DE3887941T3

DE3887941T3 - Testvorrichtung mit mehrfachen Öffnungen.

Info

Publication number: DE3887941T3
Application number: DE3887941T
Authority: DE
Inventors: Martin Becker; Geoffrey A Dafforn; Nurith Kurn; Edwin F Ullman
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1987-09-04
Filing date: 1988-09-02
Publication date: 1998-07-09
Anticipated expiration: 2008-09-03
Also published as: EP0306336A2; ES2051303T3; EP0306336B1; DE3887941D1; EP0306336B2; JPS6472066A; EP0306336A3; DE3887941T2; ES2051303T5; JP2907339B2; CA1333046C; US4981786A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen zur Durchführung von Assays. Die Möglichkeit, auf bestimmte Verbindungen gerichtete Rezeptoren beim Untersuchen der Gegenwart einer Verbindung von Interesse zu verwenden, schuf den expandierenden Geschäffsbereich diagnostischer Assays. Im Lauf der Jahre wurden zahlreiche vereinfachte Versuchssysteme zum raschen Nachweis von Materialien von Interesse in biologischen und industriellen Flüssigkeiten entwickelt. Diese Systeme oder Vorrichtungen umfassen in ihrer einfachsten Form üblicherweise eine Kombination eines Versuchsreagens, das spezifisch mit dem Material von Interesse reagieren kann, um eine visuelle Reaktion zu ergeben, und einen saugfähigen Träger für das Versuchsreagens. Papier ist das am häufigsten verwendete Trägermaterial Ein Teil des Trägers ist normalerweise mit einem oder mehreren der Versuchsreagentien getränkt oder beschichtet. Der die Versuchsreagentien enthaltende Teil des Trägers wird mit der das Material von Interesse enthaltenden Probe in Kontakt gebracht. Der Kontakt kann hergestellt werden, indem der Teil des Trägers mit den Versuchsreagentien in die Probe in einem wäßrigen Medium eingetaucht wird, oder es kann eine wäßrige Probe einen saugfähigen Träger durch Kapillarmigration durch den Teil des Trägers, der das Versuchsreagens enthält, überqueren. Die Versuchszone kann vorher oder während der Durchführung des Assays auf dem Träger gebildet werden.
Ein Verfahren mit einer konzentrierenden Zone findet häufige Anwendung. Das Verfahren umfaßt eine Vorrichtung, die eine immunsorbierende Zone, an der ein spezifisches Bindepaarmitglied nicht-diffundierbar fixiert ist. Die immunsorbierende Zone dient als Eintritt für die Probe und Reagenslösungen. In flüssigkeitsaufnehmender Beziehung (entweder direkt oder indirekt) mit der immunsorbierenden Zone steht eine flüssigkeitsabsorbierende Zone, die dazu dient, Flüssigkeit durch die immunsorbierende Zone hindurchzusaugen, Flüssigkeit zu speichern und möglicherweise die Rate zu steuern, mit der die Flüssigkeit durch die immunsorbierende Zone gesaugt wird. In Verbindung mit der Vorrichtung wird bei diesem Verfahren auch ein signalerzeugendes System verwendet, das ein Signamarkerelement besitzt, das an einem spezifischen Bindepaarmitglied konjugiert ist. Die immunsorbierende Zone kann ein oder mehrere Elemente des signalerzeugenden Systems enthalten, die solcherart mit der Zone verbunden sind, daß eine diffusive Bewegung der signalerzeugenden Systemkomponente ermöglicht oder verhindert wird. Cemäß der Arbeitsvorschriff des Verfahrens steht die Menge an Signalmarker, der in der Nachweiszone in der immunsorbierenden Zone gebunden ist, mit der Menge des Materials von Interesse in der Probe in Zusammenhang. Im Verfahren wird die Assayvorrichtung mit flüssiger Probe in Kontakt gebracht, der möglicherweise eine oder mehrere Komponenten des signalerzeugenden Systems zugegeben wurden. Die Vorrichtung kann anschließend mit einer oder mehreren Lösungen in Kontakt gebracht werden, die übrige Komponenten des signalerzeugenden Systems enthalten und dazu dienen, die immunsorbierende Zone von nicht-spezifisch gebundenem Signalmarker freizuwaschen. Das signalerzeugende System sorgt für ein detektierbares Signal in der immunsorbierenden Zone, das mit einem Signalwert auf der Basis eines Standards mit einer bekannten Analytenmenge verglichen werden kann.
Das Verfahren mit konzentrierender Zone wurde in einer Reihe kommerzieller Produkte angewendet, z.B. in der ICON -Vorrichtung (Hybritech Corporation, der TESTPACK - Vorrichtung (Abbott Laboratories) und der SUDS -Vorrichtung (Murex Corporation) Ein Problem mit den bekannten Vorrichtungen besteht darin, daß die Probelösung und die Wasch- und Reagenslösungen im allgemeinen über die gleichen Eintrittsöffnungen zugegeben werden und Abschnitte der Vorrichtungen, die durch diese Lösungen naß sind, anschließend zugegebene Wasch- oder Reagenslösungen sofort kontaminieren.
Ein Kapillartransportverfahren zur Durchführung qualitativer und/oder quantitativer Assays für einen Analyten sind ebenfalls bekannt. Der Assay umfaßt das In-Kontakt- Bringen eines Teils eines saugfähigen Materials mit einem den Analyten enthaltenden flüssigen Medium und gegebenenfalls mit anderen Elementen eines signalerzeugenden Systems, das ein markiertes spezifisches Bindepaarmitglied umfaßt. Das saugfähige Material enthält üblicherweise eine oder mehrere Zonen zum spezifischen Binden des Analyten. Das saugfähige Material kann auch an seiner Oberfläche ein oder mehrere Elemente eines signalerzeugenden Systems aufweisen. Das flüssige Medium wird das saugfähige Material durch Kapillarwirkung überqueren gelassen und das saugfähige Material mit übrigen Elementen des signalerzeugenden Systems in Kontakt gebracht. Die Gegenwart von Analyt in einer Probe kann durch Untersuchen des saugfähigen Materials auf ein Signal an der geeigneten Zone ermittelt und die Menge eines Analyten bestimmt werden, indem die Position einer Grenze zwischen Signal und Fehlen von Signal in einer Zone mit der Analytenmenge in der Probe in Beziehung gesetzt, die Anzahl an Zonen mit oder ohne Signal gezählt und die Anzahl an Zonen mit der Analytenmenge in Beziehung gesetzt wird. Beispiele für ein Kapillartransportverfahren, das der ersten Vorgangsweise entspricht, ist das Kapillarimmunchromatographie- Produkt, das unter dem Namen Acculevel (Syva Company) bekannt ist.
Es ist wünschenswert, eine Immunassayvorrichtung bereitzustellen, die für eine Vielzahl heterogener Assays geeignet ist. Die Vorrichtung sollte einfach, rasch, genau und sicher sein, sodaß sie auch von unqualifizierten Personen in Umgebungen außerhalb von Labors mit hohem technischem Standard verwendet werden kann. Weiters ist es wünschenswert, eine diagnostische Vorrichtung zur Durchführung solcher Assays bereitzustellen, worin die Kontaminierung verschiedener Reagentien während ihrer Zugabe zur Vorrichtung vermieden wird. Eine solche Vorrichtung wäre praktisch und effizient.
DE-C-3.445.816 betrifft eine diagnostische Hilfe unter Verwendung eines saugfähigen Streifens mit darauf befindlichen dehydratisierten Reagentien.
Ein Verfahren mit konzentrierender Zone in heterogenen Immunassays ist in US-Patent 4.366.241 beschrieben. Eine Versuchsvorrichtung zum Nachweis geringer Konzentrationen von Substanzen in Flüssigkeiten ist in US-3.811.840 beschrieben. Ein verbessertes heterogenes Immunassayverfahren und eine Vorrichtung dafür ist in EP-A- 141.547 beschrieben. US-4.517.288 offenbart ein Festphasensystem für Ligandassay. Ein integriertes Material zur chemischen Analyse und ein Verfahren zu seiner Verwendung ist in US-4.270.920 beschrieben. Die Leistungsfähigkeit von chemischen Routine-Reaktionen in mit Abteilen versehenen Behältern ist in US-3.825.410 beschrieben. Eine Immundiffusions-Plattenvorrichtung ist in US-3.645.687 beschrieben. Die Leistungsfähigkeit chemischer und biologischer Reaktionen innerhalb einer absorbierenden Matrixunterlage wird in US-3.888.629 besprochen. Eine Versuchsvorrichtung zum Untersuchen flüssiger Proben auf die Gegenwart eines vorbestimmten Reagens wird in US-4.246.339 erläutert. Ein immobilisierter Antikörper oder ein immobilisiertes Antigen für Immunassays wird in US-4.407.943 geoffenbart US-3.915.647 beschreibt eine Vorrichtung zur Bestimmugn der Konzentration einer Substanz in einer Flüssigkeit. US-4.632.901 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung für Immunassays. PCT-Anmeldung, Nr. WO-86/06488 beschreibt enie diagnostische Vorrichtung mit einer Vielzahl aufbrechbarer Behälter. EP-A-0291.176 offenbart eine Assayvorrichtung mit saugfähigem Material, die eine Y-Form definiert und zwei Eintrittsöffnungen an den Enden der Arme des Y aufweist. Zwei Flüssigkeiten bewegen sich demnach getrennt entlang der Arme fort und begegnen einander an der Gabelung, wo ein Sichtfenster angeordnet ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

In einem ersten Aspekt bietet die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung eines Assays zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, wobei die Vorrichtung folgendes umfaßt:
(a) ein Gehäuse,
(b) ein saugfähiges, im Gehäuse eingeschlossenes Material, das ein Einfangmittel bereitstellt, um ein erstes Mitglied eines spezifischen Bindepaars in einer Einfangzone einzufangen und es Flüssigkeit zu ermöglichen, durch Kapillarwirkung aus der Zone abtransportiert zu werden,
(c) ein erstes Einlaßmittel in das Gehäuse zum Einbringen der Probe in die Vorrichtung, sodaß sie in Kontakt mit einer ersten Zone des saugfähigen Materials kommt, und
(d) ein zweites Einlaßmittel in das Gehäuse, um ein anderes flüssiges Reagens als die Probe in die Vorrichtung einzubringen, ohne das flüssige Reagens auch durch das erste Einlaßmittel einzubringen, sodaß es in Kontakt mit einer zweiten Zone des saugfähigen Materials kommt; und worin das saugfähige Material eine Durchgangsrichtung für eine Versuchslösung durch Kapillarmigration bereitstellt, wobei die Richtung von der zweiten Zone zur und durch die erste Zone hindurch sowie weiter zur Einfangzone verläuft, wenn diese von der ersten Zone getrennt ist.
Die Vorrichtung der Erfindung findet in Assayverfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe Anwendung, die vermutlich den Analyten enthält. Die Erfindung betrifft weiters Sets zur Durchführung eines Assays. Die Vorrichtung der Erfindung ist ein kompaktes System, das zur bequemen Vor-Ort-Untersuchung einer Vielzahl von Analyten entwickelt wurde.

BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 ist eine perspektivische, leicht seitliche Draufsicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Fig. 1A ist eine Exposionsansicht der Vorrichtung von Fig. 1.
Fig. 2 ist eine Draufsicht auf die Vorrichtung von Fig. 1.
Fig. 3 ist eine Querschnittansicht der oberen Hälfte der Vorrichtung von Fig. 1 entlang der Linie 3-3.
Fig. 4 ist eine Draufsicht auf die untere Hälfte der Vorrichtung von Fig. 1.
Fig. 5 ist eine Querschnittansicht der Vorrichtung von Fig. 1 entlang der Linie 5-5.
Fig. 6 ist eine Draufsicht auf die Seite einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Fig. 7 ist eine Querschnittansicht der Spitze der Vorrichtung von Fig. 6 entlang der Linie 7-7.
Fig. 8 ist eine Draufsicht auf die untere Hälfte der Vorrichtung von Fig. 5.
Fig. 9 ist eine Querschnittansicht der Vorrichtung von Fig. 5 entlang der Linie 9-9.
Fig. 10 ist eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Fig. 11 ist eine Querschnittansicht der oberen Hälfte der Vorrichtung von Fig. 10 entlang der Linie 11-11.
Fig. 12 ist eine Draufsicht auf die untere Hälfte der Vorrichtung von Fig. 10.
Fig. 13 ist eine Querschnittansicht der Vorrichtung von Fig. 12 entlang der Linie 13-1 3.
Fig. 14 ist eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Fig. 15 ist eine Querschnittansicht der oberen Hälfte der Vorrichtung von Fig. 14 entlang der Linie 15-15.
Fig. 16 ist eine Draufsicht auf die untere Hälfte der Vorrichtung von Fig. 14.
Fig. 1 ist eine Querschnittansicht der Vorrichtung von Fig. 14 entlang der Linie 17-17.

