DE3787826T2 - Einzelnes flüssiges Reagens für Tests. - Google Patents
Einzelnes flüssiges Reagens für Tests.Info
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Description
- Es gibt einen anhaltenden Bedarf für einfache, schnelle und genaue qualitative und quantitative Bestimmungen biologisch aktiver Substanzen. Es gibt einen Bedarf für Verfahren, die durch technisches Personal mit einem geringen Niveau an Fähigkeiten durchgeführt werden können. Zusätzlich gibt es einen Bedarf für Bequemlichkeit, Zuverlässigkeit und Einfachheit. In klinischen Laboratorien gibt es zunehmend einen Wunsch nach einfacheren Assays, die die Verwendung von weniger Reagenzien und so wenigen Schritten wie möglich erfordern.
- Immunoassays verwenden gewöhnlich mehr als ein Reagenz. In den meisten Fällen können die Reagenzien vor der Durchführung des Assays nicht in einem flüssigen Medium vereinigt werden, da sie Komponenten enthalten, die beim Kontakt miteinander reagieren würden. Es ist wünschenswert, ein Verfahren zu finden, um die aktiven Materialien in flüssiger Form zu vereinigen, während bis zu dem Zeitpunkt, wo ein Mittel zum Freisetzen von einem oder mehreren der Reagenzien bereitgestellt wird, die Reagenzien daran gehindert werden, miteinander zu reagieren. Im allgemeinen sind die Reagenzien in Immunoassays Mitglieder eines spezifischen Bindungspaares, das aus Ligand und seinem komplementären Rezeptor besteht, von denen eines mit einem Mitglied eines signalerzeugenden Systems markiert ist. Spezifische Bindungspaar-Mitglieder, die komplementär zueinander sind, reagieren gewöhnlich beim Kontakt. Deshalb werden derartige Reagenzien im allgemeinen gerade bis vor dem Zeitpunkt, an dem ein Assay durchgeführt wird, getrennt aufbewahrt.
- Ein patentiertes Verfahren zum Vereinigen von miteinander reagierenden Reagenzien in einem einzigen Reagenz ist es, die Reagenzien trocken zu formulieren, so daß keine Reaktionen stattfinden, bis eine flüssige Probe oder ein Verdünnungsmittel dazugegeben wird. Trockene Reagenzien legen Assayverfahren jedoch einige Beschränkungen auf. Das Erreichen einer homogenen Mischung und das Vermeiden von Wasseraufnahme sind zu bedenkende Umstände. Weiter muß eine vorzeitige Reaktion vermieden werden. Trockene Reagenzien sind teuer, und ihre Herstellung und Qualitätskontrolle Probe und ein Verdünnungsmittel gleichzeitig dazuzugeben und heftig zu schütteln, um eine volle Auflösung des Pulvers sicherzustellen, bevor die Reaktion signifikant fortgeschritten ist. Zusätzlich sind spezielle Verarbeitungsvorrichtungen erforderlich.
- Es ist deshalb wünschenswert, ein neues Assayverfahren zum Bestimmen eines Analyten in einer Probe zu entwickeln, in dem zwei oder mehr spezifische Bindungspaar-Mitglieder in einem einzigen flüssigen Reagenz vereinigt sind. Ein derartiges Reagenz vermeidet den Bedarf nach Mischen und Schütteln von trockenem Reagenz und erfordert nicht die gleichzeitige Zugabe von Probe und Verdünnungsmittel. Ein einziges flüssiges Reagenz verringert die Zeit und die Fertigkeit, die notwendig sind, um einen Assay durchzuführen.
- Litchfield et al., "High Sensitive Immunoassays Based on Use of Liposomes without Complement", Clin. Chem. 30, 1441-1445 (1984) diskutieren einen Immunoassay auf Liposomen-Basis, der kovalent verknüpfte Hapten-Cytolysin-Konjugate verwendet, um Vesikel mit eingeschlossenen Enzymen aufzulösen. Die US-Patente Nr. 3,850,578; 4,483,921; und 4,483,929 offenbaren immunoreaktive Liposomen- Reagenzien, in denen Antigen oder Antikörper an die Oberfläche von Lipid-Vesikeln gebunden ist. Eine Vielfalt von Verfahren zur Herstellung von Lipid-Vesikeln ist bekannt; siehe z. B. die US- Patente Nr. 4,529,561; 4,522,803 und 4,485,054. Das US-Patent Nr. 4,311,712 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer gefriergetrockneten Liposomenmischung.
- EP-A-212 989 offenbart eine markierte, in einem Lipid-Vesikel eingeschlossene Spezies, die in einem Immunoassay mit einer reaktiven Spezies vereinigt und durch Lyse freigesetzt werden kann. (Diese Referenz ist nur unter Art. 54(3) EPÜ relevant.) Verfahren und Zusammensetzungen zur Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten, der ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares (sbp) - Ligand und sein komplementärer Rezeptor - ist, in einer Probe, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält, werden bereitgestellt. Das Verfahren wird unter Verwendung einer Zusammensetzung durchgeführt, die komplementäre sbp-Mitglieder in einem einzigen flüssigen Medium einschließt, worin ein sbp-Mitglied reversibel in einem Material eingeschlossen ist, das das Mitglied vorübergehend unfähig macht, sich mit seinem komplementären sbp- Mitglied zu verbinden. Das einschließende Material ist entweder ein synthetisches oder ein natürliches Vehikel. Mindestens eines der sbp-Mitglieder ist an ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems gebunden. Ein Mittel zum Aufheben des Einschlusses des vorübergehend eingeschlossenen sbp-Mitglieds wird zur Vereinigung mit dem flüssigen Medium zur geeigneten Zeit bereitgestellt. Chemische oder physikalische Mittel oder eine Kombination derselben werden verwendet, um den Einschluß des vorübergehend eingeschlossenen sbp- Mitglieds aufzuheben. In dem Verfahren werden die Reagenzien, einschließlich der oben erwähnten, in geeigneter Reihenfolge zusammengegeben, und das Signal, das in Beziehung zu der Menge an Analyt in der Probe erzeugt wird, wird gemessen.
- Das Verfahren der Erfindung stellt einen Weg zur Bereitstellung von normalerweise miteinander reagierenden sbp-Mitgliedern in einem einzigen flüssigen Reagenz bereit. Weil eines der sbp-Mitglieder vorübergehend eingeschlossen ist, kann das einzige flüssige Reagenz in vorgemessenen Mengen auf der Herstellerseite hergestellt und dann zum Verbraucher befördert werden und für die zukünftige Verwendung ohne die Notwendigkeit, einzelne Reagenzien zu messen oder zu mischen, aufbewahrt werden.
- Das Verfahren findet eine spezielle Anwendung in verschiedenen Immunoassay-Verfahren, einschließlich Spin-Immunoassay, FIA, EMIT, ELISA, RIA und chemilumineszierenden Immunoassays. Das Verfahren ist auch in Teilchen-Agglutinations-Immunoassays, in denen eines der sbp-Mitglieder sich nicht auf einem Teilchen befindet, nützlich.
- Ein Testsatz, der das einzige flüssige Reagenz einschließt, wird zur Verwendung in Assays bereitgestellt. Ein Mittel zum Aufheben des Einschlusses des vorübergehend eingeschlossenen sbp-Mitglieds und zusätzliche Mittel können ebenfalls in dem Testsatz bereitgestellt werden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vereinigen von spezifisch bindenden Reagenzien in einem einzigen flüssigen Medium auf eine Weise, die vorübergehend die Reaktion zwischen den Reagenzien verzögert. Das Verfahren beinhaltet das Einkapseln eines Reagenz als ein Mittel, das Reagenz vorübergehend nicht-reaktiv mit den anderen Reagenzien zu machen, gefolgt von einer spezifischen Freisetzung des eingeschlossenen Materials zu einer vorgeschriebenen Zeit. Das eingekapselte Reagenz und das andere Reagenz oder die anderen Reagenzien sind in einem flüssigen Medium vorhanden. Ein empfindliches, genaues und vereinfachtes Assayverfahren zur Bestimmung einer großen Vielfalt von Analyten in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, wird unter Verwendung des obigen flüssigen Mediums bereitgestellt.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung werden ein Assayverfahren und eine Zusammensetzung zur Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten, der ein Mitglied eines aus Ligand und seinem komplementären Rezeptor bestehenden spezifischen Bindungspaares (sbp) ist, bereitgestellt. Die Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, wird mit einer vorformulierten Zusammensetzung vereinigt, welche in einem einzigen flüssigen Medium (1) ein sbp-Mitglied, reversibel in einem Material eingeschlossen, welches das eingeschlossene sbp- Mitglied vorübergehend unfähig zur Bindung mit seinem komplementären sbp-Mitglied macht, und (2) das komplementäre sbp-Mitglied, das nicht eingekapselt ist, enthält. Mindestens eines der sbp-Mitglieder ist an ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems gebunden. Andere Mitglieder des signalerzeugenden Systems können ebenfalls in dem einzigen flüssigen Medium anwesend sein. In einigen Fällen sind diese zusätzlichen Mitglieder des signalerzeugenden Systems mit dem sbp-Mitglied eingekapselt. Alternativ können zusätzliche Mitglieder des signalerzeugenden Systems in einem getrennten Medium vorliegen.
- Bevor mit der Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgeschritten wird, wird eine Anzahl von Ausdrücken definiert.
