DE3887941T2

DE3887941T2 - Testvorrichtung mit mehrfachen Öffnungen.

Info

Publication number: DE3887941T2
Application number: DE3887941T
Authority: DE
Inventors: Martin Becker; Geoffrey A Dafforn; Nurith Kurn; Edwin F Ullman
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1987-09-04
Filing date: 1988-09-02
Publication date: 1994-09-01
Anticipated expiration: 2008-09-03
Also published as: ES2051303T5; EP0306336B1; ES2051303T3; EP0306336A2; EP0306336A3; US4981786A; DE3887941T3; CA1333046C; DE3887941D1; JP2907339B2; EP0306336B2; JPS6472066A

Description

Diese Erfindung betrifft Vorrichtungen zur Durchführung von Assays. Die Fähigkeit, in Assays für die Anwesenheit einer interessierenden Verbindung Rezeptoren zu verwenden, die auf spezielle Verbindungen gerichtet sind, hat ein blühendes Geschäft mit diagnostischen Assays hervorgerufen. Im Lauf der Jahre sind zahlreiche vereinfachte Testsysteme für den schnellen Nachweis von interessierenden Materialien in biologischen und industriellen Flüssigkeiten entwickelt worden. Diese Systeme oder Vorrichtungen beinhalten in ihrer einfachsten Form gewöhnlich die Kombination eines Testreagenz, das speziell mit dem interessierenden Material reagieren kann, um eine visuelle Antwort zu ergeben, und einen saugfähigen Träger für das Testreagenz. Papier ist das am häufigsten verwendete Material für den Träger. Ein Teil des Trägers wird gewöhnlich mit einem oder mehreren der Testreagenzien imprägniert oder beschichtet. Der Teil des Trägers, der die Testreagenzien enthält, wird mit der Probe, die das interessierende Material enthält, in Kontakt gebracht. Der Kontakt kann durch Eintauchen des Teils des Trägers mit den Testreagenzien in die Probe in einem wäßrigen Medium bewerkstelligt werden, oder man kann die wäßrige Probe einen saugfähigen Träger durch Kapillarwanderung durch den Teil des Trägers, der das Testreagenz enthält, durchwandern lassen. Die Testzone kann zuerst auf dem Träger geschaffen werden, oder die Zone kann während der Durchführung des Assays erzeugt werden.
Ein konzentrierendes Zonenverfahren in heterogenen Assays hat breite Anwendung gefunden. Das Verfahren verwendet eine Vorrichtung, die eine immunsorbierende Zone aufweist, an der ein spezifisches Bindungspaarmitglied nicht-diffundierbar angebracht ist. Die immunsorbierende Zone dient als Eintritt für die Probe und Reagenzlösungen. In entweder direkter oder indirekter Flüssigkeits-aufnehmender Beziehung mit der immunsorbierenden Zone steht eine flüssigkeitsabsorbierende Zone, die dazu dient, Flüssigkeit durch die immunsorbierende Zone zu ziehen, Flüssigkeit zu speichern, und sie kann dazu dienen, die Geschwindigkeit, mit der die Flüssigkeit durch die immunsorbierende Zone gezogen wird, zu steuern. In Verbindung mit der Vorrichtung wird in dem Verfahren ein signalerzeugendes System verwendet, das ein Signalmarker-Mitglied an ein spezifisches Bindungspaar konjugiert aufweist. Die immunsorbierende Zone kann ein oder mehrere Mitglieder des signalerzeugenden Systems umfassen, die auf eine Weise an die Zone gebunden sind, daß eine diffundierende Bewegung der Komponente des signalerzeugenden Systems gestattet oder verhindert wird. Gemäß dem Verfahrensprotokoll steht die Menge an Signalmarker, die in der Nachweiszone in der immunsorbierenden Zone gebunden wird, mit der Menge an interessierendem Material in der Probe in Beziehung. In dem Verfahren wird die Assayvorrichtung mit flüssiger Probe in Kontakt gebracht, an die eine oder mehrere Komponenten des signalerzeugenden Systems addiert worden sein können. Die Vorrichtung kann anschließend mit einer oder mehreren Lösungen in Kontakt gebracht werden, die verbleibende Komponenten des signalerzeugenden Systems enthalten und dazu dienen, die immunsorbierende Zone frei von nicht-spezifisch gebundenem Signalmarker zu waschen. Das signalerzeugende System sorgt für ein nachweisbares Signal in der immunsorbierenden Zone, das mit einem Signalpegel verglichen werden kann, der auf einem Standard mit einer bekannten Menge an Analyt beruht.
Die konzentrierende Zonenverfahren-Technologie ist in einer Anzahl von kommerziellen Produkten, wie beispielsweise der ICON®- Vorrichtung (Hybritech Corporation), der TESTPACK®-Vorrichtung (Abbott Laboratories) und der SUDS -Vorrichtung (Murex Corporation), angewendet worden. Ein Problem bei den bekannten Vorrichtungen besteht darin, daß die Probenlösung und Wasch- und Reagenzlösungen im allgemeinen durch die gleiche Eingangsöffnung zugegeben werden, und Teile der Vorrichtung, die mit diesen Lösungen befeuchtet sind, kontaminieren sofort anschließend hinzugefügte Wasch- oder Reagenzlösungen.
Eine Kapillartransport-Technik zur Durchführung von qualitativen und/oder quantitativen Assays für einen Analyten sind ebenfalls bekannt. Der Assay beinhaltet das Inkontaktbringen eines Teils eines saugfähigen Materials mit einem flüssigen Medium, das den Analyten und gegebenenfalls andere Mitglieder eines signalerzeugenden Systems enthält, welches ein markiertes spezifisches Bindungspaar einschließt. Das saugfähige Material enthält gewöhnlich eine oder mehrere Zonen zur spezifischen Bindung des Analyten. Das saugfähige Material kann auch ein oder mehrere Mitglieder eines signalerzeugenden Systems auf seiner Oberfläche aufweisen. Man läßt das flüssige Medium das saugfähige Material durch Kapillarwirkung durchwandern, und das saugfähige Material wird mit verbleibenden Mitgliedern des signalerzeugenden Systems in Kontakt gebracht. Die Anwesenheit von Analyt in einer Probe kann durch Überprüfen des saugfähigen Materials auf ein Signal in der geeigneten Zone bestimmt werden, und die Menge an Analyt kann durch Inbeziehungsetzen der Lage einer Grenze zwischen Signal und Nicht-Signal in einer Zone zu der Menge an Analyt in der Probe oder durch Zählen der Anzahl der Zonen, die ein Signal aufweisen oder nicht, und Inbeziehungsetzen der Zahl der Zonen zu der Menge an Analyt in der Probe bestimmt werden. Beispielhaft für eine Kapillartransport- Technik gemäß dem ersten obigen Vorgehen ist ein Kapillar-Immunchromatographie-Produkt, das als Acculevel® (Syva Company) bekannt ist.
Es ist wünschenswert, eine Immunassayvorrichtung bereitzustellen, die eine breite Anwendung auf heterogene Assays findet. Die Vorrichtung sollte einfach, schnell, genau und sicher von untrainiertem Personal in Umgebungen außerhalb von anspruchsvollen Laboreinrichtungen durchführbar sein. Es ist auch wünschenswert, eine diagnostische Vorrichtung zur Durchführung von derartigen Assays bereitzustellen, in der die Kontamination von verschiedenen Reagenzien während ihrer Zugabe zu der im Assay verwendeten Vorrichtung vermieden wird. Eine derartige Vorrichtung wäre bequem und wirksam.
DE-C-3 445 816 betrifft eine diagnostische Hilfe, die einen saugfähigen Streifen verwendet, der dehydratisierte Reagenzien darauf aufweist.
Ein konzentrierendes Zonenverfahren in heterogenen Immunassays wird im US-Patent Nr. 4,366,241 beschrieben. Eine Testvorrichtung zum Nachweis geringer Konzentrationen von Substanzen in Flüssigkeiten ist im US-Patent Nr. 3,811,840 beschrieben. Ein verbessertes heterogenes Immunassayverfahren und -system wird in der veröffentlichten europäischen Anmeldung Nr. 0141547 besprochen. Das US-Patent Nr. 4,517,288 offenbart ein Festphasensystem für einen Ligandenassay. Ein integriertes Material zur chemischen Analyse und ein Verfahren zur Verwendung desselben wird im US-Patent Nr. 4,270,920 besprochen. Die Leistung von chemischen Routinereaktionen in Behältern mit Abteilen wird im US-Patent Nr. 3,825,410 besprochen. Eine Immundiffusionsplatten-Apparatur wird im US-Patent Nr. 3,645,687 beschrieben. Die Leistung von chemischen oder biologischen Reaktionen innerhalb eines Kissens mit absorbierender Matrix wird im US-Patent Nr. 3,888,629 besprochen. Eine Testvorrichtung zum Testen von flüssigen Proben auf die Anwesenheit eines vorbestimmten Reagenz wird im US-Patent Nr. 4,246,339 beschrieben. Ein immobilisierter Antikörper oder ein immobilisiertes Antigen für einen Immunassay ist im US-Patent Nr. 4,407,943 offenbart. Das US-Patent Nr. 3,915,647 offenbart eine Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration einer Substanz in einer Flüssigkeit. Das US-Patent Nr. 4,632,901 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung für Immunassays. Die PCT-Anmeldung, Veröffentlichungs-Nr. W086/06488, beschreibt eine diagnostische Vorrichtung mit einer Mehrzahl von zerbrechbaren Behältern.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die hierin beschriebene Erfindung ist eine Vorrichtung zur Durchführung eines Assays. Die Vorrichtung umfaßt ein Gehäuse, Einfangmittel [Festhaltemittel], die im Gehäuse eingeschlossen sind, zum Einfangen [Festhalten] eines ersten Mitglieds eines spezifischen Bindungspaars (sbp) in einer Zone und zum Gestatten, daß Flüssigkeit durch Kapillarwirkung von der Zone wegtransportiert wird. Die Reagenzien sind diejenigen, die zur Durchführung eines Assays bei der Bestimmung eines Analyten in einer Probe verwendet werden. Das Gehäuse ist auch mit einer ersten Einlaßvorrichtung [ersten Einlaßmitteln] zur Einführung einer Probe in die Vorrichtung und einer zweiten Einlaßvorrichtung [zweiten Einlaßmitteln], die von der ersten Einlaßvorrichtung verschieden ist, zur Einführung eines flüssigen Reagenz, das von der Probe verschieden ist, in die Vorrichtung versehen, ohne daß auch das flüssige Reagenz durch die erste Einlaßvorrichtung eingeführt wird. Ein Teil des Einfangmittels steht in einer Flüssigkeits-aufnehmenden Beziehung mit der ersten und zweiten Einlaßvorrichtung. Die Vorrichtung der Erfindung findet in Assayverfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe Verwendung, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält. Die Erfindung schließt ferner Kits zur Durchführung eines Assays ein. Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist ein kompaktes System, das für ein bequemes Testen einer Vielfalt von Analyten vor Ort gebaut ist.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 ist eine perspektivische Draufsicht, die leicht von der Seite einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung genommen ist.
Fig. 1A ist eine Explosionsdarstellung der Vorrichtung von Fig. 1.
Fig. 2 ist eine Draufsicht von oben der Vorrichtung von Fig. 1.
Fig. 3 ist eine Querschnittsansicht der oberen Hälfte der Vorrichtung von Fig. 1, entlang den Linien 3-3 genommen.
Fig. 4 ist eine Draufsicht der unteren Hälfte der Vorrichtung von Fig. 1.
Fig. 5 ist eine Querschnittsansicht der Vorrichtung von Fig. 1, entlang den Linien 5-5 genommen.
Fig. 6 ist eine Draufsicht von oben der Seite einer anderen Ausführungsform der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung.
Fig. 7 ist eine Querschnittsansicht des oberen Teils der Vorrichtung von Fig. 6, entlang den Linien 7-7 genommen.
Fig. 8 ist eine Draufsicht der unteren Hälfte der Vorrichtung von Fig. 5.
Fig. 9 ist eine Querschnittsansicht der Vorrichtung von Fig. 5, entlang der Linie 9-9 genommen.
Fig. 10 ist eine Draufsicht von oben einer anderen Ausführungsform der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung.
Fig. 11 ist eine Querschnittsansicht der oberen Hälfte der Vorrichtung von Fig. 10, entlang den Linien 11-11 genommen.
Fig. 12 ist eine Draufsicht der unteren Hälfte der Vorrichtung von Fig. 10.
Fig. 13 ist eine Querschnittsansicht der Vorrichtung von Fig. 12, entlang den Linien 13-13 genommen.
Fig. 14 ist eine Draufsicht von oben einer anderen Ausführungsform der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung.
Fig. 15 ist eine Querschnittsansicht der oberen Hälfte der Vorrichtung von Fig. 14, entlang den Linien 15-15 genommen.
Fig. 16 ist eine Draufsicht der unteren Hälfte der Vorrichtung von Fig. 14.
Fig. 17 ist eine Querschnittsansicht der Vorrichtung von Fig. 14, entlang den Linien 17-17 genommen.

