mit der Maßgabe, daß das erste saugfähige Element zu wesentlich verschiedenen Zeiten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem zweiten saugfähigen Element steht; und

das Bestimmen einer Grenze auf dem zweiten saugfähigen Element, wobei die Lage der Grenze zu der Menge an Analyt in dem erste Medium oder der Menge an Reagens oder der Menge der Komponente in dem zweiten flüssigen Medium in Beziehung steht.

20. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend:

das Bereitstellen (1) eines ersten saugfähigen Elements, wobei mindestens ein Teil desselben ein erstes Reagens nicht-diffundierbar daran gebunden aufweist, und (2) einer Probe, von der man annimmt, daß sie einen Analyten enthält, in Kombination in einem ersten flüssigen Medium, mit der Maßgabe, daß, wenn der Analyt sich nicht an das erste Reagens binden kann, ein zweites Reagens, das sich an den Analyten und das erste Reagens binden kann, in dem Medium oder auf dem ersten saugfähigen Element anwesend ist, wobei das erste saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element steht, unter Bedingungen, bei denen das erste Medium das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert;

das Bringen des ersten saugfähigen Elements in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Element;

das Bereitstellen eines Teils des ersten saugfähigen Elements und einer Komponente in Kombination in einem zweiten wäßrigen Medium, wobei die Komponente sich in Beziehung zu der Anwesenheit des Analyten in dem ersten Medium an das erste Reagens binden kann, wobei das zweite saugfähige Element nicht-diffundierbar und gleichförmig an mindestens einen Teil desselben einen spezifischen Bindungspartner für die Komponente gebunden aufweist, unter Bedingungen, bei denen das zweite Medium mindestens einen Teil des ersten saugfähigen Elements und mindestens einen Teil des zweiten saugfähigen Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert; und

das Bestimmen der Anwesenheit der Komponente auf dem zweiten saugfähigen Element, wobei die Anwesenheit desselben zu der Anwesenheit des Analyten in der Probe in Beziehung steht, oder das Bestimmen der Strecke der Wanderung der Komponente auf dem zweiten saugfähigen Element, wobei die Strecke zu der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung steht.

21. Verfahren nach Anspruch 20, in dem die flüssigkeitsaufnehmende Beziehung zwischen dem ersten saugfähigen Element und dem absorbierenden Element vor dem Inkontaktbringen des zweiten saugfähigen Elements mit dem zweiten Medium beendet wird.

22. Verfahren nach Anspruch 20, in dem das zweite saugfähige Element ein Immunchromatograph ist und die Komponente ein Enzym einschließt und die Menge der Komponente, die an das immunchromatographische Element gebunden wird, durch die Lage einer Grenze auf dem immunchromatographischen Element bestimmt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 20, in dem der Analyt ein(e) Arzneistoff/Droge ist, vorzugsweise worin der Arzneistoff/die Droge Digoxin ist.

24. Verfahren nach Anspruch 20, in dem die Komponente den an einen Marker gebundenen Analyten umfaßt, wobei der Marker vorzugsweise ein Enzym ist.

25. Verfahren nach Anspruch 20, in dem der spezifische Bindungspartner für die Komponente ein Antikörper ist.

26. Verfahren nach Anspruch 20, in dem das erste Reagens ein Analytenanalogon ist und das zweite Reagens ein Antikörper gegen den Analyten ist.

27. Verfahren nach Anspruch 20, in dem die Komponente einen Antikörper gegen das an einen Marker gebundene erste Reagens umfaßt, wobei der Marker vorzugsweise ein Enzym ist.

28. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend:

das Bereitstellen (1) eines Teils eines saugfähigen Elements, wobei mindestens an einen Teil desselben ein Mitglied eines ersten spezifischen Bindungspaares (sbp) nicht-diffundierbar gebunden ist, und (2) einer Probe, von der man annimmt, daß sie einen Analyten enthält, in Kombination in einem ersten wäßrigen Medium, wobei ein Konjugat, umfassend ein zweites sbp-Mitglied, das den Analyten binden kann, und ein drittes sbp-Mitglied, das komplementär zu dem ersten sbp-Mitglied ist, in dem Medium oder auf dem saugfähigen Element anwesend ist, wobei das saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element steht, unter Bedingungen, bei denen das erste Medium das saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert und das Konjugat nicht-diffundierbar an das saugfähige Element gebunden wird;