BESCHREIBUNG KONKRETER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Ein Aspekt der Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung eines Assays.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich für Assayverfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, die vermutlich den Analyten enthält. Ein oder mehrere .... Reagentien können auch im Gehäuse eingeschlossen sein, um ein Assayverfahren zur Bestimmung eines Analyten in der Probe durchzuführen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist vielseitig einsetzbar. Sie kann in jedem Assay verwendet werden, in dem absorbierendes Material dazu dient, das Strömen von Flüssigkeit weg von einer Kontaktposition zu unterstützen, wo das absorbierende Material mit einem den zu bestimmenden Analyten enthaltenden Medium oder Reagentien zur Bestimmung des Analyten in Kontakt gebracht wird. Die Vorrichtung der Erfindung ist einfach in der Anwendung und erfordert normalerweise lediglich das Einbringen der Probe und anderer Reagentien in flüssiger Form in die Vorrichtung durch das erste Einlaßmittel und das zweite Einlaßmittel wie vorgeschrieben. Die Vorrichtung kann außer dem ersten und zweiten Einlaßmittel auch zusätzliche Mittel enthalten, um weitere Assayreagentien in die Vorrichtung einzubringen.
Vor der weiteren Beschreibung konkreter Ausführungsformen der Erfindung werden einige Ausdrücke definiert.
Analyt: Die zu bestimmende Verbindung oder Zusammensetzung, die sich spezifisch an einen Liganden oder Rezeptor binden kann; üblicherweise einen Antikörper oder Antigen wie z.B. ein Protein oder Arzneimittel, ein Mitglied eines spezifischen Bindepaars.
Die genaue Beschaffenheit antigener und Arzneimittelanalyten sowie Beispiele dafür sind in US-Patent 4.299.916 (Litman et al.), insbesondere Spalten 16 bis 23, und in US- Patent 4.275.149, Spalten 17 und 18, geoffenbart
Die Analyten sind gekennzeichnet durch einzelne Bindestellen (einwertig) oder mehrere Bindestellen (mehrwertig). Mehrwertige Analyten sind normalerweise Poly(aminosäuren), d.h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren und Kombinationen davon. Solche Kombinationen oder Anordnungen sind z.B. Bakterien, Viren, Chromosomen, Gene, Mitochondrien, Zellkerne, Zellmembranen u.dgl.
Eine Vielzahl an Proteinen kann zur Familie von Proteinen mit ähnlichen Strukturmerkmalen, Proteinen mit bestimmten biologischen Funktionen, insbesondere Antikörpern, Proteinen, die mit spezifischen Mikroorganismen, vor allen krankheitsverursachenden Mikroorganismen, verwandt sind, usw. gezählt werden. Beispiele für mikrobiologische Analyten sind Lipopolysaccharide, Proteine und Nukleinsäuren aus Organismen wie z.B. Chlamydia, Herpesvirus, Hepatitisvirus (A, B oder nicht-A-nicht-B), Gonorrhoe, T. pallidum u.dgl.).
Es folgen Klassen an strukturverwandten Proteinen: Protamine, Histone, Albumine, Globuline, Skleroproteine, Phosphoproteine, Mukoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine, Nukleoproteine, Glykoproteine, Proteoglykane, unklassifizierte Proteine, z.B. Somatotrophin, Prolactin, Insulin, Pepsin.
Einige Proteine, die in menschlichem Plasma vorkommen, sind von klinischer Bedeutung, z.B.: Präalbumin, Albumin, α&sub1;-Lipoprotein, α&sub1;-Säureglykoprotein, α&sub1;- Antitrypsin, α&sub1;-Glykoprotein, Transcortin, 4,6S-Postalbumin, Tryptophan-poor, α&sub1;- Glykoprotein, α&sub1;χ&supmin;-Giykoprotein, Thyroxinbindeglobulin, Inter-α-trypsin-Hemmer, Gc- Globulin, Haptoglobulin, Ceruloplasmin, Cholinesterease, α&sub2;-Lipoprotein(e), Myoglobin, C-reaktives Protein, α&sub2;-Makroglobulin, α&sub2;-HS-Glykoprotein, Zn-α&sub2;- Glykoprotein, α&sub2;-Neuraminoglykoprotein, Erythropoietin, β-Lipoprotein, Transferrin, Hämopexin, Fibrinogen, Plasminogen, β&sub2;-Glykoprotein I, β&sub2;-Glykoprotein II und die spezifischen Bindeproteine wie z.B. Antikörper gegen mikrobielle Antigene, autoi mmune Antikörper, T-Zellenrezeptoren, Antikörper gegen Allergene, insbesondere IgE, u.dgl.
Komplementfaktoren und Blutgerinnungsfaktoren sind Beispiele für Analyten. Wichtige Proteinhormone sind z.B. Nebenschilddrüsenhormon, Thyrocalcitonin, Insulin, Glukagon, Relaxin, Erythropoietin, Melanotropin, Somatotropin, Kortikotropin, Thyrotropin, follikelstimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon, luteomammotropisches Hormon, Gonadotropin (chorionisches Gonadotropin).
Gewebehormone wie z.B. Secretin, Gastrin, Angiotensin I und II, Bradykinin, menschliches Plazenta-Laktogen sind Beispiele für Analyten.
Peptidhormone aus der Neurohypophyse wie z.B: Oxytocin, Vasopressin, Freisetzungsfaktoren (RF), CRF, LRF, TRF, Somatotropin-RF, GRF, FSH-RF, PIF, MIF sind Beispiele für Analyten.
Die monoepitopischen Ligandenanalyten besitzen ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 2.000, insbesondere 125 bis 1.000. Die Analyten von Interesse sind Arzneimittel, Metaboliten, Pestizide, Schmutzstoffe usw. Zu Arzneimitteln von Interesse zählen die Alkabide, z.B. Morphinalkaloide wie Morphin, Codein, Heroin, Dextromethorphan, ihre Derivate und Metaboliten; Kokainalkaloide wie Kokain und Benzoylecgonin, ihre Derivate und Metaboliten, Ergotalkabide wie das Diethylamid von Lysergsäure; Steroidalkaloide; Iminazoylalkaloide; Chinazolinalkabide, Isochinolinalkaloide; Chinolinalkaloide wie Chinin und Chinidin; Diterpenalkaloide, ihre Derivate und Metaboliten.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Steroide, z.B. Östrogene, Androgene, androkortikale Steroide, Gallensäuren, kardiotonische Glykoside und Aglykone wie Digoxin und Digoxigenin, Saponine und Sapogenine, ihre Derivate und Metaboliten. Ebenfalls enthalten in dieser Gruppe sind mimetische Steroidsubstanzen wie z.B. Diethylstilbestrol.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Lactame mit 5 bis 6 Ringementen, z.B. Barbiturate wie Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantonin, Primidon, Ethosuximid und ihre Metaboliten.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Aminoalkylbenzole mit Alkyl von 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, z.B. Amphetamine, Catecholamine wie Ephedrin, L-dopa, Epinephrin, Narcin, Papaverin und ihre Metaboliten.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Benzheterozyklen wie Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin, ihre Derivate und Metaboliten, die heterozyklischen Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Purine wie Theophyllin, Koffein, ihre Metaboliten und Derivate.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind jene, die aus Marihuana abgeleitet sind, z.B. Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Vitamine wie A, B, z.B. B&sub1;&sub2;, C, D, E und K, Folsäure und Thiamin.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln umfaßt Prostaglandine, die sich in ihrem Grad und ihren Positionen der Hydroxylierung und Ungesättigtheit unterscheiden.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind Antibiotika wie Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin, Tetacyclin, Terramycin, ihre Metaboliten und Derivate.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln umfaßt die Nukleoside und Nukleotide, z.B. ATP, NAO, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Dytidin mit ihren geeigneten Zucker- und Phosphatsubstituenten.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln sind diverse einzelne Arzneimittel, z.B. Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin, Nortriptylin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propranolol, Griseofulvin Valpronsäure, Butyrophenone, Antihistamine, Anticholinergika wie Atropin, ihre Metaboliten und Derivate.
Metaboliten, die mit Krankheitszuständen in Zusammenhang stehen, sind Spermin, Galactose, Phenylbrenztraubensäure und Porphyrin Typ 1.
Die nächste Gruppe von Arzneimitteln umfaßt Aminoglykoside wie z.B. Gentamicin, Kanamicin, Tobramycin und Amikacin.
Pestizide von Interesse sind z.B. polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide, ihre Metaboliten und Derivate.
Bei Rezeptoranalyten reichen die Molekulargewichte im allgemeinen von 10.000 bis 2 x 10&sup8;, insbesondere 10.000 bis 10&sup6;. Bei Immunoglobulinen, IgA, IgG, IgE und IgM reichen die Molekulargewichte im allgemeinen von etwa 160.000 bis etwa 10&sup6;. Enzyme weisen im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 10,000 bis 1.000.000 auf. Natürliche Rezeptoren variieren stark und können Molekulargewichte von zumindest etwa 25.000 bis 10&sup6; oder mehr aufweisen; zu ihnen zählen Materialien wie Avidin, DNA, RNA, Thyroxinbindeglobulin, Thyroxinbindepräalbumin, Transcortin usw. Mitglied eines spezifischen Bindepaars ("sbp-Mitglied): Eines von zwei unterschiedlichen Molekülen mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einem Hohlraum, der sich spezifisch an eine räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und daher als komplementär damit definiert ist. Die Mitglieder des spezifischen Bindepaars werden als Ligad und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Es handelt sich üblicherwesie um Mitglieder eines immunologischen Paars wie z.B. Antigen-Antikörper, obwohl auch andere spezifische Bindepaare wie z.B. Biotin-Avidin, Hormon-Hormon-Rezeptor, N ukleinsäureduplexe, IgG-Protein A, DNA-DNA, DNA- RNA u.dgl. zwar keine immunologischen Paare, jedoch von dieser Definition umfaßt sind.
Ligand: jede organische Verbindung, für die ein Rezeptor in der Natur existiert oder hergestellt werden kann.
Rezeptor ("Antiligand"): Jede Verbindung oder Zusammensetzung, die eine bestimmte räumliche und polare Organisation eines Moleküls erkennen kann, z.B. eine epitopische oder Determinantenstelle. Beispiele für Rezeptoren sind natürlich vorkommende Rezeptoren wie Thyroxin-Bindeglobulin, Antikörper, Enzyme, Fab- Fragmente, Lectine, Nukinsäuren, Protein A, Komplementkomponente Clq. u.dgl.
Markiertes sbp-Mitglied: Ein Marker, der im allgemeinen zum elektrochemischen Nachweis oder zur Absorption oder Emission elektromagnetischer Strahlung fähig ist, ein Katalysator, häufig ein Enzym, gebunden an ein erstes sbp-Mitglied. Das markierte sbp-Mitglied ist ein Element des signalerzeugenden Systems, und das erste sbp-Mitglied wird ausgewählt, um das zweite sbp-Mitglied in Entsprechung mit einer bestimmten Arbeitsvorschrift in einem Assay zu binden.
Antikörper: Ein Immunglobulin oder sein Derivat oder Fragment mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einem Hohlraum, der sich spezifisch an eine räumliche und polare Organisation eines anderen Moleküls bindet und daher als komplementär damit definiert ist. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren hergestellt werden, z.B. durch Immunisierung eines Wirts und Sammeln von Seren oder durch Hybridzellinien-Technologie.
Antikörper für den Analyten: Ein für den Analyten spezifischer Antikörper.
Saugfähiges Material: Ein poröses Material mit Poren von zumindest 0,1 µm, vorzugsweise zumindest 1,0 µm, das von einem wäßrigen Medium als Reaktion auf Kapillarwirkung durchquert werden kann. Solche Materialien sind im allgemeinen hydrophil oder können hydrophil gemacht werden; Beispiele sind anorganische Pulver wie z.B. Siliciumoxid, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche Polymermaterialien, insbesondere Cellulosematerialien und Materialien aus Cellulose wie z.B. faserhältige Papiere, z.B. Filterpapier, chromatographisches Papier usw; Glasfasern; synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere wie Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetzes Dextran, Agarose, Polyacrylat usw; entweder allein oder in Verbindung mit anderen Materialien; keramische Materialien u.dgl. Eine bevorzugte Ausführungsform sieht vor, daß das saugfähige Material aus Glasfasern besteht. Das saugfähige Material kann an einem Träger befestigt sein. Es kann aber auch selbsttragend sein. Das saugfähige Material kann polyfunktional sein oder polyfunktionalisiert werden, um eine kovalente Bindung von Rezeptoren oder Antikörpern sowie die Bindung anderer Verbindungen zu ermöglichen, die Teil des signalerzeugenden Systems bilden. Das saugfähige Material kann mit einem trockenen, in Wasser dispergierbaren, an einem Marker konjugierten sbp-Element in Kontakt stehen.
Die Bindung von Rezeptoren oder Antikörpern am saugfähigen Material kann durch allgemein bekannte und in der Literatur beschriebene Verfahren bewerkstelligt werden. Siehe beispielsweise "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halted Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Bio. Chem., 245: 3059(1970).
Das Stück des saugfähigen Materials kann eine einzelne Struktur wie z.B. eine in Streifen geschnittene Bahn sein oder aus mehreren Streifen oder Teilchenmaterial bestehen, das an einem Träger oder einer festen Oberfläche gebunden ist, wie z.B. in der Dünnschicht-Chromatographie bekannt; außerdem kann es als eine absorbierende Unterlage entweder als einstückig ausgebildeten Teil oder in Flüssigkeitskontakt aufweisen. Das Stück des saugfähigen Materials kann auch ein Blatt mit darauf ausgebildeten Bahnen sein, die zum Spotting fähig sind, um die Bahnbildung einzuleiten, wobei ein getrennter Assay in jeder Bahn durchgeführt werden kann. Das Stück des saugfähigen Materials kann eine rechteckige, kreisrunde, ovale, dreieckige oder eine andere Form aufweisen, sofern zumindest eine Durchgangsrichtung einer Versuchslösung durch Kapillarmigration gegeben ist. Andere Durchgangsrichtungen sind z.B. in einem ovalen oder kreisrunden Stück möglich, das im Mittelpunkt mit der Versuchsösung in Kontakt steht. Das Wesentliche ist aber, daß es zumindest eine Flußrichtung zu einer vorbestimmten Stelle gibt. In der folgenden Besprechung werden Streifen aus saugfähigem Material veranschaulichend und keinesfalls einschränkend beschrieben.