- Analyt -- Die zu messende Verbindung oder Zusammensetzung, das interessierende Material. Der Analyt kann ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares (sbp) sein und kann ein Ligand, der ein- oder mehrwertig ist, gewöhnlich antigenisch oder haptenisch, sein und ist eine einzelne Verbindung oder eine Mehrzahl von Verbindungen, die sich mindestens eine gemeinsame Epitopen- oder Determinantenstelle teilen.
- Die polyvalenten Ligand-Analyten sind normalerweise Poly(aminosäuren), d. h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren und Kombinationen davon. Derartige Kombinationen schließen Komponenten von Bakterien, Viren, Chromosomen, Genen, Mitochondrien, Zellkernen, Zellmembranen und dgl. ein.
- Die genaue Natur einiger der Analyten zusammen mit zahlreichen Beispielen dafür ist im US-Patent Nr. 4,299,916 von Litman et al.
- (insbesondere in den Spalten 16 bis 23) offenbart.
- Meistens weisen die polyepitopen Ligand-Analyten, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ein Molekulargewicht von mindestens ungefähr 5 000, gewöhnlicher mindestens ungefähr 10 000 auf. In der Poly(aminosäure)-Kategorie beträgt das Molekulargewicht der interessierenden Poly(aminosäuren) im allgemeinen ungefähr 5 000 bis 5 000 000, gewöhnlicher ungefähr 20 000 bis 1 000 000; bei den interessierenden Hormonen liegen die Molekulargewichte gewöhnlich im Bereich von ungefähr 5 000 bis 60 000.
- Eine große Vielfalt von Proteinen kann in Betracht gezogen werden, wie z. B. die Familie von Proteinen mit ähnlichen strukturellen Merkmalen, Proteinen mit speziellen biologischen Funktionen, Proteinen, die mit speziellen Mikroorganismen in Beziehung stehen, insbesondere krankheitsverursachende Mikroorganismen usw.
- Die monoepitopen Ligand-Analyten weisen im allgemeinen ein Molekulargewicht von ungefähr 100 bis 2000, gewöhnlicher von ungefähr 125 bis 1000, auf. Die interessierenden Analyten schließen Arzneimittel/Drogen, Metaboliten, Pestizide, umweltverschmutzende Substanzen und dergleichen ein. Eingeschlossen in die interessierenden Arzneimittel/Drogen sind die Alkaloide. Unter den Alkaloiden befinden sich Morphinalkaloide, einschließlich Morphin, Kodein, Heroin, Dextromethorphan, deren Derivate und Metaboliten; Kokainalkaloide, die Kokain und Benzoylecgonin, deren Derivate und Metaboliten einschließen; Ergotalkaloide, die das Diethylamid der Lysergsäure einschließen; Steroidalkaloide; Iminazoylalkaloide; Chinazolinalkaloide, Isochinolinalkaloide; Chinolinalkaloide, die Chinin und Chinidin einschließen; Diterpenalkaloide, deren Derivate und Metaboliten.
- Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen schließt Steroide, einschließlich der Östrogene, Estogene, Androgene, andreokortikalen Stereoide, Gallensäuren, kardiotonischen Glykoside und Aglykone, einschließlich Digoxin und Digoxigenin, Saponine und Sapogenine, deren Derivate und Metaboliten ein. Auch eingeschlossen sind die Steroid-nachahmenden Substanzen, wie z. B. Diethylstilböstrol u Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Lactame mit 5 bis 6 Ringmitgliedern, die die Barbiturate, z. B. Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantonin, Primidon, Ethosuximid und deren Metaboliten einschließen u
- Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Aminoalkylbenzole mit Alkyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, die die Amphetamine, Catecholamine, einschließlich Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin, Narcein, Papaverin, und deren Metaboliten einschließen.
- Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Benzheterocyclen, die Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin, deren Derivate und Metaboliten einschließen, wobei die heterocyclischen Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine sind.
- Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Purine, einschließlich Theophyllin, Koffein, deren Metaboliten und Derivate.
- Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen schließen diejenigen ein, die von Marihuana abgeleitet sind, einschließlich Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.
- Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen schließt die Vitamine ein, wie z. B. A, B, B&sub1;&sub2;, C, D, E und K, Folsäure und Thiamin.
- Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Prostaglandine, die sich durch den Grad und die Stellen der Hydroxylierung und Unsättigung unterscheiden.
- Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Antibiotika, die Penicillin, Chlormycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin, die Metaboliten und Derivate einschließen.
- Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind die Nucleoside und Nucleotide, die ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidin mit ihren geeigneten Zucker- und Phosphatsubstituenten einschließen.
- Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind verschiedene individuelle Arzneimittel/Drogen, die Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin, Nortriptylin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propranolol, Griseofulvin, Valpronsäure, Butyrophenone, Antihistamine, anticholinerge Arzneimittel/Drogen, wie z. B. Atropin, deren Metaboliten und Derivate einschließen.
- Metaboliten, die mit Krankheitszuständen in Beziehung stehen, schließen Spermin, Galaktose, Phenylbrenztraubensäure und Porphyrin Typ 1 ein.
- Die nächste Gruppe von Arzneimitteln/Drogen sind Aminoglykoside, wie z. B. Gentamicin, Kanamicin, Tobramycin und Amikacin.
- Unter den interessierenden Pestiziden sind polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfonamide, deren Metaboliten und Derivate.
- Bei Rezeptor-Analyten liegt das Molekulargewicht gewöhnlich im Bereich von 10000 bis 2·10&sup8;, gewöhnlicher von 10 000 bis 106. Bei Immunglobulinen, IgA, IgG, IgE und IgM, variiert das Molekulargewicht im allgemeinen von ungefähr 160 000 bis ungefähr 106. Enzyme liegen normalerweise in einem Molekulargewichtsbereich von ungefähr 10 000 bis 1 000 000. Natürliche Rezeptoren variieren in weitem Bereich, wobei sie im allgemeinen ein Molekulargewicht von mindestens ungefähr 25 000 aufweisen und ein Molekulargewicht bis 106 oder höher aufweisen können, einschließlich solcher Materialien wie Avidin, DNA, RNA, Thyroxin-bindendes Globulin, Thyroxin-bindendes Präalbumin, Transcortin usw.
- Ligandenanalogon oder Analytenanalogon -- ein modifizierter Ligand oder ein Ligandensurrogat oder ein modifizierter Analyt oder ein Analytensurrogat, das mit dem analogen Liganden oder Analyten um einen Rezeptor konkurrieren kann, wobei die Modifizierung Mittel bereitstellt, um ein Ligandenanalogon oder Analytenanalogon an ein anderes Molekül zu knüpfen. Das Ligandenanalogon oder Analytenanalogon unterscheidet sich gewöhnlich vom Liganden oder Analyten durch mehr als den Ersatz eines Wasserstoffatoms durch eine Bindung, die das Ligandenanalogon oder Analytenanalogon an ein Reaktivitätszentrum oder einen Marker knüpft, aber muß dies nicht. Der Ausdruck Ligandensurrogat oder Analytensurrogat bezieht sich auf eine Verbindung mit der Fähigkeit, sich spezifisch mit dem zum Liganden oder Analyten komplementären Rezeptor zu verbinden. Demgemäß kann sich das Ligandensurrogat oder Analytensurrogat auf eine Weise, die ähnlich der des Liganden oder Analyten ist, an den Rezeptor binden. Das Surrogat könnte z. B. ein Antikörper sein, der gegen den Idiotypen eines Antikörpers gegen den Liganden oder Analyten gerichtet ist.
- Poly(ligandenanalogon) -- eine Mehrzahl von Ligandenanaloga, die kovalent miteinander verknüpft sind, normalerweise zu einem Reaktivitätskern. Der Reaktivitätskern ist ein polyfunktionelles Material, normalerweise polymer, gewöhnlich mit einer Mehrzahl von funktionellen Gruppen, z. B. Hydroxyl-, Amino-, Mercapto-, ethylenischen Gruppen usw., als Stellen zur Verknüpfung. Der Reaktivitätskern kann wasserlöslich oder -unlöslich sein, vorzugsweise wasserlöslich, und weist normalerweise ein Molekulargewicht von mindestens 30 000 auf und kann ein Molekulargewicht von 10 000 000 oder mehr aufweisen. Erläuternde Reaktivitätskerne schließen Polysaccharide, Polypeptide (einschließlich Proteinen), Nukleinsäuren, Anionenaustauscherharze und dgl. ein. Wasserunlösliche Reaktivitätskerne können Wände von Behältern, z. B. Glas oder Kunststoff, Glasperlen, Additions- und Kondensationspolymere, Sephadex- und Agarose-Perlen und dgl. einschließen.
- Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ("sbp-Mitglied") -- Eines von zwei verschiedenen Molekülen mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einer Vertiefung, der sich spezifisch mit einer speziellen räumlichen und polaren Organisation des anderen Moleküls verbindet und dadurch als komplementär dazu definiert ist. Die Mitglieder des spezifischen Bindungspaares werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Diese sind gewöhnlich Mitglieder eines immunologischen Paares, wie z. B. Antigen-Antikörper, obwohl andere spezifische Bindungspaare, wie z. B. Biotin-Avidin, Hormone- Hormonrezeptoren, Nukleinsäure-Duplexe, IgG-Protein A, DNA-DNA, DNA- RNA und dgl. keine immunologischen Paare sind, aber in der Erfindung eingeschlossen sind.
- Ligand -- Irgendeine organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich existiert oder hergestellt werden kann.
- Rezeptor (Antiligand) -- Irgendeine Verbindung oder Zusammensetzung, die in der Lage ist, eine spezielle räumliche und polare Organisation eines Moleküls, d. h. eine Epitopen- oder Determinantenstelle, zu erkennen. Erläuternde Rezeptoren schließen natürlich vorkommende Rezeptoren, z. B. Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lectine, Nukleinsäuren und dgl. ein.
