DE3816953A1

DE3816953A1 - Verfahren zur reversiblen aggregation von teilchen

Info

Publication number: DE3816953A1
Application number: DE3816953A
Authority: DE
Inventors: Thomas L Tarnowski; Cheng-I Lin; Edwin F Ullman
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1987-05-19
Filing date: 1988-05-18
Publication date: 1988-12-08
Also published as: FR2615621B1; US4812401A; GB8811751D0; JPS63314466A; CA1322067C; GB2206206B; FR2615621A1; JP2657066B2; GB2206206A

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur reversiblen Aggregation von Teilchen, die in einem flüssigen Medium dispergiert sind, unter Verwendung eines polyionischen Polymers zur Aggregation der Teilchen und eines chemischen Reagens zur Rückgängigmachung der Aggregation der Teilchen durch Spaltung zumindest einiger Bindungen innerhalb des polyionischen Polymers. Die Verfahren eignen sich insbesondere zur Abtrennung von Zellen aus biologischen Flüssigkeiten, wie Vollblut, Lymphe, Urin und Zellkulturen.

Zur Bestimmung der Anwesenheit und der Menge eines Analyten in einer Probe, z. B. einer biologischen Flüssigkeit, wie Blut oder Urin, sind zahlreiche Methoden bekannt. Die gebräuchlichste Methode ist der in vitro Assay.

Viele dieser Methoden beinhalten eine kompetitive Bindung des zu bestimmenden Analyten und eines markierten Analogons des Analyten an Bindungsstellen auf einem spezifischen Rezeptor, z. B. einem Antikörper. Einige dieser Methoden beinhalten einen Aggregationsschritt, in dem das gebundene oder ungebundene, markierte Analogon an einen Träger, z. B. ein Teilchen, das aggregiert wird, gebunden oder damit assoziiert wird. Das Aggregat kann dann auf ein Signal untersucht werden, das in Beziehung zur Menge des Analyten in der Probe erzeugt wird.

Für die Aggregation von Teilchen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, sind einige Methoden bekannt. Beispielsweise können Teilchen unter Verwendung eines Polymers in dem Medium aggregiert werden. In anderen Fällen können die Teilchen mit magnetischen Teilchen unter Verwendung eines Polymers, das z. B. die Teilchen und die magnetischen Teilchen nicht-spezifisch bindet, coaggregiert werden.

Zur Trennung von gebundenen und ungebundenen Fraktionen sind ebenfalls einige Methoden bekannt. Diese umfassen z. B. eine differenzielle Migration der gebundenen bzw. freien Fraktionen, wie z. B. bei der Chromatoelektrophorese oder Gelfiltration, eine chemische Präzipitation der gebundenen oder freien Fraktion, z. B. mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln, Salzen oder Säuren, gefolgt von Filtration oder Zentrifugation; eine immunologische Präzipitation der gebundenen Fraktion, z. B. eine Doppel- Antikörpertechnik, gefolgt von Filtration oder Zentrifugation; eine Absorption der gebundenen oder freien Fraktionen an selektive Sorbentien, wie Holzkohle, Silicate oder Kunstharze; oder magnetische Trennmethoden.

Die magnetischen Trennungen umfassen im allgemeinen zwei Kategorien: Trennungen, bei denen das zu trennende Material von Haus aus magnetisch ist und Trennungen, bei denen eine oder mehrere Komponenten einer Mischung durch Bindung an eine magnetisch ansprechende Einheit magnetisch gemacht werden. Bei biologischen Trennungen z. B. sind die interessierenden Materialien im allgemeinen nicht ausreichend magnetisch und es wurden daher an Antikörper, Lectine und andere Target-Moleküle gebundene magnetische Teilchen verwendet, um viele dieser Materialien zu isolieren.

Die Bindung von nicht-magnetischen und magnetischen Teilchen aneinander kann durch den pH beeinflußt werden. Daher umfaßt ein bekanntes Verfahren zur Rückgängigmachung der Aggregation der Teilchen eine Änderung des pH. Die Bindung kann auch durch andere Faktoren, wie die Ionenstärke und die Gegenwart von ionischen oder nicht- ionischen Polymeren, beeinflußt werden. Wenn die Teilchen durch ionische Wechselwirkung gebunden sind, kann man daher die Ionenstärke erhöhen, um die Kopplung von magnetischen und nicht-magnetischen Teilchen leichter rückgängig zu machen.

Ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Substanzen in biologischen Flüssigkeiten (z. B. Arzneistoffen, Hormonen, Vitaminen und Enzymen), in dem magnetisch ansprechende, permeable, feste, wasserunlösliche Mikroteilchen verwendet werden, ist in der US-A-41 15 534 beschrieben. Die US-A-44 52 773 beschreibt magnetische Eisen-Dextran-Mikrokügelchen, die kovalent an Antikörper, Enzyme und andere biologische Moleküle gebunden werden können und dazu geeignet sind, Zellen und andere biologische Teilchen und Moleküle zu markieren und mit Hilfe eines magnetischen Feldes zu trennen. Beschichtete magnetisierbare Mikroteilchen, reversible Suspensionen hiervon und entsprechende Verfahren sind in der US-A-44 54 234 offenbart. Eine Methode zur Trennung von kationischen und anionischen Perlen in gemischten Harzbetten unter Verwendung eines ferromagnetischen Materials, das in jede der ionischen Perlen eingebaut ist, ist in der US-A-45 23 996 beschrieben. Ein magnetisches Trennverfahren unter Verwendung eines Kolloids von magnetischen Teilchen wird in der US-A-45 26 681 diskutiert. Die GB-A-21 52 664 beschreibt magnetische Testreagentien.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur reversiblen Aggregation von Teilchen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, unter Verwendung eines polyionischen Polymers, um die Teilchen zu aggregieren, in dem man die aggregierten Teilchen mit einem chemischen Reagens in Kontakt bringt, das zur Rückgängigmachung der Aggregation durch Spalten des polyionischen Polymers fähig ist. Wenn die Teilchen in dem Medium nicht-magnetisch sind, können sie miteinander, mit anderen nicht-magnetischen Teilchen oder mit magnetischen Teilchen durch Zusatz eines polyionischen Polymers Aggregate bilden. Wenn die Teilchen magnetisch sind, können sie miteinander oder mit nicht- magnetischen Teilchen durch Zusatz eines polyionischen Polymers Aggregate bilden.

Das erfindungsgemäße Verfahren findet insbesondere Anwendung zum Testen von organischen oder biologischen Analyten, insbesondere Analyten von Interesse bei der Analyse von Körperflüssigkeiten. Von besonderem Interesse sind Assays, bei denen der Analyt ein Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars (SBP) ist, wobei der Analyt oder ein zu dem Analyten komplementärer SBP-Bestandteil an die Außenoberfläche eines Teilchens gebunden ist oder gebunden werden kann. Wenn der SBP-Bestandteil an dem Teilchen nicht komplementär zu dem Analyten ist, kann ein komplementärer SBP-Bestandteil ebenfalls zugegeben werden. Das Verfahren umfaßt die Kombination der Teilchen, welche in einem flüssigen Medium suspendiert sind, mit einem SBP-Bestandteil, der zu dem Analyten oder dem SBP- Bestandteil auf der Oberfläche komplementär ist, und die Zugabe eines polyionischen Polymers, das zur nicht- spezifischen Aggregation der Teilchen fähig ist. Nach erfolgter Aggregation wird ein chemisches Reagens zugegeben, das zur Rückgängigmachung der Aggregation durch Spalten zumindest einiger Bindungen des polyionischen Polymers fähig ist. Anschließend wird die restliche spezifische Aggregation der Teilchen gemessen. Normalerweise wird der SBP-Bestandteil anhand eines Signals nachgewiesen, das unter Verwendung eines signalerzeugenden Systems hervorgerufen wird, das ein Signal in Beziehung zur Menge des Analyten in der Probe erzeugt.

Von speziellem Interesse sind Methoden, wie die Abtrennung von Zellen aus Vollblut, bei denen der Analyt eine Oberflächenkomponente ist oder an ein nicht-magnetisches Teilchen gebunden wird. In einem solchem Fall sieht die Methode vor, daß man in dem Medium die Probe, welche nicht-magnetische Teilchen enthält, z. B. Vollblut, magnetische Teilchen und ein polyionisches Polymer für die nicht-spezifische Agglutination der magnetischen Teilchen und nicht-magnetischen Teilchen, z. B. der Zellen, kombiniert. Das Medium wird einem magnetischen Feldgradienten ausgesetzt, um die agglutinierten Zellen von Blutplasma zu trennen. Die agglutinierten Zellen werden mit einem chemischen Reagens unter Bedingungen für die Rückgängigmachung der Agglutination durch zumindest teilweise Depolymerisation des polyionischen Polymers in Kontakt gebracht.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Trennung von nicht-magnetischen Teilchen aus einem Medium durch nicht-spezifische Aggregation der Teilchen mit magnetischen Teilchen unter Verwendung eines polyionischen Polymers. Es ermöglicht auch die Rückgängigmachung der Aggregation durch Verwendung eines chemischen Reagens, das zumindest einige der Bindungen innerhalb des polyionischen Polymers spaltet.

Gegenstand der Erfindung sind ferner neue polyionische Polymere, einschließlich Polykationen der Formel

(A)_n

in der A positiv geladen ist und außer Wasserstoff 4 bis 30 Atome, ausgewählt unter Kohlenstoff, Sauerstoff, Phosphor, Stickstoff und Schwefel, enthält, wobei mindestens eine der Gruppen A eine spaltbare Bindung aufweist, und n einen Mittelwert von 5 bis 10 000 hat.

Ferner sind Gegenstand der Erfindung Testsätze (Kits) zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und zur Durchführung eines Assays zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält.

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein Verfahren zur reversiblen Aggregation von Teilchen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, bei dem ein polyionisches Polymer zur Aggregation der Teilchen oder zur Coaggregation der Teilchen untereinander verwendet wird, und bei dem die Rückgängigmachung der Aggregation mit Hilfe eines chemischen Reagens zur Spaltung mindestens einiger spaltbarer Bindungen innerhalb des polyionischen Polymers erfolgt. Oft ist das aus dem flüssigen Medium abzutrennende Teilchen ein nicht-magnetisches Teilchen oder wird sich selbst mit einem nicht-magnetischen Teilchen aggregieren oder damit aggregiert werden. Andererseits ist das abzutrennende Teilchen manchmal magnetisch oder wird zur Coaggregation mit einem magnetischen Teilchen gebracht werden. Durch die erfindungsgemäße Zugabe eines polyionischen Polymers kann daher eine Aggregation zwischen nicht-magnetischen Teilchen, zwischen magnetischen und nicht-magnetischen Teilchen oder zwischen magnetischen Teilchen bewirkt werden.

In den Fällen, in denen die aus dem flüssigen Medium abzutrennenden Teilchen magnetisch sind, oder in denen magnetische Teilchen verwendet werden, um mit nicht- magnetischen Teilchen zu coaggregieren, werden die aggregierten Teilchen unter Verwendung eines magnetischen Feldgradienten aus dem Medium abgetrennt. In den Fällen, in denen keine magnetischen Teilchen verwendet werden, können die Aggregate aus dem flüssigen Medium durch beliebige bekannte Verfahren abgetrennt werden, z. B. durch Zentrifugation, Filtration, Flotation, Verteilung zwischen nicht-mischbaren Lösungsmitteln oder Absorption an selektiven Sorbentien. Die aggregierten Teilchen werden mit einem chemischen Reagens, das zur Spaltung zumindest einiger Bindungen innerhalb des polyionischen Polymers fähig ist, ausreichend lange behandelt, um die Aggregation rückgängig zu machen.

Ferner betrifft die Erfindung neue Zusammensetzungen zur reversiblen Aggregation von Teilchen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind polyionische Polymere der Formel:

(A)_n

in der A positiv geladen ist und außerdem Wasserstoff 4 bis 30 Atome, ausgewählt unter Kohlenstoff, Sauerstoff, Phosphor, Stickstoff und Schwefel, enthält, wobei mindestens eine der Gruppen A eine spaltbare Gruppe aufweist, und n einen Mittelwert von 5 bis 10 000 hat.