Der Träger des saugfähigen Materials, wo dieser erwünscht oder notwendig ist, ist normalerweise wasserunlöslich, häufig nichtporös und starr, kann aber elastisch, üblicherweise hydrophob und porös sein und besitzt üblicherweise die gleiche Länge und Breite wie der saugfähige Streifen, kann ber auch größer oder kleiner sein. Eine Vielzahl organischer und anorganischer Materialien (sowohl natürliche als auch synthetische) und Kombinationen davon sind geeignet, sofern der Träger nicht die Kapillarwirkung der saugfähigen Materialien beeinträchtigt, Assaykomponenten nichtspezifisch bindet oder das signalerzeugende System stört. Beispiele für Polymere sind Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poiy(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat), Glas, Keramikmaterialien, Metalle u.dgl. Elastische Träger können aus Polyurethan, Neopren, Latex, Silicongummi u.dgl. bestehen. Marker: Ein Marker kann jedes an ein sbp-Mitglied gebundenes Molekül sein, das zur Erzeugung eines Signals erforderlich ist. In der vorliegenden Erfindung kann der Marker inert sein und nur als Bindestelle für ein Element des signalerzeugenden Systems dienen, oder er kann spontan ein detektierbares Signal produzieren oder dieses in Verbindung mit einem signalerzeugenden System produzieren. Der Marker kann isotopisch oder nichtisotopisch sein und ist vorzugsweise kein Isotop. Der Marker kann z.B. aus der Gruppe bestehend aus Katalysatoren, Enzymen, Chromogenen, radioaktiven Substanzen und dispergierbaren Teilchen ausgewählt sein. Ein Isotop als Marker kann jedoch bevorzugt sein, um bei Verwendung radioautographischer Detektionen mit fotografischem Film hohe Sensitivität zu erzielen.
Signalerzeugendes Mittel: Ein Mittel, das mit dem Marker zusammenwirken kann, um ein detektierbares Signal zu erzeugen. Zu solchen Mitteln zählen z.B. elektromagnetische Strahlung, wärmesensitive Chemikalien u.dgl. Bei Verwendung chemischer Reagentien können einige der chemischen Reagentien als Entwicklerlösung enthalten sein. Beispiele für chemische Reagentien sind Substrate, Coenzyme, Verstärker, Sekundärenzyme, Aktivatoren, Cofaktoren, Hemmstoffe, Fänger, Metallionen, spezifische Bindesubstanzen u.dgl. Einige der chemischen Reagentien wie z.B. Coenzyme, Substanzen, die mit enzymischen Produkten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren u.dgl. können an das saugfähige Material gebunden werden.
Signalerzeugendes System: Dieses kann eine oder mehrere Komponenten umfassen, wobei zumindest eine davon üblicherweise ein markiertes sbp-Element ist. Das signalerzeugende System enthält alle Reagentien, die zur Erzeugung eines meßbaren Signals erforderlich sind, einschließlich eines signalerzeugenden Mittels, das mit dem Marker zur Erzeugung eines Signals zusammenwirken kann.
Das signalerzeugende System liefert ein durch ein externes Mittel, normalerweise durch Messung elektromagnetischer Strahlung, günstigerweise durch visuelle Kontrolle, nachweisbares Signal. Das signalerzeugende Mittel umfaßt hauptsächlich ein chromophores Substrat und Enzym, worin chromophore Susbtrate enzymatisch zu Farbstoffen umgewandelt werden, die Licht im UV- oder sichtbaren Bereich absorbieren, Phosphore und fluoreszierende Stoffe.
Das signalerzeugende System kann zumindest einen Katalysator als Marker, üblicherweise zumindest ein Enzym und zumindest ein Substrat enthalten und kann zwei oder mehr Katalysatoren und eine Vielzahl an Substraten sowie eine Kombination von Enzymen enthalten, wobei das Substrat eines Enzyms das Produkt des anderen Enzyms ist. Das signalerzeugende System wird betrieben, um ein Produkt zu erzeugen, das ein nachweisbares Signal an der vorbestimmten Stelle liefert, das mit der Gegenwart von Marker an der vorbestimmten Stelle in Zusammenhang steht.
Zwei Katalysatoren können verwendet werden, entweder eine Kombination eines Enzyms und eines Nichtenzym-Katalysators oder von zwei Enzymen, wobei die zwei Katalysatoren insofern miteinander verwandt sind, als das Produkt eines das Substrat des anderen ist. In diesem System muß nur ein Substrat vorhanden sein, das aufeinanderfolgende, durch die Katalysatoren katalysierte Änderungen erfahren kann, was zur Verbindung führt, die an der Erzeugung eines nachweisbaren Signals beteiligt ist. Zumeist sind aber normalerweise ein Substrat für das erste Enzym in der Reihe und eine zweite Verbindung vorhanden, die als Vorläufer der Verbindung dient, die an der Erzeugung des Signals beteiligt ist, wodurch normalerweise die Verbindung geliefert wird, die das Signal erzeugt. Das Produkt des ersten Enzyms kann demnach mit dem Vorläufer der Verbindung reagieren, die ein Signal erzeugt, um die Verbindung bereitzustellen, die das Signal erzeugt.
Bei Verwendung zweier Enzyme sind die stattfindenden Reaktionen hauptsächlich Hydrolyse oder Redoxreaktionen. Im Fall der Hydrolyse ist ein Beispiel für das System ein derivatisierter Farbstoffvorläufer, der eine hydrolytisch labile Bindung, ein hydrolytisches Enzym und ein Enzym enthält, das die freigesetzten Farbstoffvorläufer eines Farbstoff-Umwandlungsprodukts katalysiert. In Redoxreaktionen kann ein erstes Enzym ein essentielles Oxidationssubstrat erzeugen, das für das zweite Enzym erforderlich ist, wobei das zweite Enzym die Reaktion zwischen dem Oxidationssubstrat und einem Farbstoffvorläufer katalysiert.
Bei Verwendung von zwei Enzymen kann die erste enzymatische Reaktion die hydrolytische Spaltung oder eine Redoxreaktion des Substrats umfassen, um ein Produkt zu liefern, das das Substrat eines anderen Enzyms ist. Ein Beispiel für die erste Situation ist Glukose-6-phosphat, das katalytisch durch alkalische Phosphatase zu Glukose hydrolyisiert wird, wobei Glukose ein Substrat für Glukoseoxidase ist. Ein Beispiel für die zweite Situation ist Glukose, die durch Glukoseoxidase oxidiert wird, um Wasserstoffperoxid bereitzustellen, das enzymatisch mit einem Leukofarbstoff reagieren würde, um einen Signalgenerator zu produzieren.
Gekoppelte Katalysatoren können auch ein Enzym mit einem nichtenzymatischen Katalysator umfassen. Das Enzym kann einen Reaktanden erzeugen, der eine durch den nichtenzymatischen Katalysator katalysierte Reaktion erfährt, oder der nichtenzymatische Katalysator kann ein Substrat (umfassend Coenzyme) für das Enzym erzeugen. Eine Vielzahl geeigneter nichtenzymatischer Katalysatoren finden sich in der am 10. Juli 1979 veröffentlichten USA-4.160.645.
Verschiedene Kombinationen von Enzymen können verwendet werden, um eine signalerzeugende Verbindung bereitzustellen. Insbesondere können Kombinationen von Hydrolasen verwendet werden, um einen unlöslichen Signalgenerator zu produzieren. Alternativ dazu können Kombinationen von Hydrolasen und Oxidoreductasen die signalerzeugende Verbindung liefern. Außerdem kann man Kombinationen von Oxidoreductasen verwenden, um eine unlösliche signalerzeugende Verbindung zu produzieren.
Bei Kombinationen von Enzymen kann ein Enzym nichtdiffundierbar an das saugfähige Material gebunden sein, während das andere Enzym der an den Analyten konjugierte Marker ist. Außerdem können je nach dem ausgewählten signalerzeugenden System oder der jeweils befolgten Arbeitsvorschrift ein oder mehrere andere Elemente des signalerzeugenden Systems an das saugfähige Material gebunden sein.
Um ein nachweisbares Signal zu erzeugen, ist es wünschenswert, ein Mittel zur Verstärkung des Signals bereitzustellen, das durch die Gegenwart des Markers an der vorbestimmten Stelle erzeugt wird. Daher ist es üblicherweise vorzuziehen, daß der Marker ein Katalysator oder eine lumineszierende Verbindung oder ein Radioisotop ist, am bevorzugtesten ein Katalysator. Vorzugsweise sind Katalysatoren Enzyme und Coenzyme, die eine Vielzahl an signalerzeugenden Molekülen aus einem einzigen Marker erzeugen können.
Ein Enzym oder Coenzym wird verwendet, das für die erwünschte Verstärkung sorgt, indem ein Produkt erzeugt wird, das Licht absorbiert, z.B. ein Farbstoff, oder bei Bestrahlung Licht ausstrahlt, z.B. ein fluoreszierender Stoff. Alternativ dazu kann die katalytische Reaktion zu direkter Lichtemission, z.B. Chemilumineszenz, führen. Eine große Anzahl an Enzymen und Coenzymen zur Erzeugung solcher Produkte findet sich in US-4.275.149, Spalten 19 bis 23, und US-4.318.980, Spalten 10 bis 14.
Einige Enzymkombinationen sind in US-4.275.149, Spalten 23 bis 28 beschrieben, die sich für die vorliegende Erfindung eignen.
Von besonderem Interesse sind Enzyme, die die Erzeugung von Wasserstoffperoxid und die Verwendung von Wasserstoffperoxid vorsehen, um einen Farbstoffvorläufer eines Farbstoffs zu oxidieren. Beispiele für Kombinationen sind Saccharid-Oxidasen, z.B. Glukose- und Galaktose-Oxidase oder heterozyklische Oxidasen wie Uricase und Xanthin-Oxidase, verbunden mit einem Enzym, das Wasserstoffperoxid verwendet, um einen Farbstoffvorläufer zu oxidieren, d.h. eine Peroxidase wie z.B. Meerrettich-Peroxidase, Lactoperoxidase oder Mikroperoxidase. Additionsenzym-Kombinationen sind durch Verweise hierin aufgenommen. Bei Verwendung eines einzelnen Enzyms als Marker können andere Enzyme wie z.B. Hydrolasen, Transferasen und Oxidreductasen, vorzugsweise Hydrolasen wie z.B. alkalische Phosphatase und β-Galaktosidase, verwendet werden. Alternativ dazu eignen sich Luciferasen wie z.B. Glühwurm- Luciferase und bakterielle Luciferase.
Beispiele für geeignete Coenzyme sind NAD[H]; NADPH[H], Pyridoxalphosphat; FAD[H]; FMH[H] usw., üblicherweise Coenzyme, die Zyklisierungsreaktionen nach sich ziehen; siehe insbesondere US-4.318.980.
Das Produkt der Enzymreaktion ist normalerweise ein Farbstoff oder fluoreszierender Stoff. Eine große Anzahl an fluoreszierenden Stoffen ist in US-4.275.149, Spalten 30 und 31, geoffenbart
Hilfsmaterialien: Verschiedene Hilfsmaterialien werden im Assay gemäß der vorliegenden Erfindung häufig verwendet. Beispielsweise sind Puffer ebenso wie Stabilisatoren normalerweise im Assaymedium vorhanden. Häufig können neben diesen Additiven zusätzliche Proteine vorhanden sein, z.B. Albumine oder Tenside, insbesondere nichtionogene Tenside, Bindeverstärker, z.B. Polyalkylenglykole o.dgl.
Immunkonzentrationsanordnung: Diese enthält im allgemeinen eine immunsorbierende Zone und eine flüssigkeitsabsorbierende Zone. Die immunsorbierende Zone und die flüssigkeitsabsorbierende Zone stehen üblicherweise entweder direkt oder indirekt in einer flüssigkeitsaufnehmenden Beziehung. Die Immunkonzentrationsanordnung kann eine oder mehrere immunsorbierende Zonen umfassen. Die immunsorbierende Zone und die flüssigkeitsabsorbierende Zone können eine einstückige Einheit wie z.B. einen Streifen mit einer oder mehreren immunsorbierenden Zonen bilden. In diesem Sinne kann das saugfähige Material ein Streifen sein, von dem ein Teil eine Porengröße besitzt, die sich vom Rest des Streifens unterscheidet. Alternativ dazu können die immunsorbierende und die flüssigkeitsabsorbierende Zone voneinander verschieden sein. Beispielsweise kann die immunsorbierende Zone eine Membran sein, an der ein sbp-Mitglied befestigt ist. Die flüssigkeitsabsorbierende Zone kann absorbierendes Material in Form eines Streifens, eines Kissens, eines Stopfens, eines Dochts u.dgl. sein und in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit der immunsorbierenden Zone stehen. Das flüssigkeitsabsorbierende Material kann jedes beliebige hydrophile saugfähige Material wie z.B. Papier, Schwamm, Filz, poröse Polymere u.dgl. sein.
Immunsorbierende Zone: Ein saugfähiger fester Formkörper, Schicht oder Blatt, häufig in Kontakt mit dem Stück des saugfähigen Materials oder einem Teil davon, mit dem ein sbp-Mitglied, üblicherweise ein Antikörper oder Antigen, nichtdiffundierbar verbunden ist. Die immunsorbierende Zone besitzt oft im Vergleich zur Aufnahemfähigkeit der gesamten Assayvorrichtung nur eine geringe Flüssigkeitsaufnahmefähigkeit. Eines oder mehrere Elemente eines signalerzeugenden Systems können direkt oder indirekt an die immunsorbierende Zone gebunden sein. Die immunsorbierende Zone besitzt eine spezifische Bindefähigkeit für ein komplementäres sbp-Mitglied. Demzufolge kann die immunsorbierende Zone ein zweites sbp-Mitglied enthalten, das nichtdiffundierbar mit der Zone verbunden ist.
Flüssigkeitsabsorbierende Zone: Ein saugfähiges festes Material, das entweder direkt oder indirekt in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit der immunsorbierenden Zone steht und als Behälter- oder Speicherzone wirkt, die ein wesentlich größeres Flüssigkeitsvolumen speichern kann als die immunsorbierende Zone. Die flüssigkeitsabsorbierende Zone dient als Pumpe, um Flüssigkeit durch die und aus der immunsorbierenden Zone heraus zu pumpen. Die flüssigkeitsabsorbierende Zone dient dazu, das Volumen der Flüssigkeit zu steuern, das die immunsorbierende Zone durchquert. Eine weitere Funktion der flüsigkeitsabsorbierenden Zone kann darin bestehen, die durch die Vorrichtung gelangende Flüssigkeitsmenge zu messen. Durch Vorsehen von Graduierungen an Positionen, die sich hintereinander weg von der immunsorbierenden Zone und entlang der flüssigkeitsaufnehmenden Zone befinden, kann man bestimmen, wann sich die Lösungsmittelfront an einer bestimmten Stelle befindet. Man kann Farbstoffe bereitstellen, die sich nach Auflösung oder Kontakt mit einer Lösungsmittelfront verfärben, um so anzuzeigen, daß das Lösungsmittel die Vorrichtung durchquerte.
Flüssige(s) Reagens/Reagentien: Ein oder mehrere flüssige Reagentien zur Durchführung eines Assays unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Das flüssige Reagens kann ein sbp-Mitglied, Elemente eines signalerzeugenden Systems, eine Suspension von Teilchen, die an ein sbp-Mitglied oder Elemente eines signalerzeugenden Systems gebunden sind, Hilfsreagentien u.dgl. enthalten und ist üblicherweise wäßrig.
Vorab enthaltenes flüssiges Reagens: Siehe EP-A-286371. Eines oder mehrere flüssige Reagentien können in zumindest einem aufbrechbaren Behälter in der Vorrichtung der Erfindung enthalten sein. Das flüssige Reagens kann ein sbp-Mitglied, Elemente eines signalerzeugenden Systems, eine Suspension von Teilchen, die an ein sbp-Mitglied oder ein Element eines signalerzeugenden Systems gebunden sind, Hilfsreagentien o.dgl. enthalten und ist üblicherweise wäßrig. Mit dem Gehäuse der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der Behälter einstückig, getrennt davon oder in einer Kombination davon ausgebildet, wenn mehr als ein vorab enthaltenes Reagens verwendet wird. Nach Aufbrechen des bzw. der Behälter wird dafür gesorgt, daß das Reagens durch Kapillarwirkung das in der Assayvorrichtung verwendete saugfähige Material durchqueren kann, wobei ein Teil des saugfähigen Materials mit dem bzw. den Reagentien in Kontakt kommt. Das flüssige Reagens im aufbrechbaren Behälter kann auch ein Element eines signalerzeugenden Systems enthalten, das ein Signal im Verhältnis zur Analyten menge in der Probe erzeugen kann.