- Marker -- Ein Mitglied des signalerzeugenden Systems, das an ein sbp-Mitglied konjugiert ist. Der Marker kann isotop oder nichtisotop, gewöhnlich nicht-isotop, sein, einschließlich Katalysatoren, wie beispielsweise eines Enzyms, eines Chromogens, wie z. B. eines Fluoreszenzfarbstoffs, Farbstoffs oder Chemilumineszenzfarbstoffs, einer radioaktiven Substanz, eines Teilchens usw.
- Signalerzeugendes System -- Das signalerzeugende System kann eine oder mehrere Komponenten aufweisen, wobei mindestens eine Komponente ein Marker ist. Das signalerzeugende System erzeugt ein Signal, das mit der Anwesenheit oder Menge von Analyt in einer Probe in Beziehung steht. Das signalerzeugende System schließt alle die Reagenzien ein, die erforderlich sind, um ein meßbares Signal zu erzeugen. Mindestens ein Mitglied des signalerzeugenden Systems ist an mindestens ein sbp-Mitglied gebunden. Andere Komponenten des signalerzeugenden Systems können Substrate, Beschleuniger, Aktivatoren, chemilumineszierende Verbindungen, Cofaktoren, Inhibitoren, Abfänger, Metallionen, spezifische bindende Substanzen, die zum Binden von signalerzeugenden Substanzen erforderlich sind, und dgl. einschließen. Andere Komponenten des signalerzeugenden Systems können Coenzyme, Substanzen, die mit Enzymprodukten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren und dgl. sein. Das signalerzeugende System stellt ein Signal bereit, das durch äußere Mittel, vorzugsweise durch Messung von Radioaktivität, des Grades der Aggregation von Teilchen oder von elektromagnetischer Strahlung, wünschenswerterweise durch visuelle Überprüfung, nachweisbar ist. Meistens beinhaltet das signalerzeugende System ein chromophores Substrat und Enzym, wobei chromophore Substrate enzymatisch in Farbstoffe, welche Licht im ultravioletten oder sichtbaren Bereich absorbieren, Phosphore, Fluoreszenzfarbstoffe oder Chemilumineszenzfarbstoffe überführt werden.
- Das signalerzeugende System kann mindestens einen Katalysator, gewöhnlich ein Enzym, und mindestens ein Substrat einschließen und kann zwei oder mehr Katalysatoren und eine Mehrzahl von Substraten einschließen und kann eine Kombination von Enzymen, worin das Substrat des einen Enzyms das Produkt des anderen Enzyms ist, einschließen. Die Wirkungsweise des signalerzeugenden Systems ist es, ein Produkt zu erzeugen, das ein nachweisbares Signal bereitstellt, das zu der Menge an Analyt in der Probe in Beziehung steht.
- Eine große Anzahl von Enzymen und Coenzymen, die in einem signalerzeugenden System nützlich sind, sind im US-Patent Nr. 4,275,149 (Spalten 19 bis 23) und im US-Patent Nr. 4,318,980 (Spalten 10 bis 14) angegeben. Eine Anzahl von Enzymkombinationen ist im US-Patent Nr. 4,275,149 (Spalten 23 bis 28) aufgeführt, wobei diese Kombinationen in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können.
- Von speziellem Interesse sind Enzyme, die die Erzeugung von Wasserstoffperoxid und die Verwendung des Wasserstoffperoxids zur Oxidation eines Farbstoffvorläufers beinhalten. Spezielle Kombinationen schließen Saccharidoxidasen, z. B. Glucose- und Galaktoseoxidase, oder heterocyclische Oxidasen, wie z. B. Urikase und Xanthinoxidase, gekoppelt mit einem Enzym, das das Wasserstoffperoxid verwendet, um einen Farbstoffvorläufer zu oxidieren, d. h. eine Peroxidase, wie z. B. Meerrettichperoxidase, Lactoperoxidase oder Mikroperoxidase, ein. Zusätzliche Enzymkombinationen können in den oben genannten Patenten gefunden werden. Wenn ein einzelnes Enzym als Marker verwendet wird, können andere Enzyme Verwendung finden, wie z. B. Hydrolasen, Transferasen und Oxidoreduktasen, vorzugsweise Hydrolasen, wie z. B. alkalische Phosphatase und β-Galaktosidase. Alternatiy können Luciferasen verwendet werden, wie z. B. Glühwürmchen-Luciferase und bakterielle Luciferase.
- Erläuternde Coenzyme, die Verwendung finden, schließen NAD[H]; NADP[H], Pyridoxalphosphat; FAD[H]; FMN[H] usw., ein, gewöhnlich Coenzyme, die cyclische Reaktionen beinhalten, siehe insbesondere das US-Patent Nr. 4,318,980.
- Das Produkt der Enzymreaktion ist gewöhnlich ein Farbstoff oder Fluoreszenzfarbstoff. Eine große Anzahl von erläuternden Fluoreszenzfarbstoffen ist im US-Patent Nr. 4,275,149 (Spalten 30 und 31) angegeben.
- Ergänzende Materialien -- Verschiedene ergänzende Materialien werden häufig in einem Assay gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Zum Beispiel sind normalerweise Puffer sowie Stabilisatoren für das Assaymedium und die Assaykomponenten im Assaymedium anwesend. Häufig können zusätzlich zu diesen Additiven zusätzliche Proteine eingeschlossen sein, wie z. B. Albumine, oder Tenside, insbesondere nicht-ionische Tenside, Bindungsbeschleuniger, z. B. Polyalkylenglykole, oder dgl.
- Material zum reversiblen Einschließen eines sbp-Mitglieds -- Es kann irgendein Material verwendet werden, das in der Lage ist, ein sbp-Mitglied vorübergehend so einzuschließen, daß das eingeschlossene sbp-Mitglied daran gehindert wird, sich an sein komplementäres sbp-Mitglied zu binden. Zum Beispiel kann die Verhinderung der Bindung aufgrund der Hemmung des Zugangs der sbp-Mitglieder zueinander stattfinden. Der Einschluß muß reversibel sein. Das Material wird gewöhnlich fein zerteilt, um seine Suspension in einem flüssigen Medium zu gestatten und für eine rasche Freisetzung des eingeschlossenen sbp-Mitglieds zu sorgen. Die Teilchen können sphärisch oder unregelmäßig geformt sein und weisen normalerweise durchschnittliche Durchmesser von 10 nm bis 500 um, gewöhnlicher 20 nm bis 2 um, häufig 100 nm bis 1 um, auf. Die Materialien sind kompatibel mit und unlöslich in dem flüssigen Medium, gewöhnlich einer wäßrigen Pufferlösung, und umfassen eine(n) unmischbare(n) Flüssigkeit, Flüssigkristall, Festkörper, ein unmischbares Gel oder dgl., worin "unmischbar" unmischbar unter den Bedingungen der Lagerung des eingeschlossenen sbp-Mitglieds, aber nicht notwendigerweise unter den Assay-Bedingungen bedeutet. Erläuternde Materialien schließen Liposomen, künstliche Zellen, Vesikel, Gele, wie z. B. Gelatine und Agarose, natürliche Zellmembranen, wie z. B. rote Blutzellen-Geister, polymerisierte Perlen und dgl. ein.
- Liposomen sind Mikrovesikel von ungefähr sphärischer Form. Die äußere Schale eines Liposoms besteht aus einer Phospholipid- Doppelschicht, die ein Volumen an Wasser oder einer wäßrigen Lösung einschließt. Liposomen mit mehr als einer Doppelschicht werden als multilamellare Vesikel bezeichnet. Liposomen mit nur einer Doppelschicht werden unilamellare Vesikel genannt. Die Doppelschicht wirkt als undurchdringliche Barriere für die Diffusion eines komplementären sbp. Die Phospholipide in der Doppelschicht können teilweise oder ganz durch andere amphiphile Verbindungen ersetzt sein, die eine gewöhnlich geladene polare Kopfgruppe und einen gewöhnlich 2 oder mehr lineare Kohlenwasserstoffketten umfassenden hydrophoben Teil aufweisen. Beispiele für Phospholipid-Substitute schließen Dicetylphosphat, Dialkoxypropylphosphate, worin die Alkylgruppen lineare Ketten mit 12-20 Kohlenstoffatomen aufweisen, N-(2,3-Di-(9- (Z)-octadecenyloxy))-prop-1-yl-N,N,N-trimethylammoniumchlorid, Sphingomyellin, Cardiolipin und dgl. ein.
- Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung müssen die Liposomen in der Lage sein, das sbp-Mitglied zu beherbergen. Im allgemeinen sind die Liposomen mindestens ungefähr 20 nm bis 2 um, gewöhnlich ungefähr 100 nm bis 1 um, vorzugsweise ungefähr 200 bis 600 nm groß. Bevorzugte Liposomen sind diejenigen von einer Größe, die leicht dispergieren, um eine einheitliche Suspension zu ergeben, die sich sehr langsam absetzt, und die groß genug sind, um eine wesentliche Menge von sbp-Mitglied einzukapseln, oder die homogen verbleiben. Die Liposomen der vorliegenden Erfindung sind im Gegensatz zu den vergangenen Verfahren so gebildet, daß die äußere Oberfläche des Lipidvesikels im wesentlichen frei von sbp-Mitgliedern ist.