Die bevorzugten Zusammensetzungen sind polyionische Polymere der Formel:

in der R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und gegebenenfalls substituiertes C_6-20-Aryl, C_6-20-Aryl-C_1-6- alkyl, C_1-6-Alkyl oder C_1-6-Alkoxy-C_1-6-alkyl bedeuten. B ist eine Brückengruppe, die außer Wasserstoff 2 bis 30 Atome enthält, ausgewählt unter Kohlenstoff, Sauerstoff, Phosphor, Stickstoff und Schwefel, wobei zumindest eine der Gruppen B eine spaltbare Gruppe aufweist, die bei der Spaltung eine Verringerung von n bewirkt, und n hat einen Mittelwert von 5 bis 10 000. Die spaltbaren Bindungen sind vorzugsweise in Disulfiden, Carbonsäure-, Phosphat- und Sulfatestern sowie Amiden, Carboboranen, Siloxanen, vicinalen Glykolen und dergl.

Die Reagentien zur Spaltung der spaltbaren Bindungen sind z. B. Reduktionsmittel, etwa Mercaptane, wie Dithioerythrit, hydrolytische Enzyme, wie Pepsin, Perjodat-, Sulfit-, Phosphit- und Borhydridsalze, Wasserstoffperoxid oder Fluoride.

Das erfindungsgemäße Verfahren findet breite Anwendung bei der Abtrennung von suspendierten Teilchen aus einem Medium, insbesondere zur Abtrennung von biologischen Materialien, wie Zellen und Mikroorganismen, und auf dem Gebiet der Immunassays und der Blutbestimmung. Das Verfahren ermöglicht dei Aggregation der Teilchen unter Verwendung eines polyionischen Polymers und die Umkehr der Aggregation durch Zusatz eines chemischen Reagens, das zur zumindest teilweisen Depolymerisation des polyionischen Polymers fähig ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur reversiblen Aggregation von Teilchen ist effektiver als die Rückgängigmachung der ionischen Bindung der Teilchen durch Änderung der Ionenstärke oder des pH des Mediums und macht sie überflüssig. Die Erfindung findet auch Anwendung bei der Bestimmung eines Analyten in einer Probe, bei der ein Abtrennschritt erforderlich ist.

Im folgenden werden einige Ausdrücke näher definiert.

Analyt: zu messende Verbindung oder Zusammensetzung; interessierendes Material. Der Analyt kann ein Bestandeil eines spezifischen Bindungspaares (SBP) oder ein Ligand sein, der ein- oder mehrwertig, gewöhnlich antigen oder haptenisch, und eine einzelne Verbindung ist oder mehrere Verbindungen sind, die zumindest eine gemeinsame epitope oder determinante Stelle teilen. Der Analyt kann auch eine Komponente eines Teilchens sein oder während eines Assays an ein Teilchen gebunden werden. Ein Beispiel für einen Analyten, der eine Komponente eines Teilchens ist, ist ein Antigen auf der Oberfläche einer Zelle, z. B. ein Blutgruppenantigen (A, B, AB, 0, D etc.) oder ein HLA-Antigen.

Ein Beispiel für einen Analyten, der während eines Assays an ein Teilchen gebunden wird, ist ein SBP-Bestandteil, wenn ein komplementärer SBP-Bestandteil an ein Teilchen gebunden ist, Glykoprotein oder Glykolipide, wenn ein Lectin an ein Teilchen gebunden ist, oder Antikörper, wenn Protein A an ein Teilchen gebunden ist. Die Bindung des Analyten an ein Teilchen kann spezifisch oder nicht- spezifisch, immunologisch oder nicht-immunologisch sein.

Die mehrwertigen Ligand-Analyten sind normalerweise Polyaminosäuren, d. h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren und Kombinationen davon. Derartige Kombinationen umfassen z. B. Komponenten von Bakterien, Viren, Chromosomen, Genen, Mitochondrien, Zellkernen und Zellmembranen.

Die genaue Art einiger Analyten sowie zahlreiche Beispiele sind in der US-A-42 99 916, insbesondere Spalten 16 bis 23, beschrieben.

Zum größten Teil haben die erfindungsgemäß angewandten polyepitopen Ligand-Analyten ein Molekulargewicht von mindestens etwa 5000, gewöhnlich mindestens etwa 10 000. In der Gruppe der Polyaminosäuren haben die interessierenden Polyaminosäuren im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis 5 000 000, gewöhnlich etwa 20 000 bis 1 000 000. Das Molekulargewicht der interessierenden Hormone liegt gewöhnlich im Bereich von etwa 5000 bis 60 000.

Eine große Vielzahl von Proteinen kann der Familie von Proteinen mit ähnlichen Struktureigenschaften, Proteinen mit speziellen biologischen Funktionen, Proteinen mit Bezug zu spezifischen Mikroorganismen, insbesondere krankheitserregende Mikroorganismen, zugerechnet werden.

Die monoepitopen Ligand-Analyten haben im allgemeinen ein Molekulargewicht von etw 100 bis 2000, insbesondere 125 bis 1000. Die interessierenden Analyte umfassen z. B. Arzneistoffe, Metabolite, Pestizide und Schadstoffe. Interessierende Arzneistoffe sind z. B. Alkaloide, etwa Morphin-Alkaloide, wie Morphin, Codein, Heroin, Dextrometorphan, deren Derivate und Metabolite; Cocain- Alkaloide, wie Cocain und Benzoylecgonin, deren Derivate und Metabolite; Ergot-Alkaloide, wie das Diethylamid von Lysergsäure; Steroid-Alkaloide, Iminazoyl-Alkaloide; Chinazolin-Alkaloide; Isochinolin-Alkaloide; Chinolin- Alkaloide, wie Chinin und Chinidin; Diterpen-Alkaloide, deren Derivate und Metabolite.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen umfaßt Steroide, einschließlich Östrogene, Androgene, Andreacorticosteroide, Gallensäuren, cardiotonische Glycoside und Aglycone, wie Digoxin und Digoxigenin, Saponine und Sapogenine, deren Derivate und Metabolite. Ebenfalls umfaßt werden mimetische Steroidsubstanzen, wie Diethylstilböstrol.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Lactame mit 5 bis 6 Ringgliedern, etwa Barbiturate, wie Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantoin, Primidon, Ethosuximid und deren Metabolite.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Aminoalkylbenzole mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe, etwa Amphetamine, Catecholamine, wie Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin, Nacrein, Papaverin und deren Metabolite.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Benzheterocyclen, z. B. Oxazepan, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin, deren Derivate und Metabolite, wobei die heterocyclischen Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine sind.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Purine, z. B. Theophyllin, Coffein, deren Metabolite und Derivate.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind solche, die sich von Marÿuana ableiten, z. B. Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Vitamine, z. B. A, B, z. B. B₁₂, C, D, E und K, Folsäure und Thiamin.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Prostaglandine, die sich hinsichtlich des Ausmaßes und der Position der Hydroxylierung und Ungesättigtheit unterscheiden.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Antibiotika, wie Penicillin, Chlormycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin, deren Metabolite und Derivate.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Nucleoside und Nucleotide, wie ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidin mit ihren entsprechenden Zucker- und Phosphat- Substituenten.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind verschiedene Substanzen, wie Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin, Nortriptylin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propranolol, Griseofulvin, Valproinsäure, Butyrophenone, Antihistamine, Anticholinergica, wie Atropin, deren Metabolite und Derivate.

Mit Krankheitszuständen verbundene Metabolite sind z. B. Spermin, Galactose, Phenylbrenztraubensäure und Porphyrin Typ 1.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Aminoglycoside, wie Gentamicin, Kanamicin, Tobramycin und Amikacin.

Pestizide von Interesse sind z. B. polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide, deren Metabolite und Derivate.

Bei Rezeptor-Analyten beträgt das Molekulargewicht gewöhnlich 10 000 bis 2×10⁸, insbesondere 10 000 bis 10⁶. Bei Immunoglobulinen (IgA, IgF, IgE und IgM) beträgt das Molekulargewicht gewöhnlich etwa 160 000 bis 10⁶. Das Molekulargewicht von Enzymen liegt normalerweise im Bereich von etwa 10 000 bis 1 000 000. Natürliche Rezeptoren variieren stark, wobei das Molekulargewicht mindestens etwa 25 000 und bis zu 10⁶ oder höher beträgt, einschließlich Materialien, wie Avidin, DNA, RNA, Thyroxin- bindendem Globulin, Thyroxin- bindendem Präalbumin und Transcortin.

Ligand-Analogon oder Analyt-Analogon: modifizierter Ligand oder Ligand-Surrogat oder modifizierter Analyt oder Analyt-Surrogat, welche mit dem analogen Liganden oder Analyten um einen Rezeptor konkurrieren können, wobei es die Modifikation ermöglicht, das Ligand- oder Analyt- Analogon mit einem anderen Molekül zu verbinden. Das Ligand- oder Analyt-Analogon unterscheidet sich gewöhnlich aber nicht notwendigerweise von dem Liganden oder Analyten mehr als durch den Ersatz eines Wasserstoffs durch eine Bindung, die das Ligand- oder Analyt-Analogon mit einer Nabe (hub) oder Markierung verbindet. Der Ausdruck Ligand- oder Analyt-Surrogat bezieht sich auf eine Verbindung, die zur spezifischen Bindung eines zum Liganden oder Analyten komplementären Rezeptors fähig ist. Das Ligand- oder Analyt- Surrogat kann sich daher in ähnlicher Weise wie der Ligand oder Analyt an den Rezeptor binden. Das Surrogat kann z. B. ein Antikörper sein, der gegen den Idiotyp eines Antikörpers zum Ligand oder Analyt gerichtet ist.

Poly(ligand-analogon): mehrere Ligand-Analoga, die zusammen kovalent normalerweise an einen Nabenkern gebunden sind. Der Nabenkern ist ein polyfunktionelles Material, normalerweise polymer, das eine Vielzahl von funktionellen Gruppen, z. B. Hydroxyl-, Amino-, Mercapto- und ethylenische Gruppen, als Bindungsstellen aufweist. Der Nabenkern kann wasserlöslich oder -unlöslich, vorzugsweise wasserlöslich, sein und ein Molekulargewicht von normalerweise mindestens etwa 30 000 bis 10 000 000 oder mehr haben. Beispiele für Nabenkerne sind Polysaccharide, Polypeptide (einschließlich Proteine), Nucleinsäuren und Anionenaustauscherharze. Wasserunlösliche Nabenkerne können z. B. auch Wandungen von Behältern, etwa aus Glas oder Kunststoff, Glasperlen, Additions- und Kondensationspolymere, Sephadex und Agaroseperlen sein.

Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars (SBP): ein oder zwei unterschiedliche Moleküle, die auf der Oberfläche oder in einem Hohlraum einen Bereich aufweisen, der mit einer bestimmten räumlichen und polaren Organisation des anderen Moleküls spezifisch bindet und dadurch als komplementär definiert wird. Die Bestandteile des spezifischen Bindungspaares werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Diese sind gewöhnlich Bestandteile eines immunologischen Paares, z. B. Antigen- Antikörper, obwohl andere spezifische Bindungspaare, wie Biotin-Avidin, Hormone-Hormonrezeptoren, Nucleinsäure- Duplexe, IgG-Protein A, DNA-DNA, DNA-RNA und dergl., die keine immunologischen Paare darstellen, ebenfalls von der Erfindung erfaßt werden.

Ligand: eine beliebige organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich vorkommt oder hergestellt werden kann.

Rezeptor (Antiligand): eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, die zum Erkennen einer bestimmten räumlichen und polaren Organisation eines Moleküls, z. B. einer epitopen oder determinanten Stelle, fähig ist. Beispiele für Rezeptoren sind natürlich vorkommende Rezeptoren, wei Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lectine, Nucleinsäuren, Protein A und die Komplementkomponente Clq.