Die Behälter sind wasserdicht und können starr oder flexibel sein; außerdem können sie durch Zerdrücken, Schneiden, Durchstechen, Schmelzen, Aufbrechen einer Dichtung zwischen dem Behälter und dem Gehäuse der Vorrichtung u.dgl. aufgebrochen werden. Übliche Beispiele für Materialien sind Glas, Kunststoffe, Wachse, Polymermembranen u.dgl. Normalerweise entspricht das Volumen eines Behälters zumindest dem Flüssigkeitsabsorptionsvolumen der Materialien in der Vorrichtung, doch es kann auch größer oder kleiner sein. Wenn das Volumen kleiner als das Flüssigkeitsabsorptionsvolumen der Vorrichtung ist, wird häufig mehr als ein Behälter verwendet. Behältervolumina betragen üblicherweise 0,1 bis 15 ml, vorzugsweise 0,3 bis 5 ml, können aber auch nur 5 µm³ betragen, wenn z.B. die Flüssigkeit in zahlreichen Mikrokapseln enthalten ist. Der Behälter kann jede Form aufweisen, die für die Vorrichtung geeignet ist, z.B. ellipsenförmig, rechteckig, kugelförmig usw.
Die vorab enthaltenen flüssigen Reagentien können in einem Behälter gemäß herkömmlicher Verfahren eingeschlossen werden. Ein wichtiger Gesichtspunkt ist, daß das Einschließen keine negativen Auswirkungen auf die eingeschlossenen Reagentien hat. Beispiele für ein solches Einschließen ist das Einkapseln in einer Kapsel.
Es folgt eine ausführliche Beschreibung der erfindungsgemäßen Vorrichtung unter Bezugnahme auf die beiliegenden Abbildungen. Man beachte, daß die nachstehende Beschreibung veranschaulichend und nicht einschränkend ist.
Bezug nehmend auf Fig. 1 ist die Vorrichtung 10 zu sehen. Sie umfaßt das Gehäuse 12, das je nach der Art des durchgeführten Assays eine geeignete Form oder Größe aufweist. Das Gehäuse 12 kann aus jedem beliebigen Material bestehen, das für die Art des durchgeführten Assays geeignet ist. Das zur Fertigung des Gehäuses verwendete Material sollte die Probe, das Proben medium oder die bei der Durchführung des Assays verwendeten Reagentien einschließlich der Elemente des signalerzeugenden Systems nicht beeinträchtigen. Vorzugsweise besteht das Gehäuse aus einem thermoplastischen Material o.dgl.
Die Vorrichtung 10 enthält weiters ein erstes Mittel im Gehäuse zum Einfangen eines Mitglieds eines spezifischen Bindepaars in einer Zone und zur Ermöglichung des Abtransports von Flüssigkeit aus der Zone durch Kapillarwirkung. In der in Figuren 1 bis 5 dargestellten Ausführungsform umfaßt ein solches Mittel ein Stück eines saugfähigen Materials, einen saugfähigen Streifen 14, mit einer oder mehreren immunsorbierenden Zonen. Vorzugsweise ist der saugfähige Streifen nicht-entfernbar in der Vorrichtung 10 eingeschlossen. Ein flüssigkeitsabsorbierendes Material 16 in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem saugfähigen Streifen 14 kann gegebenenfalls in der Vorrichtung 10 enthalten sein und ist vorzugsweise nicht-entfernbar in der Vorrichtung 10 eingeschlossen. Die Kombination von Streifen 14 und absorbierenden Mittel 16 sorgt für das Einfangen eines sbp-Mitglieds in einer Zone und für den Abtransport von Flüssigkeit aus der Zone durch Kapillarwirkung. Das flüssigkeitsabsorbierende Mittel 16 befindet sich günstigerweise im ausgenommenen Abschnitt 18 der Vorrichtung 10. In der Vorrichtung der Figuren 1 bis 5 ist der ausgenommene Abschnitt 18 an einem Ende der Vorrichtung 10 gegenüber dem Ende mit dem ersten Einlaßmittel 20 zum Einbringen einer Probe und/oder von flüssigem Reagens in die Vorrichtung positioniert. Diese Anordnung ist lediglich ein Beispiel. Andere Ausführungsformen sind für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig. Beispielsweise kann das Element 16 beim, in der Nähe oder in einer Entfernung vom Mittel 20 zum Einbringen der Probe positioniert sein. Die Vorrichtung 10 enthält auch ein zweites Einlaßmittel 22 zum Einbringen eines flüssigen Reagens und einer Probe in die Vorrichtung.
Die Innenwände des Gehäuses 12 können Mittel 24 zum tragenden Einschließen des Streifens 14 im Gehäuse aufweisen. In einigen Fällen ist es wichtig, daß die Ober- und Unterseite des Streifens 14 beschränkten Kontakt mit den Innenwänden des Gehäuses hat, sodaß die Kapillarwirkung des Streifens im wesentlichen unverändert bleibt und sich der Streifen im nassen Zustand ungehindert ausdehnen kann. In anderen Fällen kann die Unterseite des Streifens auf einer hydrophoben elastischen Unterlage aufruhen, die einen guten Kontakt der Mittel 20 und 22 mit der Oberseite des Streifens sicherstellt, ohne den Kapillarfluß zu beeinträchtigen.
Beispiele für die Mittel 24 sind die vorstehenden Elemente 24 auf den Innenwänden 26 und 28 des Gehäuses 12. Die Elemente 24 sind im allgemeinen einstückig mit den Innenwänden des Gehäuses 12 ausgebildet und können die Form von Stützen aufweisen, die konisch, länglich, oval, rechteckig, dreieckig o.dgl. sind. Ein wesentliches Merkmal der Elemente 24 ist, daß sie den Kontaktbereich mit dem Streifen 14 minimieren, sodaß sich die Kapillarität des Streifens 14 nicht in bedeutender Weise ändert. Darunter versteht man, daß sich die Kapilarwirkung des Streifens 14 nicht solcherart ändert, daß die Leistungsfähigkeit des Assays stark beenträchtigt und dadurch die Genauigkeit des Versuchs verringert wird oder verloren geht. Beispielsweise muß ausreichend Kapillarwirkung aufrechterhalten werden, um den Analyten in einer Probe präzise bestimmen zu können.
In Figuren 2 bis 5 liegen die Elemente 24 und 25 in Reihen parallel zu den Längsseiten des Gehäuses 12. Im allgemeinen besitzen die Elemente 24 und 25 Dimensionen, die eine geringfügige Auf- und Abbewegung des Streifens im Gehäuse im trockenen Zustand ermöglichen und eine derartige Bewegung verhindern, wenn der Streifen durch die durchquerende Flüssigkeit benetzt wird. Üblicherweise ist der Spielraum einer solchen Bewegung 0 bis 3,0 mm, wenn sich der Streifen im trockenen Zustand befindet. Im allgemeinen sind auf jeder der oberen und unteren Innenwand des Gehäuses 12 etwa 2 bis 1 5 Elemente 24 bzw. 25 pro Seite angeordnet; sie weisen eine Länge von jeweils etwa 0,5 bis 4 mm auf. In einer alternativen Ausführungsform kann der Streifen 14 an einem Träger befestigt sein wodurch die Elemente 24 und/oder 25 überflüssig sind. Es sind Mittel 30 vorhanden, um den Streifen 14 am Kontakt mit den inneren Seitenwänden 32 des Bodenabschnitts 34 der Vorrichtung 10 zu hindern. Diese Mittel können die Form von Elementen 30 aufweisen, die aus den Wänden 32 ragen. Die Elemente 24, 25 und 30 können unabhängig voneinander oder alle rechteckig, oval, dreieckig, länglich, konisch o.dgl. geformt sein. Im allgemeinen erfüllen die Mittel 30 die gleiche Funktion wie die Mittel 24 und 25.
Das flüssigkeitsabsorbierende Element 16 ist auf den ausgenommenen Bereich 18 beschränkt. Das Element 16 kann in engem Kontakt mit den Wänden des ausgenommenen Abschnitts 18 des Gehäuses stehen, oder die Wände können Mittel enthalten, um das flüssigkeitsabsorbierende Element 16 tragend einzuschließen. Das Element 16 ist in jedem Fall innerhalb der Ausnehmung 18 des Gehäuses 12 eingeschlossen, um in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem Streifen 14 gehalten zu werden.
Das Gehäuse 12 enthält weiters ein erstes Mittel 20, um die Probe und/oder flüssiges Reagens in die Vorrichtung 10 einzubringen. In der in Figuren 1 bis 5 dargestellten Vorrichtung besitzt das Mittel 20 eine Öffnung, durch die die Probe auf den Streifen 14 aufgebracht werden kann, und einen flüssigkeitseinschließenden Napf. Dieser kann in jeder Konfiguration oder Form verwendet werden. Der Napf kann zylindrisch, konisch, rechteckig, quadratisch, oval o.dgl. oder eine Kombination davon sein. Die Dimensionen des Napfes können je nach dem durchgeführten Assay und der Form des Napfes ebenfalls stark variieren. Im allgemeinen sollte der Napf ein Volumen von 10- 1000 µl, vorzugsweise 50-500 µl, noch bevorzugter 100-400 µl, aufweisen, und die Wände sollten ausreichend geneigt sein, damit die Flüssigkeit ungehindert zur Öffnung im Boden fließen kann. Die Öffnung ist im allgemeinen klein (üblicherweise 0,3-15 mm², vorzugsweise 1-10 mm²) und kann quadratisch, oval, dreieckig, rund u.dgl. sein. Vorzugsweise ist die Öffnung so ausgebildet, daß sie mit dem Streifen 14 in ausreichend gutem Kontakt steht, sodaß die gesamte mit der Öffnung in Kontakt stehende Flüssigkeit ohne Lecken in den Streifen absorbiert wird. Alternativ dazu kann das Mittel 20 die Form einer Scheidewand aus einem Elastomermaterial wie Gummi, Kunststoff o.dgl. annehmen.
Das Gehäuse 12 umfaßt weiters ein zweites Mittel 22 zum Einbringen flüssiger Reagentien und der Probe in die Vorrichtung 10. Im allgemeinen gilt die obigen Beschreibung für das erste Mittel 20 auch für das zweite Mittel 22. Das erste Mittel 20 und das zweite Mittel 22 können die gleiche Konfiguration oder Form aufweisen oder aus dem gleichen Material gefertigt sein, oder sie können unterschiedlich sein. Vorzugsweise liegen die Öffnungen in den Mitteln 20 und 22 nahe beisammen, üblicherweise 1-20 mm, vorzugsweise 1-10 mm, häufig 2-5 mm, sodaß die Näpfe der Mittel 20 und 22 als einzelner Napf mit einer Trennwand zwischen den beiden Öffnungen ausgebildet sein können.
Die Zufuhr der Probe in die Vorrichtung kann durch das erste Mittel 20 oder das zweite Mittel 22 mittels einer Tropfvorrichtung, Injektionsnadel o.dgl., die die zu analysierende Probe enthält, erfolgen. Die Zufuhr der Probe in die Vorrichtung führt dazu, daß die Probe auf den Streifne 14 aufgebracht wird. Üblicherweise wird ein anderes flüssiges Reagens als die Probe nach Zugabe der Probe der Vorrichtung zugeführt. Außerdem können der Vorrichtung entweder vor oder nach der Probenzugabe zusätzliche flüssige Reagentien zugeführt werden, wobei zumindest eines dieser Reagentien durch das Mittel zugegeben wird, das bei der Zufuhr der Probe nicht verwendet wird. Andere Mittel zum Einbringen der Probe in die Vorrichtung sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Eine bevorzugte Ausführungsform zur Anordnung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist aus Figuren 1-5 ersichtlich. Die Vorrichtung besteht günstigerweise aus zwei Stücken, die hierin als obere Hälfte oder oberes Stück 35 und als untere Hälfte oder unteres Stück 38 bezeichnet werden. Die Stücke 36 und 38 sind entlang der Kantenlinien 40 am Stück 36 und 42 am Stück 38 verbunden. Günstigerweise können die zwei Hälften Mittel zum Verriegeln der Hälften enthalten. Beispielsweise kann die obere Hälfte 36 einen Vorsprung enthalten, der mit einem Vorsprungaufnahmemittel auf dem Stück 38 wie ein Schnappverschluß zusammenpaßt. Nach dem Positionieren des Streifens 14 und des absorbierenden Elements 16 (falls es von 14 getrennt ist) im Stück 38 werden die Stücke 36 und 38 entlang ihrer Kanten aneinandergefügt. Das Stück 36 und das Stück 38 können durch Schallenergie, Klebstoff, Hitze, o.dgl. gemäß herkömmlicher Verfahren miteinander dicht verbunden werden. Das bevorzugte Verfahren ist ein Schnappverschluß. Die Verwendung eines oberen und unteren Stücks für das Zusammensetzen der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist lediglich ein Beispiel. Andere Mittel zum Zusammensetzen der Vorrichtung sind Fachleuten auf dem Gebiet aufgrund der hierin enthaltenen Offenbarung bekannt.
Die obere Hälfte 36 der Vorrichtung 10 kann eine Öffnung oder ein durchsichtiges Fenster enthalten, um Sicht auf die immunsorbierende Zone zu bieten, und eine Skala auf ihrer Vorderfläche aufweisen, um die Quantifizierung der Analytenmenge in der Probe zu vereinfachen. Wenn die Quantifizierung z.B. das Ergebnis des Messens der Länge innerhalb einer immunsorbierenden Zone ist, in der der Nachweis eines Signals beobachtet wird, unterstützt ein Anzeigemittel wie z.B. eine Skala angrenzend an ein Fenster zur Beobachtung der immunsorbierenden Zone das Erhalten von quantitativen Ergebnissen.
Andere Vorrichtungen als die in Figuren 1-5 dargestellten sind Teil der vorliegenden Erfindung. Einige derartiger Vorrichtungen können als einstückige Verbundvorrichtung zusammengesetzt werden, die einige Proben untersuchen kann.
Eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in Figuren 6-9 dargestellt. Die Vorrichtung 110 umfaßt ein Cehäuse 112, das allgemein einen saugfähigen Streifen 114 und ein saugfähiges Stück 116 umfaßt. Das obere Stück 136 besitzt ein erstes Mittel 120, ein zweites Mittel 122 und ein drittes Mittel 123 zum Einbringen von Probe und/oder anderer flüssiger Reagentien als der Probe in die Vorrichtung. Wenn die Probe über das dritte Mittel 123 eingebracht wird, wird zumindest eines der flüssigen Reagentien durch ein anderes Mittel als das dritte Mittel 123 nach Zugabe der Probe zugeführt. In der dargestellten Ausführungsform sind die Mittel 120, 122 und 123 Öffnungen im Stück 136.
Bezug nehmend auf Figuren 10-13 sieht man die Vorrichtung 210. Diese umfaßt ein Gehäuse 212, das je nach der Art des durchzuführenden Assays eine beliebige Form oder Größe aufweisen kann.
Die Vorrichtung 210 enthält außerdem ein Mittel, das im Gehäuse eingeschlossen ist, um ein Mitglied eines spezifischen Bindepaars in einer Zone einzufangen und es Flüssigkeit zu ermöglichen, durch Kapilarwirkung aus der Zone abtransportiert zu werden. In der in Figuren 10-13 dargestellten Ausführungsform umfaßt ein derartiges Mittel ein Stück saugfähiges Material, den saugfähigen Streifen 214, mit einer oder mehreren immunsorbierenden Zonen. Vorzugsweise ist der saugfähige Streifen nichtentfernbar in der Vorrichtung 210 eingeschlossen. Ein flüssigkeitsabsorbierendes Material 216 in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit dem saugfähigen Streifen 214 kann gegebenenfalls in der Vorrichtung 210 enthalten und vorzugsweise nichtentfernbar in dieser eingeschlossen sein. Das flüssigkeitsabsorbierende Mittel 216 befindet sich günstigerweise im Ausnehmungsabschnitt 218 der Vorrichtung 210. In der Vorrichtung der Figuren 10-13 ist der Ausnehmungsabschnitt 218 beispielsweise an einem Ende der Vorrichtung 210 gegenüber dem Ende mit dem unten beschriebenen Mittel 243 zum Aufbrechen des Behälters 246 angeordnet, der das vorab enthaltene flüssige Reagens 248 enthält.