- Liposomen können durch Hydratation und mechanisches Dispergieren von getrocknetem Phospholipid oder Phospholipid-Substitut in einer wäßrigen Lösung hergestellt werden. Auf diese Weise hergestellte Liposomen weisen eine Vielfalt von Abmessungen, Zusammensetzungen und Verhaltsweisen auf. Ein Verfahren zur Verringerung der Heterogenität und Inkonsistenz der Verhaltensweise von mechanisch dispergierten Liposomen geschieht durch Beschallung. Ein derartiges Verfahren verringert die durchschnittliche Liposomengröße. Alternativ ist Extrusion als letzter Schritt während der Herstellung der Liposomen verwendbar. Das US-Patent Nr. 4,529,561 offenbart ein Verfahren zum Extrudieren von Liposomen unter Druck durch eine Membran einheitlicher Porengröße, um die Größeneinheitlichkeit zu verbessern.
- Bei den Phospholipiden der vorliegenden Erfindung kann es sich um irgendein(e) Phospholipid oder Phospholipidmischung, das bzw. die in natürlichen Membranen gefunden wird, einschließlich Lecithin, handeln oder um synthetische Glycerylphosphatdiester von linearen gesättigten oder ungesättigten 12-Kohlenstoff- oder 24-Kohlenstoff- Fettsäuren, worin das Phosphat als Monoester oder als Ester eines polaren Alkohols, wie z. B. Ethanolamin, Cholin, Inosit, Serin, Glycerin und dgl., vorhanden sein kann. Besonders bevorzugte Phospholipide schließen L-α-Palmitoyloleoylphosphatidylcholin (POPC), Palmitoyloleoylphosphatidylglycerin (POPG), L-α-Dioleoylphosphatidylglycerin und L-α-(Dioleoyl)-phosphatidyIethanolamin ein.
- Das Liposom kann auch Cholesterol und dessen Derivate und eine Vielfalt von Amphiphilen in der Doppelschicht einschließen.
- Beispielhaft für bevorzugte Liposomen gemäß der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, die aus 65 bis 97 Gew.-% POPC, 3-30 Gew.-% POPG und 0-30 Gew.-% Cholesterol zusammengesetzt sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Zusammensetzung der Liposomen 67-76% POPC, 3-4% POPG und 20-30% Cholesterol.
- Wie oben aufgeführte Liposomen können durch eine Vielfalt von Verfahren hergestellt werden. Ein erläuterndes Verfahren beinhaltet das Vereinigen des Phospholipids in einer Chloroformlösung und das anschließende Entfernen des Chloroforms unter einem Stickstoffstrom. Verbleibende Spuren von Lösungsmittel können z. B. unter Verwendung von Hochvakuum entfernt werden. Das Phospholipid wird dann in einem einfrierbaren Lösungsmittel, wie z. B. t-Butanol oder Cyclohexan, unter sanftem Mischen gelöst, und die Lösung wird dann gefriergetrocknet. Das resultierende Pulver wird trocken und kalt gehalten, bis es zum Einzukapseln eines sbp-Mitglieds verwendet wird.
- Das einzukapselnde Material wird in Puffer gelöst. Erläuternde Puffer schließen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dgl. ein. Der spezielle verwendete Puffer ist nicht kritisch für diese Erfindung; jedoch kann in individuellen Verkapselungen ein Puffer gegenüber einem anderen vorgezogen werden.
- Eine Liposomen-Suspension kann hergestellt werden, indem man das Lipidpulver und das einzukapselnde Material mischt. Die Suspension wird dann mit Puffer verdünnt und durch eine Aufeinanderfolge von Filtern mit fortschreitend kleineren Poren filtriert, zum Beispiel 1,0 um, 0,6 um, 0,4 um und 0,2 um. Wiederholte Filtration durch irgendeines der Filter, und insbesondere durch das kleinste Filter, ist wünschenswert. Die Liposomen können beispielsweise durch Gelfiltration, wie z. B. durch eine Säule aus Sephacryl S-1000®, gereinigt werden. Die Säule kann mit Puffer eluiert und die Liposomen können gesammelt werden.
- In einer bevorzugten Ausführungsform ist das reversibel eingeschlossene sbp-Mitglied an ein Mitglied des signalerzeugenden Systems gebunden. In einem derartigen Fall kann das reversibel eingeschlossene Mitglied z. B. ein Konjugat eines Enzyms und eines Haptens sein, das komplementäre Mitglied, das ebenso reversibel eingeschlossen oder frei sein kann, kann z. B. Antikörper gegen das Hapten sein, und das einschließende Material kann z. B. ein Liposom sein. In denjenigen Fällen, in denen das eingeschlossene Material ein Konjugat eines Enzyms und eines Haptens ist, kann das eingekapselte Material fakultativ einen Stabilisator für das Enzym einschließen. Ein Vorteil des Einschließens des Enzyms ist es, das stabilisierende Mittel bei viel höheren Konzentrationen in das eingekapselte Material eingeschlossen werden können, als dies andernfalls in der übrigen Lösung praktisch wäre, wo sie die Assayleistung nachteilig beeinflussen könnten. Demgemäß stellt die Einkapselung eine Gelegenheit dar, um eine größere Enzymstabilität zu erreichen, als dies in einer normalen Lösung möglich wäre, wenn es Beschränkungen bezüglich der Zusammensetzung der normalen Lösung, wie z. B. Viskosität, Ionenstärke, pH und Konzentration von Enzyminhibitoren, gibt.
- Alternativ kann das reversibel eingeschlossene Mitglied ein unmarkiertes sbp-Mitglied sein, z. B. ein Antikörper, und das komplementäre Mitglied kann ein Konjugat eines Markers, wie z. B. eines Enzyms, und eines sbp-Mitglieds, wie z. B. eines Haptens, sein.
- Wenn das Material zum reversiblen Einschließen des sbp-Mitglieds ein roter Blutzellen-Geist ist, kann das sbp-Mitglied gemäß bekannten Verfahren in die Zellen inkorporiert werden, wie z. B. denjenigen, die in Method in Enzymology, Band XXXI, Hrsg. S. Fleischer und L. Packer, Seiten 172-180, Acad. Press (1974) beschrieben werden.
- Mittel zum Aufheben des Einschlusses -- Ein sbp-Mitglied ist reversibel eingeschlossen, wenn es nicht in der Lage ist, unter Bedingungen, bei denen die zwei sbp-Mitglieder in dem gleichen flüssigen Medium aufbewahrt sind, mit seinem komplementären sbp zu reagieren, aber durch Zugabe eines Mittels zum Aufheben des Einschlusses in die Lage versetzt wird, mit seinem komplementären sbp- Mitglied zu reagieren. Irgendeine chemische Verbindung, Zusammensetzung oder irgendein Material, entweder natürlich vorkommend oder synthetisch, organisch oder anorganisch, oder irgendein physikalisches Mittel oder eine Kombination derselben oder irgendein enzymatisches Verfahren oder lytisches Proteinmaterial kann verwendet werden, welche(s) in der Lage ist, den Einschluß des vorübergehend eingeschlossenen sbp-Mitglieds aufzuheben, vorausgesetzt, daß es (sie) nicht wesentlich die Assay-Leistung stört. Das Mittel zum Aufheben des Einschlusses hängt von dem verwendeten Material zum reversiblen Einschluß des sbp-Mitglieds ab.
- Beispielhafte chemische Verbindungen, Zusammensetzungen oder Materialien zum Aufheben des Einschlusses innerhalb Liposomen und Zellmembranen schließen Detergentien, einschließlich Triton, Natriumdesoxycholat, Octylglucosid, Natriumdodecylsulfat und dgl., ein. Einschluß durch Phospholipidliposomen und -zellmembranen kann durch Polypeptide, wie z. B. Melittin, Enzyme, wie z. B. Phospholipase, mehrfach geladene Metallionen, wie z. B. Cu&spplus;&spplus; und Mg&spplus;&spplus;, aufgehoben werden. Zellmembranen setzen ihre Inhalte durch osmotischen Schock frei. Liposomen, Zellmembranen und Gele können ihren Inhalt durch Beschallung oder durch thermische Veränderungen, gewöhnlich Erwärmen, freisetzen. Calciumalginat bildet ein Gel, das durch Mittel gelöst wird, die Calciumionen chelatisieren, wie z. B. EDTA. Die obigen Materialien und ihre Herstellung oder Isolierung sind im Stand der Technik wohlbekannt, und viele sind im Handel erhältlich.
- Erläuternde physikalische Mittel zum Aufheben des Einschlusses schließen Wechsel in der Temperatur, einschließlich Einfrieren und Auftauen, Beschallung und osmotischen Schock ein.
- Wie zuvor angegeben, ist an der vorliegenden Erfindung ein einziges flüssiges Reagenz und seine Verwendung in Assays beteiligt. Die Assays können homogen oder heterogen sein und können einen Marker, der katalytisch, chromophor, radioaktiv usw. ist, einschließen. Das einzige flüssige Reagenz der vorliegenden Erfindung ist insbesondere bei dem Verfahren, das im US-Patent Nr. 3,817,837 beschrieben wird, nützlich. Andere Verfahren, in denen das vorliegende Reagenz verwendet werden kann, schließen beispielsweise diejenigen ein, die in "Enzyme-Immunoassay", von Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980, und in den US-Patenten Nr. 3,690,834; 3,791,932; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; und 4,098,876 beschrieben werden.