Nicht-magnetische Teilchen: diamagnetische oder paramagnetische Teilchen mit einer magnetischen Suszeptibilität (X) von weniger als 1×10^-5 EME/Oe · cm³. Die nicht-magnetischen Teilchen haben einen Durchmesser von gewöhnlich mindestens etwa 0,02 µm und nicht mehr als etwa 100 µm, normalerweise mindestens etwa 0,05 µm und weniger als etwa 20 µm, vorzugsweise etwa 0,3 bis 10 µm. Das nicht-magnetische Teilchen kann organisch oder anorganisch, quellbar oder nicht-quellbar, porös oder nicht-porös sein und hat vorzugsweise eine Dichte ähnlich der von Wasser, gewöhnlich etwa 0,7 bis 1,5 g/ml. Es kann z. B. aus einem transparenten, teilweise transparenten oder opaken Material bestehen. Gewöhnlich haben die nicht-magnetischen Teilchen eine entweder positive oder negative Ladung und können auf ihrer Oberfläche SBP- Bestandteile tragen. Normalerweise sind die nicht- magnetischen Teilchen biologische Materialien, z. B. Zellen und Mikroorganismen, wie Erythrocyten, Leucocyten, Lymphocyten, Hybridoma, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli oder Viren. Die nicht-magnetischen Teilchen können auch Teilchen aus organischen und anorganischen Polymeren, Liposomen, Latexteilchen, Phospholipid-Bläschen, Chylomicronen oder Lipoproteinen sein.

Die Polymeren sind normalerweise entweder Additions- oder Kondensationspolymere. Hiervon abgeleitete nicht- magnetische Teilchen sind in dem Assaymedium leicht dispergierbar und können adsorptiv oder funktionalisierbar sein, so daß ein SBP-Bestandteil oder ein magnetisches Teilchen entweder direkt oder indirekt gebunden werden können.

Oft werden die nicht-magnetischen Teilchen ein Analyt sein, an einen Analyten gebunden sein oder während des Assays an einen Analyten gebunden werden. Ursprünglich nicht an den Analyten gebundene nicht-magnetische Teilchen können sich von natürlich vorkommenden Materialien, synthetisch modifizierten, natürlich vorkommenden Materialien und synthetischen Materialien ableiten. Organische Polymere von besonderem Interesse sind z. B. Polysaccharide, insbesondere vernetzte Polysaccharide, wie Agarose, die als Sepharose erhältlich ist, Dextran, das als Sephadex und Sephacryl erhältlich ist, Cellulose und Stärke; Additionspolymere, wie Polystyrol, Polyvinylalkohol, Homopolymere und Copolymere von Acrylat- und Methacrylatderivaten, insbesondere Ester und Amide mit freien Hydroxylfunktionalitäten.

Die in Assays verwendeten nicht-magnetischen Teilchen sind gewöhnlich polyfunktionell und sind entweder gebunden oder fähig zur spezifischen, nicht-kovalenten Bindung an SBP-Bestandteile, z. B. Antikörper, Avidin, Biotin, Lectine oder Protein A. Es stehen eine Vielzahl funktioneller Gruppen zur Verfügung oder können eingebaut werden. Funktionelle Gruppen sind z. B. Carbonsäure-, Aldehyd-, Amino-, Cyano-, Ethylen-, Hydroxyl- und Mercaptogruppen. Die Verknüpfung einer Vielzahl von Verbindungen mit Teilchen ist in der Literatur ausführlich beschrieben; siehe z. B. Cautrecasas, J. Biol. Chem.- Bd. 245, S. 3059 (1970). Die Länge der Brückengruppe kann stark variieren, in Abhängigkeit von der Art der zu verknüpfenden Verbindung, des Einflusses des Abstands zwischen der zu verknüpfenden Verbindung und dem Teilchen auf die Bindung der SBP-Bestandteile und des Analyten etc.

Das nicht-magnetische Teilchen hat normalerweise eine entweder positive oder negative Elektronenladung. Das Teilchen kann entweder von Haus aus geladen sein oder chemisch oder physikalisch behandelt werden, um es aufzuladen. Beispielsweise können Carboxyl-, Sulfonat-, Phosphat- oder Aminogruppen chemisch gebunden oder auf den Teilchen nach bekannten Methoden erzeugt werden. Zellen sind normalerweise aufgrund der Anwesenheit von Sialsäureresten auf der Zelloberfläche negativ geladen. Latexteilchen können positiv oder negativ geladen sein, haben jedoch normalerweise eine negative Ladung aufgrund der Einführung von funktionellen Gruppen oder der Absorption von geladenen Polymeren, wie Polypeptiden, Proteinen und Polyacrylat.

Die nicht-magnetischen Teilchen können fluoreszierend oder nicht-fluoreszierend, gewöhnlich jedoch nicht- fluoreszierend sein. Wenn sie fluoreszierend sind, fluoreszieren sie entweder direkt oder aufgrund von Fluoreszenzverbindungen, die an das Teilchen auf herkömmliche Weise gebunden werden. Die Fluoreszenzverbindungen werden gewöhnlich in dem Teilchen gelöst oder an dieses kovalent oder nicht-kovalent gebunden und sind oft im wesentlichen gleichmäßig durch das Teilchen gebunden. Fluoresceinierte Latexteilchen werden in der US-A-38 53 987 beschrieben.

Die Fluoreszenzverbindungen von Interesse emittieren im allgemeinen Licht einer Wellenlänge über 300 nm, gewöhnlich über 400 nm und vorzugsweise über 450 nm. Vorzugsweise haben die Fluoreszenzverbindungen eine hohe Quantenausbeute, eine große Stokes-Verschiebung und sind unter den Bedingungen ihrer Konjugation und Anwendung chemisch stabil. Die Fluoreszenzverbindungen umfassen auch Substanzen, die Licht bei der Aktivierung mit elektromagnetischer Strahlung oder chemischen Aktivierung emittieren, wie z. B. fluoreszierende und phosphoreszierende Substanzen, Scintillatoren und Chemilumineszenz-Substanzen.

Interessierende Fluoreszenzverbindungen fallen in eine Vielzahl von Kategorien mit bestimmten Primärfunktionalitäten. Diese Primärfunktionalitäten umfassen z. B. 1- und 2-Aminonaphthalin, p,p-Diaminostilbene, Pyrene, quaternäre Phenanthridinsalze, 9-Aminodcridine, p,p′-Diaminostilbene, Imine, Anthracene, Oxacarbocyanin, Merocyanin, 3-Aminoequilenin, Perylen, Bis-benzoxazol, Bis-p-oxazolylbenzol, 1,2-Benzophenazin, Retin, Bis-3-aminopyridiniumsalze, Hellebrigenin, Tetracyclin, Sterophenol, Benzimidazolylphenylamin, 2-Oxo-3-chromen, Indol, Xanthen, 7-Hydroxycumarin, 4,5-Benzimidazole, Phenoxazin, Salicylate, Strophanthidin, Porphyrine, Triarylmethane, Flavin und Seltenerdmetallchelate, -oxide und -salze. Beispiele für Fluoreszenzverbindungen sind in der US-A-43 18 707 genannt. Als Fluoreszenzverbindungen geeignete Squarain-Farbstoffe sind in der EP-A-2 14 847 beschrieben.

Zusätzlich können Licht absorbierende, nicht-magnetische Teilchen verwendet werden, die feste unlösliche Teilchen mit einem Durchmesser von mindestens etwa 10 nm darstellen. Es können zahlreiche verschiedene Arten von Teilchen angewandt werden, insbesondere Kohlenstoffteilchen, wie Holzkohle, Lampenruß, Graphit und kolloidaler Kohlenstoff. Neben Kohlenstoffteilchen finden Metallsole Anwendung, insbesondere solche von Edelmetallen, Gold, Silber und Platin.

Marker: ein Bestandteil des signalerzeugenden Systems, das mit einem SBP-Bestandteil konjugiert ist. Der Marker kann isotop oder nicht-isotop, gewöhnlich nicht-isotop, sein und ist z. B. ein Katalysator, etwa ein Enzym, ein Chromogen, z. B. ein fluoreszierender oder chemilumineszierender Stoff oder Farbstoff, eine radioaktive Substanz oder ein Teilchen.

Signalerzeugendes System: das signalerzeugende System umfaßt eine oder mehrere Komponenten, von denen mindestens eine ein Marker ist. Das signalerzeugende System erzeugt ein Signal, das mit der Anwesenheit oder Menge des Analyten in einer Probe in Beziehung steht. Das signalerzeugende System umfaßt alle Reagentien, die erforderlich sind, um ein meßbares Signal zu erzeugen. Wenn der Marker nicht mit einem SBP-Bestandteil konjugiert ist, der zu dem Analyten analog ist, wird der Marker normalerweise an einen SBP-Bestandteil gebunden, der komplementär zu einem SBP-Bestandteil ist, welcher analog zu dem Analyten ist. Andere Komponenten des signalerzeugenden Systems können z. B. Substrate, Verstärker, Aktivatoren, chemilumineszierende Verbindungen, Cofaktoren, Inhibitoren, Abfänger, Metallionen oder spezifisch bindende Substanzen zum Binden von signalerzeugenden Substanzen sein. Andere Komponenten des signalerzeugenden Systems können sein Coenzyme, Substanzen, die mit enzymatischen Produkten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren. Das signalerzeugende System ergibt ein Signal, das extern nachweisbar ist, vorzugsweise durch Messung des Aggregationsgrades der Teilchen oder durch Anwendung von elektromagnetischer Strahlung, zweckmäßig unter visueller Auswertung. Größtenteils umfaßt das signalerzeugende System Teilchen, z. B. fluoreszierende oder lichtabsorbierende Teilchen, ein chromophores Substrat und ein Enzym, wenn die chromophoren Substrate enzymatisch in Farbstoffe überführt werden, die Licht im UV- oder sichtbaren Bereich absorbieren, phosphoreszierende, fluoreszierende oder chemilumineszierende Stoffe.

Das signalerzeugende System kann mindestens einen Katalysator, gewöhnlich ein Enzym, und mindestens ein Substrat umfassen und zwei oder mehr Katalysatoren sowie mehrere Substrate enthalten. Auch eine Kombination von Enzymen, wobei das Substrat eines Enzyms das Produkt des anderen Enzyms ist, ist möglich. Der Zweck des signalerzeugenden Systems ist es, ein Produkt zu ergeben, das ein nachweisbares Signal in Beziehung zur Menge des Analyten in der Probe liefert.

Eine große Anzahl von Enzymen und Coenzymen, die für signalerzeugende Systeme geeignet sind, werden in der US-A-42 75 149, Spalten 19 bis 23, und US-A-43 18 980, Spalten 10 bis 14, beschrieben. Eine Anzahl von Enzymkombinationen, die auch erfindungsgemäß verwendbar sind, beschreibt die US-A-42 75 149 in Spalten 23 bis 28.

Von besonderem Interesse sind Enzyme, die Wasserstoffperoxid produzieren, und die Verwendung von Wasserstoffperoxid zur Oxidation einer Farbstoffvorstufe zu einem Farbstoff. Spezielle Kombinationen sind Saccharid-Oxidasen, z. B. Glucose- und Galactose-Oxidase oder heterocyclische Oxidase, wie Uricase- und Xanthin- Oxidase, gekoppelt mti einem Enzym, welches Wasserstoffperoxid zur Oxidation einer Farbstoffvorstufe verwendet, d. h. einer Peroxidase, wie Meerrettich-, Lacto- oder Mikroperoxidase. Weitere verwendbare Enzymkombinationen sind in den oben genannten Patentschriften beschrieben. Wenn ein einzelnes Enzym als Marker verwendet wird, können andere Enzyme angewandt werden, z. B. Hydrolasen, Transferasen und Oxidoreduktasen, vorzugweise Hydrolasen, z. B. alkalische Phosphatase und β-Galactosidase. Alternativ können Luciferasen angewandt werden, z. B. Leuchtkäfer-Luciferase und bakterielle Luciferase.

Verwendbare Coenzyme sind z. B. NAD[H], NADP[H], Pyridoxalphosphat, FAD[H] und FMN[H], gewöhnlich Coenzyme, die cyclische Reaktionen involvieren; siehe z. B. US-A-43 18 980.

Das Produkt der Enzymreaktion ist gewöhnlich ein Farbstoff oder Fluoreszenzstoff. Eine große Anzahl von Fluoreszenzstoffen ist n der US-A-42 75 149, Spalten 30 und 31, beschrieben.