Außerdem ist - vorzugsweise nicht-entfernbar - im Gehäuse 212 das vorab enthaltene flüssige Reagens 248 im aufbrechbaren Behälter 246 eingeschlossen. Das flüssige Reagens dient der Bestimmung eines Analyten inder Probe. Das flüssige Reagens kann Elemente eines signalerzeugenden Systems wie z.B. Enzymsubstrate u.dgl. enthalten. Der Behälter 246 befindet sich in der Ausnehmung 250 der Vorrichtung 210. Der Behälter 246 besteht günstigerweise aus einem aufbrechbaren Material wie z.B. Glas, Kunststoff u.dgl. Der Behälter 246 ist normalerweise durch das Mittel 252 tragend in der Ausnehmung 250 eingeschlossen, sodaß er zum geeigneten Zeitpunkt leicht aufgebrochen werden kann. Das Mittel 252 ist eine Wand oder kann die Form einer Schulter, einer Rippe, eines Vorsprungs o.dgl. annehmen. Die Ausnehmung 250 kann Reagentien zur Durchführung eines Assays in trockener Form oder diffundierbar an einen Träger gebunden enthalten.
Das Gehäuse 212 enthält weiters ein Mittel 254 zur Unterstützung des Aufbrechens des Behälters 246. Vorzugsweise umfaßt das Mittel 254 einen beweglichen Abschnitt, der bei 258 angelenkt ist (im allgemeinen über dem ausgenommenen Bereich 250). Das Mittel 254 kann manipuliert werden, um die Kapsel 246 aufzubrechen. Außerdem kann das Mittel 254 einen Knopf 260 gegenüber dem Behälter 246 enthalten. Wenn der bewegliche Abschnitt 254 gedrückt wird, wird der Knopf 260 gegen den Behälter 246 gezwängt und der Behälter 246 aufgebrochen. Die Elemente 260 können vorgesehen sein, um das Brechen von 246 zu unterstützen.
Das Gehäuse 212 enthält weiters ein erstes Mittel 220 und ein zweites Mittel 222, um eine Probe in die Vorrichtung 10 einzubringen. In der in Figuren 10-13 dargestellten Vorrichtung sind das erste Mittel 220 und das zweite Mittel 222 Öffnungen, über die Probe und flüssige Reagentien gemäß dem Prinzip der Erfindung auf den Streifen 214 aufgebracht werden können.
Gegebenenfalls besitzt das Gehäuse 212 ein Mittel 262, das die Visualisierung einer oder mehrerer immunsorbierenden Zonen auf dem saugfähigen Material erlaubt, sodaß man das Ergebnis eines Assays bestimmen kann, wenn sich die immunsorbierende Zone nicht am Mittel 220 oder 222 befindet. Demzufolge kann der obere Abschnitt 236 des Gehäuses 212 zur Gänze aus einem durchsichtigen thermoplastischen Material bestehen. Alternativ dazu kann nur der Bereich zur Visualisierung der immunsorbierenden Zone(n) aus einem durchsichtigen Material gebildet sein, oder es kann ein solcher Bereich eine Öffnung im oberen Abschnitt der Vorrichtung 210 sein. Die Dimensionen des Gehäuses hängen wieder vom jeweils durchgeführten Assay ab.
Das Lösungsmittel für die zu analysierende Probe und das Lösungsmittel für die flüssigen Reagentien und alle vorab enthaltenen Reagentien ist ein wäßriges Medium, das bis zu etwa 40 Gew.-% andere polare Lösungsmittel, insbesondere sauerstoffhaltige Lösungsmittel mit 1 bis 6, üblicherweise von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einschließlich Alkoholen, Ethern u.dgl., umfaßt. Üblicherweise sind die Colösungsmittel in weniger als etwa 20 Gew.-% vorhanden.
Der pH-Wert für das Medium liegt üblicherweise im Bereich von 4-11, noch häufiger 5- 10 und vorzugsweise etwa 6-9. Der pH-Wert wird ausgewählt, um eine signifikante Stelle mit Bindeaffinität der Bindemitglieder und eine optimale Erzeugung des Signals durch das signalerzeugende System aufrechtzuerhalten. Verschiedene Puffer können zur Erzielung des erwünschten pH-Werts und dessen Aufrechterhaltung während des Assays verwendet werden. Beispiele für Puffer sind Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital u.dgl. Der jeweils verwendete Puffer ist nicht entscheidend, doch in einzelnen Assays kann ein Puffer gegenüber einem anderen vorzuziehen sein.
Bei einigen Assays ist günstigerweise etwa 0,05 bis 0,5 Gew.-% Detergens in der Probe und/oder den flüssigen Reagentien enthalten. Detergentien wie z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS), Desoxycholat, CHAPS und NP 40 sind für mikrobielle Analyten und Antikörper besonders geeignet. Im allgemeinen sind nichtionogene Detergenien wie z.B. Triton X-100 für makromolekulare Analyten geeignet.
Während der Durchführung des Assays herrschen mäßige und günstigerweise im wesentlichen konstante Temperaturen. Die Temperatur für den Assay und die Erzeugung eines nachweisbaren Signals liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 4º- 50ºC, noch häufiger im Bereich von etwa 10º-40ºC und oft im Bereich von Umgebungstemperaturen, d.h. etwa 15º-25ºC. Wenn der Analyt eine Nukleinsäure ist, sind höhere Temperaturen bis zu 70ºC zweckmäßig.
Die zu untersuchende Konzentration in der wäßrigen Versuchslösung des Analyten variiert im allgemeinen zwischen etwa 10&supmin;&sup4; und etwa 10&supmin;¹&sup5; M, vor allem etwa 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;¹&sup4; M. Zu berücksichtigende Faktoren wie die Konzentration des Analyten von Interesse und die Arbeitsvorschrift bestimmen normalerweise die Konzentration der anderen Reagentien.
Während die Konzentrationen zahlreicher Reagentien in der Probe und den Reagenslösungen im allgemeinen durch den Konzentrationsbereich von Interesse des Analyten bestimmt werden, wird die Endkonzentration jedes Reagens normalerweise empirisch bestimmt, um die Sensitivität des Assays im Bereich von Interesse zu optimieren. Bei bestimmten Arbeitsvorschriften können einzelne Reagentien in deutlichem Überschuß verwendet werden, ohne die Empfindlichkeit des Assays zu beeinträchtigen.
Wenn das saugfähige Material ein Streifen ist, hängt die Größe des Streifens 14 von mehreren Überlegungen ab. Der erste Faktor ist die Bewegung von ungebundenen Materialien aus der immunsorbierenden Zone hinaus, üblicherweise dem Bereich auf dem Streifen gegenüber dem ersten Mittel 20 oder einem Bereich zwischen dem ersten Mittel 20 und dem absorbierenden Material 16, und das Binden der sbp-Mitglieder an die immunsorbierende Zone als Reaktion auf die Anwesenheit eines Analyten inder Versuchsösung. Wenn flüssiges absorbierendes Material 16 nicht enthalten ist, regulieren die Länge und Dicke des Streifen die Lösungsmenge, die den Streifen entlang fließen kann. Wenn der Durchgang eines großen Volumens einer Versuchsösung erwünscht ist, muß die Flüssigkeitskapazität des Streifens über der immunsorbierenden Zone ausreichend sein, um das erwünschte Volumen aufzunehmen. Bei Verwendung des flüssigkeitsabsorbierenden Materials 16 ist diese Vol umensanforderung nicht gegeben. Wenn kein flüssigkeitsabsorbierendes Material 16 verwendet wird, ist das Retentionsvolumen üblicherweise mehr als 20 µl, vorzugsweise zumindest 50-200 µl. Wenn das flüssigkeitsabsorbierende Material 20 verwendet wird, können die Retentionsvolumina des Streifens von nur 2-20 µl verwendet werden, doch Volumina von 20-200 µl sind vorzuziehen.
Die Dicke der Streifen ist nicht entscheidend und beträgt normalerweise 0,1-2 mm, üblicherweise 0,15-1 mm, vorzugsweise 0,2-0,7 mm. Im allgemeinen wird die Mindestdicke durch die Stärke des Materials und die Notwendigkeit bestimmt, ein leicht nachweisbares Signal zu erzeugen, während die Höchstdicke durch die praktische Handhabung und die Kosten der Reagentien bestimmt wird.
Um die Bewahrung von Reagentien zu ermöglichen und Proben beschränkter Größe zur Verfügung zu stellen, ist die Streifenbreite im allgemeinen relativ gering, üblicherweise weniger als 20 mm, vorzugsweise weniger als 10 mm. Im allgemeinen beträgt die Streifenbreite nicht weniger als etwa 1,0 mm und reicht normalerweise von etwa 2 bis 12 mm, vorzugsweise von etwa 4 bis 8 mm.
Die Querschnittdimensionen eines Streifens wurden in der obigen Besprechung in veranschaulichender und keinesfalls einschränkender Weise in bezug auf ein Rechteck beschrieben. Wie bereits erwähnt, fallen auch andere Querschnittformen wie Kreise, Dreiecke, Ovale usw. in den Schutzbereich der Erfindung. Die Dimensionen können durch Fachleute auf dem Gebiet unter Bezugnahme auf die vorliegende Offenbarung bestimmt werden.
Die Streifenänge hängt von folgenden Faktoren ab: (1) Verwendung eines absorbierenden Elements 16, (2) Konzentration eines oder mehrerer der Analyten und (3) praktische Überlegungen betreffend die einfache Handhabung der Vorrichtung 10; sie beträgt etwa 1-40 cm, üblicherweise etwa 2-25 cm, vorzugsweise etwa 4-20 cm, kann jedoch jede praktikable Länge sein. Die Struktur des Streifens kann stark variieren - fein, mittelfein, mittel, mittelgrob und grob. Im allgemeinen sorgen eine kleinere Porengröße und ein feineres Material für langsamen Kapillarfluß und ein wirkungsvolles Einfangen von gebundenem Konjugat auf dem Streifen. Gröbere, porösere Materialien bieten langsameren Fluß, doch die Effizienz des Einfangens nimmt ab, außer wenn Teilchen aus der Probe eines Ligandenreagens beteiligt sind. Die Auswahl der Porosität des Materials hängt von der Binderate der Komponenten für einen bestimmten Assay ab.
Das absorbierende Element 16 kann aus dem gleichen oder einem anderen saugfähigen Material wie der Streifen 14 bestehen und einstückig mit diesem ausgebildet sein. Das Element 16 kann die Form eines Streifens, eines Kissens, eines Zylinders oder eine andere günstige Ausgestaltung aufweisen. Die Dimensionen des Elements 16 hängen von einigen der gleichen Faktoren wie die Dimensionen des Streifens 14 ab. Die primäre Überlegung ist die, daß das Element 16 das minimale Flüssigkeitsvolumen absorbieren muß, das im Assay erforderlich ist, einschließlich des Lösungsmittels für die Probe, der Assayreagentien und allälliger Wasch lösungen.
Die Länge der Vorrichtung 10 ist üblicherweise etwa 2-30 cm, vorzugsweise 4-15 cm. Der Querschnitt der Vorrichtung ist normalerweise rechteckig, kann aber auch ellipsoid oder beliebig anders geformt sein, ist allerdings zumindest auf einer Seite im allgemeinen eben. Die minimalen und maximalen Querschnittdimensionen sind 0,5-5 cm, vorzugsweise 1,0-3 cm, können aber auch größer sein, wenn die Elemente von mehr als einer Vorrichtung in einer einzelnen Einheit enthalten sind. Üblicherweise beträgt die gemessene Höhe senkrecht von der flachen Seite 1-30 mm, vorzugsweise 5-20 mm.
Die Position der Mittel 20 und 22 sowie der immunsorbierenden Zone(n) in bezug auf den Streifen 14 und das absorbierende Material 16 wird durch das Grundprinzip der Erfindung und durch den jeweils verwendeten Assay bestimmt, auf den die Erfindung eingestellt ist.
In der einfachsten in Figuren 1-5 dargestellten Form besitzt die Vorrichtung zwei Öffnungen 20 und 22. Die Öffnung 22 befindet sich in der Nähe des Endes des Streifens 14 und die Öffnung 20 zwischen der Öffnung 22 und dem flüssigkeitsabsorbierenden Element 16. Die Probe kann durch die Öffnung 20 oder die Öffnung 22 zugegeben werden, gefolgt von einem oder mehreren flüssigen Reagentien, die Elemente eines signalerzeugenden Systems sein können, wobei einer der flüssigen Reagentien durch die Öffnung 22 zugegeben wird. Diese Reagentien bewegen sich entlang des Streifens 14 durch Kapillarwirkung am Teil des Streifens 14 gegenüber der Öffnung 20 vorbei. Auf diese Weise werden nicht immobilisierte Materialien wie z.B. ein sbp-Mitglied abgeführt, sodaß ein Signal an der Öffnung 20 gelesen werden kann, wenn sich die immunsorbierende Zone auf dem Streifen 14 gegenüber der Öffnung 20 befindet. Alternativ dazu kann das sbp-Mitglied zu einer immunsorbierenden Zone transportiert werden, die von der Öffnung 20 entfernt ist, wo ein Signal abgelesen werden kann.
Der Mindestabstand des Mittels 20 vom Mittel 22 beträgt üblicherweise etwa 1 mm. Der Mindestabstand einer immunsorbierenden Zone vom Mittel 20, wenn die immunsorbierende Zone nicht gegenüber vom Mittel 20 angeordnet ist, wird durch die Fähigkeit des dazwischenliegenden saugfähigen Materials, ein sbp-Mitglied nichtdiffundierbar zu binden, wenn dies erforderlich ist, und durch die Fließeigenschaften des Streifens 14 bestimmt, die die Wirksamkeit des Waschens der immunsorbierenden Zone beeinflussen. Dieser Abstand ist üblicherweise einer, der günstig ist und eine leichte Visualisierung des Ergebnisses ermöglicht. Günstigerweise befindet sich die immunsorbierende Zone, wenn sie nicht gegenüber vom Mittel 20 angeordnet ist, zumindest 5 mm, vorzugsweise zumindest 10 mm, vom Kontaktabschnitt gegenüber vom Mittel 20 in Richtung des absorbierenden Materials 16 entfernt. Sie kann auch in einer größeren Entfernung angeordnet sein, sofern die flüssigen Reagentien durch Kapilarwirkung dorthin gelangen können. Auf diese Weise ist die immunsorbierende Zone von einem solchen Kontaktabschnitt "getrennt".
Die flüssigen Reagentien, die normalerweise sbp-Mitglieder, Elemente des signalerzeugenden Systems oder gegebenenfalls Waschösungen sind, können je nach der Assay-Arbeitsvorschrift und ihrer Rolle bei der Signalerzeugung hinsichtlich ihrer Konzentration stark variieren. Die Mengen an sbp-Mitgliedern werden auf der Grundlage der vorbestimmten nachweisbaren Mnidestmengen der Analyten, die sich in der Versuchslösung befinden, ausgewählt. Die Menge jedes der sbp-Mitglieder, die die immunsorbierende Zone kontaktiert, ist vorzugsweise so groß oder größer als die Menge des korrespondierenden Analyten in der Versuchsösung, die die immunsorbierende Zone kontaktiert. Die Menge des sbp-Mitglieds kann aber auch 100 Mal oder noch kleiner als die korrespondierende Menge des Analyten sein, die die immunsorbierende Zone kontaktiert.
Eines oder mehrere sbp-Mitglieder und Elemente des signalerzeugenden Systems können im wesentlichen einheitlich an eine immunsorbierende Zone auf dem Streifen gebunden sein. Die Menge jedes gebundenen sbp-Mitglieds und Elements des signalerzeugenden Systems hängt von der jeweils befolgten Assay-Arbeitsvorschrift ab.