- Das Verfahren der Erfindung umfaßt im allgemeinen das Vereinigen einer Probe, von der man annimmt, daß sie einen Analyten enthält, mit einer Zusammensetzung, die in einem einzigen flüssigen Medium (1) ein sbp-Mitglied, das reversibel in einem Material eingeschlossen ist, welches das sbp-Mitglied vorübergehend unfähig macht, sich mit seinem komplementären sbp-Mitglied zu verbinden, eingeschlossen ist, und (2) das komplementäre sbp-Mitglied, das frei im flüssigen Medium vorliegt, umfaßt. Mindestens eines der sbp- Mitglieder ist an ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems gebunden. Die reversibel eingeschlossene Substanz ist häufig ein markiertes sbp-Mitglied, wie z. B. ein Enzym/Arzneimittel- bzw. Drogen-Konjugat. In einem derartigen Fall ist das nicht-eingeschlossene sbp-Mitglied das komplementäre sbp-Mitglied, wie z. B. ein Antikörper gegen das Arzneimittel/die Droge. Wegen der Permeabilitätsbarriere, die durch das Material dargestellt wird, welches das reversibel eingeschlossene sbp-Mitglied einkapselt, kann das komplementäre sbp-Mitglied nicht mit dem eingeschlossenen Mitglied reagieren.
- Beim Durchführen des Assay-Verfahrens wird eine vorbestimmte Menge einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, gemessen. Die Menge an Probe wird im allgemeinen so gewählt, daß sie einen genauen und empfindlichen Assay für den Analyten zur Folge hat. Im allgemeinen liegt das Volumen für viele Arzneimittel/Drogen in physiologischer Flüssigkeit im Bereich von ungefähr 1,0 bis 500 ul, gewöhnlich ungefähr 5 bis 100 ul. Abhängig von der Natur der Probe und dem anfänglichen Volumen kann die Probe mit einem geeigneten Volumen an destilliertem oder entionisiertem Wasser oder Puffer verdünnt werden. Normalerweise wird die Probe mit der flüssigen Reagenzzusammensetzung der Erfindung vereinigt, und anschließend wird ein Mittel zum Aufheben des Einschlusses bereitgestellt. Die Menge an verwendetem flüssigen Reagenz hängt von der Menge der Verdünnung der Probe, die erforderlich ist, um nichtspezifische Störeinflüsse von Probenkomponenten zu vermeiden, dem Konzentrationsbereich des Analyten und der Berücksichtigung von Faktoren, wie z. B. dem optimalen Volumen für genaue Flüssigkeitsmessungen und eine spektrometrische Bestimmung, ab. Gewöhnlich beträgt die Menge an flüssigem Reagenz 5 ul bis 3 ml, häufig 25 ul bis 1 ml. Das Endvolumen der Kombination beträgt ungefähr 5 ul bis 3 ml, gewöhnlich ungefähr 50 bis 500 u1. Wie oben erwähnt ist mindestens ein Mitglied des signalerzeugenden Systems an eines der sbp-Mitglieder gebunden. In dem Verfahren kann das Medium auch zusätzliche Mitglieder des signalerzeugenden Systems enthalten, die ursprünglich getrennt von oder innerhalb des eingeschlossenen Materials oder auf beiden Wegen vorliegen können. Die Konzentration der verschiedenen Mitglieder des signalerzeugenden Systems variiert und ist vom Konzentrationsbereich des interessierenden Analyten abhängig.
- Die verwendete Menge des Mittels zum Aufheben des Einschlusses hängt von der Natur und der Menge des Materials zum reversiblen Einschließen des sbp-Mitglieds, der Natur des Freisetzungsmittels und der gewünschten Freisetzungsgeschwindigkeit ab. Wenn ein chemisches Freisetzungsmittel oder eine Kombination von chemischen Mitteln verwendet wird, sollte die Konzentration des Mittels oder der Mittel ausreichend sein, um eine beträchtliche oder vollständige Freisetzung des eingeschlossenen sbp-Mitglieds innerhalb der gewünschten Zeit zum Ergebnis zu haben. Im allgemeinen ist es bequem, eine vollständige Freisetzung in weniger als 5 Minuten, vorzugsweise weniger als 1 Minute, bevorzugter in weniger als 15 Sekunden, zu verursachen. Häufig findet die Freisetzung im wesentlichen unmittelbar nach dem Bereitstellen des Mittels zum Aufheben des Einschlusses statt.
- Wenn Detergentien als Mittel zum Aufheben des Einschlusses verwendet werden, werden die Menge und Zusammensetzung des Detergens empirisch ausgewählt, um die Menge an freigesetztem sbp-Mitglied zu maximieren und die Freisetzungszeit zu minimieren. Wenn Enzyme oder Proteinreagenzien verwendet werden, sind die Kosten und Erhältlichkeit dieser Reagenzien wichtige Faktoren bei der Bestimmung, wieviel dieser Reagenzien verwendet werden kann. Im allgemeinen ist das Freisetzungsverfahren umso schneller und vollständiger, je mehr von diesen Reagenzien verwendet wird. Bei diesen und anderen Mitteln zum Aufheben des Einschlusses stellt die Notwendigkeit, jegliche abträglichen Einflüsse auf die Assay-Komponenten oder das Assayergebnis zu vermeiden, eine Beschränkung hinsichtlich der Menge des Reagenz, wenn es chemisch ist, und der Größe des Verfahrens, wenn es physikalisch ist, dar. Es ist wichtig, das (die) Freisetzungsmittel unter Berücksichtigung der Natur des einkapselnden Materials und der sbp-Mitglieder zu wählen, um einen Schaden für das sbp- Mitglied und sein komplementäres Mitglied nach der Freisetzung des sbp-Mitglieds aus der Einkapselung zu minimieren oder zu vermeiden.
- Nachdem die Probe, die den Analyten enthält, mit dem flüssigen Medium vereinigt worden ist und das Mittel zur Umkehrung des Einschlusses des eingeschlossenen sbp-Mitglieds bereitgestellt worden ist, wird das flüssige Medium über einen Zeitraum, der für das Stattfinden der Bindung ausreicht, gehalten. Normalerweise erfordert dies mindestens ungefähr 5 Sekunden bis ungefähr 30 Minuten, und gewöhnlicher ungefähr 10 Sekunden bis 5 Minuten. Danach wird die erste Ablesung eines nachweisbaren Signals vorgenommen. Alle weiteren Ablesungen werden normalerweise ungefähr 30 Sekunden bis 60 Minuten nach der Zeit des Mischens vorgenommen.
- Es werden normalerweise gemäßigte Temperaturen für die Durchführung des Verfahrens und gewöhnlich konstante Temperaturen während des Zeitraums für die Durchführung des Verfahrens verwendet. Im allgemeinen liegt die Temperatur für das Verfahren im Bereich von ungefähr 0 bis 50ºC, gewöhnlicher von ungefähr 15 bis 40ºC. Nachdem die Aufhebung der Einkapselung des sbp-Mitglieds bewerkstelligt ist, wird eine Temperatur, die die Bindung des sbp-Mitglieds und seines komplementären Mitglieds fördert, gewählt. Wiederum werden im allgemeinen gemäßigte Temperaturen und gewöhnlich konstante Temperaturen für die Durchführung eines Assays verwendet. Die Temperaturen für die Bestimmung liegen im allgemeinen im Bereich von ungefähr 10 bis 50ºC, gewöhnlicher von 15 bis 40ºC.
- Bei der Durchführung des Verfahrens liegt der pH für das Medium gewöhnlich im Bereich von 2 bis 12, gewöhnlicher im Bereich von ungefähr 5 bis 10 und vorzugsweise im Bereich von ungefähr 6 bis 9. Der pH wird so gewählt, daß er die Aufhebung des Einschlusses verhindert, die Stabilität der Reagenzien kontrolliert und unerwünschte Reaktionen während der Lagerung verhindert. Wenn der pH des Mediums für die Durchführung des Assays nicht geeignet ist, wird vor oder gleichzeitig mit der Zugabe des Mittels zur Freisetzung ein geeigneter Puffer zum Medium dazugegeben, um für einen pH zu sorgen, der es gestattet, daß der Assay durchgeführt wird. Verschiedene Puffer können verwendet werden, um den gewünschten pH zu erreichen und den pH während der Bestimmung aufrechtzuerhalten. Der spezielle verwendete Puffer ist nicht kritisch für diese Erfindung, aber in individuellen Assays kann ein Puffer gegenüber einem anderen vorgezogen werden. Erläuternde Puffer schließen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dgl. ein.
- Zusätzlich zur Durchführung eines Assays für den Analyten ist es normalerweise wünschenswert, Assays mit einem oder mehreren Kalibratoren durchzuführen, wodurch man entweder einen einzigen Wert oder eine Mehrzahl von Werten bei verschiedenen Konzentrationen erhalten und die Konzentration von Analyt gegen beobachtete Werte aufzeichnen würde, um eine Standardkurve zu erhalten. Keine spezielle Temperaturkontrolle ist erforderlich, solange die Kalibratoren und die Analyten-Assaybestimmungen unter im wesentlichen ähnlichen Umgebungsbedingungen durchgeführt werden.
- Das vorliegende Verfahren weist spezielle Vorteile für automatisierte Assay-Verfahren auf, indem es einen Weg bereitstellt, ein einziges flüssiges Reagenz bereitzustellen, das sowohl ein sbp- Mitglied als auch sein komplementäres Mitglied enthält, von denen mindestens eines an ein signalerzeugendes System gebunden ist. Die vorliegende Erfindung macht es unnötig, vor der Durchführung des Assays getrennte flüssige Reagenzien in den korrekten Anteilen abzumessen und zu mischen oder feste Reagenzien wieder in Lösung zu bringen.