Magnetische Teilchen: Teilchen, die von sich aus magnetisch ansprechen oder magnetisch gemacht worden sind, z. B. durch Anbringen einer magnetisch ansprechenden Substanz oder durch Einbau einer solchen Substanz in die Teilchen. Die magnetischen Teilchen können paramagnetisch, ferromagnetisch oder superparamagnetisch, gewöhnlich paramagnetisch, sein und haben magnetische Suszeptibilitäten (X) von mindestens 5×10^-5 EME/Oe · cm³, gewöhnlich mindestens 4×10^-4 EME/Oe · cm³. Der Teilchendurchmesser sollte klein sein, gewöhnlich im Bereich von etwa 5 nm bis 50 µm, vorzugsweise etwa 20 nm bis 5 µm, insbesondere etwa 50 nm bis 1 µm, und oft im kolloidalen Bereich.

Beispiele für magnetische Komponenten der Teilchen, die selbst magnetisch sind oder magnetisch ansprechen, sind Komplexsalze, Oxide, Boride und Sulfide von Eisen, Kobalt, Nickel und Seltenerdelementen mit hoher magnetischer Suszeptibilität, z. B. Hämatit und Ferrit. Die magnetischen Komponenten anderer derartiger Teilchen umfaßt z. B. Reinmetalle oder Legierungen aus einem oder mehreren dieser Elemente.

Größtenteils enthalten die magnetischen Teilchen einen Kern aus der magnetischen Komponente mit funktionellen Oberflächengruppen, wie Hydroxyl, Silikat, Carboxylat, Sulfat, Amino oder Phosphat. Oft wird eine zusätzliche Oberflächenbeschichtung angewandt, die kovalent oder nicht-kovalent an die Oberfläche gebunden ist. Die Oberflächenbeschichtung kann z. B. ein anionisches oder kationisches, gewöhnlich anionisches, Detergens; ein Protein, wie Albumin, Immunoglobulin, Avidin oder Fetuin; ein Kohlenhydrat, wie Dextran, Chitosan oder Amylose; oder eine Kombination dieser Substanzen in nativer Form oder funktionalisierter (um ihre Ladung und Hydrophilie zu steuern) Form sein. Alternativ können die Teilchen mit anderen amphiphilen Substanzen, z. B. Lipopolysacchariden oder Octylglucosid, beschichtet sein.

Die magnetische Komponente kann auch in ein Teilchen eingebaut werden, z. B. durch Imprägnieren der Substanz in eine Polymermatrix. Eine detaillierte Diskussion der Herstellung derartiger magnetischer Teilchen findet sich bei Whitesides et al., (1983) Trends in Biotechnology, Bd. 1(5), S. 144 bis 148.

In jenen Fällen, in denen es wünschenswert ist, kleine magnetische Teilchen zu verwenden, können magnetische Teilchen mit einem Durchmesser von weniger als 100 nm hergestellt werden, indem man Eisenoxide in Gegenwart oder Abwesenheit einer Beschichtung, z. B. aus Polysaccharid oder Protein, präzipitiert. Magnetische Teilchen mit einem Durchmesser von wenigen µm können auch durch Mahlen in einer Kugelmühle und Abtrennen von Material eines nicht-interessierenden Größenbereichs hergestellt werden. Gewöhnlich sind nach den letztgenannten Verfahren hergestellte Teilchen recht polydispers. Metalloxidsuspensionen, die gewöhnlich monodispers sind, lassen sich durch sorgfältige Steuerung von pH, Temperatur und Konzentration während der Fällung erhalten. Eine Beschichtung der magnetischen Teilchen mit Makromolekülen kann deren kolloidale Stabilität erhöhen. Dies kann durch direkte Adsorption von hochmolekularen Polymeren oder durch Funktionalisieren der Oberfläche der Teilchen und anschließendes Binden von Makromolekülen an die funktionellen Gruppen bewirkt werden. Emulsionspolymerisation und Pfropftechniken sind geeignete Mittel zur Beschichtung von magnetischen Teilchen mit Polymeren.

Im allgemeinen wird das für einen bestimmten Zweck optimale magnetische Teilchen primär bestimmt anhand der Größe und der Eigenschaften der abzutrennenden Teilchen. Für Immunoassays oder die Isolation von Zellen sind die magnetischen Teilchen vorzugsweise leicht suspendierbar, bilden stabile, vorzugsweise kolloidale, Suspensionen und haben eine hohe magnetische Suszeptibilität. Wird ein SBP-Bestandteil an ihre Oberfläche gebunden, so sollte ihre Fähigkeit zur Bildung eines komplementären SBP- Bestandteils erhalten bleiben und sie sollten zeitlich stabil bleiben.

Kleine (<100 nm) magnetische Teilchen sind vorteilhaft in Immunoassays und für Zelltrennungen. Diese Teilchen haben vorzugsweise einen homogenen Kern aus Metall, Metalloxid oder einer anderen Metallverbindung. Wenn sie kolloidal stabil sind, lassen sich kleine Teilchen über längere Zeiträume suspendieren. Ihr großes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen und ihre relativ hohe Diffusionsgeschwindigkeit ermöglichen eine schnelle Bindung von Molekülen und Teilchen, die in dem Medium dispergiert sind. Kleine magnetische Teilchen neigen im Vergleich zu großen magnetischen Teilchen weniger zur Aggregation aufgrund ihrer magnetischen Restmomente, nachdem sie einem großen magnetischen Feld ausgesetzt worden sind. Es sind auch Methoden zur Kolloidstabilisierung derartiger kleiner Teilchen bekannt.

Magnetische Teilchen von mittlerer Größe (100 bis 1000 nm) lassen sich leicht suspendieren und erfordern eine niedrigere Oberflächen-Ladungsdichte, um eine spontane Aggregation zu verhindern, als kleinere Teilchen. Magnetische Teilchen dieses Größenbereichs können durch Emulsionspolymerisation hergestellt werden und haben den Vorteil einer Oberfläche, die leicht durch Pfropfen oder kovalente Anbindung von Makromolekülen modifiziert werden kann. Sie bleiben jedoch kürzere Zeit suspendiert und ihr niedriges Verhältnis von Oberfläche zu Volumen verringert die Bindungsrate der abzutrennenden Substanz.

Magnetisches Fluid: eine kolloidale Suspension von magnetischen Teilchen in einem flüssigen Träger, welche nicht leicht durch ein magnetisches Feld getrennt wird. Die erhaltene Flüssigkeit hat die Grundeigenschaften eines magnetischen Materials. Das Fluid wird in Gegenwart eines externen magnetischen Feldes spontan magnetisiert. Die Flüssigkeit wirkt auch als Fluid und ist fähig, die Form des Behälters anzunehmen, zu fließen und Hindernisse zu entströmen. Ein Beispiel für ein magnetisches Fluid ist ein Ferrofluid, in dem die suspendierten Teilchen ferromagnetische Teilchen sind; siehe z. B. Rosenzweig, a. a. O., US-A-40 19 994 sowie Khalafolla et al., (1980), IEEE Transactions on Magnetics, MAG. 16, S. 178 bis 183.

Die kolloidalen magnetischen Teilchen können mit einem Proteinmaterial beschichtet werden, z. B. einem Serumprotein, wie Albumin, oder Gammaglobulin. Die kolloidalen magnetischen Teilchen können mit einer wäßrigen gepufferten Proteinlösung vermischt werden, um Protein-beschichtete kolloidale magnetische Teilchen herzustellen. Die Beschichtung der magnetischen Teilchen mit Protein kann durch physikalische (z. B. Absorption) oder chemische Bindung erfolgen.

Nicht-spezifische Bindung: nicht-kovalente Bindung zwischen Teilchen, die relativ unabhängig von spezifischen Oberflächenstrukturen ist. Eine derartige nicht- spezifische Bindung resultiert gewöhnlich aus elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen entgegengesetzt geladenen Teilchen oder zwischen Teilchen mit derselben Ladung, wenn ein polyionisches Reagens mti entgegengesetzter Ladung angewandt wird. Eine nicht- spezifische Bindung kann auch aus hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Teilchen resultieren.

Polyionisches Polymer: eine Verbindung, Zusammensetzung oder ein Material, das entweder organisch oder anorganisch, natürlich vorkommend oder synthetisch, polyanionisch oder polykationisch ist, mindestens fünf, vorzugsweise mindestens zehn gleiche Ladungen hat und z. B. ein Polyelektrolyt ist.

Das erfindungsgemäß verwendete polyionische Polymer ist fähig, Teilchen in einem flüssigen Medium zu aggregieren, und weist Bindungen auf , die mit einem chemischen Reagens gespalten werden können, wodurch die Aggregation der Teilchen rückgängig gemacht wird. Beispiele für spaltbare Bindungen in dem polyionischen Polymer sind Disulfide, Carbonsäure-, Phosphat- und Sulfatester, Amide, Carboborane, Siloxane und vicinale Glykole.

Erfindungsgemäß verwendbare polyionische Polymere sind z. B. Polymere der folgenden Formel

(A)_n

in der A positiv geladen ist und außer Wasserstoff 4 bis 30 Atome aufweist, ausgewählt unter C, O, P, N und S, wobei mindestens eine Gruppe A eine spaltbare Bindung aufweist, und n einen Mittelwert von 5 bis 10 000 hat.

Ein bevorzugtes polykationisches Polymer hat die folgende Struktur:

in der R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und gegebenenfalls substituiertes C_6-20-Aryl, C_6-20-Aryl-C_1-6- alkyl, C_1-6-Alkyl oder C_1-6-Alkoxy-C_1-6-alkyl bedeutet; B eine Brückengruppe ist, die außer Wasserstoff 2 bis 30 Atome enthält, ausgewählt unter C, O, P, N und S, wobei mindestens eine der Gruppen B eine spaltbare Bindung aufweist, und n einen Mittelwert von 5 bis 10 000 hat. Vorzugsweise umfassen die spaltbaren Bindungen Disulfide oder Glykole.

Ein weiteres bevorzugtes polykationisches Polymer hat die oben genannte Struktur, wobei R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und Alkyl oder Alkoxyalkyl bedeuten; B Polyalkylen, O,O′-Bis-alkylenylpolyether, Bis- alkylenyldisulfid oder Bis-alkylenylethylenglykol bedeutet, wobei mindestens eine der Gruppen B eine Disulfid- oder Glykolgruppe aufweist, und n einen Mittelwert von 5 bis 10 000 hat.

Ein weiteres bevorzugtes polykationisches Polymer hat die oben genannte Struktur, wobei R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet; B ausgewählt ist unter -(CH₂)_a-(S-S)_b-(DH₂)_c-, wobei b 0 oder 1 ist, a und c einen Wert von 2 bis 8 haben, wenn b 1 ist, und a und c einen Wert von 2 bis 10 haben, wenn b 0 ist, mit der Maßgabe, daß in zumindest einer der Gruppen B b den Wert 1 hat; und n einen Mittelwert von 10 bis 10 000, vorzugweise 10 bis 20, hat.

Ein weiteres bevorzugtes Polykation hat die oben genannte Struktur, wobei R₁ und R₂ Methyl sind, B (CH₂)_m[CH(OH)]₂(CH₂)_p ist, m und p einen Wert von 1 bis 8 haben und n einen Mittelwerrt von 10 bis 200, vorzugsweise 10 bis 100, hat.

Ein weiteres bevorzugtes Kation hat die genannte Struktur, wobei R₁ und R₂ Methyl bedeuten; B -(CH₂)_a-SS-(CH₂)_c- ist, worin a und c einen Wert von 3 bis 5 haben; und n einen Mittelwert von 10 bis 20 hat.

Spaltreagens: eine chemische Verbindung, Zusammensetzung oder Material, entweder natürlich vorkommend oder synthetisch, organisch oder anorganisch, welches zur Rückgängigmachung der Aggregation der Teilchen durch zumindest teilweise Depolymerisation des polyionischen Polymers fähig ist. Das Spaltreagens wirkt auf die Bindungen des polyionischen Polymers ein und spaltet durchschnittlich mindestens eine Bindung pro Polymer, vorzugsweise mindestens zwei Bindungen pro Polymer.

Die Wahl des spezifischen Spaltreagens richtet sich nach den spaltbaren Bindungen des polyionischen Polymers. Die folgenden Spaltreagentien stellen lediglich Beispiele für geeignete Verbindungen dar. Im allgmeinen werden die Spaltreagentien ausgewählt unter hydrolytischen Enzymen, wie Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin und Phosphodiesterase; Mercatanen, wie Mercaptoethanol, Dithioerythrit und Glutathion; Sulfit-, Halogenid-, Phosphit-, Perjodat- und Borhydridsalzen; und Peroxiden, wie Wasserstoffperoxid.