Bei der Durchführung des Assays unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfaßt die Arbeitsvorschrift normalerweise das Kombinieren der Probe, die vermutlich die Analyten enthält, und anderer Reagentien in einem wäßrigen Medium, welche Reagentien gemäß der Assay-Arbeitsvorschrift erforderlich und ausgewählt sind, die wäßrige Versuchslösung zu bilden. In einigen Fällen ist die Versuchsösung die Probe selbst. Die Probe kann aus einer Vielzahl an Quellen stammen, z.B. physiologischen Flüssigkeien wie Speichel, Blut, Serum, Plasma, Harn, Augenlinsenflüssigkeit, Rückenmarksflüssigkeit usw., Nahrungsmitteln wie Milch und Wein, chemischen Prozeßflüssigkeiten, Nahrungsmittelabwasser usw.
Bezug nehmend auf Figuren 1-5 wird die Versuchslösung durch das Mittel 20 oder 22 in die Vorrichtung 10 eingebracht, um einen Abschnitt des Streifens 14 zu kontaktieren. Die Versuchslösung wird entlang des Streifens 14 durch Kapillarwirkung durch den Kontaktabschnitt hindurchgezogen. Als nächstes kann ein flüssiges Assayreagens wie z.B. ein enzymmarkiertes sbp-Mitglied über das Mittel 20 oder 22, üblicherweise das andere Mittel als jenes, das für die Versuchslösung verwendet wurde, in die Vorrichtung eingebracht werden. Im allgemeinen ist es vorzuziehen, dieses flüssige Reagens über die Öffnung 22 zuzugeben, wenn die Versuchslösung der Öffnung 20 zugeführt wurde. Das Reagens kontaktiert einen Abschnitt des Streifens 14 (üblicherweise einschließlich eines Abschnitts des Streifens, der durch das flüssige Reagens kontaktiert wird). Zusätzliches flüssiges Reagens wird je nach den Erfordernissen des Assays zugegeben und kann über beide Öffnungen eingebracht werden, außer daß das letzte flüssige Reagens, das die immunsorbierende Zone kontaktiert, üblicherweise als letztes und häufig durch die Öffnung 22 zugegeben wird. Dieses Reagens kann eine Waschlösung sein und Chemikalien enthalten, die Teil des signalerzeugenden Systems sind. Wenn ein Enzym als Marker verwendet wird, umfassen die Chemikalien üblicherweise ein Substrat, normalerweise in einer ausreichenden Konzentration, um nicht die Rate einzuschränken (höhere Konzentration als Km), das für das Enzymsysem entsprechend gepuffert wird.
Wie bereits erwähnt, kann der Kontaktabschnitt auch als immunsorbierende Zone dienen, oder es können je nach der ausgewählten Assay-Arbeitsvorschrift getrennte immunsorbierende Zonen verwendet werden. Das Benetzen des Streifens durch Kapilarwirkung wird üblicherweise fortgesetzt, sodaß eine ausreichende Menge an Assayreagentien hindurchfließen oder gegebenenfalls in der immunsorbierenden Zone gebunden werden kann. Nachdem die Flüssigkeit den Streifen durchquert hat, wird die immunsorbierende Zone auf die Gegenwart eines nachweisbaren Signals untersucht.
Meistens durchqueren die Lösungen den Streifen in relativ kurzer Zeit. Normalerweise dauert der Durchgang der Lösungen durch den Streifen zumindest 30 Sekunden und nicht mehr als 1 Stunde, noch häufiger etwa 1 bis 30 Minuten. Bei Verwendung eines Enzyms im signalerzeugenden Mittel dauert die Entwicklung des Signals im allgemeinen 30 Sekunden bis 30 Minuten, vor allem etwa 30 Sekunden bis 5 Minuten.
Man läßt eine ausreichend lange Zeit vor der Messung des Signals verstreichen, um eine gewisse Menge der signalerzeugenden Verbindung zu erzeugen. Sobald die Möglichkeit der Erzeugung eines nachweisbaren Signals besteht, wird offensichtlich, ob zumindest einer der Analyten in der Probe in einer vorbestimmten nachweisbaren Mindestmenge oder einer größeren Menge vorhanden ist oder nicht.
Der Streifen kann vor dem Assay unbehandelt bleiben oder mit einer Vielzahl an Materialien beschichtet werden, um die Eigenschaften zu verbessern. Beschichtungen sind z.B. Protein- und Polysaccharidbeschichtungen, synthetische Polymere, Zucker o.dgl., die vor allem dazu dienen, die Stabilität der an den Streifen gebundenen Materialien zu steigern. Diese Verbindungen können auch dazu dienen, die nichtspezifische Bindung von Materialien wie z.B. Antikörpern, Antigenen, Markern und Bindemitteln zu bekämpfen.
Der Streifen kann mit reaktiven Funktionalitäten aktiviert werden, um für die kovalente Bindung der an den Streifen zu konjugierenden organischen Materialien (siehe z.B. US- 4.168.146) zu sorgen.
Sbp-Mitglieder und - auf Wunsch - Elemente des signalerzeugenden Systems können mittels Adsorption statt kovalenter Bindung an das Stück des saugfähigen Materials oder den Streifen gebunden werden. Eine solche Bindung kann nicht-diffundierbar oder diffundierbar sein, wobei dies davon abhängt, ob die Assay-Arbeitsvorschrift den Transport eines derartigen Mitglieds entlang des Streifen vorsieht. Es geht z.B. um das Kontaktieren des saugfähigen Materials mit einer Lösung, die die an den Streifen zu bindende Materialien enthält, und das Trocknen des Streifens oder - wenn die Bindung diffundierbar ist - um das Aufbringen des trockenen Lösungsmittels Wenn die Bindung nicht-diffundierbar ist, kann eine nachfolgende Behandlung mit Proteinen, Detergentien, Polysacchariden oder anderen Materialien, die nichtspezifische Bindestellen blocken können, erforderlich sein. Das saugfähige Material kann auch in der Lage sein, mit einem sbp-Mitglied beschichtete Perlen einzuschließen.
In anderen Ausführungsformen der Vorrichtung der Erfindung befindet sich eine dritte Öffnung zwischen den ersten zwei Öffnungen (Figuren 6-9), oder ein flüssiges Reagens ist in einem aufbrechbaren, abgedichteten Behälter in der Vorrichtung enthalten (Figuren 10-13). Nach der Zugabe der Probe durch eine der Öffnungen kann das letzte flüssige Reagens, das die immunsorbierende Zone kontaktiert, durch Aufbrechen des abgedichteten Behälters oder durch Zugabe in diesen oder durch eine andere Öffnung zugegeben werden. Dieses Reagens kann für jede Öffnung gemäß dem Prinzip der Erfindung verwendet werden, sofern sowohl die Probe als auch das flüssige Reagens die immunsorbierende Zone kontaktiert, doch es ist häufig wünschenswert, dieses Reagens an der Öffnung einzubringen, die sich nicht zwischen der Öffnung, durch die die Probe zugegeben wurde, und der immunsorbierenden Zone befindet. Während des Fließens dieses Reagens oder davor können zusätzliche Reagentien zugegeben werden, sofern sie durch die Strömung mitgenommen und zur immunsorbierenden Zone transportiert werden. Die Strömung sorgt auch dafür, daß die Positionen auf dem Streifen gegenüber der ersten Öffnung und der Nachweiszone mit einer Mindestanzahl an Verfahrensschritten gewaschen werden. In einer solchen Ausführungsform kann das im Gehäuse eingeschlossene saugfähige Material ein Mitglied eines spezifischen Bindepaars (sbp), das nicht-diffundierbar an eine Stelle auf dem saugfähigen Material gebunden ist, und ein markiertes sbp-Mitglied aufweisen, das diffundierbar auf das saugfähige Material zwischen der ersten und dritten Öffnung aufgebracht wird.
Eine Anwendung der Vorrichtung umfaßt zeitlich abgestimmte Reagenszugaben, obwohl die Bedienperson alle Schritte in rascher Abfolge durchführt. Bei dieser Arbeitsvorschrift werden die Probe und notwendige Reagentien über eine Öffnung zugegeben, zweite Reagentien werden über eine zweite Öffnung zugegeben, und das letzte flüssige Reagens, das die immunsorbierende Zone kontaktiert, wird über eine dritte Öffnung zugegeben, die sich am weitesten stromaufwärts relativ zur allgemeinen Fließrichtung (Figuren 6-9) befindet, oder es wird durch Aufbrechen eines Behälters in der Vorrichtung bereitgestellt (Figuren 10-13). Da für die Kapillarmigration dieses Reagens vorbei an jeder Öffnung Zeit erforderlich ist, kann die Inkubationszeit an jeder Öffnung vor dem Transport von Reagentien, die über eine andere Öffnung oder durch Aufbrechen des Behälters zugegeben werden, zu dieser Öffnung durch den Abstand zwischen jeder Öffnung und dem aufbrechbaren Behälter gesteuert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Form der Näpfe innerhalb der Öffnungen. Zwar sind sie - wie oben erwähnt - häufig zylindrisch, konisch, oval oder rechteckig, doch ist es in manchen Fällen wünschenswert, eine angrenzende Vertiefung, z.B. 320a, vorzusehen, die mit einem oder mehreren Näpfen verbunden ist oder sich in diesen befindet, wo ein Reagens oder eine Probe ohne Kontaktieren des Streifens abgelagert werden kann (Figuren 14-17). Die Zugabe eines zweiten Reagens bewirkt das Vermischen mit dem ersten Reagens, sodaß das Gemisch auf den Streifen fließt.
Die Vorrichtung der Erfindung kann in einer Vielzahl an Assayverfahren und - arbeitsvorschriften eingesetzt werden. Allgemein gesprochen umfassen die Assayverfahren die folgenden Schritte:
(a) Einbringen einer Versuchslösung, die eine Probe umfaßt, die vermutlich einen Analyten enthält, in die Vorrichtung der Erfindung über eine erste Öffnung,
(b) Ermöglichen, daß die Versuchslösung zumindest einen Teil der immunsorbierenden Zone durchquert,
(c) Einbringen eines flüssigen Reagens in die Vorrichtung über eine zweite Öffnung, wodurch das Reagens zumindest einen Teil der immunsorbierenden Zone durchquert, und
(d) Beobachten der immunsorbierenden Zone hinsichtlich des Auftretens eines Signals bezüglich der Gegenwart von Analyt in der Probe.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sind nicht einschränkend. US-4.366.241 beschreibt ein Assayverfahren zur Bestimmung von sbp-Mitgliedern. Die Vorrichtung besitzt eine immunsorbierende Zone, an der ein sbp-Mitglied gegen Wanderung durch Diffusion befestigt ist. Die immunsorbierende Zone liegt allgemein gegenüber dem Eingang der Probelösung. In flüssigkeitsaufnehmender Beziehung mit der immunsorbierenden Zone steht eine flüssigkeitsabsorbierende Zone.
Im Verfahren in Verbindung mit der Vorrichtung wird üblicherweise ein signalerzeugendes System verwendet, das einen Marker enthält, der an ein sbp-Mitglied konjugiert ist, das diffundierbar an den saugfähigen Träger gebunden oder als flüssiges Reagens bereitgestellt sein kann. Die immunsorbierende Zone kann ein oder mehrere zusätzliche Elemente des signalerzeugenden Systems enthalten, die solcherart an die Zone gebunden sind, daß eine Wanderung einer signalerzeugenden Systemkomponente durch Diffusion ermöglicht oder verhindert wird. Das flüssige Reagens, das sich in einem aufbrechbaren Behälter befinden kann, enthält üblicherweise alle verbleibenden Elemente des signalerzeugenden Systems in einem Waschpuffer. Gemäß der Verfahrensarbeitsvorschrift steht die Menge an in der immunsorbierenden Zone gebundenem Marker mit der Analyten menge in der Probe in Zusammenhang.
Das signalerzeugende System liefert ein nachweisbares Signal in der immunsorbierenden Zone in Beziehung zur Menge an daran gebundenem Marker, das mit einem Signalwert auf der Grundlage eines Standards mit einer bekannten Analytenmenge oder mit einem anderen Teil des saugfähigen Materials als der immunsorbierenden Zone verglichen werden kann.
Eine spezifische Ausführungsform des Verfahrens gemäß US-4.366.241 ist in US- 4.632.901 beschrieben. Dieses Patent offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung von Immunassays. Die Vorrichtung umfaßt ein erstes Element, das eine Membran oder ein Filter ist, an der bzw. dem ein Antikörper, typischerweise ein monoklonaler Antikörper, gebunden ist. Eine derartige Membran mit Antikörper entspricht einer immunsorbierenden Zone. Das Verfahren umfaßt weiters ein zweites Element, das aus absorbierenden Material besteht, das seine Wirkung im Kontakt mit dem ersten Element entfaltet, um das Fließen durch das erste Element hindurch einzuleiten, wenn eine flüssige Probe zugegeben wird. Dieses Verfahren kann mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden, indem eine Probe, die einen antigenen Analyten enthält, über eine erste Öffnung dem ersten Element zugeführt wird, an das ein Antikörper nicht-diffundierbar gebunden ist. An die Zugabe der Probe schließt sich die Zugabe eines flüssigen Mediums, das enzymmarkierten Antikörper gegen das untersuchte Antigen enthält, über eine zweite Öffnung an. Das erste Element wird dann mit Enzymsubstraten in Kontakt gebracht und durch Zugabe einer Substratlösung über die erste oder eine dritte Öffnung oder durch Aufbrechen eines aufbrechbaren Behälters gewaschen. Die Gegenwart von enzymmarkiertem Antikörper auf dem ersten Element wird duch die Bildung von enzymkatalysiertem Produkt nach dem Waschen angezeigt und ist ein Indikator für die Gegenwart des Antigens in der untersuchten Probe. Die Vorrichtung und die Arbeitsvorschrift der Erfindung stellen eine Weiterentwicklung gegenüber der Arbeitsvorschrift in US-4.632.901 dar, da alle getrennten Waschschritte eliminiert wurden und nur ein oder zwei flüssige Reagentien erforderlich sind, die nicht in der Vorrichtung enthalten sind.
Ein weiteres Beispiel für ein Assayverfahren, in dem die vorliegende Vorrichtung Anwendung findet, ist in EP-A-191.640 beschrieben. Das Verfahren dient zur Bestimmung der Gegenwart eines Analyten in einer Probe, die vermutlich den Analyten enthält. Das Verfahren umfaßt das In-Kontakt-Bringen einer Versuchslösung, die die Probe und ein erstes sbp-Mitglied enthält, mit einem Teil eines Streifen aus saugfähigem Material, das die Versuchsösung durch Kapillarwirkung durchqueren kann. Das erste sbp-Mitglied kann den Analyten binden. Der Streifen enthält ein zweites, einstückig damit ausgebildetes sbp-Mitglied, um das erste sbp-Mitglied an einer kleinen Stelle oder der immunsorbierenden Zone auf dem Streifen getrennt vom Kontaktabschnitt des Streifens zu konzentrieren und nicht-diffundierbar zu binden. Ein nachweisbares Signal wird im Verhältnis zur Gegenwart des Analyten in der Versuchslösung erzeugt. Die Versuchslösung wandert durch die immunsorbierende Zone, während die Versuchslösung das saugfähige Material durchquert. Nachdem die Versuchslösung zumindest einen Teil des Streifens durchqueren konnte, wird der Streifen mit einer Entwicklerlösung in Kontakt gebracht, die Elemente eines signalerzeugenden Systems enthält. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann eine solche Entwicklerlösung über die zweite Öffnung in der Vorrichtung oder durch Aufbrechen des aufbrechbaren Behälters eingebracht werden. Erforderlichenfalls kann der Streifen mit anderen Elementen des signalerzeugenden Systems entweder vor oder nach dem Kontakt mit der Entwicklerlösung durch Zuführen über eine der Öffnungen in Kontakt gebracht werden. Das in der immunsorbierenden Zone erzeugte nachweisbare Signal wird dann mit dem Signal, das in einem anderen Teil des Streifens als der immunsorbierenden Zone nachweisbar ist, oder mit dem Signal verglichen, das durch eine Vergleichsprobe erzeugt wird, um den Analyten in der Probe zu bestimmen. Das in der immunsorbierenden Zone erzeugte Signal kann ein typisches scharfkantiges Muster aufweisen, das in starkem Kontrast zum Signal steht, das an angrenzenden Positionen auf dem Streifen erzeugt wird, wenn Analyt in der Versuchslösung vorhanden ist.