BESCHREIBUNG DER SPEZIELLEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung eines Assays. Die Vorrichtung umfaßt ein Gehäuse und Einfangmittel, die in dem Gehäuse eingeschlossen sind, zum Einfangen eines ersten Mitglieds eines spezifischen Bindungspaars (sbp) in einer Zone und zum Gestatten, daß Flüssigkeit durch Kapillarwirkung von der Zone wegtransportiert wird. Das Gehäuse schließt ferner ein erste Einlaßvorrichtung zum Einführen der Probe in die Vorrichtung und eine zweite Einlaßvorrichtung zur Einführung eines flüssigen Reagenz, das von der Probe verschieden ist, in die Vorrichtung ein, welche gestattet, daß das flüssige Reagenz in die Vorrichtung eintritt, ohne es durch die erste Einlaßvorrichtung zu betreten. Ein Teil des Einfangmittels steht in Flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit der ersten und zweiten Einlaßvorrichtung. Die Vorrichtung der Erfindung findet Verwendung bei Assayverfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält. Eine oder mehrere selbst-enthaltene Reagenzien können ebenfalls in dem Gehäuse zur Durchführung eines Assayverfahrens für die Bestimmung eines Analyten in der Probe eingeschlossen sein.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung findet eine breite Anwendung. Die Vorrichtung kann in irgendeiner Anzahl von Assays verwendet werden, worin absorbierendes Material verwendet wird, um den Fluß von Flüssigkeit weg von einem Kontaktteil zu unterstützen, wo das absorbierende Material mit einem Medium in Kontakt gebracht wird, das den zu bestimmenden Analyten oder Reagenzien zum Analysieren des Analyten enthält. Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist einfach zu verwenden, wobei sie normalerweise lediglich das Einführen der Probe und anderer Reagenzien in flüssiger Form in die Vorrichtung durch die erste Einlaßvorrichtung und die zweite Einlaßvorrichtung, wie angemessen, erfordert. Die Vorrichtung kann auch zusätzliche Vorrichtungen, die von der ersten Einlaßvorrichtung und der zweiten Einlaßvorrichtung verschieden sind, zum Einführen von zusätzlichen Assayreagenzien in die Vorrichtung einschließen.
Bevor mit der Beschreibung der speziellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, wird eine Anzahl von Begriffen definiert.
Analyt - die zu messende Verbindung oder Zusammensetzung, die in der Lage ist, sich spezifisch an einen Liganden oder Rezeptor zu binden, gewöhnlich ein Antikörper oder Antigen, wie beispielsweise ein Protein oder ein(e) Arzneistoff/Droge; ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars.
Die genaue Natur von Antigenen und Arzneistoff-/Drogenanalyten zusammen mit zahlreichen Beispielen dafür ist im US-Patent Nr. 4,299,916 von Litman et al., speziell in den Spalten 16-23, und im US-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 17 und 18, offenbart.
Die Analyten sind gekennzeichnet durch das Vorliegen von einzelnen Bindungsstellen (einwertig) oder mehreren Bindungsstellen (mehrwertig). Die mehrwertigen Analyten sind normalerweise Poly(aminosäuren), d. h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren und Kombinationen davon.
Derartige Kombinationen oder Ansammlungen schließen Bakterien, Viren, Chromosomen, Gene, Mitochondrien, Zellkerne, Zellmembranen und dergleichen ein.
Eine große Vielzahl von Proteinen kann in Betracht gezogen werden, wie beispielsweise die Familie von Proteinen mit ähnlichen strukturellen Merkmalen, Proteinen mit speziellen biologischen Funktionen, insbesondere Antikörpern, Proteinen, die mit speziellen Mikroorganismen, insbesondere Krankheits-verursachenden Mikroorganismen in Beziehung stehen usw. Beispielhaft für mikrobiologische Analyten sind Lipopolysaccharide, Proteine und Nukleinsäuren aus Organismen wie beispielsweise Chlamydien, Herpes-Virus, Hepatitis- Virus (A, B oder nicht-A-nicht-B), Gonorrhoe, T. Pallidum und dergleichen.
Die folgenden sind Proteinklassen, die durch Struktur verwandt sind: Protamine, Histone, Albumine, Globuline, Skleroproteine, Phosphoproteine, Mucoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine, Nukleoproteine, Glykoproteine, Proteoglycane, unklassifizierte Proteine, z. B. Somatotrophin, Prolactin, Insulin, Pepsin.
Eine Anzahl von Proteinen, die in menschlichem Plasma gefunden wird, ist klinisch wichtig und schließt ein: Präalbumin, Albumin, α&sub1;-Lipoprotein, α&sub1;-saures Glykoprotein, α&sub1;-Antitrypsin, α&sub1;-Glykoprotein, Transcortin, 4. 6S-Postalbumin, Tryptophan-armes α&sub1;-Glykoprotein, α&sub1;-ξ-Glykoprotein, Thyroxin-bindendes Globulin, Inter-α-Trypsin-Inhibitor, Gc-Globulin, Haptoglobulin, Ceruloplasmin, Cholinesterase, α&sub2;-Lipoprotein(e), Myoglobin, C-reaktives Protein, α&sub2;-Makroglobulin, α&sub2;-HS-Glykoprotein, Zn-α&sub2;-Glykoprotein, α&sub2;-Neuraminoglykoprotein, Erythropoietin, β-Lipoprotein, Transferrin, Hämopexin, Fibrinogen, Plasminogen, β&sub2;-Glykoprotein I, β-2-Glykoprotein II und spezifisch bindende Proteine, wie Antikörper gegen mikrobische Antigene, Autoimmun-Antikörper, T-Zell- Rezeptoren, Antikörper gegen Allergene, insbesondere IgE, und dergleichen.
Komplementfaktoren und Blutgerinnungsfaktoren sind beispielhaft für Analyten. Wichtige Proteinhormone, wie beispielsweise Parathyroid-Hormon, Thyrocalcitonin, Insulin, Glucagon, Relaxin, Erythropoietin, Melanotropin, Somatotropin, Corticotropin, Thyrotropin, Follikel-stimulierendes Hormon, Luteinisierungshormon, luteomammotropisches Hormon, Gonadotropin (Choriongonadotropin); Gewebehormone, wie beispielsweise Sekretin, Gastrin, Angiotensin I und II, Bradykinin, Human-Plazentalactogen sind beispielhaft für Analyten.
Peptidhormone aus der Neurohypophyse, wie beispielsweise Oxytocin, Vasopressin, Releasing Faktoren (RF) CRF, LRF, TRF, Somatotropin-RF, GRF, FSH-RF, PIF, MIF sind beispielhaft für Analyten.
Die monoepitopen Ligandenanalyten weisen im allgemeinen ein Molekulargewicht von ungefähr 100 bis 2000, gewöhnlicher von 125 bis 1000 auf. Die interessierenden Analyten schließen Arzneimittel/Drogen, Metaboliten, Pestizide, Umweltgifte und dergleichen ein. Eingeschlossen in die interessierenden Arzneimittel/Drogen sind die Alkaloide. Unter den Alkaloiden befinden sich Morphinalkaloide, einschließlich Morphin, Kodein, Heroin, Dextromethorphan, deren Derivate und Metaboliten; Kokainalkaloide, die Kokain und Benzoylecgonin, deren Derivate und Metaboliten einschließen; Ergotalkaloide, die das Diethylamid der Lysergsäure einschließen; Steroidalkaloide; Iminazoylalkaloide; Chinazolinalkaloide, Isochinolinalkaloide; Chinolinalkaloide, die Chinin und Chinidin einschließen; Diterpenalkaloide, deren Derivate und Metaboliten.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen schließt Steroide, einschließlich der Östrogene, Estogene, Androgene, andreokortikalen Stereoide, Gallensäuren, kardiotonischen Glykoside und Aglykone, einschließlich Digoxin und Digoxigenin, Saponine und Sapogenine, deren Derivate und Metaboliten ein. Auch eingeschlossen sind die Steroid-nachahmenden Substanzen, wie z. B. Diethylstilböstrol.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Lactame mit 5 bis 6 Ringmitgliedern, die die Barbiturate, z. B. Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantonin, Primidon, Ethosuximid und deren Metaboliten einschließen.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Aminoalkylbenzole mit Alkyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, die die Amphetamine, Catecholamine, einschließlich Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin, Narcin, Papaverin, und deren Metaboliten einschließen.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Benzheterocyclen, die Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin, deren Derivate und Metaboliten einschließen, wobei die heterocyclischen Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine sind.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Purine, einschließlich Theophyllin, Koffein, deren Metaboliten und Derivate.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen schließen diejenigen ein, die von Marihuana abgeleitet sind, einschließlich Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen schließt die Vitamine ein, wie z. B. A, B, z. B. B&sub1;&sub2;, C, D, E und K, Folsäure und Thiamin.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Prostaglandine, die sich durch den Grad und die Stellen der Hydroxylierung und Unsättigung unterscheiden.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Antibiotika, die Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin, die Metaboliten und Derivate einschließen.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind die Nukleoside und Nucleotide, die ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidin mit ihren angemessenen Zucker- und Phosphatsubstituenten einschließen.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind verschiedene individuelle Arzneimittel/Drogen, die Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin, Nortriptylin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propranolol, Griseofulvin, Valpronsäure, Butyrophenone, Antihistamine, anticholinerge Arzneimittel/Drogen, wie z. B. Atropin, deren Metaboliten und Derivate einschließen.
Metaboliten, die mit Krankheitszuständen in Beziehung stehen, schließen Spermin, Galaktose, Phenylbrenztraubensäure und Porphyrin Typ 1 ein.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Aminoglykoside, wie z. B. Gentamicin, Kanamicin, Tobramycin und Amikacin.
Unter den interessierenden Pestiziden sind polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide, deren Metaboliten und Derivate.
Bei Rezeptor-Analyten liegt das Molekulargewicht gewöhnlich im Bereich von 10 000 bis 2 · 10&sup8;, gewöhnlicher von 10 000 bis 10&sup6;. Bei Immunglobulinen, IgA, IgG, IgE und IgM, variiert das Molekulargewicht im allgemeinen von ungefähr 160 000 bis ungefähr 10&sup6;. Enzyme liegen normalerweise in einem Molekulargewichtsbereich von ungefähr 10 000 bis 1 000 000. Natürliche Rezeptoren variieren in weitem Bereich, wobei sie im allgemeinen ein Molekulargewicht von mindestens ungefähr 25 000 aufweisen und ein Molekulargewicht bis 10&sup6; oder höher aufweisen können, einschließlich solcher Materialien wie Avidin, DNA, RNA, Thyroxin-bindendes Globulin, Thyroxin-bindendes Präalbumin, Transcortin usw.
Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ("sbp-Mitglied") - Eines von zwei verschiedenen Molekülen mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einer Vertiefung, der sich spezifisch mit einer speziellen räumlichen und polaren Organisation des anderen Moleküls verbindet und dadurch als komplementär dazu definiert ist. Die Mitglieder des spezifischen Bindungspaares werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Diese sind gewöhnlich Mitglieder eines immunologischen Paares, wie z. B. Antigen-Antikörper, obwohl andere spezifische Bindungspaare, wie z. B. Biotin-Avidin, Hormon- Hormonrezeptor, Nukleinsäure-Duplexe, IgG-Protein A, DNA-DNA, DNA- RNA und dgl. keine immunologischen Paare sind, aber in der Definition eingeschlossen sind.
Ligand - Irgendeine organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich existiert oder hergestellt werden kann.
Rezeptor ("Antiligand") - Irgendeine Verbindung oder Zusammensetzung, die in der Lage ist, eine spezielle räumliche und polare Organisation eines Moleküls, z. B. eine Epitopen- oder Determinantenstelle, zu erkennen. Erläuternde Rezeptoren schließen natürlich vorkommende Rezeptoren, z. B. Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lectine, Nukleinsäuren, Protein A, die Komplementkomponente Clq und dgl. ein.
Markiertes sbp-Mitglied - ein Marker, im allgemeinen in der Lage zum elektrochemischen Nachweis oder zur Absorption oder Emission von elektromagnetischer Strahlung, ein Katalysator, häufig ein Enzym, gebunden an ein erstes sbp-Mitglied. Das markierte sbp-Mitglied ist ein Mitglied des signalerzeugenden Systems, und das erste sbp-Mitglied ist so gewählt, daß es sich gemäß einem speziellen Protokoll in einem Assay an das zweite sbp-Mitglied bindet.
Antikörper - ein Immunglobulin oder Derivat oder Fragment desselben mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einer Vertiefung, die sich spezifisch mit einer speziellen räumlichen und polaren Organisation eines anderen Moleküls verbindet und dadurch als komplementär dazu definiert ist. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und kann durch Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie beispielsweise Immunisieren eines Wirts und Sammeln von Seren oder Hybridzellinien-Technologie.
Antikörper gegen Analyt - ein Antikörper, der spezifisch für einen Analyten ist.
Saugfähiges Material - Ein poröses Material mit Poren von mindestens 0,1 um, vorzugsweise mindestens 1,0 um, das von einem wäßrigen Medium als Antwort auf Kapillarwirkung durchwandert werden kann. Solche Materialien sind im allgemeinen hydrophil oder sind in der Lage, hydrophil gemacht zu werden, und schließen anorganische Pulver, wie z. B. Kieselerde, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche polymere Materialien, insbesondere Cellulosematerialien und Materialien, die von Cellulose abgeleitet sind, wie z. B. faserhaltige Papiere, z. B. Filterpapier, Chromatographiepapier usw.; Glasfasern; synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere, wie z. B. Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat usw.; entweder alleine verwendet oder in Verbindung mit anderen Materialien; keramische Materialien und dergleichen ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das saugfähige Material aus Glasfasern zusammengesetzt. Das saugfähige Material kann an einem Träger angebracht sein. Andererseits kann das saugfähige Material seinen eigenen Träger bereitstellen. Das saugfähige Material kann polyfunktionell sein oder in der Lage sein, polyfunktionalisiert zu werden, um kovalentes Binden von Rezeptoren oder Antikörpern zu gestatten sowie das Binden von anderen Verbindungen, die einen Teil des signalerzeugenden Systems bilden, zu gestatten. Das saugfähige Material kann in Kontakt damit ein trockenes, in Wasser dispergierbares, an einen Marker gebundenes sbp-Mitglied aufweisen.
Das Binden von Rezeptoren und Antikörpern an das saugfähige Material kann durch wohlbekannte Techniken, die allgemein in der Literatur verfügbar sind, bewerkstelligt werden. Siehe z. B. "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Bio. Chem., 245 : 3059 (1970).
Das Stück saugfähige Material kann aus einer einzigen Struktur bestehen, wie z. B. einem Blatt, das in Streifen geschnitten ist, oder es kann aus mehreren Streifen oder teilchenförmigem Material bestehen, das an einen Träger oder eine feste Oberfläche gebunden ist, wie es z. B. in der Dünnschichtchromatographie gefunden wird, und kann entweder als integralen Bestandteil oder in flüssigem Kontakt ein Absorptionskissen aufweisen. Das Stück saugfähige Material kann auch ein Blatt sein, das Pfade darauf aufweist, die in der Lage sind, betüpfelt zu werden, um eine Pfadbildung zu induzieren, wobei in jedem Pfad ein getrennter Assay durchgeführt werden kann. Das Stück saugfähige Material kann eine rechteckige, kreisförmige, ovale, dreieckige oder andere Form aufweisen, vorausgesetzt, daß es mindestens eine Richtung der Durchwanderung einer Testlösung mittels Kapillarwanderung gibt. Andere Durchwanderungsrichtungen können vorkommen, z. B. in einem ovalen oder kreisförmigen Stück, das im Zentrum mit der Testlösung in Kontakt gebracht wird. Die Hauptüberlegung ist jedoch, daß es mindestens eine Flußrichtung zu einer vorbestimmten Stelle gibt. In der folgenden Diskussion werden Streifen von saugfähigem Material erläuternd und nicht beschränkend beschrieben.