Wie bereits erwähnt, richtet sich das jeweils speziell ausgewählte Spaltreagens nach der Art der zu spaltenden Bindungen. Wenn z. B. die spaltbare Bindung zwei Schwefelatome verbindet, wird das Reagens im allgemeinen ein Reduktionsmittel sein, wie z. B. Dithioerythrit. Wenn die spaltbare Bindung eine Peptidbindung ist, ist das Spaltreagens z. B. Trypsin. In Fällen, in denen die spaltbare Bindung die Kohlenstoffatome eines vicinalen Glykols verbindet, kann das Spaltreagens z. B. ein Perjodat, wie Natriumperjodat, sein. Wenn die spaltbare Bindung die Kohlenstoff- und Sauerstoffatome eines Esters verbindet, kann das Spaltreagens z. B. Chymotrypsin oder Natriumhydroxid sein. Wenn die Bindung ein Phosphatester ist, kann das Spaltreagens Phosphodiesterase sein, und wenn die Bindung ein Carboboran ist, kann das Spaltreagens Wasserstoffperoxid sein. Wenn die Bindung ein Siloxan ist, kann das Reagens ein Fluorid sein.

Hilfsmaterialien: verschiedene Hilfsmaterialien werden oft in einem erfindungsgemäßen Assay eingesetzt, z. B. enthält das Assaymedium normalerweise Puffer sowie Stabilisatoren für das Assaymedium und die Assaykomponenten. Bei der Zugabe dieser Additive können oft zusätzliche Proteine verwendet werden, z. B. Albumine, oder Netzmittel, insbesondere nicht-ionische Tenside, Bindungsförderer, z. B. Polyalkylenglykole, und dergl.

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur reversiblen Aggregation von Teilchen, die in einem flüssigen Medium dispergiert oder suspendiert sind, zur Verfügung, welches die Kombination des flüssigen Mediums mit einem polyionischen Polymer beinhaltet. Die polyionischen Polymeren sind fähig, die Teilchen zu aggregieren, und auch gespalten zu werden, wodurch die Aggregeation rückgängig gemacht wird. Das die Teilchen und das polyionische Polymer enthaltende flüssige Medium wird ausreichend lange inkubiert, um eine Aggregation der Teilchen zu bewirken. Anschließend werden die aggregierten Teilchen mit einem chemischen Reagens, das zur Spaltung des polyionischen Polymers fähig ist, unter Bedingungen, z. B. hinsichtlich Zeit, Temperatur und Reagenskonzentration, zusammengebracht, bei denen eine Rückgängigmachung der Aggregation erfolgt.

Die abzutrennenden Teilchen sind oft nicht-magnetische Teilchen oder sind an nicht-magnetische Teilchen gebunden, z. B. rote Blutkörperchen. In diesen Fällen ist es gewöhnlich zweckmäßig, magnetische Teilchen zu verwenden. Im allgemeinen wird eine Coaggregation der nicht- magnetischen Teilchen mit magnetischen Teilchen erhalten, indem man magnetischen Teilchen und ein polyionisches Polymer in das flüssige Medium einbringt. Wenn nicht- magnetische und magnetische Teilchen derselben Ladung verwendet werden, wird ein polyionisches Polymer mit der entgegengesetzten Ladung eingesetzt. Nachdem das Medium ausreichend lange inkubiert wurde, um ein Aggregat zu bilden, wird das Medium einem magnetischen Feldgradienten ausgesetzt, um die aggregierten Teilchen aus dem Medium abzutrennen. Nach Abtrennung der Teilchen aus dem Medium wird die Aggregation der Teilchen rückgängig gemacht. Erfindungsgemäß erfolgt die Rückgängigmachung der Aggregation durch Kontaktieren der Teilchen mit dem Spaltreagens.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden gewöhnlich gemäßigte Temperaturen angewandt, normalerweise eine konstante Temperatur über die gesamte Verfahrensdauer. Die Temperatur wird im allgemeinen so gewählt, daß die Aggregation oder Coaggregation der Teilchen durch Binden der Teilchen an das polyionische Polymer gefördert wird. Die Temperatur für die Aggregation der Teilchen, insbesondere im Falle eines Assays, beträgt gewöhnlich etwa 0 bis 50°C, insbesondere etwa 15 bis 40°C. Auch bei der Kontaktierung der aggregierten Teilchen mit dem Spaltreagens kann eine Temperatur gewählt werden, welche die Rückgängigmachung der Aggregation oder Coaggregation der Teilchen durch Spaltung des polyionischen Polymers fördert. Die Temperatur für die Rückgängigmachung der Aggregation, insbesondere im Falle eines Assays, beträgt gewöhnlich etwa 0 bis 50°C, insbesondere etwa 15 bis 40°C.

Wenn nicht-magnetische Teilchen aus einem Medium abgetrennt werden, kann die Konzentration der nicht-magnetischen Teilchen entsprechend den Bedürfnissen stark variiren. Bei der Abtrennung von Zellen aus Blut kann z. B. das Zellvolumen 50% des Gesamtvolumens des Bluts ausmachen. Andererseits kann es zweckmäßig sein, nur etwa 1000 Bakterien/ml aus einer Wasserprobe abzutrennen. Wenn es notwendig ist, nicht-magnetische Teilchen zu erhalten, die relativ frei von Medium sind (wie in einem Assay) sollte das Gesamtvolumen der nicht-magnetischen Teilchen normalerweise weniger als 5% des Mediums ausmachen. In einem Assay, in dem der Analyt eine Komponente eines Teilchens ist oder an ein Teilchen gebunden wird, variiert der Analyt im allgemeinen von etwa 10^-4 bis 10^-14M, insbesondere etwa 10^-6 bis 10^-12M.

In den Fällen, in denen magnetische Teilchen zu dem flüssigen Medium gegeben werden, in dem die interessierenden Teilchen suspendiert sind, richtet sich die Konzentration der zugegebenen magnetischen Teilchen nach der Menge der abzutrennenden Teilchen in dem Medium, der gewünschten Abtrennungsgeschwindigkeit etc. Die Konzentration der magnetischen Teilchen hängt auch z. B. ab von dem magnetischen Feldgradienten und der Feldstärke sowie der magnetischen Suszeptibilität der magnetischen Teilchen. Im allgemeinen ist die Trennung umso wirksamer und schneller, je höher die Konzentration der zur Aggregation der in dem flüssigen Medium suspendierten Teilchen zugesetzten magnetischen Teilchen ist. Jedoch verursacht eine zu hohe Konzentration eine zu starke Mitführung von Medium. Die Konzentration an magnetischen Teilchen, die dem Medium zugegeben werden, wird normalerweise empirisch ermittelt und beträgt im allgemeinen etwa 0,1 bis 1000 µg/ml, gewöhnlich etwa 0,5 bis 200 µg/ml, und insbesondere etwa 1 bis 50 µg/ml.

In den Fällen, in denen nicht-magnetische Teilchen, die von den mit dem Analyten assoziierten natürlichen Teilchen verschieden sind, dem Medium in dem die interessierenden Teilchen suspendiert sind, zugegeben werden, richtet sich deren Konzentration nach verschiedenen Faktoren, z. B. der Teilchengröße, Oberfläche und Konzentration der Teilchen in dem Medium und der gewünschten Abtrennungsgeschwindigkeit. Im allgemeinen wird die Konzentration der dem Medium zugesetzten nicht-magnetischen Teilchen empirisch bestimmt und beträgt gewöhnlich etwa 0,01 bis 100 µg/ml, insbesondere etwa 0,1 bis 20 µg/ml. Die Konzentration der nicht-magnetischen Teilchen richtet sich auch z. B. nach der Temperatur, Löslichkeit, Viskosität und dem angewandten Abtrennverfahren.

Obwohl die Konzentrationen der verschiedenen Reagentien im allgemeinen durch den Konzentrationsbereich der zu aggregierenden bzw. disaggregierenden Teilchen mit oder ohne dazwischenliegenden Trennverfahren oder durch den Konzentrationsbereich des Analyten in einem Assay bestimmt werden, wird die Endkonzentration jedes Reagens normalerweise empirisch bestimmt, um die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Aggregation, Disaggregation und Abtrennung in allen Fällen bzw., im Falle eines Assays, die Empfindlichkeit und Spezifität des Assays über den interessierenden Bereich zu optimieren. Andere zu berücksichtigende Faktoren sind z. B. spezifische und nicht-spezifische Bindungseffekte, die gewünschte Reaktionsgeschwindigkeit, Temperatur, Löslichkeit und Viskosität.

Das polyionische Polymer für die Aggregation der Teilchen wird dem flüssigen Medium zugesetzt. Wie erwähnt, ist das erfindungsgemäß angewandte polyionische Polymer durch ein Spaltreagens zumindest teilweise depolymerisierbar. Das polyionische Polymer hat eine den Teilchen entgegengesetzte Ladung. Die Menge des polyionischen Polymers sollte ausreichend sein, damti im wesentlichen alle Teilchen aggregiert oder coaggregiert werden. Diese Konzentration kann empirisch bestimmt werden. Im allgemeinen hat das polyionische Polymer in dem flüssigen Medium eine ausreichende Konzentration, um eine Anzahl von mit dem Polymer assoziierten Ionen zu ergeben, die gleich ist der Gesamtzahl von entgegengesetzten Ladungen auf allen Teilchen in dem Medium. In einem Assay, in dem, wie oben erwähnt, der Analyt im Bereich von etwa 10^-4 bis 10^-14M vorliegt, hat das polyionische Polymer eine Konzentration von gewöhnlich etwa 10 nM bis 1 nM, insbesondere etwa 10 nM bis 100 nM.

In einem Assay kann das wäßrige Medium auch ein oder mehrere Bestandteile eines signalerzeugenden Systems enthalten. Wie erwähnt, richtet sich die Konzentration der verschiedenen Bestandteile des signalerzeugenden Systems nach dem interessierenden Konzentrationsbereich des Analyten und der Art der Messung bzw. des Assays. Unter einem allgemeinen Gesichtspunkt wird die Konzentration der verschiedenen Bestandteile des signalerzeugenden Systems so ausgewählt, daß das in Beziehung zum enteressierenden Konzentrationsbereich des Analyten erzeugte Signal optimiert wird.

Die nicht-spezifische Aggregation erfolgt im wesentlichen sofort, und es ist gewöhnlich ausreichend, die Mischung 60 Sekunden, oft weniger als 15 Sekunden stehen zu lassen. Wenn eine spezifische Bindung notwendig ist, wird das flüssige Medium ausreichend lange Zeit gehalten, damit die Bindung erfolgt. Normalerweise erfordert dies 0,5 bis 120 Minuten, oft 1 bis 60 Minuten.

Wenn magnetische Teilchen angewandt werden, legt man das magnetische Feld vorzugsweise unmittelbar nach dem Mischen an. Das Ausmaß der Bindung zwischen den Teilchen und den magnetischen Teilchen oder zwischen den magnetischen Teilchen beeinflußt die Wirksamkeit der magnetischen Trennung. Das Anlegen eines Magnetfeldes an das Medium, um die Teilchen aus dem Medium abzutrennen, kann auf die zur Erzeugung eines hohen magnetischen Feldgradienten übliche Weise erfolgen. Normalerweise wird das Verfahren in einem Behälter durchgeführt, der aus einem nicht- magnetischen Material, wie Glas oder Kunststoff, besteht. Zum Anlegen des Magnetfeldes, kann der Reaktionsbehälter in enger Nachbarschaft zu einem Elektromagneten oder vorzugsweise einem Permanentmagneten angeordnet werden, der eine Geometrie aufweist, die eine Maximierung der Feldintensität und des Gradienten im Inneren der Suspension ermöglicht. Je höher die Stärke des Magnetfeldes und des Gradienten ist, desto schneller erfolgt die Trennung. Normalerweise ist es zweckmäßig, die Trennung in einem Rohr mit einem Durchmesser von etwa 2 bis 50 mm, insbesondere etwa 3 bis 15 mm, durchzuführen, wobei ein oder mehrere Permanentmagneten so nahe wie möglich an dem Rohr angeordnet sind, um Feldstärken von mindestens etwa 200 Oe, vorzugsweise mindestens 1 kOe, mit magnetischen Feldgradienten von gewöhnlich mindestens etwa 20 kOe/cm zu ergeben. Das Magnetfeld wird ausreichend lange angelegt, um den gewünschten Abtrenngrad der Teilchen aus dem Medium zu ergeben. In Abhängigkeit von der Geometrie, Feldstärke, magnetischen Suszeptibilität der Teilchen etc., wird das Magnetfeld etwa 2 Sekunden bis 1 Stunde, vorzugsweise etwa 5 bis 60 Sekunden, angelegt.