Ein weiteres Beispiel für ein Assayverfahren, in dem die erfindungsgemäße Vorrichtung Anwendung findet, ist in EP-A-02591 57 beschrieben. Dieses Verfahren betrifft die Bestimmung der Gegenwart eines Analyten in einer Probe, die den Analyten vermutlich enthält. Das Verfahren umfaßt das In-Kontakt-Bringen einer Versuchsösung, die die Probe, einen Antikörper für den Analyten und ein Konjugat des Analyten sowie einen Marker enthält, mit einem Kontaktabschnitt eines Stücks des saugfähigen Materials, das in zumindest einer Richtung durch Kapillarwirkung von der Versuchsiösung durchquert werden kann. Das saugfähige Material enthält eine immunsorbierende Zone mit einem ersten Rezeptor, der sich an das Konjugat binden kann, das nicht-diffundierbar an das saugfähige Mateiral getrennt vom Kontaktabschnitt gebunden ist. Das saugfähige Material enthält weiters einen zweiten Rezeptor, der zur Bindung des Antikörpers an den Analyten zwischen der immunsorbierenden Zone und dem Kontaktabschnitt fähig ist. Der zweite Rezeptor ist nicht-diffundierbar an das saugfähige Material gebunden. Zumindest ein Teil der Versuchsösung kann durch Kapilarwirkung das saugfähige Material durchqueren und dadurch die immunsorbierende Zone kontaktieren. Die Zone wird hinsichtlich Gegenwart des Konjugats untersucht. Zu diesem Zweck kann der Streifen einem signalerzeugenden Mittel ausgesetzt werden, das mit dem Marker, üblicherweise einem Enzymsubstrat in Wechselwirkung treten kann, um von der Analytenmenge abhängiges Signal in der Versuchslösung zu erzeugen. Vorzugsweise wird die immunsorbierende Zone vor oder während des Kontakts mit dem signalerzeugenden Mittel gewaschen. Das signalerzeugende Mittel kann über die zweite Öffnung zwischen dem zweiten Rezeptor und der immunsorbierenden Zone in die Vorrichtung der Erfindung eingebracht werden. Die Zone wird dadurch gewaschen und das in der immunsorbierenden Zone nachgewiesene Signal nachgewiesen.
Ein weiteres Beispiel für einen Assay, für den die erfindungsgemäße Vorrichtung geeignet ist, ist in EP-A2-0267006 geoffenbart In diesem Verfahren wird die Gegenwart von mehr als einer vorbestimmten nachweisbaren Mindestmenge eines oder mehrerer Analyten in einer Probe, die vermutlich eine Vielzahl an Analyten enthält, ermittelt. Jeder Analyt ist ein sbp-Mitglied. Das Verfahren umfaßt das In-Kontakt-Bringen eines Kontaktabschnitts eines Stücks aus saugfähigem Material, das in zumindest einer Richtung durch Kapillarmigration von einer Versuchslösung durchquert werden kann, mit der Versuchslösung, die die Probe und eine vorbestimmte Menge zweier oder mehrerer erster sbp-Mitglieder enthält (jeweils Analoge eines der Analyten). Das saugfähige Material enthält vorbestimmte Mengen von zwei oder mehreren zweiten sbp-Mitgliedern, die jeweils zur Bindung eines der Analyten und des korrespondierenden ersten sbp-Mitglieds fähig sind. Die zweiten sbp-Mitglieder werden an das saugfähige Material zumindest zwischen dem Kontaktabschnitt und einer vorbestimmten Stelle oder in der immunsorbierenden Zone auf dem Stück saugfähigen Materials getrennt vom Kontaktabschnitt nicht-diffundierbar gebunden, sodaß bei Gegenwart von mehr als einer vorbestimmten Menge eines Analyten das analoge erste sbp-Mitglied zumindest zur vorbestimmten Stelle auf dem Stück saugfähigen Materials wandert. Als nächstes wird ermöglicht, daß ein Teil der Versuchsiösung das saugfähige Material durch Kapillarwirkung durchquert. Die vorbestimmte Stelle wird hinsichtlich der Gegenwart eines oder mehrerer der ersten sbp-Mitglieder untersucht, was sich üblicherweise in der Gegenwart eines nachweisbaren Signals äußert. Die vorbestimmte Stelle kann einem signalerzeugenden Mittel ausgesetzt werden, das zur Wechselwirkung mit den ersten sbp-Mitgliedern fähig ist, um ein nachweisbares Signal an der vorbestimmten Stelle in Abhängigkeit von der Gegenwart eines oder mehrerer der Analyten in der Probe zu erzeugen. Ein solches signalerzeugendes Mittel kann über die zweite Öffnung oder mittels Aufbrechen eines aufbrechbaren Behälters in die Vorrichtung der Erfindung eingebracht werden, um das saugfähige Material zu kontaktieren.
Ein weiteres Beispiel für ein Assayverfahren, in dem die erfindungsgemäße Vorrichtung Anwendung findet, ist in EP-A2-0271204 beschrieben. In diesem Verfahen wird die Gegenwart eines Analyten in einer Probe, die vermutlich den Analyten enthält, bestimmt. Das Verfahren umfaßt das In-Kontakt-Bringen eines Kontaktabschnitts eines Stücks saugfähigen Materials, das in zumindest einer Richtung durch Kapillarwirkung von einer Versuchslösung durchquert werden kann, mit der Versuchslösung, die die Probe und ein erstes, mit dem Analyten analoges sbp-Mitglied enthält. Das saugfähige Material enthält ein zweites sbp-Mitglied, das zur Bindung des Analyten und des ersten sbp-Mitglieds fähig ist. Das zweite sbp-Mitglied ist an das saugfähige Material zumindest in einem Teil davon zwischen dem Kontaktabschnitt und einer kleinen Stelle oder der immunsorbierenden Zone auf dem Stück getrennt vom Kontaktabschnitt nichtdiffundierbar gebunden. Die Oberfläche der Stelle ist wesentlich kleiner als jene des Stücks saugfähigen Materials. Die Stelle ist zur Bindung des ersten sbp-Mitglieds fähig, das nicht an das zweite sbp-Mitglied gebunden ist. Als nächstes wird ermöglicht, daß ein Teil der Versuchslösung durch Kapillarwirkung das saugfähige Material durchquert und dadurch die Stelle kontaktiert. Die Stelle wird hinsichtlich der Gegenwart des ersten sbp-Mitglieds an der Stelle untesucht, was sich üblicherweise in der Gegenwart eines nachweisbaren Signals äußert. Ein solches Signal kann erzeugt werden, indem die Stelle einem signalerzeugenden Mittel ausgesetzt wird, das zur Wechselwirkung mit dem ersten sbp-Mitglied fähig ist, um ein nachweisbares Signal an der Stelle in Abhängigkeit von der Analytenmenge in der Probe zu erzeugen. Das signalerzeugende Mittel kann über eine zweite Öffnung oder durch Aufbrechen eines aufbrechbaren Behälters in die erfindungsgemäße Vorrichtung eingebracht werden. Das Signal an der Stelle unterscheidet sich vom Signal, das in anderen Abschnitten des saugfähigen Materials als der Stelle nachweisbar ist.
Ein weiteres Beispiel eines Assayverfahrens, in dem die vorliegende Erfindung Anwendung finden kann, ist in US-4.552.839 und eine Variante davon in US-4.623.461 beschrieben. US-4.552.839 offenbart Verfahren und Zusammensetzungen zur Bestimmung der Gegenwart von Analyten in einem teilchenhältigen Medium, wobei der Analyt von Interesse an ein Teilchen in der Probe gebunden sein kann oder nicht. Durch In-Kontakt-Bringen des Assaymediums mit einem saugfähigen Material an einer Flüssigkeit-Luft-Grenzfläche kann eine kleine Stelle, üblicherweise ein dünnes Band oder ein konzentrierter Punkt, von Teilchen angrenzend an die Grenzfläche erhalten werden, welche Stelle ein Signal liefert, das mit der Gegenwart von Analyten in der Probe in Beziehung gesetzt werden kann. Die Teilchen sind z.B. synthetische Teilchen, Zellen und Immunkomplexaggregate. Die Größe und Beschaffenheit der Teilchen sowie die Beschaffenheit des wäßrigen Mediums kann dazu dienen, die Bildung der kleinen Stelle zu modulieren. In einigen Ausführungsformen dieses Verfahrens werden als nächstes eines oder mehrere Elemente eines signalerzeugenden Systems in einem flüssigen Medium mit dem saugfähigen Material in Kontakt gebracht. Ein solches flüssiges Medium kann über die zweite Öffnung in eine erfindungsgemäße Vorrichtung eingebracht werden.
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann die Vorrichtung für serologische Untersuchungen verwendet werden, z.B. für das Testen von Antikörpern gegen HIV, HBS, Röteln, Syphilis usw. In einer solchen Ausführungsform wird die Probe mit einem Antigen in einem flüssigen Medium zusammengebracht. Jeder gebildete Immunkomplex muß von nichtspezifischem Immunglobulin in der Probe getrennt sein. Nur dann kann der Kontakt von Anti-Immunglobulin mit dem Immunkomplex ermöglicht werden. Wenn der Marker ein Enzym ist, muß der Immunkomplex vom markierten Anti-Immunglobulin getrennt werden, bevor er mit einem Enzymsubstrat kontaktiert wird. Durch Verwendung der Vorrichtung der Figuren 10-1 3 können diese Schritte durch nacheinander erfolgendes Zugeben der Reagentien durchgeführt werden. Eine Serumprobe wird mit antigenbeschichteten Latexperlen zusammengebracht und über die Öffnung 222 der Vorrichtung 210 eingebracht. Alternativ dazu ist die Vertiefung 320a der Vorrichtung der Figuren 14-1 7 in die Öffnung 222 der Vorrichtung 210 integriert (Figuren 10-13). Die Serumprobe wird der Vertiefung zugeführt und eine Suspension von Latexperlen über die Öffnung 222 eingebracht, wodurch das Serum und die Latexsuspension auf den Streifen gespült werden. Enzymmarkiertes Rezeptorimmunglobulin wird als nächstes durch die Öffnung 220 eingebracht und der aufbrechbare Behälter aufgebrochen, wodurch eine Enzymsubstrate enthaltende Waschösung freigesetzt wird. Während die Substratlösung zu den Näpfen wandert, hat die Immunglobulinrezeptor-Lösung Zeit, um zu den gegenüber der Öffnung 222 eingeschlossenen Latexperlen zu wandern und diese zu kontaktieren, wo sie mit gebundenen Antikörpern reagieren kann. Die Substratlösung wandert anschließend an den Latexperlen vorbei in entgegengesetzter Richtung, um die Perlen wirkungsvoll zu waschen und sie Substrat auszusetzen, das im Verhältnis zur Menge an Konjugat, das sich an die Perlen gebunden hat, in nachweisbares Produkt umgewandelt wird. Der Inkubation wird ausreichend Zeit gelassen, damit sich Produkt auf dem Streifen gegenüber der ersten Öffnung bilden kann, wenn Enzym an der Öffnung vorhanden ist. Die Bedienperson kann nun wieder die Gegenwart oder Abwesenheit von Farbe an der Öffnung 222 beobachten, wobei sie zumindest so lange warten muß, bis diese Ereignisse eintreten können. Bei diesem Verfahren kann die Öffnung 220 auch als Farbreferenz dienen, um die Definition der Farbmenge and er Öffnung 222 zu unterstützen. Vorzugsweise besitzen die Perlen einen Durchmesser von weniger als etwa 5 µm.
Ein verwandtes Verfahren kann zur Untersuchung eines Antigens z.B. hinsichtlich des Chlamydia-Antigens angewendet werden.Unter Verwendung eines Vorrichtung mit einer aufbrechbaren, Entwickler enthaltenden Kapsel (Figuren 10-13) können die Probe und der Chlamydia-Antikörper nacheinander über eine Öffnung zugegeben werden, eine Lösung, die enzymmarkierte Anti-Immunglobuline enthält, kann über eine zweite Öffnung zugegeben werden, und die Kapsel kann aufgebrochen werden, um Enzymsubstrate und Waschlösung freizusetzen. Während einer Inkubationsdauer absorbiert die Probe in den Streifen, und der Antigen-Antikörper-Komplex bindet sich an den Streifen, wenn Antigen vorhanden ist. Das enzymmarkierte Anti-Immunglobulin kommt dann durch Kapillarmigration oder durch Migration aufgrund des Kapiarflusses des Enzymsubstrats und der Waschlösung mit dem Komplex in Kontakt und bindet sich an jeden vorhandenen Komplex. Die Waschlösung wäscht dann überschüssiges Konjugat aus dem Komplex und liefert schließlich das Substrat, sodaß die enzymkatalysierte Bildung eines nachweisbaren Produkts an der ersten Öffnung ermöglicht wird.
Eine Vorrichtung mit zwei Öffnungen und einer Nachweiszone kann in einem Assay auf menschliches choriales Gonadotrophin (HCG) verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird ein Konjugat eines Enzyms mit Anti-HCG auf dem Streifen an der ersten Öffnung getrocknet und ein zweiter Anti-HCG-Antikörper in einer Nachweiszone auf dem Streifen stromab von der ersten Öffnung immobilisiert. Der Assay kann durchgeführt werden, indem eine Probe, die vermutlich HCG enthält, an der ersten Öffnung zugegeben und gleichzeitig eine Entwicklerlösung, die Enzymsubstrat enthält, an der zweiten Öffnung zugegeben wird. Während der nachfolgenden Inkubation bindet sich HCG an das Konjugat, der Komplex wird durch den sich bewegenden Entwickler zur Nachweiszone transportiert, wo er sich bindet, und der gebundene Komplex wirkt solcherart auf das Substrat ein, daß in der Nachweiszone Farbe entsteht, wenn HCG in der Probe vorhanden ist.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann aus praktischen Gründen als verpackter Set in Kombination mit Reagentien in vorbestimmten Mengen zur Verwendung bei Untersuchungen hinsichtlich eines Analyten bereitgestellt werden. Je nach dem durchgeführten Assay können die Reagentien folgendes beinhalten: enzymmarkiertes sbp-Mitglied, Substrat für das Enzym, Puffer, beliebige zusätzliche Substrate und Cofaktoren, die die Enzyme brauchen, Farbstoffvorläufer u.dgl. Außerdem können andere Additive enthalten sein, z.B. Stabilisatoren, Puffer u.dgl. Die relativen Mengen der verschiedenen Reagentien können stark variiert werden, um Konzentrationen in Lösung der Reagentien bereitzustellen, die die Empfindlichkeit des Assays wesentlich verbessern. Gegebenenfalls kann die erfindungsgemäße Vorrichtung luftdicht verpackt sein, um die Aktivität von immunchemischen Mitteln aufrechtzuerhalten.
Obwohl die vorliegende Erfindung zum besseren Verständnis in veranschaulichender Weise und durch Beispiele erklärt wurde, ist es offenkundig, daß innerhalb des Sch utzbereichs der beigelegten Patentansprüche gewisse Änderungen oder Modifikationen möglich sind.