Der Träger für das saugfähige Material, falls ein Träger erwünscht oder nötig ist, ist normalerweise wasserunlöslich, nichtporös und starr, kann aber elastisch, gewöhnlich hydrophob, und porös sein, und weist gewöhnlich die gleiche Länge und Breite wie der saugfähige Streifen auf, kann aber größer oder kleiner sein. Eine große Vielfalt von organischen und anorganischen Materialien, sowohl natürliche als auch synthetische, und Kombinationen davon, kann verwendet werden, lediglich vorausgesetzt, daß der Träger nicht die Kapillarwirkung des saugfähigen Materials stört oder nicht-spezifisch Assaykomponenten bindet oder das signalerzeugende System stört. Erläuternde Polymere schließen Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat), Glas, Keramiken, Metalle und dergleichen ein. Elastische Träger können aus Polyurethan, Neopren, Latex, Siliconkautschuk und dergleichen bestehen.
Marker - ein Marker kann irgendein Molekül sein, das an ein sbp-Mitglied gebunden ist, von dem gefordert wird, daß es ein Signal erzeugt. In der vorliegenden Erfindung kann der Marker inert sein und nur als Bindungsstelle für ein Mitglied des signalerzeugenden Systems dienen, oder er kann spontan ein nachweisbares Signal erzeugen oder er kann ein nachweisbares Signal in Verbindung mit einem signalerzeugenden System erzeugen. Der Marker kann isotop oder nicht-isotop, vorzugsweise nicht-isotop, sein. Der Marker kann z. B. aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Katalysatoren, Enzymen, Chromogenen, radioaktiven Substanzen und dispergierbaren Teilchen besteht. Jedoch kann ein isotoper Marker zum Erreichen hoher Empfindlichkeit bevorzugt werden, wenn man radioautographische Nachweise mit photographischem Film verwendet.
Signalerzeugende Mittel - Mittel, die in der Lage sind, mit dem Marker wechselzuwirken, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Solche Mittel schließen z. B. elektromagnetische Strahlung, Wärme, chemische Reagenzien und dergleichen ein. Wenn chemische Reagenzien verwendet werden, können einige der chemischen Reagenzien als Teil einer Entwicklerlösung eingeschlossen werden. Die chemischen Reagenzien können Substrate, Coenzyme, Beschleuniger, zweite Enzyme, Aktivatoren, Kofaktoren, Inhibitoren, Abfänger, Metallionen, spezifische bindende Substanzen, die zum Binden von signalerzeugenden Substanzen erforderlich sind, und dergleichen einschließen. Einige der chemischen Reagenzien, wie z. B. Coenzyme, Substanzen, die mit Enzymprodukten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren und dergleichen, können an das saugfähige Material gebunden sein.
Signalerzeugendes System - Das signalerzeugende System kann eine oder mehrere Komponenten aufweisen, wobei gewöhnlich mindestens eine Komponente ein markiertes sbp-Mitglied ist. Das signalerzeugende System schließt alle die Reagenzien ein, die erforderlich sind, um ein meßbares Signal zu erzeugen, einschließlich signalerzeugender Mittel, die mit einem Marker wechselwirken können, um ein Signal zu erzeugen.
Das signalerzeugende System stellt ein Signal bereit, das durch äußere Mittel, normalerweise durch Messung von elektromagnetischer Strahlung, wünschenswerterweise durch visuelle Überprüfung, nachweisbar ist. Meistens beinhaltet das signalerzeugende System ein chromophores Substrat und Enzym, wobei chromophore Substrate enzymatisch in Farbstoffe, welche Licht im ultravioletten oder sichtbaren Bereich absorbieren, Phosphore oder Fluoreszenzfarbstoffe überführt werden.
Das signalerzeugende System kann als Marker mindestens einen Katalysator, gewöhnlich ein Enzym, und mindestens ein Substrat einschließen und kann zwei oder mehr Katalysatoren und eine Mehrzahl von Substraten einschließen und kann eine Kombination von Enzymen, worin das Substrat des einen Enzyms das Produkt des anderen Enzyms ist, einschließen. Die Wirkungsweise des signalerzeugenden Systems ist es, ein Produkt zu erzeugen, das ein nachweisbares Signal an der vorbestimmten Stelle bereitstellt, das mit der Anwesenheit von Marker an der vorbestimmten Stelle in Beziehung steht.
Es können zwei Katalysatoren verwendet werden, entweder eine Kombination eines Enzyms und eines Nicht-Enzymkatalysators oder zwei Enzyme, wobei die beiden Katalysatoren dadurch in Beziehung stehen, daß das Produkt des einen das Substrat des anderen ist. In diesem System kann nur ein Substrat vorhanden sein, das aufeinanderfolgende, durch die Katalysatoren katalysierte Veränderungen eingeht, was in der Verbindung resultiert, die an der Erzeugung eines nachweisbaren Signals beteiligt ist. Meistens ist jedoch normalerweise ein Substrat für das erste Enzym in der Reihe und eine zweite Verbindung vorhanden, die als Vorläufer für die Verbindung dient, die an der Erzeugung des Signals beteiligt ist und die normalerweise die Verbindung liefert, die das Signal erzeugt. So kann das Produkt des ersten Enzyms mit dem Vorläufer der Verbindung reagieren, die ein Signal erzeugt, um die Verbindung bereitzustellen, die das Signal erzeugt.
Wenn zwei Enzyme verwendet werden, sind die beteiligten Reaktionen meistens Hydrolyse oder Redoxreaktionen. Im Fall von Hydrolyse ist ein derivatisierter Farbstoffvorläufer, der eine hydrolytisch labile Bindung aufweist, das hydrolytische Enzym und ein Enzym, das die freigesetzten Farbstoffvorläufer in ein unlösliches Farbstoffüberführungsprodukt katalysiert, erläuternd für diesen Typ von System. Bei Redoxreaktionen kann ein erstes Enzym ein wesentliches oxidierendes Substrat erzeugen, das für das zweite Enzym erforderlich ist, wobei das zweite Enzym die Reaktion zwischen dem oxidierenden Substrat und einem Farbstoffvorläufer katalysiert.
Wenn zwei Enzyme verwendet werden, kann die erste enzymatische Reaktion die hydrolytische Spaltung oder eine Redoxreaktion des Substrats beinhalten, um ein Produkt bereitzustellen, das das Substrat eines anderen Enzyms ist. Der erste Fall kann durch Glukose-6-phosphat erläutert werden, das katalytisch durch alkalische Phosphatase zu Glukose hydrolysiert wird, wobei Glukose ein Substrat für Glukoseoxidase ist. Der zweite Fall kann durch Glukose erläutert werden, die durch Glukoseoxidase oxidiert wird, um Wasserstoffperoxid bereitzustellen, das enzymatisch mit einem Leukofarbstoff reagieren würde, um einen Signalerzeuger zu produzieren.
An gekoppelten Katalysatoren kann ebenfalls ein Enzym mit einem nicht-enzymatischen Katalysator beteiligt sein. Das Enzym kann einen Reaktanten erzeugen, der eine Reaktion eingeht, die durch den nicht-enzymatischen Katalysator katalysiert wird, oder der nichtenzymatische Katalysator kann ein Substrat (einschließlich Coenzymen) für das Enzym erzeugen. Eine große Vielfalt von nichtenzymatischen Katalysatoren, die verwendet werden können, wird im US-Patent Nr. 4,160,645, erschienen am 10. Juli 1979, gefunden. Verschiedene Kombinationen von Enzymen können verwendet werden, um eine signalerzeugende Verbindung bereitzustellen. Insbesondere können Kombinationen von Hydrolasen verwendet werden, um einen unlöslichen Signalerzeuger zu erzeugen. Alternativ können Kombinationen von Hydrolasen und Oxidoreduktasen die signalerzeugende Verbindung bereitstellen. Ebenso können Kombinationen von Oxidoreduktasen verwendet werden, um eine unlösliche signalerzeugende Verbindung zu erzeugen.
Bei Kombinationen von Enzymen kann ein Enzym nicht-diffundierbar an das saugfähige Material gebunden sein, während es sich bei dem anderen Enzym um den Marker handelt, der an den Analyten konjugiert ist. Zusätzlich können ein oder mehrere andere Mitglieder des signalerzeugenden Systems an das saugfähige Material gebunden sein, abhängig vom speziellen gewählten signalerzeugenden System oder dem speziellen befolgten Protokoll.
Um ein nachweisbares Signal vorliegen zu haben, ist es wünschenswert, Mittel zur Verstärkung des Signals bereitzustellen, das durch die Anwesenheit des Markers an der vorbestimmten Stelle erzeugt wird. Deshalb ist es gewöhnlich vorzuziehen, das der Marker ein Katalysator oder eine lumineszierende Verbindung oder ein Radioisotop ist, am bevorzugtesten ein Katalysator. Vorzugsweise sind Katalysatoren Enzyme und Coenzyme, die eine Vielzahl von signalerzeugenden Molekülen aus einem einzigen Marker erzeugen können.
Ein Enzym oder Coenzym wird verwendet, welches die gewünschte Verstärkung durch Erzeugung eines Produkts erzeugt, das Licht absorbiert, z. B. eines Farbstoffs, oder Licht nach Bestrahlung emittiert, z. B. eines Fluoreszenzfarbstoffs. Alternativ kann die katalytische Reaktion zu direkter Lichtemission führen, z. B. Chemilumineszenz. Eine große Anzahl von Enzymen und Coenzymen zur Bereitstellung derartiger Produkte ist im US-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 19 bis 23, und in US-Patent Nr. 4,318,980, Spalten 10 bis 14, angegeben.
Eine Anzahl von Enzymkombinationen ist in US-Patent Nr.
4,275,149, Spalten 23 bis 28, angegeben, welche Kombinationen in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können.
Von speziellem Interesse sind Enzyme, die die Erzeugung von Wasserstoffperoxid und die Verwendung des Wasserstoffperoxids zur Oxidation eines Farbstoffvorläufers zu einem Farbstoff beinhalten. Spezielle Kombinationen schließen Saccharidoxidasen, z. B. Glukose- und Galaktoseoxidase, oder heterocyclische Oxidasen, wie z. B. Urikase und Xanthinoxidase, gekoppelt mit einem Enzym ein, das das Wasserstoffperoxid verwendet, um einen Farbstoffvorläufer zu oxidieren, d. h. eine Peroxidase, wie z. B. Meerrettichperoxidase, Lactoperoxidase oder Mikroperoxidase. Zusätzliche Enzymkombinationen können in dem durch Bezugnahme aufgenommenen Gegenstand gefunden werden. Wenn ein einzelnes Enzym als Marker verwendet wird, können andere Enzyme Verwendung finden, wie z. B. Hydrolasen, Transferasen und Oxidoreduktasen, vorzugsweise Hydrolasen, wie z. B. alkalische Phosphatase und β-Galaktosidase. Alternativ können Luciferasen verwendet werden, wie z. B. Glühwürmchen-Luciferase und bakterielle Luciferase.
Erläuternde Coenzyme, die Verwendung finden, schließen NAD[H]; NADP[H], Pyridoxalphosphat; FAD[H]; FMN[H) usw., ein, gewöhnlich Coenzyme, die cyclische Reaktionen beinhalten, siehe insbesondere das US-Patent Nr. 4,318,980.
Das Produkt der Enzymreaktion ist gewöhnlich ein Farbstoff oder Fluoreszenzfarbstoff. Eine große Anzahl von erläuternden Fluoreszenzfarbstoffen ist im US-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 30 und 31, angegeben.
Ergänzende Materialien - Verschiedene ergänzende Materialien werden häufig in einem Assay gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Zum Beispiel sind normalerweise Puffer sowie Stabilisatoren im Assaymedium anwesend. Häufig können zusätzlich zu diesen Additiven zusätzliche Proteine eingeschlossen sein, wie z. B. Albumine, oder Tenside, insbesondere nicht-ionische Tenside, Bindungsbeschleuniger, z. B. Polyalkylenglykole, oder dgl.
Immunkonzentrierende Zusammenstellung - Die immunkonzentrierende Zusammenstellung weist im allgemeinen eine immunsorbierende Zone und eine flüssigkeitsabsorbierende Zone auf. Die immunsorbierende Zone und die flüssigkeitsabsorbierende Zone stehen gewöhnlich entweder direkt oder indirekt in einer Flüssigkeitsaufnehmenden Beziehung im Eingriff. Die immunkonzentrierende Zusammenstellung kann eine oder mehrere immunsorbierende Zonen einschließen. Die immunsorbierende Zone und die flüssigkeitsabsorbierende Zone können eine integrale Einheit bilden, wie beispielsweise einen Streifen mit einer oder mehreren immunsorbierenden Zonen. In diesem Sinn kann das saugfähige Material ein Streifen sein mit einem Teil, der eine Porengröße aufweist, die verschieden ist von dem Rest des Streifens. Alternativ können die immunsorbierende Zone und die flüssigkeitsabsorbierende Zone unterschiedlich sein. Zum Beispiel kann die immunsorbierende Zone eine Membran sein, an die ein sbp-Mitglied angebracht ist. Bei der flüssigkeitsabsorbierenden Zone kann es sich um absorbierendes Material in Form eines Streifens, Kissens, Pfropfens, Dochts oder dergleichen in Flüssigkeits-aufnehmender Beziehung mit der immunsorbierenden Zone handeln. Das flüssigkeitsabsorbierende Material kann aus irgendeinem hydrophilen saugfähigen Material sein, wie beispielsweise Papier, Schwamm, Filz, poröse Polymere und dergleichen.
Immunsorbierende Zone - ein saugfähiger fester Film, eine saugfähige feste Schicht oder ein saugfähiges festes Blatt, häufig in Kontakt mit einem Teil des Stücks saugfähigen Materials, an das ein sbp-Mitglied, gewöhnlich ein Antikörper oder Antigen, nichtdiffundierbar gebunden ist. Die immunsorbierende Zone weist häufig eine kleine Flüssigkeitskapazität im Vergleich zu der gesamten Assayvorrichtungs-Kapazität auf. Ein oder mehrere Mitglieder eines signalerzeugenden Systems können direkt oder indirekt an die immunsorbierende Zone gebunden sein. Die immunsorbierende Zone weist eine spezifische Bindungsfähigkeit für ein komplementäres sbp-Mitglied auf. Demgemäß kann die immunsorbierende Zone ein zweites sbp-Mitglied nicht-diffundierbar an die Zone gebunden einschließen.
Flüssigkeitsabsorbierende Zone - ein saugfähiges festes Material, entweder direkt oder indirekt in Flüssigkeits-aufnehmender Beziehung mit der immunsorbierenden Zone und als Reservoir oder Speicherzone dienend, die in der Lage ist, ein wesentlich größeres Flüssigkeitsvolumen als die immunsorbierende Zone zu speichern. Die flüssigkeitsabsorbierende Zone wirkt als Pumpe, um Flüssigkeit durch die immunsorbierende Zone hinein und daraus heraus zu pumpen. Die flüssigkeitsabsorbierende Zone dient dazu, das Volumen der Flüssigkeit, die die immunsorbierende Zone durchwandert, zu steuern. Eine weitere Funktion der flüssigkeitsabsorbierenden Zone kann es sein, die Menge an Flüssigkeit zu messen, die durch die Vorrichtung geschickt wird. Indem man für Graduierungen an aufeinanderfolgenden Positionen sorgt, die sich von der immunsorbierenden Zone weg und entlang der flüssigkeitsabsorbierenden Zone erstrecken, kann man bestimmen, wann die Lösungsmittelfront an einer gewissen Position ist. Man kann Farbstoffe bereitstellen, die nach Auflösen oder Kontakt mit einer Lösungsmittelfront farbig werden, um eine Anzeige bereitzustellen, daß das Lösungsmittel die Vorrichtung durchwandert hat.
Flüssige(s) Reagenz(ien) - Ein oder mehrere flüssige Reagenzien zum Durchführen eines Assays, der die Vorrichtung der Erfindung verwendet. Das flüssige Reagenz kann ein sbp-Mitglied, Mitglieder eines signalerzeugenden Systems oder eine Suspension von Teilchen, die an ein sbp-Mitglied oder Mitglied eines signalerzeugenden Systems gebunden sind, ergänzende Reagenzien oder dergleichen einschließen und ist gewöhnlich wäßrig.