- Ein erläuterndes Verfahren zur Durchführung eines Assays, für den das einzige flüssige Reagenz der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist im US-Patent Nr. 3,817,837 offenbart. Das reversibel eingeschlossene Material kann ein Enzym-Hapten-Konjugat sein, wie z. B. Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Theophyllin; das nicht eingeschlossene komplementäre Mitglied kann Antikörper gegen den Analyten sein, z. B. Anti-Theophyllin, und das einschließende Material kann ein Liposom sein. Die einzige Formulierung und der Analyt werden vereinigt.
- In einem derartigen Verfahren wird das Assay-Protokoll mit der Anwendung eines Mittels zum Aufheben des Einschlusses des Enzymkonjugats begonnen. Demgemäß kann ein Detergenz, wie z. B. TRITON X- 100® oder Natriumdesoxycholat, oder ein Polypeptid, wie z. B.
- Melittin, dem flüssigen Medium zugesetzt werden. Alternativ kann ein physikalisches Mittel, einschließlich eines Wechsels in der Temperatur, Beschallung oder osmotischen Schocks, verwendet werden.
- Nachdem der vorübergehende Einschluß der einzigen flüssigen Formulierung, die das im Liposom eingeschlossene Enzym-Hapten- Konjugat und den Antikörper enthält, aufgehoben ist und irgendwelche zusätzliche Reagenzien des signalerzeugenden Systems, wie z. B. Enzymsubstrate, hinzugefügt sind, wird die enzymatische Aktivität des Assaymediums bestimmt und zur Konzentration des Analyten im Medium in Beziehung gesetzt. Das Enzym-Hapten-Konjugat und der Analyt konkurrieren um den Antikörper. Da die enzymatische Aktivität geändert, gewöhnlich verringert oder gehemmt wird, wenn sich das Enzym-Hapten-Konjugat an den Antikörper bindet, steht die enzymatische Aktivität der Lösung in direkter Beziehung zu der Menge an Analyt, der im Assaymedium anwesend ist. Vorzugsweise werden das Enzym und Enzymsubstrat so ausgewählt, daß entweder das Substrat oder das Endprodukt im ultravioletten oder sichtbaren Bereich absorbiert oder fluoresziert. Deshalb kann man nach Aufheben des Einschlusses des einzigen flüssigen Testreagenz dieser Erfindung in der wäßrigen Lösung, die den Analyten enthält, die Analytenkonzentration durch Messen der Absorption oder Emission von Licht bestimmen.
- Die Erfindung umfaßt weiter eine vorformulierte Zusammensetzung, die in einem flüssigen Medium (a) ein sbp-Mitglied, das reversibel in einem Material eingeschlossen ist, was das sbp-Mitglied vorübergehend unfähig macht, sich mit seinem komplementären sbp- Mitglied zu verbinden, und (b) das komplementäre sbp-Mitglied, das frei in dem flüssigen Medium vorliegt, umfaßt. Mindestens eines der sbp-Mitglieder ist an ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems gebunden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das reversibel eingeschlossene sbp-Mitglied an ein Mitglied eines signalerzeugenden Systems gebunden. Alternativ kann das komplementäre sbp-Mitglied an ein Mitglied des signalerzeugenden Systems gebunden sein.
- Die Zusammensetzung des einkapselnden Materials kann in weitem Bereich variieren. Vorzugsweise ist das einkapselnde Material ein Liposom. Das Liposom ist vorzugsweise aus Phospholipiden oder Phospholipid-Mischungen, die in natürlichen Membranen gefunden werden, einschließlich Lecithin, oder synthetischen Glycerylphosphatdiestern von linearen gesättigten oder ungesättigten 12- bis 24- Kohlenstoff-Fettsäuren aufgebaut, worin das Phosphat als Monoester oder als Ester eines polaren Alkohols, wie z. B. Ethanolamin, Cholin, Inosit, Serin, Glycerin und dgl., vorliegt. Besonders bevorzugte Phospholipide schließen L-α-Palmitoyloleoylphosphatidylcholin (POPC), L-α-Palmitoyloleoylphosphatidylglycerin (POPG), L-α- Dioleoylphosphatidylglycerin und L-α-(Dioleoyl)phosphatidyIethanolamin ein. Phospholipid-Substitute können ebenso verwendet werden. Andere amphiphile Verbindungen weisen gewöhnlich geladene polare Kopfgruppen und einen gewöhnlich zwei oder mehr lineare Kohlenwasserstoffketten umfassenden hydrophoben Teil auf. Beispiele für Phospholipid-Substitute schließen Dicetylphosphat, Dialkoxypropylphosphate, worin die Alkylgruppen lineare Ketten mit 12-20 Kohlenstoffatomen aufweisen, DOTMA, Sphingomyelin, Cardiolipin und dgl. ein. Das Lipidmaterial kann auch Cholesterin und dessen Derivate einschließen u In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zusammensetzung der Liposomen 67-97% POPC, 3-30% POPG und 0-30% Cholesterol. Erläuternd für ein derartiges Liposom ist 67% POPC, 4% POPG und 29% Cholesterol. Ein anderes Beispiel ist 70% POPC und 30% POPG. Ein weiteres Beispiel ist 76% POPC, 4% POPG und 20% Cholesterol.
- In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das reversibel eingeschlossene Mitglied ein Konjugat eines Enzyms und eines Haptens, das komplementäre Mitglied ist Antikörper gegen das Hapten, und das einschließende Material ist ein Liposom. Eine derartige Zusammensetzung kann weiter Stabilisatoren, andere Mitglieder des signalerzeugenden Systems, einschließlich des Enzymsubstrats, umfassen. In einem derartigen Fall kann das reversibel eingeschlossene Mitglied Glucose-6-phosphatdehydrogenase- Theophyllin und das komplementäre Mitglied Anti-Theophyllin sein.
- Alternativ ist das reversibel eingeschlossene Mitglied Antikörper, das komplementäre Mitglied ist ein Konjugat eines Enzyms und eines Haptens, und das einschließende Material ist ein Liposom.
- Aus Bequemlichkeitsgründen können die Reagenzien zur Durchführung eines Assays in einem Testsatz in abgepackter Kombination in vorbestimmten Mengen zur Verwendung bei der Durchführung eines Assays für einen Analyten bereitgestellt werden. Der Testsatz kann (a) eine vorformulierte Zusammensetzung, die ein sbp-Mitglied umfaßt, das reversibel in ein Material eingeschlossen ist, welches das sbp-Mitglied vorübergehend unfähig zur Bindung mit seinem komplementären sbp-Mitglied macht, und das komplementäre sbp- Mitglied und (b) ein Reagenz zum Aufheben des Einschlusses des eingeschlossenen sbp-Mitglieds umfassen. Mindestens eines der sbp- Mitglieder ist an ein Mitglied einer signalerzeugenden Gruppe gebunden. Der Testsatz kann auch Reagenzien zur Erzeugung eines Signals in Beziehung zur Menge an Analyt in der Probe enthalten. Ergänzende Mittel können wie benötigt eingeschlossen sein.
- Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung gegeben.
- Alle Temperaturen sind in Grad Celsius, falls nicht anders angegeben. Prozente und Teile sind, falls nicht anders angegeben, Gewichtsprozente und -teile, außer bei Mischungen von Flüssigkeiten, bei denen es sich um Volumenprozente bzw. -teile handelt.
- Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:
- G6PDH - Glucose-6-phosphatdehydrogenase; POPC - Palmitoyloleoylphosphatidylcholin; POPG - Palmitoyloleoylphosphatidylglycerin; RSA - Kaninchenserumalbumin; BSA - Rinderserumalbumin; G6P - Glucose-6- phosphat; NAD - Nicotinamidadenindinukleotid; Triton - Triton X- 100®; Puffer - 0,055M Tris-Cl, pH 8, enthaltend 0,05% Natriumazid;
- 1 Eu = 0,003 ΔA/1cm/34nm.
- Liposomencharakterisierung und -herstellung Enzym und Enzym-Hapten-Konjugate wurden vor der Einkapselung auf 5 mg/ml konzentriert. Antikörper wurde unverdünnt verwendet. Alle Proteine wurden vor der Einkapselung gegen Puffer dialysiert.
- Die Lipide wurden in einem Glasröhrchen in Chloroformlösung zusammengegeben. Chloroform wurde unter einem sanften Stickstoffstrom entfernt. Spuren von Lösungsmittel wurden über mehr als 4 Stunden unter Hochvakuum entfernt. Das Lipid wurde dann bei 600 unter sanftem Rühren zu 30 mg/ml in t-Butanol gelöst. Die Butanollösung wurde gefriergetrocknet, um ein voluminöses, flauschiges Pulver zu ergeben, das trocken und kalt (-20ºC) gehalten wurde, bis es verwendet wurde.
- Verfahren 1. Proteinlösung (1 ml pro 100 mg Phospholipid) wurde bei Umgebungstemperatur zum Lipid gegeben und durch Schütteln (vortex) gemischt. Ein Volumenpuffer, das zweimal denjenigen des Proteins gleich war, wurde dazugegeben, und die Suspension wurde wieder schüttel-gemischt (vortex mixed), um eine dicke, milchige Suspension von Liposomen ohne unsuspendiertes Lipid oder Klumpen zu ergeben. Die Suspension wurde dann mit Puffer auf das 20-fache des ursprünglichen Proteinvolumens verdünnt. Liposomen wurden durch Zentrifugieren bei 15K U/min über 20 Minuten bei 40 gesammelt. Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt und zur Bestimmung von uneingekapseltem Protein aufbewahrt. Das Liposomenpellet wurde kurz nach der Zentrifugation vom Überstand abgetrennt. Die Liposomen wurden zweimal mit einem Puffer, der das 20-fache des Volumens des ursprünglichen Proteinvolumens aufwies, gewaschen. Danach wurden die Liposomen durch Schütteln resuspendiert. Die Liposomen wurden durch Zentrifugieren wieder pelletiert, und der Überstand wurde entfernt. Die gewaschenen Liposomen wurden im 20-fachen des ursprünglichen Proteinvolumens suspendiert.