Claims

1. Vorrichtung (10) zur Durchführung eines Assays zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, wobei die Vorrichtung folgendes umfaßt:

(a) ein Gehäuse (12),

(b) ein saugfähiges, im Gehäuse (12) eingeschlossenes Material (14), das ein Einfangmittel bereitstellt, um ein erstes Mitglied eines spezifischen Bindepaars (spb) in einer Einfangzone einzufangen und es Flüssigkeit zu ermöglichen, durch Kapillarwirkung aus der Zone abtransportiert zu werden,

(c) ein erstes Einlaßmittel (20) in das Gehäuse (12) zum Einbringen der Probe in die Vorrichtung (10), sodaß sie in Kontakt mit einer ersten Zone des saugfähigen Materials (14) kommt, und

(d) ein zweites Einlaßmittel (22) in das Gehäuse, um ein anderes flüssiges Reagens als die Probe in die Vorrichtung (1) einzubringen, ohne das flüssige Reagens auch durch das erste Einlaßmittel einzubringen, sodaß es in Kontakt mit einer zweiten Zone des saugfähigen Materials (14) kommt; und worin das saugfähige Material (14) eine Durchgangsrichtung für eine Versuchslösung durch Kapillarmigration bereitstellt, wobei die Richtung von der zweiten Zone zur und durch die erste Zone sowie weiter zur Einfangzone verläuft, wenn diese von der ersten Zone getrennt ist.

2. Vorrichtung (10) nach Anspruch 1, worin das Einfangmittel saugfähiges Material umfaßt, das immunsorbierend oder fähig ist, immunsorbierend gemacht zu werden.

3. Vorrichtung (10) nach Anspruch 2, worin das saugfähige Material des Einfangmittels ein daran gebundenes Mitglied eines spezifischen Bindepaars (sbp) aufweist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, worin das gebundene sbp-Mitglied ein Antikörper oder Antigen ist.

5. Vorrichtung (10) nach Anspruch 2, 3 oder 4, worin ein zweites Stück saugfähiges Material (16) in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung zum saugfähigen Material (14) des Einfangmittels steht, um Flüssigkeit aufzunehmen, die in der Durchgangsrichtung zur Einfangzone gelangte.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiters umfassend ein oder mehrere flüssige Reagentien (248), die zur anschließenden Freisetzung in zumindest einem im Gehäuse (12) eingeschlossenen Behälter (246) enthalten sind, um ein Assayverfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe durchzuführen.

7. Vorrichtung (10) nach Anspruch 6, worin das bzw. die Reagentien (248) in einem wasserunlöslichen aufbrechbaren Behälter (246) enthalten ist bzw. sind und das bzw. die flüssige(n) Reagens bzw. Reagentien (248) ein Enzymsubstrat enthält bzw. enthalten.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bs 7, worin das erste und das zweite Einlaßmittel (20, 22) Öffnungen in der Vorrichtung sind.

9. Verfahren zur Durchführung eines Immunassays auf einen Analyten, dessen Gegenwart in einer Probe vermutet wird, welches Verfahren folgendes umfaßt:

(a) Einbringen einer Versuchslösung, die eine Probe umfaßt, die vermutlich einen Analyten enthält, in die Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 8 über das erste Einlaßmittel (20),

(b) Ermöglichen, daß die Versuchslösung zumindest einen Teil der Einfangzone überquert,

(c) Einbringen eines flüssigen Mittels (248) in die Vorrichtung (10) über das zweite Einlaßmittel (22), wodurch das Mittel zumindest einen Teil der Einfangzone überquert, und

(d) Beobachten der Einfangzone hinsichtlich der Gegenwart eines Signals bezüglich der Gegenwart von Analyt in der Probe.

10. Set zur Durchführung eines Assayverfahrens, welches Set die Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in verpackter Kombination mit anderen Assaykomponenten umfaßt.