Selbst-enthaltene flüssige Reagenzien - beschrieben in EP-A-286371. Ein oder mehrere flüssige Reagenzien können in mindestens einem zerbrechbaren Behälter in der Vorrichtung der Erfindung eingeschlossen sein. Das flüssige Reagenz kann ein sbp-Mitglied, Mitglieder eines signalerzeugenden Systems oder eine Suspension von Teilchen, die an ein sbp-Mitglied oder ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems gebunden sind, ergänzende Reagenzien oder dergleichen einschließen und ist gewöhnlich wäßrig. Der Behälter kann als Einheit mit dem Gehäuse der vorliegenden Vorrichtung vorliegen oder getrennt davon oder beides, wenn mehr als ein selbst-enthaltenes Reagenz verwendet wird. Nach Zerbrechen des bzw. der Behälter(s), wird das Reagenz in die Lage versetzt, durch Kapillarwirkung das saugfähige Material, das in der vorliegenden Assayvorrichtung verwendet wird, zu durchwandern, wenn ein Teil des saugfähigen Materials mit dem bzw. den Reagenz(ien) in Kontakt kommt. Das flüssige Reagenz in dem zerbrechbaren Behälter kann auch ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems enthalten, das in der Lage ist, ein Signal in Beziehung zu der Menge an Analyt in der Probe zu erzeugen.
Die Behälter sind wasserundurchlässig und können starr oder flexibel sein und in der Lage sein, durch Zerbrechen, Zerschneiden, Durchstoßen, Schmelzen, Aufbrechen einer Versiegelung zwischen einem solchen Behälter und dem Gehäuse der Vorrichtung und dergleichen zerbrochen zu werden. Gewöhnliche Materialien schließen Glas, Kunststoffe, Wachse, Polymermembranen und dergleichen ein. Normalerweise beträgt das Volumen eines Behälters mindestens das Flüssigkeitsabsorptionsvolumen des Materials in der Vorrichtung, kann aber größer oder kleiner sein. Wenn es kleiner als das Flüssigkeitsabsorptionsvolumen der Vorrichtung ist, wird häufig mehr als ein Behälter verwendet. Die Behältervolumina sind gewöhnlich zwischen 0,1 bis 15 ml, vorzugsweise 0,3 bis 5 ml, können aber so klein wie 5 um³ sein, wie z. B., wenn die Flüssigkeit in zahlreichen Mikrokapseln enthalten ist. Der Behälter kann von irgendeiner Form sein, die mit der vorliegenden Vorrichtung verträglich ist, z. B. ellipsoid, rechteckig, kugelförmig usw.
Die selbst-enthaltenen flüssigen Reagenzien können gemäß Standardtechniken in einem Behälter eingeschlossen sein. Eine wichtige Überlegung ist, daß der Einschluß keine nachteilige Wirkung auf die eingeschlossenen Reagenzien ausübt. Beispielhaft für einen derartigen Einschluß ist die Verkapselung in einer Kapsel.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung wird als nächstes in größerer Einzelheit mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es sollte betont werden, daß die folgende Beschreibung erläuternd und nicht limitierend ist.
Es wird jetzt Bezug auf Fig. 1 genommen, die die Vorrichtung 10 darstellt. Die Vorrichtung umfaßt ein Gehäuse 12, das von irgendeiner geeigneten Form oder Größe gemäß dem speziellen Assaytyp sein, der durchgeführt werden soll. Das Gehäuse 12 kann aus irgendeinem geeigneten Material, das für den durchgeführten Assaytyp angemessen ist, hergestellt sein. Das Material, das verwendet wird, um das Gehäuse herzustellen, sollte die Probe, das Probenmedium oder irgendwelche Reagenzien, die bei der Durchführung des Assays verwendet werden, einschließlich Mitgliedern des signalerzeugenden Systems, nicht störend beeinflussen. Vorzugsweise ist das Gehäuse aus einem thermoplastischen Material oder dergleichen gebildet.
Die Vorrichtung 10 schließt weiter ein erstes Mittel zum Einfang eines Mitglied eines spezifischen Bindungspaars in einer Zone und zum Gestatten, daß Flüssigkeit durch Kapillarwirkung von der Zone wegtransportiert wird, im Gehäuse ein. In der in den Fig. 1-5 dargestellten Ausführungsform umfaßt ein derartiges Mittel ein Stück saugfähiges Material, einen saugfähigen Streifen 14, mit einer oder mehreren immunsorbierenden Zonen. Vorzugsweise ist der saugfähige Streifen nicht-entfernbar in der Vorrichtung 10 eingeschlossen. Ein flüssigkeitsabsorbierendes Material 16 in Flüssigkeits-aufnehmender Beziehung mit dem saugfähigen Streifen 14 kann gegebenenfalls in der Vorrichtung 10 eingeschlossen sein, vorzugsweise nicht-entfernbar in der Vorrichtung 10 angebracht. Die Kombination des Streifens 14 und des absorbierenden Mittels 16 sorgt für das Einfangen eines sbp-Mitglieds in einer Zone und den Transport der Flüssigkeit von der Zone weg durch Kapillarwirkung. Das flüssigkeitsabsorbierende Element 16 ist zweckmäßigerweise in einem ausgenommenen Teil 18 der Vorrichtung 10 angeordnet. In der Vorrichtung der Fig. 1-5 ist der ausgenommene Teil 18 an einem Ende der Vorrichtung 10 gegenüber dem Ende mit der ersten Einlaßvorrichtung 20 für das Einführen einer Probe und/oder eines flüssigen Reagenz in die Vorrichtung angeordnet. Dies ist nur ein Beispiel. Andere Ausführungsformen werden dem Fachmann nahegelegt. Zum Beispiel kann das Element 16 bei, nahe oder entfernt von der Vorrichtung 20 zum Einführen der Probe angeordnet sein. Die Vorrichtung 10 schließt auch eine zweite Einlaßvorrichtung 22 zum Einführen eines flüssigen Reagenz und einer flüssigen Probe in die Vorrichtung ein.
Die Innenwände des Gehäuses 12 können Mittel 24 zum stützenden Einschließen des Streifens 14 in dem Gehäuse enthalten. In solchen Fällen ist es wichtig, daß das obere Ende und die Unterseiten des Streifens 14 einen begrenzten Kontakt mit den Innenwänden des Gehäuses aufweisen, so daß die Kapillarwirkung des Streifens im wesentlichen unverändert bleibt und der Streifen frei ist sich auszudehnen, wenn er feucht wird. In anderen Fällen kann die Unterseite des Streifens auf einem hydrophoben elastischen Kissen ruhen, das einen guten Kontakt der Vorrichtungen 20 und 22 mit dem oberen Teil des Streifens sicherstellt, ohne den Kapillarfluß störend zu beeinflussen.
Beispielhaft für die Mittel 24 sind vorspringende Elemente 24, die auf den Innenwänden 26 und 28 des Gehäuses 12 gefunden werden. Die Elemente 24 bilden im allgemeinen eine Einheit mit den Innenwänden des Gehäuses 12 und können in der Form von Pfosten vorliegen, die konisch, länglich, oval, rechteckig, dreieckig oder dergleichen sind. Ein Schlüsselmerkmal der Elemente 24 ist, daß sie die Kontaktfläche mit dem Streifen 14 minimieren, so daß die Kapillarität des Streifens 14 nicht auf signifikante Weise geändert wird. Mit dem Ausdruck "auf signifikante Weise geändert" ist gemeint, daß die Kapillarwirkung des Streifens 14 nicht so geändert wird, daß die Leistung des Assays signifikant beeinflußt wird, wodurch die Genauigkeit des Tests verringert oder aufgehoben würde. Zum Beispiel muß eine ausreichende Kapillarwirkung aufrechterhalten werden, damit man in der Lage ist, den Analyten in einer Probe genau zu bestimmen.
In den Fig. 2-5 liegen die Elemente 24 und 25 in Reihen, die parallel zu den langen Seiten des Gehäuses 12 sind. Im allgemeinen weisen die Elemente 24 und 25 derartige Dimensionen auf, daß sie eine leichte Auf- und Abwärtsbewegung des Streifens in trockenem Zustand im Gehäuse gestatten und eine derartige Bewegung verhindern, wenn der Streifen von durchwandernder Flüssigkeit befeuchtet wird. Gewöhnlich beträgt die Strecke einer derartigen Bewegung 0 mm bis 3,0 mm, wenn der Streifen in trockenem Zustand ist. Im allgemeinen gibt es auf jeder Seite der oberen und unteren Innenwände des Gehäuses 12 ungefähr 2 bis 15 Elemente 24 bzw. 25 pro Seite mit einer jeweiligen Länge von ungefähr 0,5 bis 4 mm. In einer alternativen Ausführungsform kann der Streifen 14 an einem Träger befestigt sein, was den Bedarf für die Elemente 24 oder 25 oder für beide erübrigt. Mittel 33 werden bereitgestellt, um den Streifen 14 frei von Kontakt mit den inneren Seitenwänden 32 des Bodenteils 34 der Vorrichtung 10 zu halten. Derartige Mittel können die Form von Elementen 30, die von den Wänden 32 hervorspringen, annehmen. Die Form der Elemente 24, 25 und 30 kann jeweils unabhängig sein, oder alle können rechteckig, oval, dreieckig, länglich, konisch oder dergleichen sein. Allgemein haben die Mittel 30 die gleiche Funktion wie die Mittel 24 und 25.
Das flüssigkeitsabsorbierende Element 16 ist in einem ausgenommenen Bereich 18 untergebracht. Das Element 16 kann in innigem Kontakt mit den Wänden des ausgenommenen Teils 18 des Gehäuses stehen, oder die Wände können auch Mittel zum stützenden Einschließen des flüssigkeitsabsorbierenden Elements 16 aufweisen. Auf jeden Fall ist das Element 16 innerhalb der Ausnehmung 18 des Gehäuses 12 angebracht, so daß es in Flüssigkeits-aufnehmender Beziehung mit dem Streifen 14 gehalten wird.
Das Gehäuse 12 schließt ferner eine erste Vorrichtung 20 zum Einführen der Probe und/oder des flüssigen Reagenz in die Vorrichtung 10 ein. In der in den Fig. 1-5 dargestellten Vorrichtung schließt die Vorrichtung 20 eine Öffnung ein, durch die hindurch eine Probe auf dem Streifen 14 und einer Flüssigkeitsaufnehmenden Vertiefung abgesetzt werden kann. Eine derartige aufnehmende Vertiefung kann in jeglicher Bauweise oder Form verwendet werden. Die Vertiefung kann zylindrisch, konisch, rechteckig, quadratisch, oval oder dergleichen oder eine Kombination derselben sein. Die Abmessungen der Vertiefung können gemäß dem speziellen durchzuführenden Assay und der Form der Vertiefung ebenfalls in weitem Bereich variiert werden. Im allgemeinen sollte die Vertiefung ein Volumen von 10-1000 ul, vorzugsweise 50-500 ul, bevorzugter 100-400 ul aufweisen, und die Wände sollten ausreichend geneigt sein, um die Flüssigkeit zu veranlassen, frei zu der Öffnung am Boden zu fließen. Die Öffnung ist im allgemeinen klein, gewöhnlich 0,3-15 mm², vorzugsweise 1-10 mm², und kann quadratisch, oval, dreieckig, rund und dergleichen sein. Vorzugsweise ist die Öffnung so konstruiert, daß sie in ausreichend gutem Kontakt mit dem Streifen 14 steht, so daß alle Flüssigkeit, die in Kontakt mit der Öffnung steht, ohne Lecks in den Streifen absorbiert wird. Alternativ kann die Vorrichtung 20 die Form eines Septums annehmen, das aus einem elastomeren Material wie Gummi, Kunststoff oder dergleichen hergestellt ist.
Das Gehäuse 12 schließt weiter eine zweite Vorrichtung 22 zum Einführen von flüssigen Reagenzien und der Probe in die Vorrichtung 10 ein. Allgemein trifft die obige Beschreibung für die erste Vorrichtung 20 auch für die zweite Vorrichtung 22 zu. Die erste Vorrichtung 20 und die zweite Vorrichtung 22 können von der gleichen Bauart oder Form sein oder aus dem gleichen Material sein, oder sie können verschieden sein. Vorzugsweise sind die Öffnungen in den Vorrichtungen 20 und 22 nahe beieinander, gewöhnlich 1-20 mm, vorzugsweise 1-10 mm, häufig 2-5 mm, wobei dann die Vertiefungen der Vorrichtungen 20 und 22 als eine einzige Vertiefung mit einer Abtrennung zwischen den beiden Öffnungen konstruiert sein können.
Die Zufuhr der Probe in die Vorrichtung 10 kann unter Verwendung einer Tropfpipette, einer Spritzennadel oder dergleichen, die die zu analysierende Probe enthält, durch die erste Vorrichtung 20 oder die zweite Vorrichtung 22 vorgenommen werden. Die Zufuhr der Probe in die Vorrichtung hat zur Folge, daß die Probe auf dem Streifen 14 abgesetzt wird. Ein flüssiges Reagenz, das von der Probe verschieden ist, wird gewöhnlich nach Zugabe der Probe zur Vorrichtung gegeben. Weiter können zusätzliche flüssige Reagenzien entweder vor oder nach der Probenzugabe zu der Vorrichtung gegeben werden, wobei mindestens eines von derartigen Reagenzien durch die nicht bei der Zugabe der Probe verwendete Vorrichtung zugegeben wird. Andere Vorrichtungen zum Einführen der Probe in die Vorrichtung werden dem Fachmann nahegelegt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Zusammenstellung der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann mit Bezug auf die Fig. 1-5 erkannt werden. Die vorliegende Vorrichtung ist zweckmäßigerweise aus zwei Stücken, hierin als obere Hälfte oder Stück 36 und untere Hälfte oder Stück 38 bezeichnet. Die Stücke 36 und 38 sind entlang den Kantenlinien 40 auf Stück 36 und 42 auf Stück 38 zusammengefügt. Zweckmäßigerweise können die beiden Hälften eine Vorrichtung zum Ineinandergreifen der Hälften umfassen. Zum Beispiel kann die obere Hälfte 36 einen Vorsprung enthalten, der so konstruiert ist, daß er mit einer den Vorsprung aufnehmenden Vorrichtung auf Stück 38 schnappend zusammenwirkt. Nach Anbringen des Streifens 14 und des absorbierenden Elements 16, falls es von 14 getrennt vorliegt, werden das Stück 36 und das Stück 38 entlang ihren Kanten zusammengefügt. Das Stück 36 und das Stück 38 können durch Anwendung von Schallenergie, einem Klebstoff, Wärme oder dergleichen gemäß herkömmlichen Techniken fest zusammengeschlossen werden, um das Gehäuse 12 zu erzeugen. Die bevorzugte Technik ist ein Schnappverschluß. Die Verwendung von oberen und unteren Stücken für die Zusammenstellung der Vorrichtung der Erfindung ist lediglich erläuternd. Andere Mittel zum Ausbilden der vorliegenden Vorrichtung in Abhängigkeit von der speziellen Bauweise, die für die Vorrichtung gewählt wurde, schlagen sich mit Bezug auf die hierin enthaltene Offenbarung dem Fachmann vor.
Die obere Hälfte 36 der Vorrichtung 10 kann eine Öffnung oder ein transparentes Fenster zur Besichtigung einer immunsorbierenden Zone besitzen und kann auf ihrer Stirnseite eine Skala umfassen, um die quantitative Bestimmung der Menge an Analyt in der Probe zu unterstützen. Wenn es sich z. B. bei der quantitativen Bestimmung um das Ergebnis des Messens der Länge innerhalb einer immunsorbierenden Zone handelt, in der ein Signalnachweis beobachtet wird, kann ein Anzeigemittel wie eine Skala, die an das Fenster zur Beobachtung der immunsorbierenden Zone angrenzt, den Erhalt der quantitativen Ergebnisse unterstützen.
Vorrichtungen, die von den in den Fig. 1-5 dargestellten verschieden sind, sind als Teil dieser Erfindung eingeschlossen. Eine Anzahl derartiger Vorrichtungen kann als eine einzige zusammengesetzte Vorrichtung, die in der Lage ist, eine Anzahl von Proben in einem Assay zu testen, zusammengestellt werden.
Eine andere Ausführungsform einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist in den Fig. 6-9 dargestellt. Die Vorrichtung 110 umfaßt das Gehäuse 112, das im allgemeinen einen saugfähigen Streifen 140 und ein saugfähiges Stück 116 umfaßt. Das obere Stück 136 weist eine erste Vorrichtung 120, eine zweite Vorrichtung 122 und eine dritte Vorrichtung 123 zum Einführen der Probe und/oder von flüssigen Reagenzien, die von der Probe verschieden sind, in die Vorrichtung auf. Wenn die Probe in die dritte Vorrichtung 123 eingeführt wird, wird mindestens eines der flüssigen Reagenzien nach Zugabe der Probe durch Vorrichtungen, die von der dritten Vorrichtung 123 verschieden sind, zugegeben. Die in der Ausführungsform dargestellten Vorrichtungen 120, 122 und 123 sind Öffnungen im Stück 136.