- Protein wurde in Puffer (pH 7) gelöst. Eine Liposomen-Suspension wurde durch Schüttelmischen (vortex mixing) des Lipidpulvers und Proteins hergestellt. Die ungereinigte Suspension wurde mit einem Volumen Puffer verdünnt und durch eine Reihenfolge von Nucleopore-Polycarbonatfiltern mit fortschreitend kleineren Poren (1,0 um, 0,6 um, 0,4 um und 0,2 um) filtriert. Die Filtration durch den 0,2 um-Filter wurde dreimal wiederholt. Die Membran wurde an einer von Hand betriebenen Spritze befestigt, um die Filtration zu bewirken. Ein Filter von 13 mm Durchmesser wurde verwendet. Während der Filtration wurden die Lichtstreuungseigenschaften der Liposomen sichtbar geändert, was ihre verringerte Größe widerspiegelte Schließlich wurden die kleinen Liposomen durch Gelfiltration über eine 30 · 1,5 cm-Säule aus Sephacryl S-1000® gereinigt. Die Säule wurde mit Puffer bei 30 ml/Stunde eluiert, und Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt. Die Liposomen traten als asymmetrischer Peak mit einem lange nachschleppenden Rand, der dem Peak des uneingekapselten Proteins voranging, aus. Fraktionen wurden mit und ohne Triton X-100® einem Assay unterzogen. Liposomen wurden zusammengegeben ("pooled"), um jegliches uneingekapselte Protein auszuschließen.
- Es ist ein wichtiges Merkmal von Verfahren 2, daß die Membranfiltration in Gegenwart von unverdünntem Protein stattfindet, so daß, wenn die Liposomen brechen, kein Nettoverlust an eingekapseltem Protein auftritt.
- Als Liposomen, die ein Theophyllin-G6PDH-Konjugat einkapselten, durch das Verfahren 1 hergestellt wurden, war die Enzymaktivität wie folgt:
- % an Input-Aktivität
- ungereinigtes Liposomenpräparat 98, 7
- eingekapselt in Liposomen 28,4
- uneingekapselt 70,1
- Zurückgewinnung (eingekapselt + uneingekapselt) nach Reinigung der Liposomen 98,5
- Enzymlatenz in Liposomen 99%
- Das Durchführen der Herstellung der Liposomen verursachte einen sehr geringen Verlust an Aktivität. Fast das gesamte Enzym wurde in den gereinigten Liposomen und dem ursprünglichen Liposomenüberstand zurückgewonnen. Ungefähr ein Drittel der Aktivität war in nichtleckenden Liposomen eingekapselt. Ergebnisse mit anderen Enzymkonjugaten waren ähnlich.
- Verfahren 1 ist sowohl auf G6PDH-Hapten-Konjugate als auch auf Antikörper anwendbar. Es wurde verwendet, um natives G6PDH und seine Digoxin-, Theophyllin-, Chinidin- und Thyroxin-Konjugate mit vergleichbaren Graden an Einkapselung und Latenz einzukapseln. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper und ein Komplex von Enzym und Antikörper (Anti-Enzym) wurden ebenfalls eingekapselt.
- Theophyllin-G6PDH wurde in Liposomen (POPC, 67%; POPG, 4%; Cholesterol, 29%) wie in Verfahren 1 oben eingekapselt und in Puffer (25 mg Lipid/ml) suspendiert. G6P (0,13 M), NAD (0,08M) und RSA (20 mg/ml) in Puffer (pH 4,7) wurden als Substrat hergestellt. Eingekapseltes Enzym (50 ul) und Substrat (50 ul) wurden mit und ohne Zugabe von Triton (5%) mit 0,8 ml Puffer gemischt. ΔA&sub3;&sub4;&sub0; bei 30º wurde über 30 Sekunden in einer temperaturgeregelten Zelle aufgenommen, wobei man begann, als die Temperatur erreicht war. In der Abwesenheit von Triton zeigten die Enzym-haltigen Liposomen im wesentlichen keine Aktivität (weniger als 1%) auf. In Gegenwart von Triton war der größte Teil des eingekapselten Enzyms innerhalb von 30 Sekunden freigesetzt.
- Die in Beispiel 1 oben hergestellte Lipidzusammensetzung wurde in einem Assay für Digoxin verwendet. Der Assay verwendete die folgenden Reagenzien:
- Reagenz: Digoxin-G6PDH, eingekapselt in Liposomen (POPC 70%, POPG 30%) (0,49 mg Lipid/ml), Anti-Digoxin, optimiert für die Antwort, 0,13M G6P, RSA (20 mg/ml) in Puffer Verdünnungsmittel:0,5% Triton, 4 mM NAD, 5 mM NaN&sub3;, 0,005% Thimerosal, pH 4,4
- Protokoll: 50 ul des Reagenz wurden in einen Verdünner aufgezogen und mit 200 u1 Puffer, der RSA (1 mg/ml) enthielt, in einen 1 ml Croan-Becher eingefüllt. Eine 50 ul Aliquote der Probe wurde aufgezogen und mit 700 ul Verdünnungsmittel im Croan®-Becher dispergiert. Unmittelbar nach Probenzugabe wurde die gesamte Probe in eine Durchflußzelle angesaugt, und Ablesungen wurden bei 300 über 30 Sekunden vorgenommen. Die Ergebnisse werden in EMIT-Assayeinheiten (EU) in Tabelle 2 wiedergegeben. TABELLE 2 Digoxin zwei Reagenzien einziges Reagenz
- Genügend Anti-Digoxin Antikörper war anwesend, um eine 46%-ige Hemmung von Digoxin-G6PDH zu verursachen, aber es trat keine Hemmung auf, bis Triton hinzugefügt war.
- Als Vergleich mit dem Assay, der ein einziges flüssiges Reagenz verwendet, wurde ein Assay unter Verwendung von uneingekapseltem Enzym-Konjugat und Antikörper in getrennten flüssigen Reagenzien durchgeführt. Die Reagenzmengen und das Endvolumen des Assays wurden so eingestellt, daß sie identisch mit denjenigen in dem Einzelreagenz-Assay oben in Beispiel 3 waren.
- Der Assay verwendete die folgenden Reagenzien:
- Reagenz A: Digoxin-G6PDH (Konz. festgelegt, um die gleiche Geschwindigkeit zu ergeben, d. h. wenn kein Anti-Digoxin, wie in Beispiel 4 oben), 0,13M G6P, RSA (20 mg/ml) in Puffer
- Reagenz B: Anti-Digoxin (Konz. festgelegt, um die gleiche Endmenge wie in Beispiel 4 oben zu ergeben), 0,13M G6P, RSA (20 mg/ml) in Puffer
- Protokoll: 50 u1 Reagenz A wurden in einen Verdünner aufgezogen und mit 100 ul Puffer, der RSA (1 mg/ml) enthielt, in einem Croan®- Becher suspendiert. Eine 50 ul-Aliquote der Probe wurde mit 100 ul Puffer, der RSA (1 mg/ml) enthielt, verdünnt und in den Croan®- Becher gegeben. 25 u1 Reagenz B wurden in einen Verdünner aufgezogen und mit 700 u1 Puffer in den Croan®-Becher eingefüllt. Unmittelbar danach wurde die Probe wie in Beispiel 4 oben einem Assay unterzogen. Die Ergebnisse werden in EMIT-Assayeinheiten in Tabelle 2 wiedergegeben.
- Theophyllin-G6PDH wurde in Liposomen (POPC 76%, POPG 4% und Cholesterol 20%) eingekapselt und in einem Assay für Theophyllin verwendet. Der Assay verwendete die folgenden Reagenzien:
- Reagenz: Theophyllin-G6PDH, eingekapselt in Liposom (POPC 76%, POPG 4%, Cholesterol 20%), 0,86 ug/ml monoklonales Anti-Theophyllin, 3,0 mM NAD und BSA (2 mg/ml) in Puffer
- Verdünnungsmittel:2,5% Triton, 2% Natriumdesoxycholat, 3 mM 6P, 1 mg/ml BSA, 50 mM NaN&sub3;.
- Protokoll: 0,3 ml des Reagenz wurden in einen Croan®-Becher eingefüllt. Eine 8,3 ul-Serumprobe wurde in einem Verdünner aufgezogen und zusammen mit 0,6 ml Verdünnungsmittel in den Croan®- Becher eingefüllt.
- Unmittelbar nach der Probenzugabe wurde die gesamte Probe in eine Durchflußzelle gesaugt, und die Enzymaktivität wurde bei 30º gemessen (15 Sekunden Verzögerung, 30 Sekunden abgelesen). Die Ergebnisse werden in EMIT-Assayeinheiten in Tabelle 5 wiedergegeben.
- Theophyllin (ug/ml) einziges Reagenz (EU) 0 310
- 2,5 356
- 5 394
- 10 455
- 20 537
- 40 610
- Anti-G6PDH wurde in Liposom eingekapselt. Die Liposomen- Zusammensetzung war L-α-Dioleoyllecithin (70%) und L-α-Dioleoylphosphatidylglycerin (30%).