das Bereitstellen eines Teils des saugfähigen Elements und einer Komponente, die ein Analytenanalogon umfaßt, das an ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems gebunden ist oder daran gebunden werden kann, in Kombination in einem zweiten wäßrigen Medium, wobei das saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem immunchromatographischen Element steht, das nicht-diffundierbar daran gebunden einen Bindungspartner für die Komponente aufweist, unter Bedingungen, bei denen das zweite Medium das saugfähige Element und mindestens einen Teil des immunchromatographischen Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert, mit der Maßgabe, daß das saugfähige Element zu wesentlich verschiedenen Zeiten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem immunchromatographischen Element steht; und

das Bestimmen einer Grenze auf dem immunchromatographischen Element, wobei die Lage der Grenze zu der Menge an Analyt in dem ersten Medium in Beziehung steht.

29. Verfahren nach Anspruch 28, in dem der Analyt ein(e) Arzneistoff/Droge ist, vorzugsweise worin der Arzneistoff/die Droge Digoxin ist.

30. Verfahren nach Anspruch 28, worin das Konjugat einen Antikörper gegen den Analyten und ein Protein umfaßt.

31. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend:

das Bereitstellen (1) eines Teils eines saugfähigen Elements, an das nicht-diffundierbar ein Analytenanalogon gebunden ist, und (2) einer Probe, von der man annimmt, daß sie einen Analyten enthält, in Kombination in einem ersten wäßrigen Medium, wobei ein Reagens, das den Analyten binden kann, in dem Medium oder auf dem saugfähigen Element anwesend ist, wobei das saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element steht, unter Bedingungen, bei denen das erste Medium das saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert und das Reagens in inverser Beziehung zu der Menge des Analyten in dem ersten Medium nicht-diffundierbar an das saugfähige Element gebunden wird;

das Bereitstellen eines Teils des saugfähigen Elements und einer Komponente in Kombination in einem zweiten wäßrigen Medium, wobei die Komponente an ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems gebunden ist oder daran gebunden werden kann und sich an das Reagens binden kann, wenn das Reagens nicht-diffundierbar an das saugfähige Element gebunden ist, wobei das saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem immunchromatographischen Element steht, das nichtdiffundierbar daran gebunden einen spezifischen Bindungspartner für die Komponente aufweist, unter Bedingungen, bei denen das zweite Medium das saugfähige Element und mindestens einen Teil des immunchromatographischen Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert, mit der Maßgabe, daß das saugfähige Element zu wesentlich verschiedenen Zeiten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem immunchromatographischen Element steht; und

32. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend:

das Bereitstellen (1) eines Teils eines saugfähigen Elements, an das nicht-diffundierbar ein Antikörper gegen den Analyten gebunden ist, und (2) einer Probe, von der man annimmt, daß sie einen Analyten enthält, in Kombination in einem ersten wäßrigen Medium, wobei das saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element steht, unter Bedingungen, bei denen das erste Medium das saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert;

das Bereitstellen eines Teils des saugfähigen Elements und einer Komponente in Kombination in einem zweiten wäßrigen Medium, wobei die Komponente an ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems gebunden ist oder daran gebunden werden kann und sich an den Antikörper gegen den Analyten binden kann, wobei das saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem immunchromatographischen Element steht, das nicht-diffundierbar daran gebunden einen spezifischen Bindungspartner für die Komponente aufweist, unter Bedingungen, bei denen das zweite Medium das saugfähige Element und mindestens einen Teil des immunchromatographischen Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert, mit der Maßgabe, daß das saugfähige Element zu wesentlich verschiedenen Zeiten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem immunchromatographischen Element steht; und