Es wird nun Bezug auf die Fig. 10-13 genommen, die die Vorrichtung 210 darstellen. Die Vorrichtung umfaßt das Gehäuse 212, das von irgendeiner geeigneten vorm oder Größe gemäß dem speziellen durchzuführenden Assaytyp sein kann.
Die Vorrichtung 210 schließt ferner im Gehäuse eingeschlossene Mittel zum Einfangen eines Mitglieds eines spezifischen Bindungspaars in einer Zone und zum Gestatten, daß Flüssigkeit durch Kapillarwirkung von der Zone wegtransportiert wird, ein. In der in den Fig. 10-13 dargestellten Ausführungsform umfaßt ein derartiges Mittel ein Stück saugfähiges Material, einen saugfähigen Streifen 214 mit einer oder mehreren immunsorbierenden Zonen. Vorzugsweise ist der saugfähige Streifen nicht-entfernbar in der Vorrichtung 210 angebracht. Ein flüssigkeitsabsorbierendes Material 216 in Flüssigkeits-aufnehmender Beziehung mit dem saugfähigen Streifen 214 kann gegebenenfalls in der Vorrichtung 210 eingeschlossen sein, vorzugsweise nicht-entfernbar in der Vorrichtung 210 angebracht. Das flüssigkeitsabsorbierende Element 216 ist zweckmäßigerweise in einem ausgenommenen Teil 218 der Vorrichtung 210 angeordnet. In der Vorrichtung der Fig. 10-13 ist der ausgenommene Teil 218 beispielsweise an einem Ende der Vorrichtung 210 angeordnet, das gegenüber dem Ende mit der unten beschriebenen Vorrichtung 254 zum Brechen des Behälters 246 liegt, der das selbst-enthaltene flüssige Reagenz 248 enthält.
Weiter eingeschlossen, vorzugsweise nicht-entfernbar, im Gehäuse 212 ist ein selbst-enthaltenes flüssige Reagenz 248 in einem zerbrechbaren Behälter 246. Das flüssige Reagenz wird bei der Bestimmung eines Analyten in der Probe verwendet. Das flüssige Reagenz kann Mitglieder eines signalerzeugenden Systems, wie Enzymsubstrate und dergleichen, einschließen. Der Behälter 246 ist in der Ausnehmung 250 der Vorrichtung 210 angeordnet. Der Behälter 246 bestehen zweckmäßigerweise aus einem zerbrechlichen Material, wie Glas, Kunststoff und dergleichen. Der Behälter 246 ist normalerweise unterstützt durch ein Mittel 252 in der Ausnehmung 250 eingeschlossen, derart, daß er zu einem gewünschten Zeitpunkt leicht zerbrochen wird. Das Mittel 252 ist eine Wand oder kann die Form einer Schulter, Rippe, eines Vorsprungs oder dergleichen annehmen. Die Ausnehmung 250 kann Reagenzien zum Durchführen eines Assays in trockener Form oder diffundierbar an einen Träger gebunden enthalten.
Das Gehäuse 212 schließt weiter eine Vorrichtung 254 zum Unterstützen des Zerbrechens des Behälters 246 ein. Vorzugsweise umfaßt die Vorrichtung 254 ein an 258 aufgehängtes bewegliches Teil, das im allgemeinen über dem ausgenommenen Bereich 250 liegt. Die Vorrichtung 254 kann so gehandhabt werden, daß sie die Kapsel 246 zerbricht. Weiter kann die Vorrichtung 254 auch einen Knopf 260, der gegenüber dem Behälter 246 liegt, umfassen. Wenn das bewegliche Teil 254 herabgedrückt wird, wird der Knopf 260 gegen den Behälter 246 gedrückt, und der Behälter 246 wird zerbrochen. Die Elemente 260 können eingeschlossen sein, um das Zerbrechen von 246 zu unterstützen.
Das Gehäuse 212 schließt ferner eine erste Vorrichtung 220 und eine zweite Vorrichtung 222 zum Einführen einer Probe in die Vorrichtung 10 ein. In der Vorrichtung, die in den Fig. 10-13 dargestellt ist, sind die erste Vorrichtung 220 und die zweite Vorrichtung 222 Öffnungen, durch die die Probe und flüssige Reagenzien gemäß dem Prinzip der vorliegenden Erfindung auf dem Streifen 214 abgesetzt werden können.
Gegebenenfalls weist das Gehäuse 212 eine Vorrichtung 262 auf, die es gestattet, das (eine) immunsorbierende Zone(n) auf dem saugfähigen Material betrachtet werden kann/können, so daß man in der Lage ist, das Ergebnis eines Assays zu bestimmen, wenn sich die immunsorbierende Zone nicht bei der Vorrichtung 220 oder Vorrichtung 222 befindet. Demgemäß kann der obere Teil 236 des Gehäuses 212 vollständig aus klarem thermoplastischem Material gebaut sein. Alternativ kann nur die Fläche, die die Betrachtung der immunsorbierenden Zone(n) gestattet, ein klares Material sein, oder es kann sich bei einem derartigen Bereich lediglich um eine Öffnung im oberen Teil der Vorrichtung 210 handeln. Die Abmessungen des Gehäuses hängen wiederum von dem speziellen Assay, der durchgeführt wird, ab.
Bei dem Lösungsmittel für die zu analysierende Probe und dem Lösungsmittel für die flüssigen Reagenzien und irgendwelche selbstenthaltenen Reagenzien handelt es sich um ein wäßriges Medium, das bis zu ungefähr 40 Gewichtsprozent andere polare Lösungsmittel, insbesondere sauerstoffhaltige Lösungsmittel mit 1 bis 6, gewöhnlicher 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, enthalten kann, einschließlich Alkoholen, Ethern und dergleichen. Gewöhnlich ist das Cosolvenz zu weniger als ungefähr 20 Gewichtsprozent vorhanden.
Der pH des Mediums liegt gewöhnlich im Bereich von 4-11, gewöhnlicher 5-10 und vorzugsweise im Bereich von ungefähr 6-9. Der pH wird so gewählt, daß er eine signifikante Bindungsaffinitätstelle der bindenden Mitglieder und eine optimale Signalerzeugung durch das signalerzeugende System aufrechterhält. Verschiedene Puffer können verwendet werden, um den gewünschten pH zu erreichen und den pH während des Assays aufrechtzuerhalten. Erläuternde Puffer schließen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen ein. Der spezielle verwendete Puffer ist nicht kritisch, aber in einzelnen Assays kann ein Puffer gegenüber einem anderen vorgezogen werden.
Wünschenswerterweise ist bei einigen Assays ungefähr 0,05 bis 0,5 Gewichtsprozent eines Detergens in der Probe und/oder den flüssigen Reagenzien enthalten. Detergentien, wie Natriumdodecylsulphat (SDS), Desoxycholat, CHAPS und NP 40 finden spezielle Anwendung bei mikrobischen Analyten und Antikörpern. Im allgemeinen sind nicht-ionische Detergentien, wie Triton X-100, bei makromolekularen Analyten nützlich.
Gemäßigte und wünschenswerterweise im wesentlichen konstante Temperaturen werden normalerweise bei der Durchführung des Assays angewendet. Die Temperaturen für den Assay und die Erzeugung eines nachweisbaren Signals liegen gewöhnlich im Bereich von ungefähr 40 bis 50ºC, gewöhnlicher im Bereich von ungefähr 10º-40ºC, und häufig sind sie Umgebungstemperaturen, d. h. ungefähr 15º-25ºC. Wenn der Analyt eine Nukleinsäure ist, sind höhere Temperaturen bis zu 70ºC nützlich.
Die Konzentration in der wäßrigen Testlösung des Analyten, die untersucht werden kann, schwankt im allgemeinen von ungefähr 10&supmin;&sup4; bis ungefähr 10&supmin;¹&sup5; M, gewöhnlicher von ungefähr 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;¹&sup4; M. Überlegungen, wie die Konzentration des interessierenden Analyten und das Protokoll, legen normalerweise die Konzentration der anderen Reagenzien fest.
Während die Konzentrationen von vielen der verschiedenen Reagenzien in der Probe und in den Reagenzlösungen im allgemeinen durch den interessierenden Konzentrationsbereich des Analyten festgelegt werden, wird die Endkonzentration jedes der Reagenzien normalerweise empirisch festgelegt, um die Empfindlichkeit des Assays über den interessierenden Bereich zu optimieren. Bei gewissen Protokollen können einzelne Reagenzien in beträchtlichem Überschuß verwendet werden, ohne die Empfindlichkeit des Assays nachträglich zu beeinflussen.
Wenn das saugfähige Material ein Streifen ist, hängt die Größe des Streifens von mehreren Überlegungen ab. Die primäre Überlegung ist, ungebundene Materialien von der immunsorbierenden Zone, gewöhnlich der Fläche auf dem Streifen, der der ersten Vorrichtung 20 gegenüberliegt, oder einer Fläche zwischen der ersten Vorrichtung 20 und dem absorbierenden Material 16, wegzubewegen und die Bindung der sbp-Mitglieder an die immunsorbierende Zone als Antwort auf die Anwesenheit eines Analyten in der Testlösung zu veranlassen. Wenn das flüssigkeitsabsorbierende Material 16 nicht enthalten ist, steuern die Länge und Dicke des Streifens die Menge an Lösung, die entlang des Streifens wandern kann. Falls die Überführung eines großen Volumens an Testlösung gewünscht wird, muß die Flüssigkeitskapazität des Streifens oberhalb der immunsorbierenden Zone ausreichend sein, um das gewünschte Volumen unterzubringen. Wenn das flüssigkeitsabsorbierende Material 16 verwendet wird, ist diese Volumenerfordernis nicht notwendig. Im allgemeinen ist, wenn das flüssigkeitsabsorbierende Material 16 nicht verwendet wird, das Flüssigkeitsaufnahmevolumen größer als 20 ul, vorzugsweise mindestens 50-200 ul. Wenn flüssigkeitsabsorbierendes Material 20 verwendet wird, können Streifenaufnahmevolumina, die so gering wie 2-20 ul sind, verwendet werden, aber Volumina von 20-200 ul sind vorzuziehen.
Die Dicke des Streifens ist nicht kritisch und beträgt normalerweise 0,1-2 mm, gewöhnlich 0,15-1 mm, vorzugsweise 0,2-0,7 mm. Im allgemeinen wird die minimale Dicke durch die Stärke des Materials und den Bedarf, ein leicht nachweisbares Signal zu erzeugen, diktiert, wohingegen die maximale Dicke durch die Zweckmäßigkeit der Handhabung und die Kosten der Reagenzien diktiert wird.
Um eine Einsparung von Reagenzien zu gestatten und für Proben beschränkter Größe zu sorgen, ist die Breite des Streifens im allgemeinen relativ gering, gewöhnlich weniger als 20 mm, vorzugsweise weniger als 10 mm. Im allgemeinen beträgt die Breite des Streifens nicht weniger als ungefähr 1,0 mm und liegt gewöhnlich im Bereich von ungefähr 2 mm bis 12 mm, vorzugsweise ungefähr 4 mm bis 8 mm.
Die Querschnittsabmessungen eines Streifens sind in der vorangehenden Besprechung als Rechteck für die Zwecke der Erläuterung und nicht der Beschränkung beschrieben worden. Wie oben erwähnt, können andere Querschnittsformen, wie kreisförmig, dreieckig, oval usw. ebenfalls in den Bereich dieser Erfindung fallen. Die Abmessungen davon können durch den Fachmann mit Bezug auf die Offenbarung hierin festgelegt werden.
Die Länge des Streifens hängt davon ab, (1) ob ein absorbierendes Element 16 verwendet wird, (2) von der Konzentration von einem oder mehreren der Analyten und (3) von praktischen Überlegungen bezüglich der Leichtigkeit der Handhabung der Vorrichtung 10 ab und beträgt ungefähr 1 cm bis 40 cm, gewöhnlich ungefähr 2 cm bis 25 cm, vorzugsweise ungefähr 4 bis 20 cm, kann aber von irgendeiner praktischen Länge sein. Die Struktur des Streifens kann in weitem Bereich variiert werden und schließt fein, mittelfein, mittel, mittelgrob und grob ein. Im allgemeinen sorgen eine geringere Porengröße und feineres Material für einen langsamen Kapillarfluß und ein wirksames Einfangen von gebundenem Konjugat auf dem Streifen. Gröbere, porösere Materialien sorgen für einen schnelleren Fluß, aber die Wirksamkeit des Einfangens ist verringert, außer wenn Teilchen aus der Probe oder ein Ligandenreagenz beteiligt sind. Die Auswahl der Porosität des Materials hängt von der Bindungsgeschwindigkeit der Komponenten bei einem gegebenen Assay ab.
Das absorbierende Element 16 kann aus dem gleichen oder einem verschiedenen saugfähigen Material wie der Streifen 14 aufgebaut sein und kann eine Einheit mit dem Streifen 14 bilden. Das Element 16 kann die Form eines Streifens, Kissens, Zylinders oder eine andere zweckmäßige Form annehmen. Die Abmessungen des Elements 16 hängen von einigen der gleichen Faktoren wie die Abmessungen des Streifens 14 ab. Die primäre Überlegung ist, daß das Element 16 in der Lage sein soll, das minimale Flüssigkeitsvolumen zu absorbieren, das im Assay erforderlich ist, einschließlich des Lösungsmittels für die Probe, der Assayreagenzien und irgendwelcher Waschlösungen, wie benötigt.
Die Länge der Vorrichtung 10 beträgt ungefähr 2 bis 30 cm, vorzugsweise 4-15 cm. Der Querschnitt der Vorrichtung wird im allgemeinen rechteckig sein, kann aber ellipsoid oder von einer anderen Form sein, wird aber gewöhnlich auf mindestens einer Seite flach sein. Die minimalen und maximalen Querschnittsabmessungen werden 0,5 bis 5 cm, vorzugsweise 1,0 bis 3 cm sein, können aber größer sein, wenn die Elemente von mehr als einer Vorrichtung in einer einzigen Einheit enthalten sind. Gewöhnlich wird die Höhe, senkrecht zur flachen Seite gemessen, 1-30 mm, vorzugsweise 5-20 mm sein.
Die Lage der Vorrichtungen 20 und 22 und jeglicher immunsorbierenden Zone(n) mit Bezug auf den Streifen 14 und das absorbierende Material 16 wird durch das Grundprinzip dieser Erfindung und den speziellen Assay, der verwendet wird und an den die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung angepaßt ist, bestimmt.
In der einfachsten in den Fig. 1-5 gezeigten Form weist die Vorrichtung zwei Öffnungen auf, 20 und 22. Die Öffnung 22 ist nahe dem Ende des Streifens 14 und die Öffnung 20 ist zwischen der Öffnung 22 und dem flüssigkeitsabsorbierenden Element 16 angeordnet. Die Probe kann durch die Öffnung 20 oder die Öffnung 22 zugegeben werden, gefolgt von einem oder mehreren flüssigen Reagenzien, die Mitglieder eines signalerzeugenden Systems sein können, wobei eines der flüssigen Reagenzien zur Öffnung 22 gegeben wird. Diese Reagenzien bewegen sich entlang dem Streifen 14 durch Kapillarwirkung über den Teil des Streifens 14 hinaus, der gegenüber der Öffnung 20 liegt. Auf diese Weise werden nichtimmobilisierte Materialien, wie ein sbp-Mitglied, weggetragen, so daß ein Signal an der Öffnung 20 abgelesen werden kann, wenn die immunsorbierende Zone auf dem Streifen 14 gegenüber der Öffnung 20 liegt. Alternativ kann das sbp-Mitglied zu einer immunsorbierenden Zone, die von der Öffnung 20 entfernt liegt, getragen werden, wo ein Signal abgelesen werden kann.
Die minimale Entfernung der Vorrichtung 20 von der Vorrichtung 22 beträgt gewöhnlich 1 mm. Die minimale Entfernung einer immunsorbierenden Zone von der Vorrichtung 20 wird, wenn die immunsorbierende Zone nicht gegenüber der Vorrichtung 20 liegt, durch die Kapazität des dazwischenliegenden saugfähigen Materials, nicht-diffundierbar ein sbp-Mitglied zu binden, wenn dies erforderlich ist, und durch die Flußeigenschaften des Streifens 14, die die Wirksamkeit des Waschens der immunsorbierenden Zone beeinflussen, bestimmt. Diese Entfernung ist gewöhnlich derart, daß sie bequem ist und das Ergebnis leicht sichtbar werden läßt. Wünschenswerterweise kann die immunsorbierende Zone, wenn sie nicht gegenüber der Vorrichtung 20 liegt, mindestens 5 mm, vorzugsweise mindestens 10 mm, von dem Kontaktteil gegenüber der Vorrichtung 20 in Richtung des absorbierenden Materials 16 liegen. Sie kann bei irgendeiner größeren Entfernung angeordnet sein, vorausgesetzt, daß die flüssigen Reagenzien durch Kapillarwirkung dahin gelangen können. Auf diese Weise ist die immunsorbierende Zone von einem derartigen Kontaktteil "abgetrennt".
Die flüssigen Reagenzien, bei denen es sich normalerweise um sbp-Mitglieder, Mitglieder des signalerzeugenden Systems oder um Waschlösungen, falls benötigt, handelt, können bezüglich ihrer Konzentration in weitem Bereich schwanken, abhängig vom speziellen Assayprotokoll und ihrer Rolle bei der Signalerzeugung. Die Mengen an sbp-Mitgliedern werden auf der Grundlage der vorbestimmten minimalen nachweisbaren Mengen der sich in der Testlösung befindenden Analyten ausgewählt. Die Menge von jedem der sbp-Mitglieder, die mit der immunsorbierenden Zone in Kontakt tritt, ist vorzugsweise gleich der Menge des entsprechenden Analyten in der Testlösung, der mit der immunsorbierenden Zone in Kontakt tritt, oder überschreitet diese. Jedoch kann die Menge des sbp-Mitglieds hundert oder mehr Mal geringer sein als die entsprechende Menge an Analyt, die mit der immunsorbierenden Zone in Kontakt tritt.