Sobald die Teilchen in einem Teil des Behälters konzentriert sind, kann das flüssige Suspendiermedium auf übliche Weise, z. B. durch Dekantieren oder Pipettieren, von den Teilchen abgetrennt werden.

Die vorliegende Erfindung kann auch auf solche Fälle angewandt werden, in denen nicht-magnetische Teilchen ohne Verwendung von magnetischen Teilchen aus einem flüssigen Medium abgetrennt werden. In diesen Fällen können die aggregierten nicht-magnetischen Teilchen aus dem Medium auf beliebige Weise abgetrennt werden, z. B. durch Absetzen, Zentrifugieren, Flotieren, Verteilen zwischen nicht-mischbaren Lösungsmitteln, Filtrieren oder Absorbieren an selektiven Sorbentien, wie Aktivkohle, Silicate oder Harze.

Die aus dem flüssigen Mediuim abgetrennten Teilchen werden behandelt, um die Aggregation der Teilchen rückgängig zu machen. Im allgemeinen werden die Teilchen in einem flüssigen Medium mit einem zur Rückgängigmachung der Aggregation fähigen chemischen Reagens suspendiert.

Die Rückgängigmachung der Aggregation der Teilchen und der Coaggregation der Teilchen und der magnetischen Teilchen erfolgt durch Spalten zumindest einiger Bindungen in dem polyionischen Polymer. Zusätzlich ist es notwendig, das Spaltreagens im Hinblick auf die Natur der Teilchen in dem Aggregat auszuwählen, um eine Schädigung der Teilchen nach Rückgängigmachung der Aggregation zu minimieren oder zu verhindern. Das gewählte Spaltreagens wird das polyionische Polymer zumindest teilweise depolymerisieren.

Die Konzentration des Spaltreagens sollte ausreichen, um eine nennenswerte oder vollständige Rückgängigmachung der Aggregation oder Coaggregation der Teilchen zu bewirken. Die Konzentration des Spaltreagens ist gewöhnlich abhängig von der Art der zu spaltenden Bindungen des polyionischen Polymers. Im allgemeinen ist die Konzentration des Spaltreagens zumindest gleich der Konzentration der zu spaltenden Bindungen, vorzugsweise beträgt sie zumindest das 10fache, insbesondere zumindests das 100fache der Konzentration der zu spaltenden Bindungen.

Je nach der Stärke und Anzahl der zu spaltenden Bindungen und der Natur und Konzentration des Spaltreagens, variiert die zur Rückgängigmachung der Aggregation erforderliche Zeit und Temperatur. Gewöhnlich liegt die Temperatur im Bereich von etwa 0 bis 45°C, insbesondere etwa 15 bis 40°C. Die zur Aggregationsumkehr erforderliche Zeit beträgt gewöhnlich etwa 0 bis 45 Minuten, insbesondere 15 bis 40 Minuten.

Wenn die Teilchen einmal vom dem Aggregat abgetrennt sind, können sie nach Wunsch verwendet werden. In einem Assay können die abgetrennten Teilchen z. B. auf die Gegenwart eines nachweisbaren Signals in Beziehung zur Menge eines Analyten in der Probe untersucht werden. Die abgetrennten Teilchen können Zellen sein, die nach Wunsch verwendbar sind. Beispielsweise können die abgetrennten Teilchen rote Blutkörperchen oder Testzellen sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die magnetischen Teilchen in einer magnetischen Flüssigkeit, z. B. Ferrofluid, eingesetzt. Die abzutrennenden Teilchen werden mit der magnetischen Flüssigkeit kombiniert.

Ein wichtiges Anwendungsgebiet der Erfindung ist das Abtrennen von Zellen aus einer zellhaltigen Probe, z. B. die Abtrennung von roten Blutkörperchen aus Vollblut. In einem derartigen Verfahren wird eine Vollblutprobe in einem flüssigen Medium mit geladenen magnetischen Teilchen unter Bedingungen für die nicht-spezifische Bindung der magnetischen Teilchen an die Zellen in Gegenwart eines polyionischen Polymers kombiniert. Die Zellen haben gewöhnlich eine negative Ladung aufgrund der Sialsäurereste und dergleichen an der Zelloberfläche. Die magnetischen Teilchen haben im allgemeinen eine negative Ladung. Ein polykationisches Polymer, das zur Aggregation der Teilchen fähig ist und auch spaltbare Bindungen aufweist, so daß eine Rückgängigmachung der Aggregation erfolgen kann, ist in dem Medium enthalten, um Bedingungen für die nicht- spezifische Bindung zwischen den Zellen und den magnetischen Teilchen zu schaffen. Hierbei können die oben beschriebenen polykationischen Reagentien angewandt werden.

Das Medium kann dann einem magnetischen Feldgradienten ausgesetzt werden, um die aggregierten Zellen von dem Medium zu trennen. Das Anlegen des Magnetfelds bewirkt eine Konzentration des Zell-Magnetteilchen-Aggregats in einem Bereich des Behälters, so daß es von dem zellfreien Restmedium abgetrennt werden kann, z. B. durch Dekantieren oder Pipettieren.

Das abgetrennte Zell-Magnetteilchen-Aggregat kann dann behandelt werden, um die Zellen, wie oben beschrieben, aus dem Aggregat freizusetzen. Das ausgewählte Spaltreagens richtet sich nach der Art der Bindungen in dem polykationischen Polymer.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat besondere Vorteile bei der automatischen Blutgruppenbestimmung aufgrund der Bereitstellung von Blutplasma ohne Zentrifugieren. Es eignet sich auch im Coombs-Antiglobulin-Test, in dem Immunoglobulin enthaltendes Plasma zuerst mit Testzellen kombiniert wird, die dann vollständig entfernt werden müssen, um festzustellen, ob sich Antikörper aus dem Plasma an die Zellen gebunden haben. Bei diesem Verfahren werden magnetische Teilchen und ein polyionisches Polymer, das als nicht-spezifisches Aggregationsmittel fungiert, der Mischung aus Plasma und Testzellen zugesetzt und die anschließend abgetrennten Zellen werden mit Hilfe eines Spaltreagens, das die Bindungen des polyionischen Polymers spaltet, resuspendiert. Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren in Immunoassays eingesetzt werden, in denen ein SBP-Bestandteil an ein Teilchen gebunden ist und es wünschenswert ist, die Teilchen ohne Zentrifugation abzutrennen und zu waschen. Die Teilchen können hierbei magnetisch oder nicht-magnetisch sein.

Die Erfindung findet allgemein Anwendung in Assays für einen Analyten in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält. Wenn der Analyt ein SBP- Bestandteil ist, wird für den Assay eine Probe in einem Assaymedium mit einem zu dem Analyten komplementären SBP- Bestandteil kombiniert, wobei der Analyt und/oder der komplementäre SBP-Bestandteil mit der Oberfläche eines nicht-magnetischen Teilchens, gewöhnlich einer Zelle, z. B. einem Erythrocyten, Latexteilchen oder magnetischen Teilchen, assoziiert ist. Geladene magnetische Teilchen werden ebenfalls mit dem Medium unter Bedingungen für die nicht-spezifische Bindung und Aggregation der Teilchen kombiniert, wobei man ein polyionischen Polymer verwendet, um eine nicht-spezifische Bindung zwischen den Teilchen und magnetischen Teilchen zu bewirken. Die Erfindung hat den Vorteil einer Rückgängigmachung der Aggregation durch Verwendung eines chemischen Mittels zur Spaltung von Bindungen des aggregierenden Polymers.

Der Assay umfaßt normalerweise ein signalerzeugendes System zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals in Beziehung zur Menge des Analyten in der Probe. Das signalerzeugende System umfaßt gewöhnlich einen markierten SBP-Bestandteil. Das Medium kann ferner mit keinem, einem oder mehreren Bestandteilen des signalerzeugenden Systems kombiniert werden. Bei Verwendung von magnetischen Teilchen, wird das Medium einem magnetischen Feldgradienten ausgesetzt, um die die magnetischen Teilchen enthaltenden Aggregate von dem Medium abzutrennen. Die abgetrennten Teilchen werden mit einem chemischen Reagens versetzt, das zur Spaltung des polyionischen Polymers fähig ist. Die restliche spezifische Aggregation der Teilchen kann dann gemessen werden. Eine derartige Bestimmung kann die Zugabe von restlichen Bestandteilen des signalerzeugenden Systems, die noch nicht zugegeben worden sind, erfordern.

Aus Zweckmäßigkeitsgründen können die Reagentien zum Aggregieren der Teilchen und zur Rückgängigmachung der Aggregation in verpackter Kombination in einem Testsatz in vorbestimmten Mengen für einen bestimmten Analyten enthalten sein. Der Testsatz kann enthalten (a) ein polymeres Reagens zum Aggregieren der Teilchen in einem flüssigen Medium und (b) ein Spaltreagens zum Rückgängigmachen der Teilchenaggregation durch Spalten von Bindungen des polymeren Reagens. Zusätzlich kann der Testsatz magnetische Teilchen und/oder Hilfsstoffe enthalten.

Auch die Reagentien zur Durchführung eines Assays können in einem Testsatz in abgepackter Kombination in vorbestimmten Mengen zum Bestimmen eines Analyten enthalten sein. Der Testsatz kann enthalten (a) einen zu dem Analyten komplementären SBP-Bestandteil, (b) einen an ein geladenes Teilchen gebundenen SBP-Bestandteil, wenn weder der Analyt, noch der komplementäre SBP-Bestandteil an ein geladenes Teilchen gebunden sind, (c) geladene magnetische Teilchen, wenn das geladene Teilchen nicht magnetisch ist, und (d) ein polymeres Reagens für die nicht- spezifische Bindung der magnetischen Teilchen oder der magnetischen Teilchen und der nicht-magnetischen Teilchen, wobei das polymere Reagens mit einem chemischen Reagens spaltbar ist, wodurch die nicht-spezifische Bindung rückgängig gemacht wird. Zusätzlich kann der Testsatz das chemische Reagens zur Rückgängigmachung der nicht- spezifischen Bindung und Reagentien zur Erzeugung eines Signals in Beziehung zur Menge des Analyten in der Probe enthalten. Ferner können gegebenenfalls für einen bestimmten Assay erforderliche Hilfsstoffe enthalten sein.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Alle Teile und Prozente beziehen sich auf das Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist.

Definitionen

Latexteilchen:0,297 µm acrylierter Polystyrollatex, tensidfrei LISS:0,23 M Glycin, 0,029 M NaCl, 0,0017 M KH₂₄ und 0,0013 M Na₂HPO₄; pH 6,7 KOH:Kaliumhydroxid H₂O₂:Wasserstoffperoxid Polybrene:von der Sigma Chemical Co., St. Louis, MO DMSO:Dimethylsulfoxid DTE:Dithioerythrit Puffer:0,02 M Ammoniumcarbonat, pH 7.

Beispiel 1 Herstellung des Disulfids von 2-Dimethylaminoethanethiol (1)

Eine homogene Lösung von 14,2 g (100 mMol) 2-Dimethylaminoethanethiol-hydrochlorid in 50 ml Methanol wird gerührt und auf 0°C abgekühlt. Die gekühlte gerührte Lösung wird mit 101 mMol KOH versetzt, gefolgt von langsamer Zugabe von 49,9 mMol H₂O₂. Nach 15 Minuten wird das Methanol abgedampft und das erhaltene Gemisch wird dreimal mit Ether extrahiert. Der Etherextrakt wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu 10,1 g eines blaßgelben Öls eingedampft. Die Destillation des Öls im Hochvakuum ergibt 10 g des Disulfids (1) als farblose Flüssigkeit.