- Enzym:G6PDH, gelöst in Puffer, der RSA (1 mg/ml) enthielt
- eingekapselter Antikörper:Anti-G6PDH, in Liposomen (70% L-α- (Dioleoyl)lecithin und 30% L-α-Dioleoylphosphatidylglycerin), suspendiert in Puffer, der RSA (1 mg/ml) enthielt
- freier Antikörper:Anti-G6PDH, in Puffer, der RSA (1 mg/ml) enthielt
- Substrat: 0,13M G6P, 0,08M NAD und RSA (20 mg/ml) in Puffer (pH 4,7)
- Protokoll: 50 u1 Enzym (270 ng) wurden mit 50 u1 freiem oder eingekapseltem Antikörper und 0,6 ml Puffer, der (1 mg/ml) enthielt, mit oder ohne 5% Triton gemischt. Nach 1 Stunde bei Umgebungstemperatur wurden 50 u1 Substrat zusammen mit 0,3 ml Puffer dazugegeben. Der Assay wurde wie in Beispiel 2 oben abgelesen und das Ergebnis wird in EMIT-Assayeinheiten (EU) in Tabelle 7 wiedergegeben. TABELLE 7 Antikörper Triton EMIT-Einheiten% Hemmung abwesend frei¹ eingekapselt² 1) 7 nl unverdünnte γ-Globulin-Fraktion 2) 9,3 ug Lipid
- Die Daten zeigten, daß eingekapselter Antikörper das Enzym viel weniger als die gleiche Menge uneingekapselter Antikörper hemmte. Triton, das hinzugefügt wurde, um eingekapselten Antikörper freizusetzen, beeinträchtigte weder die Enzymaktivität noch das Ausmaß der Enzymhemmung durch Antikörper. Der eingekapselte Antikörper, gemischt mit Enzym, verursachte in der kurzen Assayzeit eine 57%-ige Hemmung, wenn Triton hinzugefügt wurde, aber verursachte in Abwesenheit von Triton in 1 Stunde nur eine 6%-ige Hemmung.
- Theophyllin-G6PDH wurde in Liposomen (POPC, 58%; POPG, 25%; und Cholesterol, 17%) eingekapselt und zu 5 mg Lipid/ml in Puffer suspendiert. TABELLE 9 Additiv Behandlung zurückgewonnene Aktivität % Enzym-Akt. uneingekaps. % Akt. Freisetzung RSA (45 mg/ml) in Puffer Wasser Triton Einfrieren/Auftauen Beschallen
- 1 ml des eingekapselten Theophyllin-G6PDH wurde mit dem Additiv gemischt und den wie in Tabelle 9 gezeigten Behandlungen unterzogen. Danach wurden 0,1 ml- Aliquoten mit 0,9 ml Puffer, der RSA (1 mg/ml) enthielt, verdünnt. 50 ul-Aliquoten der verdünnten Proben wurden wie in Beispiel 4 mit oder ohne 2% Triton einem Assay unterzogen. Der Teil an zurückgewonnener Enzymaktivität und der Teil, der nach Behandlung uneingekapselt war, wurden dann berechnet und sind in Tabelle 9 dargestellt.
- Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die schnelle, einfache Tests zur Bestimmung einer großen Vielfalt von Analyten gestatten. Das einzige flüssige Reagenz sorgt für einen hohen Grad an Verläßlichkeit und Genauigkeit und kann leicht durch Personal mit einem geringen Fertigkeits- und/oder Trainingsgrad benutzt werden. Es ist kein Bedarf vorhanden, ein Pulver aufzulösen, und kein Bedarf, verschiedene Reagenzien zu mischen, um genaue Anteile zu erhalten. Herkömmliche Ausrüstung kann verwendet werden, und 2 Tests können gleichzeitig durchgeführt werden, z. B. eine Kontrolle und die Probe, so daß die Bedingungen für die zwei Assaymedien die gleichen sind.
Claims (16)
1. Assayverfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer
Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten
enthält, worin der Analyt ein Mitglied eines aus Ligand und
seinem komplementären Rezeptor bestehenden spezifischen
Bindungspaares (sbp) ist und worin ein Signal-erzeugendes
System verwendet wird, welches ein nachweisbares Signal
in Beziehung zu der Menge an Analyt in der Probe
bereitstellt, wobei der Assay die Schritte umfaßt von:
a) Zusammengeben einer Probe, von der vermutet
wird, daß sie einen Analyten enthält, mit einer
vorformulierten, einzigen, flüssigen Zusammensetzung, die in
einem einzigen flüssigen Medium (1) ein sbp-Mitglied,
das reversibel in einem Material eingeschlossen ist,
welches das sbp-Mitglied vorübergehend unfähig macht,
sich mit seinem komplementären sbp-Mitglied zu verbinden,
und (2) das komplementäre sbp-Mitglied frei in dem
flüssigen Medium umfaßt, worin mindestens eines der sbp-
Mitglieder an ein Mitglied eines Signal-erzeugenden
Systems gebunden ist; und
b) Bereitstellen von Mitteln zum Aufheben des
Einschlusses des sbp-Mitglieds in dem Material; und
c) Messen eines Signals, das in Beziehung zu der
Menge an Analyt in der Probe erzeugt wurde.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Mitglied des
Signalerzeugenden Systems ausgewählt ist aus Enzymen,
Co-Enzymen, Fluoreszenzfarbstoffen, Farbstoffen, Substraten,
Chemilumineszenzfarbstoffen und Co-Faktoren,
vorzugsweise, worin das Enzym Glucose-6-phosphatdehydrogenase ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der
Analyt aus Antigenen und Antikörpern ausgewählt ist.
4. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche,
worin der Analyt ausgewählt ist aus Arzneimitteln/Drogen,
Proteinen, Polypeptiden, Nukleinsäuren und
Polysacchariden, vorzugsweise, worin die Arzneimittel/Drogen aus
Theophyllin, Thyroxin und Digoxin ausgewählt sind.
5. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche,
worin das Mittel zum Aufheben des Einschlusses des sbp-
Mitglieds ein chemisches Mittel, ausgewählt aus
Detergentien, Komplement und anderen Polypeptiden und
organischen Lösungsmitteln; oder ein physikalisches Mittel,
ausgewählt aus einem Temperaturwechsel, Beschallung und
osmotischem Schock; oder eine Kombination eines
chemischen und eines physikalischen Mittels ist.
6. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche,
worin das Material ein natürlich vorkommendes Material,
vorzugsweise rote Blutzellen-Geisterteilchen, oder ein
synthetisches Material, vorzugsweise ein Liposomen, ist.
7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1, worin das
reversibel eingeschlossene Mitglied ein Konjugat eines
Enzyms und eines Haptens ist und das komplementäre
Mitglied ein Antikörper für das Hapten ist und das Material
ein Liposomen ist, vorzugsweise, worin das reversibel
eingeschlossene Mitglied Glucose-6-phosphatdehydrogenase-
Theophyllin, das nicht-eingesperrte Mitglied
Anti-Theophyllin und das Material ein Liposomen ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, worin das
Material ein Liposomen ist und das Liposomen
Palmitoyloleoylphosphatidylcholin, Palmitoylphosphatidylglycerin
und Cholesterin umfaßt.
9. Vorformulierte, einzige, flüssige Zusammensetzung zur
Durchführung eines Assays für einen Analyten, der ein
Mitglied eines aus Ligand und seinem komplementären
Rezeptor bestehenden spezifischen Bindungspaares (sbp) ist,
wobei die Zusammensetzung in einem flüssigen Medium und
in Abwesenheit des Analyten umfaßt:
a) ein sbp-Mitglied, das reversibel in ein Material
eingeschlossen ist, welches das sbp-Mitglied
vorübergehend unfähig zur Bindung mit seinem komplementären sbp-
Mitglied macht; und
b) das komplementäre sbp-Mitglied frei in dem
flüssigen Medium; worin mindestens eines der sbp-Mitglieder
an ein Mitglied eines Signal-erzeugenden Systems gebunden
ist.
10. Zusammensetzung, welche einen Festkörper umfaßt, der
durch verdampfende Entfernung der Flüssigkeit aus der
Zusammensetzung nach Anspruch 9 erhalten wurde.
11. Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, worin
der Analyt aus Antikörpern und Antigenen ausgewählt ist.
12. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11,
worin das Mitglied des Signal-erzeugenden Systems
ausgewählt ist aus Enzymen, Co-Enzymen, Fluoreszenzfarbstoffe,
Farbstoffen, Substraten, Chemilumineszenzfarbstoffen und
Co-Faktoren, vorzugsweise worin das Enzym
Glucose-6-phosphatdehydrogenase ist.
13. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 12,
worin das Material ein natürlich vorkommendes Material,
vorzugsweise rote Blutzellen-Geisterteilchen, oder ein
synthetisches Material, vorzugsweise ein Liposomen, ist.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin das reversibel
eingeschlossene Mitglied ein Konjugat eines Enzyms und
eines Haptens ist und das komplementäre Mitglied ein
Antikörper gegen das Hapten ist und das Material ein
Liposomen ist, vorzugsweise worin das reversibel
eingeschlossene Mitglied
Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Theophyllin
ist, das komplementäre Mitglied Anti-Theophyllin
ist und das Material ein Liposomen ist.
15. Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, worin
das Material ein Liposomen ist und das Liposomen
Palmitoyloleoylphosphatidylcholin,
Palmitoylphosphatidylglycerin und Cholesterin umfaßt.
16. Kit zur Verwendung in einem Assay zur Bestimmung eines
Analyten in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie
den Analyten enthält, umfassend in Kombination:
a) eine Zusammensetzung gemäß irgendeinem der
Ansprüche 9 bis 15; und
b) ein Reagenz zum Aufheben des Einschlusses des
eingeschlossenen sbp-Mitglieds.
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