Ein oder mehrere sbp-Mitglieder und Mitglieder des signalerzeugenden Systems können im wesentlichen gleichförmig an eine immunsorbierende Zone auf dem Streifen gebunden sein. Die Menge jedes sbp-Mitglieds und Mitglieds des signalerzeugenden Systems, die gebunden ist, hängt von dem speziellen verwendeten Assayprotokoll ab.
Beim Durchführen eines Assays unter Verwendung der vorliegenden Vorrichtung beinhaltet das Protokoll normalerweise das Vereinigen der Probe, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält, und anderer Reagenzien, wie für das gewählte Assayprotokoll benötigt, in einem wäßrigen Medium, um die wäßrige Testlösung zu bilden. In einigen Fällen ist die Testlösung die Probe selbst. Die Probe kann von einer großen Vielfalt von Quellen abstammen, wie beispielsweise physiologischen Flüssigkeiten, erläutert durch Speichel, Blut, Serum, Plasma, Urin, Augenlinsenflüssigkeit, Rückenmarksflüssigkeit usw., Nahrungsmittelprodukten, wie Milch und Wein, chemischen Prozeß-Strömen, Nahrungsmittelabwasser usw.
Mit Bezug nun auf die Fig. 1-5 wird die Testlösung durch die Vorrichtung 20 oder 22 in die Vorrichtung 10 eingeführt, um mit einem Teil des Streifens 14 in Kontakt zu treten. Die Testlösung wird durch den Kontaktteil durch Kapillarwirkung entlang dem Streifen 14 gezogen. Als nächstes kann ein flüssiges Assayreagenz, wie beispielsweise ein mit Enzym markiertes sbp-Mitglied, durch die Vorrichtung 20 oder 22, gewöhnlich durch die Vorrichtung, die von der für die Testlösung verwendeten verschieden ist, in die Vorrichtung eingeführt werden. Im allgemeinen wird es vorzuziehen sein, dieses flüssige Reagenz durch die Öffnung 22 einzuführen, wenn die Testlösung durch die Öffnung 20 zugeführt worden ist. Das Reagenz tritt mit einem Teil des Streifens 14 in Kontakt, gewöhnlich einschließlich eines Teils des Streifens, mit dem das flüssige Reagenz in Kontakt getreten ist. Zusätzliche flüssige Reagenzien werden abhängig von den Erfordernissen des Assays da zugegeben und können zu jeder der Öffnungen gegeben werden, außer daß das letzte flüssige Reagenz, das mit der immunsorbierenden Zone in Kontakt tritt, gewöhnlich zuletzt zugegeben wird und häufig durch die Öffnung 22 zugegeben wird. Dieses Reagenz kann eine Waschlösung sein und kann chemische Mittel, die einen Teil des signalerzeugenden Systems bilden, enthalten. Wenn ein Enzym als Marker verwendet wird, schließt das chemische Mittel gewöhnlich ein Substrat ein, normalerweise in ausreichender Konzentration, damit es nicht geschwindigkeitsbegrenzend ist (größere Konzentration als Km), welches für das Enzymsystem geeignet gepuffert ist.
Wie oben erwähnt, kann der Kontaktteil auch als immunsorbierende Zone dienen, oder getrennte immunsorbierende Zonen können verwendet werden, abhängig von dem speziellen gewählten Assayprotokoll. Man läßt gewöhnlich das Befeuchten des Streifens durch Kapillarwirkung so andauern, daß eine ausreichende Menge an Assayreagenzien durch die immunsorbierende Zone wandert oder daran gebunden wird, je nach Fall. Nachdem die Flüssigkeit den Streifen durchwandert hat, wird die immunsorbierende Zone auf die Anwesenheit eines nachweisbaren Signals überprüft.
Meistens sind relativ kurze Zeiten am Durchwandern der Lösungen durch den Streifen beteiligt. Gewöhnlich dauert die Durchwanderung der Lösungen über den Streifen hinweg mindestens 30 Sekunden und nicht mehr als 1 Stunde, gewöhnlicher ungefähr 1 Minute bis 30 Minuten. Wenn ein Enzym in den signalerzeugenden Mitteln verwendet wird, liegt die Entwicklung des Signals gewöhnlich im Bereich von 30 Sekunden bis 30 Minuten, gewöhnlicher von ungefähr 30 Sekunden bis 5 Minuten.
Man läßt vor dem Messen des Signals eine ausreichende Zeit verstreichen, um eine Menge der signalerzeugenden Bindung zu erzeugen. Nachdem die Gelegenheit gegeben worden ist, daß sich ein nachweisbares Signal bildet, ist es bekannt, ob mindestens einer der Analyten in der Probe bei oder oberhalb einer vorbestimmten minimalen nachweisbaren Menge anwesend ist oder nicht.
Der Streifen kann vor dem Assay unbehandelt sein, oder er kann mit einer großen Vielfalt von Materialien beschichtet sein, um für verbesserte Eigenschaften zu sorgen. Die Beschichtungen können Proteinbeschichtungen, Polysaccharidbeschichtungen, synthetische Polymere, Zucker oder dergleichen einschließen, welche insbesondere verwendet werden, um die Stabilität von irgendwelchen Materialien, die an den Streifen gebunden sind, zu verbessern. Diese Verbindungen können auch verwendet werden, um eine nicht-spezifische Bindung von Materialien, wie beispielsweise Antikörpern, Antigenen, Markern und Bindung oder dergleichen, zu steuern.
Der Streifen kann mit reaktiven Funktionalitäten aktiviert sein, um für eine kovalente Bindung der an den Streifen zu konjugierenden organischen Materialien, wie denjenigen, die im US-Patent Nr. 4,168,146 beschrieben werden, zu sorgen.
Sbp-Mitglieder und, falls gewünscht, Mitglieder des signalerzeugenden Systems können an das Stück saugfähige Material oder den Streifen durch Adsorption anstelle von kovalenter Bindung gebunden werden. Eine derartige Bindung kann nicht-diffundierend oder diffundierend sein, abhängig davon, ob das Assayprotokoll die Bewegung eines derartigen Mitglieds entlang dem Streifen erfordert oder nicht. Dies kann das Inkontaktbringen des saugfähigen Materials mit einer Lösung, die die an den Streifen zu bindenden Materialien enthält, und das Gestatten, daß der Streifen trocknet, oder, wenn die Bindung diffundierend ist, das Auftragen des trockenen Lösungsmittels beinhalten. Wenn die Bindung nichtdiffundierend ist, kann eine anschließende Behandlung mit Proteinen, Detergentien, Polysacchariden oder anderen Materialien, die nicht-spezifische Bindungsstellen blockieren können, erforderlich sein. Das saugfähige Material kann auch in der Lage sein, Perlen, die mit einem sbp-Mitglied beschichtet sind, einzufangen.
In anderen Ausführungsformen der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist eine dritte Öffnung zwischen den ersten beiden Öffnungen angeordnet (Fig. 6-9), oder ein flüssiges Reagenz ist einem zerbrechbaren verschlossenen Behälter innerhalb der Vorrichtung enthalten (Fig. 10-13). Nach Zugabe der Probe durch eine der Öffnungen kann das letzte flüssige Reagenz, das mit der immunsorbierenden Zone in Kontakt treten soll, durch Zerbrechen des verschlossenen Behälters oder durch Zugabe durch die gleiche oder eine verschiedene Öffnung zugegeben werden. Dieses Reagenz kann gemäß dem Prinzip der vorliegenden Erfindung durch irgendeine Öffnung zugegeben werden, lediglich vorausgesetzt, daß sowohl die Probe als auch das flüssige Reagenz mit der immunsorbierenden Zone in Kontakt treten, aber es wird häufig wünschenswert sein, dieses Reagenz bei einer Öffnung zuzugeben, die nicht zwischen der Öffnung, zu der die Probe zugegeben worden war, und der immunsorbierenden Zone liegt. Während oder vor der Zeitspanne des Flusses dieses Reagenz können zusätzliche Reagenzien hinzugefügt werden, lediglich vorausgesetzt, daß sie durch den Fluß mitgeschleppt und zu der immunsorbierenden Zone getragen werden. Der Fluß sorgt auch dafür, daß die Stellen auf dem Streifen, die gegenüber der ersten Öffnung und der Nachweiszone liegen, mit minimalen Durchführungsschritten gewaschen werden. In einer derartigen Ausführungsform kann das im Gehäuse eingeschlossene saugfähige Material ein spezifisches Bindungspaar(sbp)-Mitglied nicht-diffundierbar an einer Stelle auf dem saugfähigen Material gebunden aufweisen, und ein markiertes sbp-Mitglied kann diffundierbar zwischen der ersten und dritten Öffnung auf dem saugfähigen Material abgeschieden sein.
Eine Anwendung der Vorrichtung sorgt für zeitlich gestaffelte Reagenzzugaben, obwohl das Bedienungspersonal alle Schritte in rascher Aufeinanderfolge durchführt. In diesem Protokoll werden Probe und notwendige Reagenzien durch eine Öffnung gegeben. Zweite Reagenzien werden durch eine zweite Öffnung gegeben und das letzte flüssige Reagenz, das mit der immunsorbierenden Zone in Kontakt treten soll, wird durch eine dritte Öffnung gegeben, die am weitesten stromaufwärts und relativ zur allgemeinen Flußrichtung liegt (Fig. 6-9) oder durch Zerbrechen eines Behälters in der Vorrichtung bereitgestellt wird (Fig. 10-13). Da für die Kapillarwanderung dieses Reagenz über jede der Öffnungen hinaus Zeit erforderlich ist, kann die Inkubationszeit von Reagenzien, die an einer verschiedenen Öffnung oder durch Zerbrechen des Behälters zugegeben werden, an jeder Öffnung vor dem Transport zu dieser Öffnung durch die Entfernungen zwischen jeder der Öffnungen und dem zerbrechbaren Behälter gesteuert werden.
Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung betrifft die Form der Vertiefungen innerhalb der Öffnungen. Während diese häufig zylindrisch, konisch, oval oder rechteckig sind, wie oben erwähnt, ist es in einigen Fällen wünschenswert, eine angrenzende Vertiefung oder Leiste, z. B. 320a, bereitzustellen, die mit einer oder mehreren Vertiefungen verbunden ist, wo ein Reagenz oder eine Probe abgesetzt werden kann, ohne mit dem Streifen in Kontakt zu treten (Fig. 14-17). Die Zugabe eines zweiten Reagenz veranlaßt das erste Reagenz, sich damit zu mischen, und die Mischung fließt auf den Streifen.
Die Vorrichtung der Erfindung kann in einer großen Vielfalt von Assayverfahren und Protokollen verwendet werden. Im allgemeinen umfassen die Assayverfahren die folgenden Schritte:
(a) Einführen einer Testlösung, die eine Probe umfaßt, von der man annimmt, daß sie einen Analyten enthält, in die Vorrichtung der Erfindung durch eine erste Öffnung,
(b) Gestatten, daß die Testlösung mindestens einen Teil der immunsorbierenden Zone durchwandert,
(c) Einführen eines flüssigen Reagenz in die Vorrichtung durch eine zweite Öffnung, wodurch das Reagenz mindestens einen Teil der immunsorbierenden Zone durchwandert, und
(d) Beobachten der immunsorbierenden Zone auf die Anwesenheit eines Signals in Beziehung zu der Anwesenheit eines Analyten in der Probe.
Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung, nicht zur Beschränkung gegeben. Das US-Patent Nr. 4,366,241 beschreibt ein Assayverfahren zur Bestimmung von sbp-Mitgliedern. Die Vorrichtung weist eine immunsorbierende Zone auf, an die ein sbp-Mitglied gegen diffundierende Bewegung fixiert ist. Die immunsorbierende Zone liegt im allgemeinen gegenüber dem Eingang für die Probenlösung. In Flüssigkeits-aufnehmender Beziehung mit der immunsorbierenden Zone steht eine flüssigkeitsabsorbierende Zone.
Gewöhnlich wird in dem Verfahren in Verbindung mit der Vorrichtung ein signalerzeugendes System verwendet, das einen an ein sbp-Mitglied konjugierten Marker verwendet, der diffundierbar an den saugfähigen Träger gebunden oder als flüssiges Reagenz bereitgestellt werden kann. Die immunsorbierende Zone kann ein oder mehrere zusätzliche Mitglieder des signalerzeugenden Systems einschließen, die auf eine Weise an die Zone gebunden sind, um eine diffundierende Bewegung einer Komponente des signalerzeugenden Systems zu gestatten oder zu verhindern. Das flüssige Reagenz, das in einem zerbrechbaren Behälter vorliegen kann, enthält gewöhnlich irgendwelche verbleibenden Mitglieder des signalerzeugenden Systems in einem Waschpuffer. Gemäß dem Verfahrensprotokoll wird die Menge an gebundenem Marker in der immunsorbierenden Zone mit der Menge an Analyt in der Probe in Beziehung gesetzt.
Das signalerzeugende System sorgt für ein nachweisbares Signal in der immunsorbierenden Zone in Beziehung zu der Menge an daran gebundenem Marker, das mit einem Signalpegel verglichen werden kann, der auf einem Standard mit einer bekannten Menge Analyt basiert oder auf Vergleich mit einem Teil des saugfähigen Materials, das nicht die immunsorbierende Zone ist, basiert.
Eine spezielle Ausführungsform des Verfahrens des US-Patents Nr. 4,366,241 wird im US-Patent Nr. 4,632,901 beschrieben. Das letztgenannte Patent offenbart eine Apparatur und eine Vorrichtung zur Durchführung von Immunassays. Die Apparatur umfaßt ein erstes Element, das eine Membran oder ein Filter ist, an die bzw. den ein Antikörper, typischerweise ein monoklonaler Antikörper, gebunden ist. Eine derartige Membran mit Antikörper entspricht einer immunsorbierenden Zone. Das Verfahren verwendet weiter ein zweites Element, das aus absorbierendem Material zusammengesetzt ist, welches, wenn es mit dem ersten Element in Kontakt steht, die Induktion eines Flusses durch das erste Element bewirkt, wenn eine flüssige Probe zu ihm gegeben wird. Dieses Verfahren kann mit der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, indem man eine Probe, die einen antigenen Analyten enthält, durch eine erste Öffnung auf das erste Element, an das ein Antikörper nichtdiffundierbar gebunden ist, aufträgt. Nach Zugabe der Probe folgt die Zugabe eines flüssigen Mediums, das mit Enzym markierten Antikörper gegen das Antigen, das getestet wird, enthält, durch eine zweite Öffnung. Das erste Element wird dann mit Enzymsubstraten in Kontakt gebracht und durch Zugabe einer Substratlösung zu der ersten Öffnung oder zu einer dritten Öffnung oder mittels des Zerbrechens eines zerbrechbaren Behälters gewaschen. Die Anwesenheit von mit Enzym markiertem Antikörper auf dem ersten Element, die durch die Bildung von durch Enzym katalysiertem Produkt nach Waschen angezeigt wird, zeigt die Anwesenheit des Antigens in der zu testenden Probe an. Die Vorrichtung und das Protokoll der vorliegenden Erfindung stellen eine Verbesserung gegenüber dem Protokoll des US-Patents 4,632,901 dar, indem alle getrennten Waschschritte beseitigt wurden und nur ein oder zwei flüssige Reagenzien erforderlich sind, die nicht in der Vorrichtung inkorporiert sind.