Beispiel 2 Herstellung von ψ-Brene

Pseudobrene (ψ-Brene) wird nach den folgenden beiden Methoden A und B hergestellt:
Methode A: 1,043 g (5 mMol) Diamindisulfid (aus Beispiel 1) und 1,03 g (5 mMol) 1,3-Dibrompropan werden zu etwa 4 ml DMSO gegeben. Die Reaktion wird in einem geschlossenen Gefäß unter Rühren bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach 3 bis 4 Stunden ist das Reaktionsgemisch wolkig und nach 1 Tag bildet sich ein weißer Niederschlag. Nach 7 Tagen wird das Reaktionsgemisch mit 5 ml Methanol verdünnt. Nach Zugabe von 100 ml Diethylether bildet sich ein weißer Niederschlag. Das feste ψ-Brene wird abzentrifugiert. Die Reinigung des Feststoffs durch Zusatz von 5 ml Methanol, gefolgt von Ausfällen mit 100 ml Diethylether, wird zwei weitere Male wiederholt. Ein Teil des Feststoffs wird an Sephadex G 25 mit 0,02 M Ammoniumcarbonatpuffer chromatographiert.
Methode B: 1,04 g (5 mMol) Diamindisulfid und 1,03 g (5 mMol) 1,3-Dibrompropan werden zu etwa 4 ml DMSO-H₂O (75 : 25 V/V) gegeben. Die Reaktion erfolgt in einem geschlossenen Gefäß unter Rühren bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch ist wolkig und klärt sich nach 3 bis 4 Stunden. Insgesamt 20 ml Wasser werden periodisch innerhalb der nächsten 11 Tage in Anteilen zugegeben, um das Gemisch zum Trübungspunkt zu bringen. Anschließend wird das Wasser abgedampft. Das Produkt wird mit Diethylether ausgefällt und ein Teil des Feststoffs wird wie in Methode A chromatographiert.

NMR für Methode A und Methode B (D₂O) δ 2,50 und 2,55 (kleine Singletts, -N(CH₃)₂-Endgruppen), 3,3 (br s, ⁺NCH₃) und 3,35-4,1 (m, CH₂) ppm.

Tabelle 1

Beispiel 3 Herstellung von Copolymeren

Copolymere des Diamindisulfids (1) und von 1,6-Dimethylaminohexan mit 1,3-Dibrompropan werden in DMSO wie in Tabelle 1 angegeben, hergestellt. Die Reaktionen und Produktisolationen erfolgen wie in Beispiel 1, jedoch wird für die beiden ersten Ausfällungen Ethylacetat anstelle von Diethylether verwendet. Die Copolymeren A und B sind weiße Pulver, die Copolymeren C und D gummiartige Feststoffe, das Copolymer E ist ein hygroskopischer Feststoff. Unter Hochvakuum werden die Copolymeren C und D glasige Schäume.

Beispiel 4 Herstellung von Hydroxypolybrene

Ein Gemisch aus 1,24 g (5 mMol) 1,6-Bis-dimethylaminohexan, 1,24 g (5 mMol) DL-1,4-Dibrom-2,3-butandiol und 3,5 ml DMSO wird abgeschlossen und gerührt. Nach 3 Tagen wird das anfänglich zweiphasige Gemisch homogen. Nach 6 Tagen gibt man das Reaktionsgemisch zu 150 g wasserfreiem Diethylether, wobei Hydroxypolybrene als gummiartiges Öl entsteht. Ein Anteil wird durch Auflösen in der vierfachen Gewichtsmenge Methanol, Ausfällen bei -78°C und Dekantieren des kalten Überstands weiter gereinigt.

NMR (Methanol-d₄): δ 0,3-2,3 (m, 8 H, -NCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-); 2,9 (s, <1 H, endständiges N(CH₃)₂), 3,3 (br s, 12 H, -⁺N(CH₃)₂-) 3,4-3,8 (m, 8 H, -⁺N(CH₃)₂CH₂-) und 4,3-4,6 (m, 2 H, CHOH) ppm.

Bei Zugabe von Säure verschiebt sich das endständige Dimethylamin-Singlett zu niedriger Feldstärke hin.

Beispiel 5 Herstellung eines Polymers aus dem Disulfid von 2-Dimethylaminoethanethiol und 1,4-Dibrombutan

Eine Lösung von 834 mg (4,0 mMol) Diamindisulfid (1) und 864 mg (4,0 mMol) 1,4-Dibrombutan in 2,8 ml DMSO wird verschlossen und gerührt. Nach 7 Tagen verdünnt man das pastöse Gemisch mit 5 ml Methanol, fällt durch Eintropfen der Suspension in 100 ml Ethylacetat aus und zentrifugiert ab. Die Suspension, Ausfällung und Zentrifugation werden zwei weitere Male wiederholt, wobei man ein weißes Pulver erhält, das im Vakuum getrocknet wird.

Beispiel 6 Aggregation von Latexteilchen durch Polybrene und ψ-Brene

Testmischungen, die 0,88 mg/ml Latexteilchen, Ammoniumcarbonatpuffer und verschiedene Konzentrationen an Aggregationsmittel (Polybrene, ψ-Brene oder Hydroxypolybrene) enthalten, werden hergestellt und nach 0 bis 60 Sekunden visuell auf Aggregation untersucht. Mischungen, die keine Aggregation zeigen, werden nach 4 bis 6 Stunden nochmals untersucht. Testmischungen, die klar sichtbare Aggregate enthalten, werden positiv (+) bewertet. Mischungen, die einige Aggregate in einer wolkigen Suspension enthalten, und jene, die eine wolkige Suspension enthalten, die sich in 6 Stunden absetzt, werden als Grenzfall (±) bewertet.

Sowohl hoch- als auch niedermolekulare Säulenfraktionen von ψ-Brene aus Beispiel 2 werden getestet. Das Diamindisulfid (1) wird als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 genannt.

Tabelle 2

Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß alle getesteten Polymeren eine Aggregation der Latexteilchen bewirken. In jedem Fall hat der Konzentrationsbereich des Polymers, der eine Aggregation bewirkt, mindestens einen Faktor von zwei. Die Diamindisulfid-(1)-Kontrolle verursacht keine Aggregation der Latexteilchen.

Beispiel 7 Verhinderung einer ψ-Brene-abhängigen Aggregation

Testmischungen von Latexteilchen (2,2 mg/ml) und DTE (1,22 mM) in Ammoniumcarbonatpuffer werden mit Lösungen von ψ-Brene in Ammoniumcarbonatpuffer behandelt. Das erhaltene Gemisch enthält Latexteilchen (0,88 mg/ml) DTE (0,49 mM) und ψ-Brene 1 (0,2 mg/ml). Sowohl hoch- als auch niedermolekulare Säulenfraktionen von ψ-Brene aus Beispiel 2 werden getestet. Polybrene (0,1 mg/ml im Endgemisch) wird anstelle von ψ-Brene als Kontrolle verwendet. Die Aggregation wird wie in Beispiel 6 visuell ausgewertet.

Die Anwesenheit von DTE in den Testmischungen verhindert eine Aggregation der Latexteilchen durch ψ-Brene. Dies gilt sowohl für hoch- als auch niedermolekulare Fraktionen von ψ-Brene. Die Aggregation der Latexteilchen durch Polybrene wird durch Zusatz von DTE nicht verhindert.

Beispiel 8 Rückgängigmachung der ψ-Brene-abhängigen Aggregation

Aggregierte Testmischungen (500 ml), die 0,88 mg/ml Latexteilchen und 0,2 mg/ml ψ-Brene in Ammoniumcarbonatpuffer enthalten, werden mit 10 ml wäßrigem 25 mM DTE behandelt. Sowohl hoch- als auch niedermolekulare Fraktionen von ψ-Brene aus Beispiel 2 werden getestet. Aggregierte Testmischungen, die 0,1 mg/ml Polybrene anstelle von ψ-Brene enthalten, werden als Kontrollen verwendet. Die Aggregation wird wie in Beispiel 6 ausgewertet. Es ist eine Dispersion der mit ψ-Brene aggregierten Latexteilchen durch DTE zu beobachten. Bei Ersatz von H₂O durch DTE tritt keine Aggregatdispersion auf. Das Verfahren wird unter Ersatz von ψ-Brene durch Polybrene wiederholt. Weder DTE noch H₂O ergeben eine Dispersion der mit Polybrene aggregierten Latexteilchen.

Beispiel 9 Verhinderung der Hydroxypolybrene-abhängigen Aggregation

Testmischungen, die 2,2 mg/ml Latexteilchen und 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM, 0,625 mM bzw. 0 mM NaIO₄ in Ammoniumcarbonatpuffer enthalten, werden mit Hydroxypolybrene in Ammoniumcarbonatpuffer behandelt, so daß die Endmischung 0,88 mg/ml Latexteilchen, 0,1 mg/ml Hydroxypolybrene und 2 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM bzw. 0 mM enthält. Zwei Sätze von Kontrollen werden angewandt. Im ersten Satz wird NaIO₄ durch eine äquivalente Konzentration NaCl ersetzt. Im zweiten Satz wird Hydroxypolybrene durch 0,1 mg/ml Polybrene ersetzt. Die Aggregation wird wie in Beispiel 6 visuell ausgewertet.

Eine NaIO₄-Konzentration von 2 mM verhindert eine sofortige Aggregation, während Konzentrationen von 1 mM und 0,5 mM anfangs Grenzfälle sind. Nach 16 Stunden sind Mischungen, die mehr als 0,5 mM NaIO₄ enthalten, nicht mehr aggregiert. Kontrollen ohne NaIO₄ aggregieren sofort und ändern sich nicht, ebenso wie Polybrene enthaltende Kontrollen.

Beispiel 10 Rückgängigmachung der Hydroxypolybrene-abhängigen Aggregation

10 µl, 5 µl, 1,5 µl bzw. 1,2 µl wäßriges 0,1 M NaIO₄ werden zu Testmischungen (500 µl) und 0,1 mg/ml Hydroxypolybrene in Ammoniumcarbonatpuffer gegeben. Zwei Sätze von Kontrollen werden angewandt. Im ersten Satz wird NaIO₄ durch NaCl von gleicher Konzentration ersetzt. Im zweiten Satz wird Hydroxypolybrene durch Polybrene ersetzt. Die Mischungen werden wie in Beispiel 6 visuell auf Aggregation untersucht.

Die Hydroxypolybrene enthaltenden aggregierten Latexteilchen dispergieren sofort mit den beiden höheren NaIO₄-Konzentrationen. Nach 16 Stunden verursachen alle vier getesteten NaIO₄-Konzentrationen eine Dispersion der aggregierten Latexteilchen, während ohne NaIO₄ die Aggregate bestehen bleiben. Kontrollen mit NaCl bzw. Polybrene bleiben aggregiert.

Beispiel 11 Aggregation von Blut mit ψ-Brene und Copolymeren

10 µl Blut, 85 µl LISS und 15 µl einer Lösung des Testpolymers in LISS werden vermischt und nach 30 Sekunden wie in Beispiel 6 visuell auf Aggregation untersucht. Die Polymeren, ihre Konzentration und die Aggregationswirkung sind in Tabelle 3 angegeben. Die Copolymeren sind aus Beispiel 3, ψ-Brene aus Beispiel 1.

Tabelle 3

Beispiel 12 Verhinderung der Blutkörperchenaggregation

Testmischungen, die gewaschene rote Blutzellen (10 µl von 50% Zellen in LISS), 5 µl wäßriges 25 mM DTE und 95 µl LISS enthalten, werden hergestellt. Ferner werden Kontrollen hergestellt, in denen DTE allein durch H₂O ersetzt ist. 5 µl einer wäßrigen Lösung von ψ-Brene (10 mg/ml) werden zu jeder Testmischung und Kontrolle gegeben. Nach 30 Sekunden wird die Aggregation wie in Beispiel 6 visuell untersucht.

Die Kontrollen, die kein DTE enthalten, aggregieren sofort, während in der DTE enthaltenden Testmischung die Aggregation verhindert wird.

Die Blutzellen-Agglutination durch Polybrene in einem ähnlichen Test wird durch DTE nicht beeinflußt.

Beispiel 13 Rückgängigmachung der Blutzellenaggregation

Aggregierte Testmischungen von roten Zellen werden durch Kombinieren von roten Blutzellen (10 µl von 50% Zellen in LISS), 95 µl LISS und 5 µl einer wäßrigen Lösung von ψ-Brene (10 mg/ml) hergestellt. Die Testmischungen werden mit 5 µl wäßrigem 25 mM DTE versetzt. In einem Satz von Kontrollen wird das wäßrige DTE durch Wasser allein ersetzt. Nach 30 Sekunden wird die Aggregation wie in Beispiel 6 visuell ausgewertet.

Die mit DTE behandelten Testmischungen zeigen eine Dispersion der aggregierten Zellen. Die Kontrollen ohne DTE bleiben aggregiert.

In einem vergleichbaren Experiment werden mit Polybrene aggregierte Blutzellen durch DTE nicht dispergiert.

Beispiel 14 Herstellung von succinylierten magnetischen Teilchen

200 mg magnetische Teilchen (Advanced Magnetic BioMag 4100, 4 ml) werden mit magnetischer Abtrennung gewaschen (3×40 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0) und in 15 ml desselben Puffers resuspendiert. Die Teilchen werden mit 5 ml 1 M Bernsteinsäureanhydrid in DMF durch Zusatz von 5 Aliquoten über 2 Stunden (nach jeder Zugabe wird der pH auf 7,0 eingestellt) umgesetzt. Die succinylierten Teilchen werden mit magnetischer Abtrennung gewaschen (3×40 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, und 2×40 ml LISS), in 20 ml LISS resuspendiert und bei 4°C mit 0,02% Natriumazid gelagert.

Beispiel 15 Vollbluttrennung

480 µl Vollblut werden mit 80 µl einer 20 mg/ml Lösung von ψ-Brene in LISS vermischt. Eine Suspension von magnetischen Teilchen, hergestellt gemäß Beispiel 14 (2 mg in 248 ml LISS) werden zugegeben und die Suspension wird vermischt. Die Aggregate werden magnetisch abgetrennt. Die Trennung wird visuell beobachtet, wobei die aggregierten Zellen und magnetischen Teilchen zu den Magneten hingezogen werden. Nach 1 Minute kann klares Plasma mit einer Pipette abgezogen werden.

Ersetzt man ψ-Brene durch LISS allein, so erfolgt keine Trennung.

Beispiel 16 Aggregation, Verhütung und Rückgängigmachung der Aggregation von Blut mit Hydroxypolybrene A. Aggregation

Blut (10 µl), LISS (95 µl) und 5 µl einer Lösung von Hydroxypolybrene (100, 10, 1 bzw. 0 mg/ml) in LISS werden vermischt und nach 30 Sekunden wie in Beispiel 6 auf Aggregation untersucht. Bei den beiden höchsten getesteten Hydroxypolybrene-Konzentrationen wird eine Aggregation beobachtet.

B. Verhütung

Blut (10 µl), LISS (95 µl) und 5 µl wäßriges 25 mM NaIO₄ werden mit jeder Testmischung kombiniert. 5 µl einer 10 mg/ml Lösung von Hydroxypolybrene in LISS werden zugegeben. Kontrollen, in denen die NaIO₄-Lösung durch H₂O allein ersetzt wird, werden ebenfalls durchgeführt. Nach 30 Sekunden wird die Aggregation wie in Beispiel 6 visuell untersucht. Bei Anwesenheit von NaIO₄ ist keine Aggregation zu beobachten. In den Kontrollen ohne NaIO₄ tritt Aggregation auf.

In einem ähnlichen Experiment wird die Aggregation von Polybrene durch NaIO₄ nicht beeinflußt.

C. Rückgängigmachung

Aggregierte Testmischungen werden hergestellt durch Kombinieren von Blut (10 µl), LISS (95 µl) und 5 µl einer 10 mg/ml Lösung von Hydroxypolybrene in LISS. 5 µl wäßriges 25 mM NaIO₄ werden zu jeder Testmischung gegeben. Kontrollen, in denen die NaIO₄-Lösung durch Wasser allein ersetzt ist, werden ebenfalls durchgeführt. Nach 30 Sekunden wird die Aggregation wie in Beispiel 6 visuell untersucht.

Aggregierte Zellen werden in den NaIO₄ enthaltenden Testmischungen dispergiert. In Kontrollen, die kein NaIO₄ enthalten, erfolgt keine Dispersion.

In einem ähnlichen Experiment werden durch Polybrene aggregierte Zellen durch NaIO₄ nicht dispergiert.

Claims

1. Verfahren zur reversiblen Aggregation von Teilchen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß man das Medium mit einem polyionischen Polymer kombiniert, das fähig ist, die Teilchen zu aggregieren, das Medium ausreichend lange Zeit inkubiert, damit eine Aggregation der Teilchen eintritt, und die Teilchen mit einem chemischen Reagens, das zur Spaltung des polyionischen Polymers fähig ist, ausreichend lange Zeit in Kontakt bringt, um die Aggregation rückgängig zu machen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die reversible Aggregation die spezifische Bindung zwischen den Teilchen fördert.

3. Verfahren zur reversiblen Aggregation von Teilchen, die in einem wäßrigen Medium suspendiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) die Teilchen durch Versetzen des Mediums mit einem polyionischen Polymer, das fähig ist, die Teilchen zu aggregieren, zur Aggregation bringt, (b) das Medium ausreichend lange Zeit inkubiert, damit eine Aggregation eintritt, (c) die aggregierten Teilchen aus dem Medium abtrennt und (d) die Aggregation der Teilchen unter Verwendung eines polyionischen Polymers, das mit einem chemischen Reagens depolymerisiert werden kann, rückgängig macht.

4. Verfahren zur Abtrennung von Teilchen, die in einem flüssigen Medium dispergiert sind, aus dem Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) unter Vernetzen des Mediums mit einem polyionischen Polymer eine Coaggregation der Teilchen mit magnetischen Teilchen bewirkt, (b) das Medium einem magnetischen Feldgradienten aussetzt, um die coaggregierten Teilchen und magnetischen Teilchen aus dem Medium abzutrennen, und (c) die Aggregation der Teilchen rückgängig macht, wobei man für die Coaggregation der Teilchen mit den magnetischen Teilchen ein polyionisches Polymer verwendet, das mit einem chemischen Reagens depolymerisierbar ist, wodurch die Coaggregation rückgängig gemacht wird.

5. Verfahren zum Abtrennen von Teilchen, die in einem flüssigen Medium dispergiert sind, aus dem Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) magnetische Teilchen in dem flüssigen Medium suspendiert, (b) ein polyionisches Polymer zur nicht-spezifischen Bindung der Teilchen an die magnetischen Teilchen zugibt, (c) die gebundenen Teilchen mit Hilfe eines magnetischen Feldgradienten aus dem Medium abtrennt und (d) die nicht-spezifische Bindung der Teilchen an die magnetischen Teilchen rückgängig macht, wobei man für die nicht-spezifische Bindung der Teilchen an die magnetischen Teilchen ein polyionisches Polymer verwendet, das mit einem chemischen Reagens depolymerisierbar ist, wodurch die nicht-spezifische Bindung rückgängig gemacht wird.

6. Verfahren zur Abtrennung von Teilchen aus einem Medium, das die Teilchen enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man das die Teilchen enthaltende Medium mit einem polyionischen Polymer für die nicht- spezifische Bindung der Teilchen kombiniert, wobei das polyionische Polymer mit einem chemischen Reagens spaltbar ist, wodurch die nicht-spezifische Bindung rückgängig gemacht wird, die gebundenen Teilchen aus dem Medium abtrennt und die gebundenen Teilchen mit dem chemischen Reagens unter Bedingungen für die Rückgängigmachung der nicht-spezifischen Bindung in Kontakt bringt.

7. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Analyten, der Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars ("SBP") ist, wobei sich der Analyt oder ein zu dem Analyten komplementärer SBP-Bestandteil auf der Oberfläche von Teilchen befindet, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß man die in dem flüssigen Medium suspendierten Teilchen mit einem zu dem Analyten oder dem SBP-Bestandteil auf der Oberfläche komplementären SBP-Bestandteil kombiniert, ein polyionisches Polymer zugibt, das zur nicht- spezifischen Aggregation der Teilchen fähig ist, das flüssige Medium ausreichend lange inkubiert, um eine nicht-spezifische Aggregation der Teilchen zu bewirken, das flüssige Medium mit einem chemischen Reagens versetzt, das zur Spaltung des polyionischen Polymers fähig ist, das flüssige Medium ausreichend lange inkubiert, um die nicht-spezifische Aggregation der Teilchen rückgängig zu machen, und die restliche spezifische Aggregation der Teilchen mißt.

8. Verfahren zum Abtrennen von Zellen aus Vollblut, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Vollblutprobe, geladene magnetische Teilchen und ein polyionisches Reagens zur nicht-spezifischen Agglutination der magnetischen Teilchen und der Zellen kombiniert, wobei das polyionische Reagens mit einem chemischen Reagens spaltbar ist, wodurch die Agglutiniation rückgängig gemacht wird, das Medium einem magnetischen Feldgradienten aussetzt, um die agglutinierten Zellen aus dem Blutplasma abzutrennen, und die agglutinierten Zellen mit einer wäßrigen Lösung des chemischen Reagens unter Bedingungen für die Rückgängigmachung der Agglutination durch zumindest teilweise Depolymerisation des polyionischen Reagens in Kontakt bringt.

9. Testmethode für einen Analyten in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, wobei der Analyt ein Bestandteil eines spezifischen Bindungspaares (SBP) bestehend aus Ligand und komplementärem Rezeptor ist, gekennzeichnet durch folgende Schritte: Kombinieren der Probe in einem Assaymedium mit einem SBP-Bestandteil, der komplementär zu dem Analyten ist, wobei der Analyt und/oder der komplementäre SBP-Bestandteil an die Oberfläche eines nicht-magnetischen Teilchens gebunden wird, Kombinieren des Mediums mit magnetischen Teilchen und einem polymeren Reagens für die nicht- spezifische Bindung der magnetischen Teilchen an die nicht-magnetischen Teilchen, Aussetzen des Mediums einem magnetischen Feldgradienten, um die gebundenen Teilchen aus dem Medium abzutrennen, und Rückgängigmachen der Aggregation der aggregierten Teilchen, wobei man als polymeres Reagens ein Reagens verwendet, das mit einem chemischen Reagens spaltbar ist, wodurch die Aggregation rückgängig gemacht wird, und wobei man die Aggregation durch Zusatz des chemischen Reagens rückgängig macht.

10. Polykation der Formel: worin R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und gegebenenfalls substituiertes C_6-20-Aryl, C_6-20-Aryl- C_1-6-alkyl, C_1-6-Alkyl oder C_1-6-Alkoxy-C_1-6-alkyl bedeuten; B eine Brückengruppe ist, die außer Wasserstoff 2 bis 30 Atome enthält, ausgewählt unter Kohlenstoff, Sauerstoff, Phosphor, Stickstoff und Schwefel, wobei mindestens eine der Gruppen B eine Disulfid- oder Glykolgruppe aufweist; und n einen Mittelwert von 10 bis 10 000 hat.

11. Zusammensetzung, enthaltend nicht-spezifisch agglutinierte Teilchen, die an einen Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars (SBP) bestehend aus Ligand und dessen komplementärem Rezeptor gebunden sind, und das Polykation nach Anspruch 10.

12. Testsatz zur Durchführung einer Testmethode zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, von dem angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, wobei der Analyt ein Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars (SBP) bestehend aus Ligand und dessen komplementärem Rezeptor ist, dadurch gekennzeichnet, daß er (a) einen SBP-Bestandteil, der zu dem Analyten komplementär ist, (b) einen SBP-Bestandteil, der an ein geladenes Teilchen gebunden ist, wenn weder der Analyt, noch der komplementäre SBP-Bestandteil an ein geladenes Teilchen gebunden sind, (c) geladene magnetische Teilchen, wenn das geladene Teilchen nicht-magnetisch ist, und (d) ein polymeres Reagens zur nicht-spezifischen Bindung der magnetischen Teilchen oder der magnetischen Teilchen und der nicht-magnetischen Teilchen enthält, wobei das polymere Reagens mit einem chemischen Reagens spaltbar ist, wodurch die nicht-spezifische Bindung rückgängig gemacht wird.

13. Testsatz zur reversiblen Aggregation von Teilchen, enthaltend (a) ein polymeres Reagens zur Aggregation der Teilchen und (b) ein chemisches Reagens, das zur Spaltung von Bindungen innerhalb des polymeren Reagens fähig ist.