33. Verfahren nach Anspruch 1 zur Durchführung eines Assays für Digoxin, umfassend:

das Inkontaktbringen eines Endteils eines saugfähigen Streifens, der eine Zone distal von dem Endteil aufweist, wobei die Zone einen Antikörper (Ab&sub1;) gegen ein organisches Molekül mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500 nicht-diffundierbar daran gebunden aufweist, mit einem ersten wäßrigen Medium, das eine Probe enthält, von der man annimmt, daß sie Digoxin enthält, wobei ein Konjugat, das einen Antikörper gegen an das organische Molekül gebundenes Digoxin umfaßt, in dem ersten Medium oder auf dem saugfähigen Streifen anwesend ist, unter Bedingungen, bei denen das erste Medium den saugfähigen Streifen und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert und das Konjugat nicht-diffundierbar an den Ab&sub1; gebunden wird und Digoxin, falls anwesend, an das Konjugat gebunden wird;

das Beendigen der flüssigkeitsaufnehmenden Beziehung zwischen dem saugfähigen Element und dem aborbierenden Element;

das Bereitstellen des Endteils des saugfähigen Streifens und einer Komponente, die an ein Enzym gebundenes Digoxin-Analogon umfaßt, in Kombination in einem zweiten wäßrigen Medium, wobei der saugfähige Streifen in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem immunchromatographischen Streifen steht, der nicht-diffundierbar daran gebunden einen Antikörper gegen Digoxin aufweist, unter Bedingungen, bei denen das zweite Medium den saugfähigen Streifen und mindestens einen Teil des immunchromatographischen Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert, mit der Maßgabe, daß der Streifen zu wesentlich verschiedenen Zeiten in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem absorbierenden Element und dem immunchromatographischen Streifen steht; und

das Bestimmen einer Grenze auf dem immunchromatographischen Streifen, wobei die Lage der Grenze in Beziehung zu der Menge an Analyt in der Probe steht.

34. Vorrichtung zur Analyse auf die Anwesenheit eines Analyten, umfassend:

(a) ein erstes saugfähiges Element, wobei mindestens

ein Teil desselben ein erstes Mitglied eines spezifischen Bindungspaares aufweist, das den Analyten oder ein Reagens in Beziehung zu dem Analyten binden kann,

(b) ein absorbierendes Element in beendbarer flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem ersten saugfähigen Element,

(c) ein zweites saugfähiges Element, von dem mindestens ein Teil daran gebunden ein zweites Mitglied eines spezifischen Bindungspaares aufweist, das den Analyten oder das Reagens binden kann, wobei das zweite saugfähige Element angepaßt ist, um eine flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit dem ersten saugfähigen Element aufzunehmen, und

(d) Mittel zum Beendigen der flüssigkeitsaufnehmenden Beziehung zwischen dem ersten saugfähigen Element und dem absorbierenden Element und Aufnehmen einer flüssigkeitsaufnehmenden Beziehung zwischen dem ersten saugfähigen Element und dem zweiten saugfähigen Element.

35. Vorrichtung nach Anspruch 34, in der das zweite saugfähige Element ein Immunchromatograph ist.

36. Testsatz zur Durchführung eines Assays, der in abgepackter Kombination die Vorrichtung mit den Reagenzien zur Durchführung eines Assays von Anspruch 34 oder 35 umfaßt.

37. Verfahren zur Durchführung eines Assays für einen Analyten, umfassend:

das Veranlassen, daß ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares (sbp) in einem ersten wäßrigen Medium an ein erstes saugfähiges Element gebunden wird, indem man einen Teil des ersten saugfähigen Elements mit dem Medium in Kontakt bringt, wobei das erste saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit einem absorbierenden Element steht, unter Bedingungen, bei denen das erste Medium das erste saugfähige Element und mindestens einen Teil des absorbierenden Elements mittels Kapillarwirkung durchwandert;

das Veranlassen, daß das erste saugfähige Element in flüssigkeitsaufnehmende Beziehung mit einem zweiten saugfähigen Element kommt;

das Veranlassen, daß eine Komponente in einem zweiten wäßrigen Medium in Beziehung zu der Anwesenheit des Analyten in dem ersten Medium durch das zweite saugfähige Element absorbiert wird, indem man einen Teil des ersten saugfähigen Elements mit dem zweiten wäßrigen Medium unter Bedingungen in Kontakt bringt, bei denen das zweite wäßrige Medium das erste saugfähige Element mittels Kapillarwirkung und mindestens einen Teil des zweiten saugfähigen Elements durchwandert, wobei der Teil des zweiten saugfähigen Elements von anderer Zusammensetzung ist als der Teil des ersten saugfähigen Elements; und

das Bestimmen der Anwesenheit der Komponente auf mindestens einem Teil des zweiten saugfähigen Elements.