Ein anderes Beispiel für ein Assayverfahren, in dem die vorliegende Vorrichtung verwendet werden kann, wird in EP-A-191,640 beschrieben. Das Verfahren dient zur Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält. Das Verfahren beinhaltet das Inkontaktbringen einer Testlösung, die die Probe und ein erstes sbp-Mitglied enthält, mit einem Teil eines Streifens saugfähigen Materials, der in der Lage ist, von der Testlösung durch Kapillarwirkung durchwandert zu werden. Das erste sbp-Mitglied ist in der Lage, den Analyten zu binden. Der Streifen enthält ein zweites sbp-Mitglied als Einheit damit zum Konzentrieren und nicht-diffundierbaren Binden des ersten sbp-Mitglieds an einer kleinen Stelle oder immunsorbierenden Zone auf den Streifen, die von dem Kontaktteil des Streifens getrennt vorliegt. Ein nachweisbares Signal wird in Beziehung zur Anwesenheit des Analyten in der Testlösung erzeugt. Die Testlösung wandert durch die immunsorbierende Zone, wenn die Testlösung das saugfähige Material durchwandert. Nachdem man die Testlösung mindestens einen Teil des Streifens durchwandern hat lassen, wird der Streifen mit einer Entwicklerlösung in Kontakt gebracht, die Mitglieder eines signalerzeugenden Systems enthält. Unter Verwendung der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann eine derartige Entwicklerlösung durch die zweite Öffnung in die Vorrichtung oder durch Zerbrechen des zerbrechbaren Behälters eingeführt werden. Falls notwendig, kann der Streifen mit irgendwelchen anderen Mitgliedern des signalerzeugenden Systems entweder vor oder nach dem Inkontaktbringen mit der Entwicklerlösung durch Einführen durch eine der Öffnungen in Kontakt gebracht werden. Das nachweisbare Signal, das an der immunsorbierenden Zone erzeugt wird, wird dann mit dem Signal, das an einem Teil des Streifens nachweisbar ist, bei dem es sich nicht um die immunsorbierende Zone handelt, oder mit dem Signal, das von einer Kontrollprobe erzeugt wird, verglichen, um den Analyten in der Probe zu bestimmen. Das Signal, das an der immunsorbierenden Zone erzeugt wird, kann ein scharfrandiges unterscheidungskräftiges Muster aufweisen, das für einen scharfen Kontrast zu dem Signal sorgt, das an angrenzenden Stellen auf dem Streifen erzeugt wird, wenn Analyt in der Testlösung anwesend ist.
Ein weiteres Beispiel für ein Assayverfahren, in dem die vorliegende Vorrichtung verwendet werden kann, wird in EP-A-0259157 beschrieben. Ein derartiges Verfahren richtet sich auf die Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält. Das Verfahren beinhaltet das Inkontaktbringen einer Testlösung, die die Probe, einen Antikörper gegen den Analyten und ein Konjugat des Analyten und eines Markers enthält, mit einem Kontaktteil eines Stücks saugfähigen Materials, das in der Lage ist, mindestens in einer Richtung von der Testlösung durch Kapillarwirkung durchwandert zu werden. Das saugfähige Material enthält eine immunsorbierende Zone mit einem ersten Rezeptor, der sich an das Konjugat binden kann, das nicht-diffundierbar auf dem saugfähigen Material getrennt vom Kontaktteil gebunden vorliegt. Das saugfähige Material enthält weiter einen zweiten Rezeptor, der sich an den Antikörper gegen den Analyten zwischen der immunsorbierenden Zone und dem Kontaktteil binden kann. Der zweite Rezeptor ist nicht-diffundierbar an das saugfähige Material gebunden. Man läßt mindestens einen Teil der Testlösung das saugfähige Material durch Kapillarwirkung durchwandern und dadurch mit der immunsorbierenden Zone in Kontakt treten. Die Zone wird auf die Anwesenheit des Konjugats überprüft. Zu diesem Zweck kann der Streifen einem signalerzeugenden Mittel ausgesetzt werden, das in der Lage ist, mit dem Marker, gewöhnlich einem Enzymsubstrat, welchselzuwirken, um ein Signal in Beziehung zu der Menge an Analyt in der Testlösung zu erzeugen. Vorzugsweise wird die immunsorbierende Zone vor oder während der Einwirkung des signalerzeugenden Mittels gewaschen. Das signalerzeugende Mittel kann durch eine zweite Öffnung, die zwischen dem zweiten Rezeptor und der immunsorbierenden Zone liegt, in eine Vorrichtung der vorliegenden Erfindung eingeführt werden. Die Zone wird dadurch gewaschen, und das Signal, das an der immunsorbierenden Zone erzeugt wird, kann dann nachgewiesen werden.
Ein anderes Beispiel für einen Assay, in dem die vorliegende Vorrichtung verwendet werden kann, ist in EP-A2-0267006 offenbart. In dem Verfahren wird die Anwesenheit von mehr als einer vorbestimmten minimalen nachweisbaren Menge eines oder mehrerer Analyten in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie eine Mehrzahl von Analyten enthält, bestimmt. Jeder Analyt ist ein sbp-Mitglied. Das Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen eines Kontaktteils eines Stücks saugfähigen Materials, das mindestens in einer Richtung von der Testlösung durch Kapillarwirkung durchwandert werden kann, mit einer Testlösung, die die Probe und vorbestimmte Mengen von zwei oder mehr ersten sbp-Mitgliedern, jedes jeweils analog zu einem der Analyten, enthält. Das saugfähige Material enthält vorbestimmte Mengen von zwei oder mehr zweiten sbp-Mitgliedern, jedes jeweils in der Lage, einen der Analyten und das entsprechende erste sbp-Mitglied zu binden. Die zweiten sbp-Mitglieder sind nicht-diffundierbar mindestens zwischen dem Kontaktteil und einer vorbestimmten Stelle oder immunsorbierenden Zone auf dem Stück saugfähigen Material getrennt von dem Kontaktteil an das saugfähige Material gebunden, so daß in Anwesenheit von mehr als einer vorbestimmten Menge an Analyt das analoge erste sbp-Mitglied mindestens zu der vorbestimmten Stelle auf dem Stück saugfähigen Material wandert. Als nächstes läßt man mindestens einen Teil der Testlösung das saugfähige Material mittels Kapillarwanderung durchwandern. Die vorbestimmte Stelle wird auf die Anwesenheit eines oder mehrerer der ersten sbp-Mitglieder überprüft, welche gewöhnlich durch die Anwesenheit eines nachweisbaren Signals angezeigt wird. Die vorbestimmte Stelle kann einem signalerzeugenden Mittel ausgesetzt werden, das in der Lage ist, mit den ersten sbp-Mitgliedern wechselzuwirken, um ein nachweisbares Signal an der vorbestimmten Stelle in Beziehung zu der Anwesenheit von einem oder mehreren der Analyten in der Probe zu erzeugen. Derartige signalerzeugende Mittel können durch die zweite Öffnung oder durch Zerbrechen eines zerbrechbaren Behälters in die Vorrichtung der Erfindung eingeführt werden, um mit dem saugfähigen Material in Kontakt zu treten.
Ein anderes Beispiel für eine Assaytechnik, in der die vorliegende Vorrichtung Verwendung findet, wird in EP-A2-0271204 beschrieben. In diesem Verfahren wird die Anwesenheit eines Analyten in einer Probe, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält, bestimmt. Der Analyt ist ein sbp-Mitglied. Das Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen eines Kontaktteils eines Stücks saugfähigen Materials, das in mindestens einer Richtung von der Testlösung durch Kapillarwanderung durchwandert werden kann, mit einer Testlösung, die die Probe und ein erstes zu dem Analyten analoges sbp-Mitglied enthält. Das saugfähige Material enthält ein zweites sbp-Mitglied, das den Analyten und das erste sbp-Mitglied binden kann. Das zweite sbp-Mitglied ist nicht-diffundierbar an das saugfähige Material an mindestens einem Teil desselben zwischen dem Kontaktteil und einer kleinen Stelle oder immunsorbierenden Zone auf dem Stück, das vom Kontaktteil getrennt vorliegt, gebunden. Die Oberfläche der Stelle ist wesentlich kleiner als die des Stücks saugfähigen Materials. Die Stelle ist in der Lage, das erste, nicht an das zweite sbp-Mitglied gebundene sbp-Mitglied zu binden. Als nächstes läßt man mindestens einen Teil der Testlösung das saugfähige Material mittels Kapillarwanderung durchwandern und dadurch mit der Stelle in Kontakt treten. Die Stelle wird auf die Anwesenheit des ersten sbp-Mitglieds an der Stelle überprüft, welche gewöhnlich durch die Anwesenheit eines nachweisbaren Signals angezeigt wird. Ein derartiges Signal kann durch Einwirken eines signalerzeugenden Mittels, das mit dem ersten sbp-Mitglied wechselwirken kann, um ein nachweisbares Signal an der Stelle in Beziehung zu der Menge an Analyt in der Probe zu erzeugen, auf die Stelle erzeugt werden. Das signalerzeugende Mittel kann mittels einer zweiten Öffnung oder durch Zerbrechen eines zerbrechbaren Behälters in die Vorrichtung der Erfindung eingeführt werden. Das Signal an der Stelle ist von Signal unterscheidbar, das an Teilen des saugfähigen Materials, die von der Stelle verschieden sind, nachweisbar ist.
Noch ein anderes Beispiel für ein Assayverfahren, in dem die vorliegende Vorrichtung verwendet werden kann, wird im US-Patent Nr. 4,552,839 beschrieben, und eine Variante desselben im US-Patent Nr. 4,623,461. Das US-Patent Nr. 4,552,839 offenbart Verfahren und Zusammensetzungen zur Bestimmung der Anwesenheit von Analyten in einem Teilchen enthaltenden Medium, worin der interessierende Analyt an ein Teilchen in einer Probe gebunden sein kann oder nicht. Durch Inkontaktbringen des Assaymediums mit einem saugfähigen Material an einer Flüssigkeit-Luft-Grenzfläche kann eine kleine Stelle, gewöhnlich ein dünnes Band oder ein konzentrierter Punkt, von Teilchen angrenzend an die Grenzfläche erhalten werden, wobei die Stelle für ein Signal sorgt, das zu der Anwesenheit von Analyt in der Probe in Beziehung gesetzt werden kann. Die Teilchen schließen synthetische Teilchen, Zellen und Immunkomplexaggregate ein. Die Größe und Natur der Teilchen sowie die Natur des wäßrigen Mediums können verwendet werden, um die Bildung der kleinen Stelle zu modulieren. In einigen Ausführungsformen dieses Verfahrens werden als nächstes ein oder mehrere Mitglieder eines signalerzeugenden Systems in einem flüssigen Medium mit dem saugfähigen Material in Kontakt gebracht. Ein derartiges flüssiges Medium kann durch die zweite Öffnung in eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung eingeführt werden.
In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Vorrichtung für serologische Tests, wie beispielsweise den Test auf Antikörper gegen beispielsweise HIV, HBV, Röteln, Syphilis usw., verwendet werden. In einer derartigen Ausführungsform wird die Probe mit einem Antigen in einem flüssigen Medium vereinigt. Jeglicher gebildete Immunkomplex muß vom nicht-spezifischen Immunglobulin in der Probe abgetrennt werden. Nur dann kann man Anti-Immunglobulin mit dem Immunkomplex in Kontakt treten lassen. Wenn der Marker ein Enzym ist, muß der Immunkomplex vom markierten Anti-Immunglobulin vor Inkontaktbringen desselben mit einem Enzymsubstrat abgetrennt werden. Unter Verwendung der Vorrichtung der Fig. 10-13 können diese Schritte durch Zugabe all der Reagenzien in Aufeinanderfolge bewerkstelligt werden. Eine Serumprobe wird mit Latexperlen, die mit Antigen beschichtet sind, vereinigt und zu der Öffnung 222 der Vorrichtung 210 gegeben. Alternativ ist die Leiste 320a der Vorrichtung der Fig. 14-17 an der Öffnung 222 der Vorrichtung 210 eingebaut (Fig. 10-13). Die Serumprobe wird auf der Leiste abgesetzt, und eine Suspension der Latexperlen wird zur Öffnung 222 gegeben, wobei das Serum und die Latexsuspension auf den Streifen gespült werden. Mit Enzym markiertes Rezeptorimmunglobulin wird als nächstes zur Öffnung 220 gegeben, und der zerbrechbare Behälter wird zerbrochen, wobei eine Waschlösung, die Enzymsubstrate enthält, freigesetzt wird. Während die Substratlösung auf die Vertiefungen zuwandert, hat die Immunglobulinrezeptor-Lösung Zeit, auf die Latexperlen, die gegenüber der Öffnung 222 eingefangen worden sind, zu zu wandern und mit ihnen in Kontakt zu treten, wo sie mit irgendwelchen gebundenen Antikörpern reagieren kann. Die Substratlösung wandert anschließend über die Latexperlen hinaus in die entgegengesetzte Richtung, wobei sie wirksam die Perlen wäscht und sie dem Substrat aussetzt, welches in ein nachweisbares Produkt im Verhältnis zu der Menge an Konjugat, das sich an die Perlen gebunden hat, in ein nachweisbares Produkt überführt wird. Man läßt eine ausreichende Zeit zur Inkubation verstreichen, damit sich Produkt auf dem Streifen gegenüber der ersten Öffnung bildet, wenn Enzym an der Öffnung anwesend ist. Das Bedienungspersonal kann zurückkehren, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Farbe an der Öffnung 222 nach einem Zeitraum, der mindestens lang genug ist, um diese Ereignisse stattfinden zu lassen, zu betrachten. In diesem Verfahren kann die Öffnung 220 auch als Farbbezug dienen, um die Definition der Menge an Farbe an der Öffnung 222 zu unterstützen. Vorzugsweise weisen die Perlen einen Durchmesser von weniger als 5 um auf.
Ein verwandtes Verfahren kann verwendet werden, um einen Assay für ein Antigen, beispielsweise für das Chlamydien-Antigen, durchzuführen. Beispielsweise können unter Verwendung einer Vorrichtung mit einer zerbrechbaren Kapsel, die Entwickler enthält (Fig. 10-13), die Probe und der Antikörper gegen Chlamydien nacheinander durch eine Öffnung gegeben werden, eine Lösung, die mit Enzym markierte Anti-Immunglobuline enthält, kann durch eine zweite Öffnung gegeben werden, und die Kapsel kann zerbrochen werden, um Enzymsubstrat und Waschlösung freizusetzen. Während eines Inkubationszeitraums absorbiert die Probe in den Streifen, und Antigen-Antikörper-Komplex wird an den Streifen gebunden, falls Antigen anwesend ist. Das mit Enzym markierte Anti-Immunglobulin tritt dann mit dem Komplex durch Kapillarwanderung oder durch Wanderung, die durch den Kapillarfluß des Enzymsubstrats und der Waschlösung getrieben wird, in Kontakt und wird sich mit irgendwelchem Komplex, der anwesend ist, verbinden. Die Waschlösung wäscht dann den Komplex frei von überschüssigem Konjugat und stellt schließlich das Substrat zur Verfügung, um eine Enzym-katalysierte Bildung eines nachweisbaren Signals an der ersten Öffnung zu gestatten.
Eine Vorrichtung mit zwei Öffnungen und einer Nachweiszone kann in einem Assay für Human-Choriongonadotrophin (HCG) verwendet werden. In diesem Verfahren wird an der ersten Öffnung ein Konjugat eines Enzyms mit Anti-HCG auf dem Streifen getrocknet, und ein zweiter Anti-HCG-Antikörper wird an einer Nachweiszone auf dem Streifen stromabwärts von der ersten Öffnung immobilisiert. Der Assay kann durchgeführt werden, indem man eine Probe, von der man annimmt, daß sie HCG enthält, an der ersten Öffnung zugibt und gleichzeitig eine Entwicklerlösung, die Enzymsubstrat enthält, an der zweiten Öffnung zugibt. Während anschließender Inkubation bindet sich HCG an das Konjugat, der Komplex wird durch den sich bewegenden Entwickler zu der Nachweiszone getragen, wo er bindet, und der gebundene Komplex wirkt auf das Substrat, um Farbe an der Nachweiszone zu erzeugen, wenn HCG in der Probe anwesend ist.
Aus Bequemlichkeitsgründen kann die vorliegende Vorrichtung in einem Kit in abgepackter Kombination mit Reagenzien in vorbestimmten Mengen zur Verwendung beim Testen auf einen Analyten bereitgestellt werden. Abhängig von dem speziellen beteiligten Assay können die Reagenzien mit Enzym markiertes sbp-Mitglied, Substrat für das Enzym, Puffer, irgendwelche zusätzlichen Substrate und Cofaktoren, die für die Enzyme erforderlich sind, Farbstoffvorläufer und dergleichen einschließen. Zusätzlich können andere Additive wie Stabilisatoren, Puffer und dergleichen eingeschlossen sein. Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien können in weitem Bereich variieren, um für Konzentrationen der Reagenzien in Lösung zu sorgen, die wesentlich die Empfindlichkeit des Assays optimieren. Falls angezeigt, kann die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in einer luftdichten Packung verpackt sein, um die Aktivität von irgendwelchen immunchemischen Mitteln aufrechtzuerhalten.
Obwohl die vorangehende Erfindung mittels Erläuterung und Beispiel für die Zwecke der Klarheit und des Verständnisses in einiger Einzelheit beschrieben worden ist, ist es offensichtlich, daß gewisse Veränderungen und Abwandlungen innerhalb des Bereichs der beigefügten Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

1. Vorrichtung (10) zur Durchführung eines Assays für die Bestimmung eines Analyten in einer Probe, wobei die Vorrichtung umfaßt:

(a) ein Gehäuse (12),

(b) ein Festhaltemittel (14), das in dem Gehäuse (12) eingeschlossen ist, zum Festhalten eines ersten Mitglieds eines spezifischen Bindungspaars (sbp) in einer Zone und zum Gestatten, daß Flüssigkeit durch Kapillarwirkung von der Zone wegtransportiert wird,

(c) ein erstes Einlaßmittel (20) in das Gehäuse (12) zum Einführen der Probe in die Vorrichtung (10) und

(d) ein zweites Einlaßmittel (22) in das Gehäuse (12) zum Einführen von flüssigem Reagenz, das von der Probe verschieden ist, in die Vorrichtung (10), ohne daß das flüssige Reagenz auch durch das erste Einlaßmittel eingeführt wird; und worin ein Teil des Festhaltemittels (14) in Flüssigkeits-aufnehmender Beziehung zu dem ersten und zweiten Einlaßmittel (20, 22) steht.

2. Vorrichtung (10) nach Anspruch 1, worin das Festhaltemittel (14) ein saugfähiges Material umfaßt, das immunosorbierend ist oder in der Lage ist, immunosorbierend gemacht zu werden.

3. Vorrichtung (10) nach Anspruch 2, worin das saugfähige Material (14) ein an es gebundenes Mitglied eines spezifischen Bindungspaars (sbp) aufweist, vorzugsweise worin das sbp-Mitglied ein Antikörper oder ein Antigen ist.

4. Vorrichtung (10) nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, worin ein zweites Stück saugfähigen Materials (16) in Flüssigkeits-aufnehmender Beziehung zu dem saugfähigen Material (14) steht.

5. Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, die weiter ein oder mehrere flüssige Reagenzien (248), die für anschließende Freisetzung in mindestens einem Behälter (246) eingeschlossen sind, zum Durchführen eines Assayverfahrens für die Bestimmung eines Analyten in einer Probe in dem Gehäuse (12) eingeschlossen enthält.

6. Vorrichtung (10) nach Anspruch 5, worin das Reagenz oder die Reagenzien (248) in einem in Wasser unlöslichen, zerbrechbaren Behälter (246) enthalten sind und das (die) flüssige(n) Reagenz(ien) (248) ein Enzymsubstrat enthalten.

7. Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin das erste und zweite Einlaßmittel (20, 22) Öffnungen in der Vorrichtung sind.

8. Verfahren zur Durchführung eines Immunassays für einen Analyten, von dem angenommen wird, daß er sich in einer Probe befindet, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) das Einführen einer Testlösung, die eine Probe umfaßt, von der man annimmt, daß sie einen Analyten enthält, in die Vorrichtung (10) nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 durch das erste Einlaßmittel (20),

(b) das Gestatten, daß die Testlösung mindestens einen Teil der Zone durchquert,

(c) das Einführen eines flüssigen Mittels (248) in die

Vorrichtung (10) durch das zweite Einlaßmittel (22), wodurch das Mittel mindestens einen Teil der Zone durchquert, und

(d) das Beobachten der Zone auf die Anwesenheit eines Signals, das in Beziehung zur Anwesenheit von Analyten in der Probe steht.

9. Testsatz zur Durchführung eines Assayverfahrens, wobei der Testsatz in abgepackter Kombination mit anderen Assaykomponenten die Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt.