DE2830862A1 - Homogener, kompetitiver antienzym- bindungstest und reagenz zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents

Description

u.Z.: M 790

Case: 3652-1CWH

SYVA COMPANY

Palo Alto, California, V.St.A.

"Homogener, kompetitiver Antienzym-Bindungstest und Reagenz zur Durchführung des Verfahrens"

Das Interesse und das Bedürfnis zum Nachweis der verschiedensten organischen Verbindungen nimmt in letzter Zeit ständig zu. Beispiele für Verbindungen, die dabei von Interesse sind, sind Arzneistoffe, die bei der Behandlung von Krankheiten oder anormalen Zuständen verwendet werden, miss— bräuchlich verwendete Drogen, natürliche, an den Körperfunktionen beteiligte Verbindungen, umweltverschmutzende Bestandteile und Spurenverunreinigungen. Die hierbei besonders interessierenden Konzentrationen der meisten dieser Verbindungen liegen im allgemeinen in der Grössenordnung von^ug/ml oder darunter. In vielen Fällen sind dabei in der unmittelbaren Umgebung dieser Verbindungen eine oder mehrere Verbindungen ähnlicher Struktur vorhanden, so dass eine Unterscheidung von der in Frage stehenden Verbindung vorgenommen werden muss.

809885/0851

Es -wurden eine Reihe von Verfahren entwickelt, die als "kompetitive Proteinbindungstests" bezeichnet werden. Diese Bestimmungsverfahren beruhen auf der Fähigkeit eines Rezeptors, im allgemeinen eines Antikörpers, eine spezielle räumliche und ladungsmässige Konformation zu erkennen.

Die Bindung des Rezeptors an einen Liganden erlaubt eine Unterscheidung zwischen gebundenem und ungebundenem Liganden. Bei Verwendung eines markierten Liganden und bei Ermöglichung einer Konkurrenz zwischen markiertem Liganden und Liganden in der unbekannten Probe um den Rezeptor, ergibt sich eine Verteilung des Rezeptors zwischen markiertem und unmarkiertem Liganden. Bei Verwendung von entsprechenden Markierungen lässt sich eine Unterscheidung zwischen gebundenem, markiertem Liganden und ungebundenem, markiertem Liganden vornehmen, so dass dieses Verhältnis zur Menge des Liganden in der unbekannten Probe in Beziehung gesetzt werden kann. Wenn der Rezeptor zu bestimmen ist, wird im wesentlichen das gleiche Verfahren angewendet, mit der Abänderung, dass der Rezeptor nicht zugesetzt wird und dass man keinen unmarkierten Liganden benötigt.

Bei der Entwicklung von kompetitiven Proteinbindungstests müssen eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden. Ein wichtiger Gesichtspunkt liegt in der einfachen Herstellungsweise der verschiedenen Reagentien. Ebenfalls von Wichtigkeit sind die mit Handgriffen verbundenen Stufen des Tests, da es wünschenswert ist, die Fehlermöglichkeiten für das ausführende Personal möglichst gering zu halten. Wichtig ist auch die Stabilität der Reagentien sowie die Einsetzbarkeit des Verfahrens mit zur Verfugung stehenden Vorrichtungen.

Selbstverständlich ist es auch von Interesse, wie genau und zuverlässig das Verfahren bei geringen Materialkonzentrationen arbeitet.

Aus der US-PS 3 817 837 ist ein homogener Enzymimmuntest

809885/0851

bekannt. Die US-PSen-3 654.090, 3 791 932, 3 850 752 und 3 839 153 betreffen heterogene Eazymimmuntests. Auf dem Ninth Annual Symposium on Advanced Analytical Concepts for the Clinical Laboratory, 17. und 18. März 1977, Oakridge National Laboratory, wurde über einen Aufsatz von R. Wei und S. Reib mit dem Titel "Phospholipase C-Labeled Antihuman:· IgG: inhibition of enzyme activity by human IgG" berichtet. Die US-PSen 3 935 074 und 3 998 943 beschreiben Immuntests, bei denen eine sterische Hemmung zwischen zwei verschiedenen Rezeptoren für verschiedene epitope Stellen beteiligt ist. ' Carrieο und Mitarb., Anal. Biochem., Bd. 72 (1976), S. 271 und Schroder und Mitarb., a.a.O., Bd. 72 (1976), S. 283 "beschreiben kompetitive Proteinbindungstests, bei denen ein ^s · Marker ·, an ein Hapten gebunden wird, wobei der Marker einer enzymatischen Veränderung unter Erzeugung eines Signals unterzogen wird. Ein an das Enzym gebundener Antikörper hemmt eine Annäherung des Enzyms an die Markierung.

Erfindungsgemäss werden kompetitive Proteinbindungstests und Mittel zur Durchführung derselben zur Verfügung gestellt. Damit lässt sich ein zu analysierender Bestandteil (Analyt), der ein Bestandteil eines immunologischen Paars (Ligand und Rezeptor) darstellt, bestimmen. Das Verfahren beruht auf der Bildung eines Komplexes zwischen mindestens einem, im allgemeinen mehr als einem, der Bestandteile des immunologischen Paars, einschliesslich eines Enzyms, das entweder an einen Li- \ ganden (enzymgebundener Ligand) oder an einen Rezeptor (enzymgebundener Rezeptor) gebunden ist. Die Bildung des Komplexes verhindert die Annäherung des Enzyminhibitors. Wenn das Enzymkonjugat mit dem gleichen. Bestandteil des immunologischen Paars wie der Analyt gebildet ist, wird der andere Bestandteil des immunologischen Paars als Reagenz zugesetzt. Dessen Zugabe ist aber nicht erforderlich, wenn das Enzymkonjugat mit dem in bezug auf den Analyten homologen oder reziproken Bestandteil des immunologischen Paars gebildet ist. ■

L' ■ 80988 5/0851 .

-¹: Der Test wird in-einem wässrigen, gepufferten Medium durchgeführt. Die einzelnen Reagentien können nach verschiedenen Verfahrensweisen gleichzeitig oder nacheinander zugesetzt werden. Die enzymatisch^ Aktivität kann bestimmt werden, indem man die Enzymsubstrate zum Testmedium gibt. Durch

einen Vergleich der an einer unbekannten Probe bestimmten enzymatischen Aktivität mit der Analytenmenge in einer bekannten Probe, kann die Analytenmenge in der unbekannten Probe halb quantitativ oder quantitativ bestimmt werden. 10

Erfindungsgemäss werden Reagentienkombinationen zur Verfugung gestellt, mit denen das vorgenannte Verfahren durchgeführt werden kann. Diese enthalten Enzymkonjugat und Enzyminhibitor und gegebenenfalls den zum Analyten reziproken Bestandteil des immunologischen Paars. Es können auch andere Bestandteile enthalten sein, beispielsweise Stabilisatoren, Konservierungsmittel und Puffer.

Erfindungsgemäss wird also ein empfindlicher, genauer, kompetitiver Proteinbindungstest zur Verfügung gestellt, bei dem eine Enzymmarkierung angewendet wird, wobei die enzymati— sehe Aktivität im Testmedium mit der im Testmedium vorhandenen Analytenmenge in Beziehung steht. Bei dem Verfahren wird ein Konjugat aus einem Enzym und einem Bestandteil eines immunologischen Paars angewendet, wobei das Enzymkonjugat einen wesentlichen Anteil seiner enzymatischen Aktivität, bis zu 100 Prozent der Aktivität des Enzymkonjugats, behält, wenn ein Komplex unter Beteiligung der Bestandteile des immunologischen Paars unter Einschluss von mindestens einem Enzymkonjugat gebildet wird. Ferner wird erfindungsgemäss ein Enzyminhibitor verwendet, der die enzymatisch^ Aktivität wesentlich verringert. Bei diesem Verfahren wird die Annäherung des Enzyminhibitors an das Enzym durch den Komplex behindert. Bei Ligandentests mit enzymgebundenem Liganden wird die Menge des Antiliganden, der an den enzym-

809885/0851

■ gebundenen Liganden gebunden ist, durch die Menge des im Testmedium vorhandenen Liganden beeinflusst, während bei Antiligandentests mit enzymgebundenem Liganden die Menge des. Antiliganden im Testmedium direkt in Beziehung zu dessen Menge in der unbekannten Probe steht. Bei Ligandentests mit enzymgebundenem Antiliganden steht die Menge des an den Liganden gebundenen, enzymgebundenen Antiliganden direkt in Beziehung mit der Menge des Liganden in der Probe, während bei Antiligandentests die Menge des an den Liganden gebundenen, enzymgebundenen Antiliganden durch die Menge des im Testmedium vorhandenen Antiliganden beeinflusst wird. Zweckmässigerweise kann der Enzyminhibitor aus einem Antikörper für das Enzym bestehen, der in der Lage ist, bei Bindung an das Enzym die enzymatische Aktivität zu hemmen.

Der Ligand oder enzymgebundene Ligand weist eine ausreichende Anzahl von ep i top en Stellen auf, um die Annäherung des Enzyminhibitors zu hemmen, wenn diese Stellen mit Antiligandem bzw. enzymgebundenem Antiliganden gesättigt sind.

nachstehend sind einige der hier verwendeten Begriffe erläutert:

Analyt: Zu messende Verbindung oder Zusammensetzung, wobei es sich um mono- oder polyepitope, antigene oder haptenische, einzelne oder mehrere Verbindungen, die sich mindestens eine gemeinsame epitope Stelle eines Rezeptors teilen, handelt..

Ligand: Beliebige organische Verbindung, für die ein natürlicher Rezeptor existiert oder hergestellt werden kann.

Ligandenanaloges: Modifizierter Ligand, der mit dem analogen Liganden und einen Rezeptor konkurrieren kann, wobei die Modifikation bewirkt, dass das Ligandenanaloge an ein Enzym oder ein anderes Molekül gebunden werden kann.

_L 809885/0851

Rezeptor: Eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, die in der Lage ist,eine spezielle räumliche oder ladungsmässige Organisation eines Moleküls, d.h. einer epitopen Stelle, zu erkennen und normalerweise mehrwertig ist, d.h.

mindestens zwei bindende Stellen aufweist. Spezielle Beispiele für Rezeptoren sind natürlich vorkommende Rezeptoren, Antikörper, Enzyme, Lectine und" Pab-Eragmente. I¹Ur- einen spezifischen Liganden wird der Rezeptor als Antiligand bezeichnet, beispielsweise wird ein Antikörper für ein Enzym als Antienzym bezeichnet. Der Rezeptor und dessen reziproker Ligand bilden ein immunologisches Paar.

Enzymgebundener Ligand: Ein Konjugat mit mindestens einem Enzymmolekül, das an mindestens ein Ligandenanaloges kovalent gebunden ist, wobei das Enzym einen wesentlichen Anteil seiner enzymatischen Aktivität behält, wenn der Antiligand die zugänglichen epitopen Stellen absättigt, und die Bindung des Antiliganden an die ligandenepitopen Stellen die Bindung des Enzyminhibitors behindert.

Enzymgebundener Antiligand: Ein Konjugat mit mindestens einem Enzymmolekül, das an mindestens einen Rezeptor kovalent gebunden ist, wobei das Enzym einen wesentlichen Anteil seiner Aktivität behält, wenn das Konjugat die zugänglichen epitopen Stellen des Liganden absättigt, und die Bindung des Enzym-Antiliganden-Konjugats die Bindung des Enzyminhibitors behindert.

Komplex: Eicht-kovalente Bindung von mindestens einem der Bestandteile eines immunologischen Paars. Erfindungsgemäss umfasst der Komplex im allgemeinen mindestens ein Enzymmole— kül, das kovalent an einen der Bestandteile des immunologischen Paars gebunden (konjugiert) ist. Der Komplex kann relativ zweidimensional sein oder eine dreidimensionale Matrix darstellen, wobei in Analogie zu Polymerisaten, ge-

809885/0851

gebenenfalls Vernetzungen vorliegen können.

Enzymihhibitor: Ein Makromolekül, das zu einer wesentlichen Hemmung der enzymatischen Aktivität in der Lage ist, wenn es an ein Enzym gebunden ist. Die Hemmung ist entweder reversibel oder irreversibel. Die Hemmung des Enzyms wird verhindert, wenn der Rezeptor an den enzymgebundenen Liganden oder der enzymgebundene Antiligand an den Liganden gebunden ist. Zweckmässigerweise handelt es sich bei dem Enzyminhibitor um einen Antikörper, der ein spezielles Enzym erkennt und nach Bindung an das Enzym die enzymatisehe Aktivität wesentlich verringert, oder um ein Substrat, das an das Enzym gebunden wird und die gemessene enzymatische Aktivität verringert. "

nachstehend wird der erfindungsgemässe Test näher erläutert.

Der Test wird in einem wässrigen Medium bei massigem pH-Wert durchgeführt, im allgemeinen in der Nähe des pH-Werts, bei der die Reaktion auf Veränderungen in der Analytenkonzentration möglichst gross ist. Das Testmedium zur Bestimmung des Analyten wird hergestellt, indem man eine entsprechend gepufferte wässrige Lösung, die unbekannte Probe, die gegebenenfalls einer Vorbehandlung unterzogen worden ist, das Enzymkonjugat, den Enzyminhibitor, gegebenenfalls den reziproken Bestandteil des immunologischen Paars und Enzymsubstrate verwendet. Das Testmedium ist im allgemeinen homogen.

Das wässrige Medium kann andere polare Lösungsmittel enthalten, beispielsweise oxygenierte organische Lösungsmittel mit 1 bis 6 und im allgemeinen mit 1 bis 4- Kohlenstoffatomen, wie Alkohole und Ether. Im allgemeinen sind diese Eolösungsmittel in Mengen von weniger als etwa 20 Gewichtsprozent und insbesondere in Mengen von weniger als etwa 10 Gewichtspro-ζ ent vorhanden.

i_ 809885/0 851

. Der pH-Wert des Hediums liegt- im allgemeinen im Bereich von etwa 5 tis 10, vorzugsweise von etwa 7 t>is 9 und- insbesondere von 7 tis 8,5- Zur Erzielung des gewünschten pH-Werts und zur Aufrechterhaltung dieses pH-Werts während der Bestimmung können verschiedene Puffer verwendet werden. Beispiele für

Puffer sind Borat-, Phosphat-, Carbonat-, Tris- und Barbitalpuffer. Die Wahl des speziellen Puffers ist nicht kritisch, wobei aber in einzelnen Fällen einem Puffer der Vorzug gegeben werden kann.
10

Normalerweise wird der Test bei massigen Temperaturen durchgeführt, wobei im allgemeinen während der Versuchsdauer die Temperatur konstant gehalten wird. Die Temperaturen liegen im allgemeinen im Bereich, von etwa 10 bis 50 und insbesondere von etwa 15 bis 40⁰C.

Die Konzentration des zu bestimmenden Analyten variiert im allgemeinen von etwa 10 bis 10 ^y und insbesondere von etwa 10 bis 10" ^m. Die Konzentration der anderen Reagentien wird normalerweise mit Rücksicht darauf festgelegt, ob der Test qualitativ, halbquantitativ oder quantitativ durchgeführt werden soll und je nachdem welches Enzym und welches Nachweisverfahren für die enzymatisch^ Aktivität gewählt wird und in welcher Konzentration der Analyt vorliegt.

Bei einer kompetitiven Verfahrensweise, bei der die Reagentien um sterisch abgesperrte Stellen konkurrieren, sind die relativen Konzentrationen der Materialien recht wichtig. Demgegenüber sind die relativen Konzentrationen der Reagentien zum Enzyminhibitor weniger wichtig, wenn andere Reagentien als der Enzyminhibitor zuerst zugesetzt werden und wenn nach der Zugabe des Enzyminhibitors eine Gleichgewichtseinstellung ermöglicht wird.

ErfindungSgemäss wird die Bildung eines Komplexes zwischen den reziproken Bestandteilen eines immunologischen Paars

809885/0851

^Λ- dazu verwendet, die Annäherung eines Enzyminhibitors an ein ?-■ Enzym, das kovalent an eines· der Bestandteile gebunden ist, zu behindern. Das Enzym kann an beide Bestandteile des immunologischen Paars gebunden sein. Somit umfasst die Erfindung zwei Ausführungsformen:

(1) Test unter Beteiligung eines enzymgebundenen Liganden und

(2) Test unter Beteiligung eines enzymgebundenen Rezeptors.

Im folgenden wird zunächst auf die erste Ausführungsform, d.h. den Test unter Beteiligung eines enzymgebundenen Liganden, eingegangen.

Bei der ersten Ausführungsform wird die Menge des verwendeten Antiliganden normalerweise auf der Basis der Rezeptorstellen berechnet. Diese Menge kann mit der Konzentration des enzymgebundenen Liganden, dem Verhältnis von Liganden zu Enzym im enzymgebundenen Liganden und der Affinität des Rezeptors für den Liganden variieren. Im allgemeinen sind pro Molekül des enzymgebundenen Liganden mindestens eine aktive Rezeptorstelle und pro epitope Stelle des Liganden als enzymgebundenen Liganden weniger als etwa 20 aktive Stellen vorhanden. Das "Verhältnis von epitopen Stellen an Rezeptor und Liganden kann aber auch eine Höhe von beispielsweise 100 Ά erreichen, je nach der Art des Tests und der Affinität des Rezeptors. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis der Rezeptorbindungsstellen zu epitopen Stellen des Liganden als enzymgebundener Ligand mindestens 1, vorzugsweise mindestens 2 und nicht mehr als etwa 5*1·

Das Verhältnis von Enzym zu Liganden im enzymgebundenen Liganden kann je nach Enzym, insbesondere je nach dem Molekulargewicht des Enzyms und der zugänglichen Stellen, sowie in Abhängigkeit vom Molekulargewicht des Liganden stark variieren. Für Haptenliganden mit einem Molekulargewicht unter 2000 und im allgemeinen unter 1200 liegt durchschnittlieh mindestens 1 Ligand pro Enzym vor. Im allgemeinen ist

809885/0851

: nicht mehr als etwa 1 Ligand-pro etwa 2000 Molekulargewichtseinheiten und insbesondere nicht mehr als 1 Ligand pro 5000 Molekulargewichtseinheiten des Enzyms vorhanden, insbesondere bei Enzymen mit einem Molekulargewicht unter 50 000. Bei antigenen Liganden, deren Molekulargewicht im allgemeinen über 2000 und insbesondere über 5000 liegt, besteht die Möglichkeit, dass für einen Liganden mehrere Enzyme existieren. Das Gewichtsverhältnis von Enzym zu Li-

c p

ganden kann von etwa 10 bis 10 : 1 und insbesondere von etwa 10" bis 10 : 1 variieren. Da der Ligand ein Virus oder eine Zelle sein kann, kann die 'Enzymanzahl bei einem derart gross en Liganden in bezug auf das Molverhältnis gross und in bezug auf das Gewichtsverhältnis sehr klein sein. Bei Liganden mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 bis 600 000 ist im allgemeinen mindestens 1 Enzym pro Ligand und nicht mehr als 1 Enzym pro 5000 Molekulargewichtseinheiten des Liganden vorhanden.

Die Konzentrationen des enzymgebundenen Liganden und des Rezeptors (bezogen auf die Bindungsstellen) kann stark variieren. Sie betragen im allgemeinen etwa 10~ bis 1O~ m und

-6 -12

insbesondere 10 bis 10 m. Das Molverhältnis von enzymgebundenem Liganden zur maximalen in Frage kommenden Liganden-

—4-konzentration beträgt im allgemeinen etwa 10 bis 10 : 1 und insbesondere etwa 10~* bis 1:1.

Das Äquivalentverhältnis von Enzyminhibitor zum Enzym, bezogen auf aktive Stellen, beträgt im allgemeinen etwa 0,1 und insbesondere mindestens 1. Der molare Überschuss kann 100-fach oder mehr sein.

Bei jedem speziellen Test werden die verschiedenen Verhältnisse der Reagentien so ermittelt, dass Verhältnisse, die eine optimale Empfindlichkeit ergeben, gewährleistet sind. Die speziellen Verhältnisse hängen nicht nur von der

809885/0851

-. Durchführungsweise des-Tests, sondern jeweils auch vom Liganden, vom Enzym, dem Verhältnis von Enzym zu Liganden im enzymgebundenen Liganden, dem in Ei^age kommenden Konzentrationsbereich und ähnlichen Faktoren ab.

Die Durclxführungsweise des erfindungsgemässen Tests kann stark variieren, je nach Art der Materialien, der gewünschten Empfindlichkeit und der Art der verwendeten Vorrichtung. Es können sowohl Kompetitiv- oder Gleichgewichtsverfahren.

angewendet werden. Bei der kompetitiven Ausführungsform konkurrieren sowohl der Antiligand als auch der Enzyminhibitor um den enzymgebundenen. Liganden. Beim Gleichgewichtsverfahren kann der Antiligand mit dem enzymgebundenen. Liganden ausreichend lang, dass sich ein Gleichgewicht einstellt, in Wechselwirkung treten. Anschliessend wird dann der Enzyminhibitor zugesetzt. Der Enzyminhibitor kann nur mit Enzym reagieren, bei dem nicht durch die Gegenwart des Antiliganden eine Annäherung sterisch verhindert wird.

Bei der kompetitiven Verfahrensweise zur Bestimmung des Liganden können der Antiligand und der Enzyminhibitor gleichzeitig zum Liganden und zum enzymgebundenen Liganden, zweckmässigerweise als einziges Reagenz, zum Testmedium, das die Enzymsubstrate enthält, gegeben werden. Die enzymatisch^ Aktivität wird zu zwei unterschiedlichen Zeitpunkten, die von der Zugabe der Reagentien ab gemessen werden, bestimmt.

Die Differenz dieser beiden Werte kann mit Werten verglichen werden, die mit bekannten Lxgandenmengen erhalten worden sind. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Substrate nach dem Zusatz der Reagentien zuzugeben und die Zeit von der Zugabe der Reagentien an zu berechnen. Zwischen der Zugabe der Reagentien und der Messung können verschiedene Inkubationszeiten eingehalten werden.

Beim Gleichgewichtsverfahren zur Bestimmung des Liganden wird

809885/08 51

der Antiligand gleichzeitig mit dem enzymgebundenen Liganden oder anschliessend an die Zugabe desselben zum Liganden gegeben. Gemäss einer ersten Ausführungsform wird nach der Zugabe des Antiliganden und des enzymgebundenen Liganden das Testmedium ausreichend lang zur Erzielung des Gleichgewichtszustands inkubiert, wonach der Enzyminhibitor zugesetzt wird. Das Medium kann sodann ein zweites mal inkubiert werden, woran sich die Messungen der enzymatischen Aktivität anschliessen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Antiliganden der Probe zuzusetzen und zu inkubieren, wonach die Zugabe des enzymgebundenen Liganden und eine weitere Inkubation erfolgt. Hierauf wird der Enzyminhibitor zugesetzt und gegebenenfalls eine dritte Inkubation vorgenommen.. Es genügt zwar eine Messung, vorzugsweise werden jedoch für jeden Test zwei getrennte Messungen durchgeführt, wobei die Differenz zwischen den beiden Werten angegeben wird. In speziellen Fällen können auch Arbeitsweisen angewendet werden, die sich von den vorstehend angegebenen unterscheiden.

Die Inkubationszeiten können stark variieren. Sie können weniger als 1/2 Minuten und im allgemeinen nicht mehr als 24- Stunden betragen. Vorzugsweise werden Inkubationszeiten von nicht mehr als 6 Stunden und insbesondere von nicht mehr als 30 Minuten eingehalten. Da das endgültige Ergebnis von den Ergebnissen abhängt, die mit Standards, die im wesentlichen auf die gleiche Weise und womöglich auf identische Weise behandelt worden sind, sind die spezielle Ausführungsform und die einzelnen Zeiten nicht kritisch, so lange bei verschiedenen Analytkonzentrationen signifikante, reproduzierbare, unterschiedliche Ergebnisse erhalten werden.

Je nach der Wahl des Testverfahrens, der verwendeten Vorrichtung und der Konzentration des Analyten, kann das Testvolumen bis herunter zu einem Volumen von 1 ^jil betragen.

809885/0851

^Γ - 17 -

Im allgemeinen beträgt dieses Volumen mindestens 25 ^l und insbesondere nicht mehr als 5 ml. Besonders bevorzugt ist ein Volumen von nicht mehr als etwa 2 ml.

Gemäss einer speziellen Ausführungsform kann als Enzyminhibitor ein Fab-Fragment eines Antienzyms vorliegen. Dabei ist es zweckmässig, den enzymgebundenen Liganden und das Fab-Antienzymfragment als ein einziges Reagenz zuzusetzen, so dass die Reagentien in einem vorbestimmten Verhältnis hergestellt werden können» Durch Vereinigung dieser Reagentien werden Fehlermöglichkeiten verringert.

Bei der Bestimmung des Antilxganden wird im wesentlichen das vorbeschriebene Verfahren angewendet, mit der Abänderung, dass der enzymgebundene Ligand zuerst der Probe zugesetzt und inkubiert werden kann, wonach sich die Zugabe des Enzyminhibitors anschliesst.

Nachstehend wird der erfindungsgemässe Test unter Verwendung von enzymgebundenem Antilxganden näher erläutert.

Im allgemeinen beträgt bei Polyepitopligandenanalyten die Konzentration des gesamten Antilxganden, bezogen auf die Bindungsstellen etwa das 1- bis 50-fache der minimalen oder maximalen in Frage kommenden Konzentration, bezogen auf die epitopen Stellen. Im allgemeinen beträgt diese Konzentration das 1- bis 10-fache und insbesondere das 1- bis 3-fache der maximalen in Frage kommenden Konzentration. Für monoepitope Ligandenanalyten und Rezeptoranalyten sind die entsprechenden Konzentrationen von Poly-(ligandenanalogen) und markiertem Antilxganden etwa gleich der minimalen, in Frage

. .. .,bezogen auf bindende. Stellen.

kommenden Konzentratxon»/Im allgemexnen geht dxese Konzentration nicht über die maximale in Frage kommende Konzentration hinaus. Vorzugsweise beträgt sie nicht mehr als 10 und insbesondere nicht mehr als 10 der minimalen in Frage

809885/0 851

/1 .-. kommenden Konzentration. Die in !"rage kommenden Konzentrationsbereiche variieren im allgemeinen von etwa 1O~ bis 1O~ ^ g/ml. Pur monoepitope Analyten und Rezeptoranalyten betragen die Konzentrationen des gesamten Antiliganden, abgesehen vom Analyten, bis zum 50-fachen der Konzentration des Poly-(ligandenanalogen) oder Liganden, vorzugsweise bis zum 10-fachen und insbesondere bis zum 3-fachen.

Die Konzentration des Enzyminhibitors variiert stark in Abhängigkeit von der Art des Inhibitors, dessen Wirksamkeit bei der Hemmung des Enzyms und ähnlichen Paktoren. Im allgemeinen werden vernünftige Inhibitorüberschüsse verwendet, um eine rasche Hemmgeschwindigkeit zu gewährleisten und um sicherzustellen, dass die Konzentration des Inhibitors keine Beschränkung darstellt. Deshalb liegt der Enzyminhibitor in zumindest ausreichender Konzentration vor, um eine mindestens etwa 30-prozentige Hemmung und vorzugsweise eine 50-prozentige oder darüberliegende Hemmung zu ergeben. Dies bedeutet, dass in Abwesenheit des Analyten, eine Verringerung der enzymatischen Aktivität von mindestens 30 Prozent beqbachtet wird.

Die Reihenfolge der Zugabe kann stark variieren. Im allgemeinen werden die unbekannte Probe und der markierte Rezeptor vor Zugabe des Inhibitors in einem entsprechenden Medium vereinigt. Das Enzymsubstrat kann gleichzeitig oder anschliessend an die Zugabe des Enzyminhibitors zugesetzt werden. Nach Vereinigung der unbekannten Probe mit dem markierten Rezeptor und gegebenenfalls mit dem Liganden oder dem Poly-(ligandenanalogen) kann das Testmedium für eine zur Komplexbildung ausreichende Zeit inkubiert werden.

Die Zeitspannen, die zwischen den verschiedenen Zugaben der Testbestandteile ablaufen und die für die beteiligten immunologischen Reaktionen erforderlich sind, können je nach den

809885/0851

• beteiligten Verbindungen, der Art der Zugabe, der ange- " wandten Konzentrationen, der Bindungskonstanten der Rezeptoren und ähnlichen Faktoren stark variieren. Normalerweise betragen die Zeitspannen zwischen den einzelnen Zugaben wenige Sekunden bis viele Stunden. Im allgemeinen wird eine Zeitspanne von 12 Stunden und insbesondere von 6 Stunden nicht überschritten. Wach Zugabe der einzelnen Bestandteile zum Testgemisch können verschiedene Inkubationszeiten vor Zugabe des nächsten Bestandteils oder vor Durchfuhrung der Messung eingehalten werden. Da die Endergebnisse von den Ergebnissen, die mit Standards, die im wesentlichen auf die gleiche V/eise und womöglich auf identische Weise behandelt .worden sind, abhängen, sind die einzelnen Verfahrensweisen und Zeiten/
/nicht kritisch, so lange bei unterschiedlichen Analyten — konzentrationen signifikante, reproduzierbare Unterschiede erhalten werden.

Je nach Wahl des Testverfahrens, der verwendeten Vorrichtung und der Analytenkonzentration können die Testvolumina bis auf etwa 1 μ\ heruntergehen. Im allgemeinen betragen sie mindestens 25 ^uI und insbesondere nicht mehr als 5 wl. Besonders bevorzugt sind Volumina von nicht mehr als etwa 2 ml.

^y Bei der Bestimmung des Antiliganden wird das gleiche Verfahren angewendet, wobei aber das erhaltene Ergebnis ein Anstieg oder eine Abnahme des Signals in Abhängigkeit von den relativen Anteilen der verschiedenen Bestandteile sein kann. Dies bedeutet, dass der Antiligand das Enzym-Antiligand- ?Q Konjugat aus dem Komplex verdrängen kann oder die Komplexbildung fördern kann. Vorzugsweise wird eine Verfahrensweise angewendet, bei der der Antiligand das Enzym-Antiligand-Konjugat verdrängt.

Nachstehend werden die einzelnen Materialien näher erläutert.

809 885/0851

* Die Hauptbestandteile für den erfindungsgemässen Test zur Bestimmung des Analyten sind: Der Analyt, enzymgebundener Irigand oder enzymgebundener Rezeptor, Enzyminhibitor und Enzymsubstrate.

Analyt

Der erfindungsgemässe Ligandenanalyt ist dadurch gekennzeichnet, dass er monoepitop oder polyepitop ist. Bei den polyepitop en Ligandenanalyten handelt es sich im allgemeinen um Poly-(aminosäuren), d.h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, nucleinsäuren oder Kombinationen davon. Beispiele für entsprechende Kombinationen sind Bakterien, Viren, Chromosomen, Gene, Mitochondrien, Zellkerne und Zellmembranen.

In den meisten Fällen haben die erfindungsgemäss verwendeten polyepitop en Ligandenanalyten ein Molekulargewicht von mindestens etwa 5000 und insbesondere von mindestens etwa 10.000. Die in !Frage kommenden Polyaminosäuren haben im_allgemeinen

PQ ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis 5 000 000 und insbesondere von etwa 20 000 bis etwa 1 000 000. In Frage kommende Proteine weisen ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis etwa 600 000 auf, wozu Albumine und Globuline gehören. Das Molekulargewicht von in Frage kommenden Hormonen liegt bei etwa 5000 bis etwa 60 000.

Die Proteine lassen sich einteilen in Proteine mit ähnlichen Struktureigenschaften, Proteine mit besonderen biologischen Funktionen, Proteine, die mit speziellen Mikroorganismen, •zn insbesondere krankheitserregenden Mikroorganismen in Verbindung stehen, und ähnliche Proteingruppen.

Nachstehend sind Beispiele für Proteine mit struktureller Verwandtschaft angegeben:
₇e Protamine, Histone, Albumine, Globuline, Scleroproteine, Phosphoproteine, Mucoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine,

809885/0851

Nucleoproteine und nicht klassifizierte Proteine, wie Somatotropin, Prolactin, Insulin und Pepsin.

Eine Reihe von Proteinen im menschlichen Plasma sind von "besonderer klinischer Bedeutung. Beispiele dafür sind: Präalbumin ,Albumin, ou-Lipoprotein, oc^-Säureglycoprotein, ou-Antitrypsin, ou-Glycoprotein, Transcortin, 4-.6S-PoStalbumin, tryptophanarmes a^-Glycoprotein, a^X -Glycoprotein, thyroxinbindendes Globulin, Inter-a-trypsininhibitor, Gc-Globulin (Gc 1-1, Gc 2-1 und Gc 2-2), Haptoglobin (Hp 1-1,

Hp 2-1 und Hp 2-2), Ceruloplasmin, Cholinesterase, proteine, 0C2-Macroglobulin, a2-HS-Glycoprotein, 2 protein, c^-ETeuramino-glycoprotein, Erythropoietin, ß-Lipoprotein, Transferrin, Hämopexin, Fibrinogen, Plasminogen, ß2-Glycoprotein I, ß2-Glycoprotein II, Immuno globulin G (IgG oder J^G-Globulin der Formel jf^2. ^oder /2^2^' Immunoglobulin A (IgA oder ^Α-Globulin der Formel (ag Kp) oder (α₂λ₂)^η), Immunoglobulin M (IgM oder ^M-Globulin der Formel iCp) oder (ug^) )» Immunoglobulin D (IgD oder j^D-

Globulin QfD) der Formel (6 2.^2) ^0(ier (^2^2^' Immuno-· globulin E (IgE oder /Έ-Globulin (jTE) der Formel (E₂K₃) oder (E₂-^₂))* freies K und /^-leichte Ketten, Komplementfaktoren:

C^!1 (C¹Iq, C'1r und C'1s), C2, C'3 (ß/,Α und a^D), C^f4, C'5, C'6, C'7, C'8 und C'9.

In der nachstehenden Tabelle sind wichtige Blutgerinnungsfaktoren angegeben.

609885/0851

Tabelle I

Blut gerinnungsf akt or en	Name	Fibrinogen
	Prothrombin
International e	Thrombin
Bezeichnung	Gewebethromboplastin
I	Proaccelerin, Acceleratorglobulin
II	Proconvertin
Ha	Antihämophiles Globulin (AHG)
III	Christmas-Faktor;
V und VI	Plasma-Thromboplastin-Komponente
VII	(PTG)
VIII	Stuart-Prower-Faktor;
IX	Autoprothrombin III
	Plasma-Thromboplastin-Antecedent
	(PTA)
X	Hagemann-Faktor,
	Fibrinstabilisierender Faktor
XI
XII
XIII

Beispiele für wichtige Proteinhormone sind:

Peptid- und Proteinhormone

Parathyroidhormon (Parathromon), Thyrocalcitonin, Insulin, Glucagon, Relaxin, Erythropoietin, Melanotropin (melano-

gg cytenstimulierendes Hormon, Intermedin), Somatotropin (Wachstumshormon), Corticotropin (adrenocorticotropes Hormon), Thyrotropin, follikelstimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon (interstitielles zellstimulierendes Hormon), luteomammotropes Hormon (Luteotropin, Prolactin) und Gonadotropin (Choriongonadotropin).

809885/0851

283Q862

Ge weh ehormone

Secretin, Gastrin, Angiotensin I und II, Bradykinin und menschliches Placentalactogen.

Peptidhormone aus der Keurohypophyse

Oxytocin, Vasopressin, Releasing-Paktor (EB¹), wie CEO¹, LEP, TEF, Somatotropin-EE¹, GSF, PSH-EB¹, PIP und MIP.

Weitere in Präge kommende Polymermaterialien sind Mucopolysaccharide und Polysaccharide.

Beispiele für von Mikroorganismen abgeleitete antigene Polysaccharide sind nachstehend zusammengestellt:

Mikroorganismen

Streptococcus pyogenes Diplococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Corynebacterium diphtheriae Actinobacillus mallei;

Actinobacillus whitemori Francisella tularensis

Pasteurella pestis Pasteurella pestis Pasteurella multocida Brucella abortus Haemophilus Influenzae Haemophilus pertussis Treponema reiteri Veillonella
Erysipelothrix Listeria monocytogenes Chromobacterium

Hämosensitin gefunden in

Polysaccharid.. Polysaccharid. Polysaccharid.' Polysaccharid Polysaccharid·

.roher Extrakt . -

Lxpopolysaccharid .· Polysaccharid

Polysaccharid . kapsuläres Antigen! roher Extrakt Polysaccharid [ Rohpro.dukt. . . . Polysaccharid . Lipopolysaccharid Polysaccharid Polysaccharid,-Lipopolysaccharide.

809885/0851

ORIGINAL JNSPECTED

Mikr o or gani smen Mycobacterium tuberculosis

Hämosensitin gefunden in

Klebsieila aerogenes Klebsieila cloacae Salmonella typhosa

Salmonella typhi-murium; Salmonella derby Salmonella pullorum

Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella sonnei

Rickettsiae Candida albicans Entamoeba histolytica

Kochsalzextrakt von

mit ~9Q%..JPnenol ex-r.J trahierten.Mycobakterien und Poljsa^ch "-ridfraktionen von"... ί 'VZeXlen^ünd !Euberkulin

Polysaccharidi

Polysaccharid'._: !

Lipopolysaccharid. I Polysaccharid" !

Polysaccharid j

Polysaccharid

Rohprodukt, Polysaccharid

Rohextrakt

Polysaccharid

Rohextrakt

Die zu bestimmenden Mikroorganismen können in intaktem Zustand, lysiert, zermahlen oder anderweitig fragmentiert sein. Das erhaltene Produkt bzw. Anteile davon, die beispielsweise durch Extraktion erhalten worden sind, können bestimmt werden. Beispiele für entsprechende Mikroorganismen sind:

Corynebacteria

Corynebacterxum dxptheriae Pneumococci

Diplococcus pneumoniae Streptococci

Streptococcus pyogenes

Streptococcus salivarus Staphylococci

Staphylococcus aureus

Staphylococcus albus

809 88 5/0851 -J

ORIGINAL INSPECTED

283Q8B2

Neisseriae

Neisseria meningitidis Neisseria gonorrheae

Enterobacteriaciae

Escherichia coli Aerobacter aerogenes • Klebsiella pneumoniae Salmonella typhosa Salmonella choleraesuis Salmonella typhimurium Shigella dysenteriae Shigella schmitzii Shigella arabinotarda Shigella flexneri Shigella boydii Shigella Sonnei

Andere enterische Bazillen Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morgani Pseudomonas aeruginosa Alcaligenes faecalis Vibrio cholerae koliforme Bakterien

Salmonellae

Shigellae

Proteinarten

809885/0851

2230862

Hemophilus-Bordetella -Gruppe -

Hemophilus influenzae,

H. ducreyi

H. hemophilus

H. aegypticus

H. paraiufluenzae

Bordetella pertussis

Pasteurellae

Pasteurella pestis
Pasteurella tulareusis

Brucellae

Bruceila melitensis
Bruce11a abortus
Bruceila suis

Aerobe .sporenbildendeBazillen Bacillus anthracis Bacillus subtilis Bacillus megaterium Bacillus cereus

Anaerobe s poreobildende Bazillen Clostridium botulinum Clostridium tetani Clostridium perfringens Clostridium novyi Clostridium septicum

809885/0851

Clostridium histolyticuni

Clostridium tertium Clostridium bifermentans Clostridium sporogenes

Myc obac t e r j a

Mycobacterium tuberculosis hominis

Mycobacterium bovis Mycobacterium avium Mycobacterium leprae

Mycobacterium paratuberculosis Actinomycetes (pilzähnliclie Bakterien)

Actinomyces. israelii

Actinomyces bovis

Actinomyces naeslundii

Nocardia asteroides

Nocardia brasiliensis Spirochetes

Treponema pallidum Spirillum minus Treponema pertenue Streptobacillus moniliformis Treponema carateum Borrelia recurrentis , Leptospira xcterohemorrhagiae

Leptospira canicola 25

809885/0851

^Γ - 28

Mycoplasma pneumoniae ,Andere Pathogene

Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopathiae Streptobacillus moniliformis Donvania granulomatis Bartonella bacilliformis

Rickettsiae (bakterienähnliche Parasiten) " Rickettsia prowazekii Rickettsia mooseri Rickettsia rickettsii Rickettsia conori Rickettsia australis

^₅ Rickettsia sibiricus

Rickettsia akari Rickettsia tsutsugamushi Rickettsia burnetii Rickettsia quintana

Chlamydia (nicht klassifizierbare Parasiten bakterieller

oder viraler Art) "Chlamydia agents" (Bezeichnung tmsicher)

Pilze Cryptococcus neoformans Blastomyces dermatidis

Histoplasma capsulatum

Coccidioides immitis Paracoccidioides brasiliensis Candida albicans

Aspergillus fiimigatus

Mucor corymbifer (Absidia corymbifera)

Rhizopus oryzae " "^

Rhizopus arrhizus > phycomycetes Rhizopus nigricans J

809885/0851

Viren

Adenoviren Herpesviren

Pockenviren

- 29 -

Sporotrichum schenkii Fonsecaea pedrosoi Fonsecaea compacta Ponsecaea dermatitidis Cladosporium carrionii Phialophora verrucosa Aspergillus nidulans Madurella mycetomi Madurella grisea Allescheria boydii

Phialosphora jeanselmei

Microsporum gypseum

Trichophyton mentagrophytes

Keratinomyces ajelloi

Microsporiom canis

Trichophyton rubrum

Microsporum andouini

Herpes simplex Varicella (Windpocken) Herpes Zoster (Gürtelrose) Virus B
Cytomegalovirus

Variola (Pocken) Vaccinia
Poxvirus bovis Paravaccinia
Molluscum contagiosum

80S885/0851

Picornaviren

Myxoviren

Arboviren

Reoviren

Hepatitis Tumorviren

Poliovirus Coxsackievirus Echoviren Rhinoviren

Influenza (A, B, und C) Parainfluenza (1-4) Mump s—Virus

ÜTewcastle-Krankheit-Virus Masern-Virus Rinderpe st-Virus Hunde staup e-Virus Atmungs-Synzytium-Virus Röteln-Virus

Eastern Equine Eucephalitis-Virus

Western Equine Eucephalitis-Virus

Sindbi s-Virus

Cnikugunya-Virus

Semliki-Forest-Virus

Mayora-Virus

St. Louis Enzephalitis-Virus

California-Enzephalitis-Virus

Colorado-Zeckenfieber-Virus

Gelbfieber-Virus

Denguefieber-Virus

Eeοvirus Typ 1-3

Hepatitis A-Virus Hepatitis B-Virus

Rauscher-Leukämie-Virus

Gross-Virus

Maloney-Leukämie-Virus

809885/0851

Die monoepitopen Ligandenanalyten wexsen im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 100 Ms 2000 und insbesondere von 125 Ms 1000 auf. Zu den in Frage kommenden Analyten gehören Arzneistoffe, Metaboliten, Pestizide und umweltverschmutzende Bestandteile. Beispiele für entsprechende Arzneistoffe sind insbesondere Alkaloide. Beispiele für entsprechende Alkaloide sind Morphinalkaloide, wie Morphin, Codein, Heroin, Dextromethorphan, deren Derivate und Stoffwechselprodukte; Kokainalkaloide, wie Kokain und Benzoylecgonin, sowie deren Derivate und Metabolite; Ergotalkaloide, wie Lysergsäurediethylamid; Steroidalkaloide; Iminazoylalkaloide; Chinazolinalkaloide; Isochinolinalkaloide; Chinolinalkaloide, wie Chinin und Chinidin; und Diterpenalkaloide sowie deren Derivate und StoffWechselprodukte.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind Steroide. Beispiele dafür sind Östrogene, Gestrogene, Androgene, Nebennierenrindensteroide, Gallensäuren, kardiotone Glycoside und Aglycone, wie Digoxin und Dxgoxxgenxn, Saponine und Sapogenine sowie deren Derivate und StoffWechselprodukte.

Hierzu gehören auch Steroidmimetica, wie Diethylstilöstrol.

Eine, weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die cyclischen Lactame mit 5 oder 6-gliedrigen Ringen, wie Barbiturate, Diphenylhydantoin und deren Metabolite.

Eine weitere Gruppe stellen die Aminoalkylbenzole dar, die Alkylreste mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen aufweisen, wie Amphetamine, Catecholamine, einschliesslich Ephedrin, L-D op a, Epinephrin, Narcein, Papaverin, sowie deren Stoffwechseiprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Benzheterocyclen, wie Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin sowie deren Derivate und Stoff Wechselprodukte, wobei als

809885/0851 . _j

^Γ -32- "»

· " heterocyclische Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine vorliegen.

Eine weitere Gruppe sind die Purine, wie Theophyllin, Coffein soiirie deren Stoffwechselprodukte und Derivate.

Eine weitere Gruppe sind von Marihuana abgeleitete Arzneistoffe wie Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.

Eine weitere Gruppe sind die Vitamine, wie die Vitamine A, B, C, D, E und K.

Eine weitere Gruppe sind die Prostaglandine, die eine unterschiedliche Anzahl an Hydroxylgruppen und ungesättigte. Bindungen an unterschiedlichen Stellen aufweisen können.

Eine weitere Gruppe sind die Antibiotika, wie Penicillin, Chlormycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin sowie deren StoffWechselprodukte und Derivate. 20

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Nucleoside und Nucleotide, wie ATP, NAD, EMN, Adenosin, Quanosin, Thymidin und Cytidin mit den entsprechenden Zucker- und Phosphat-

substituenten.
25

Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen umfasst vermischte Produkte, wie Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin, Nortriptylin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propanolol, Griseofulvin, Butyrophenone, Anti— histaminica, anticholinergische Wirkstoffe, wie Atropin, sowie deren StoffWechselprodukte und Derivate. " .

Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind die Aminosäuren und niederen Peptide, wie Thyroxin, Trijodthyronin, Oxytocin, ACTH, Angiotensin, Gentamycin, Meta- und Leuencephalin sowie deren StoffWechselprodukte und Derivate.

809885/0851

r _ 33 - ι

■ 1 Mit krankhaften Zuständen im Zusammenhang stehende Metaboliten sind Spermin, Galactose, Phenylbrenztraubensaure und Porphyrin iyp Λ.

Beispiele für Pestizide sind polyhalogen!erte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, ρ olyhal ο genierte Sulfenamide sowie deren Stoffwechselprodukte und Derivate.

Das Molekulargewicht von Rezeptoranalyten liegt im allgemeinen im Bereich von 10 000 bis 2 χ 10 und insbesondere von, 10 000 bis 10 . Bei den Immunoglobulinen IgA, IgG, IgE und IgM variieren die Molekulargewichte im allgemeinen von etwa 160 000 bis etwa 10 . Enzyme weisen normalerweise ein Molekulargewicht von etwa 10 000 "bis etwa 600 000 auf. Natürliche Rezeptoren variieren stark in ihrem Molekulargewicht. Im

allgemeinen beträgt dieses mindestens etwa 25 000 und kann bis zu 10 oder darüber gehen. Hierzu gehören Substanzen, wie Avidin, thyroxinbindendes Globulin, thyroxinbindendes Prealbumin und Transcortin.
20

Enzymgebundene Liganden oder Rezeptoren

Das Enzymkonjugat wird hergestellt, indem man ein Enzym mit einem Beständteil des immunologischen Paars konjugiert,

entweder unter Verwendung eines difunktionellen Reagenz oder 25

durch Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den im Bestandteil oder dem Enzym vorhandenen funktionell en Gruppen, die entweder natürlicherweise in diesen vorliegen oder durch Modifikation des Bestandteils oder des Enzyms eingeführt

werden.
30

Die Anzahl der Enzyme pro Bestandteil des immunologischen Paars variiert stark je nach der Grosse und der Art des Bestandteils des immunologischen Paars. Enzymgebundene Liganden unter Beteiligung von Haptenen weisen im allgemeinen mindestens 1 und insbesondere mindestens 2 Haptene

809885/0851

" ¹ pro Enzym auf. Die 'Anzahl kann dem Molekulargewicht des Enzyms dividiert durch 15 000 entsprechen. Wenn der enzymgebundene Ligand Antigene umfasst (Molekulargewicht > 5000) kann das Molverhältnis von Enzym zu Ligand stark variieren, im allgemeinen liegt es im Bereich von etwa 0,01 bis 100:1. Wenn das Enzym an den Rezeptor gebunden ist, liegt das Molverhältnis im allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 bis 10:1.

Für eine Konjugation von Proteinen, einschliesslich Enzymen, · an eine Reihe von unterschiedlichen Materialien, wie Proteine, beispielsweise Antikörper, Polysaccharide und nucleinsäuren, gibt es zahlreiche Beispiele in der Literatur. Es können die verschiedensten verbindenden Gruppen verwendet werden.. Zweckmässigerweise werden Hbnoxocarbonyl—, Oxocar— bonyl-, Diazo-, Sulfonyl-, Oximino-, Imido- und Thionogruppen verwendet. Bei Verwendung von Oxo carbonyl gruppen wird vorzugsweise die reduktive Alkylierung angewendet. Die bindende Gruppe zwischen den funktionellen Gruppen kann aus einer einzelnen Bindung bestehen, im allgemeinen weist diese bindende Gruppe aber mindestens 1 Kohlenstoffatom, vorzugsweise mindestens 2 und nicht mehr als etwa 20 Kohlenstoffatome und insbesondere nicht mehr als 12 Kohlenstoff atome auf. Verfahren zur Konjugation von Enzymen an Proteine

finden sich in den US-PS 3 791 932 und 3 839 153-25

Verfahren zum Konjugieren von monoepitopen Liganden finden sich in der US-PS 3 817 837, insbesondere Spalten 31 bis 34-, sowie in den Beispielen dieser Druckschrift.

Bei der Herstellung der erfindungsgemässen Enzymkonjugate ist es wünschenswert, dass ein wesentlicher Anteil der Aktivität des Enzymkonjugats erhalten bleibt, wenn ein Überschuss, bezogen auf bindende Stellen, des Rezeptors über den Liganden vorhanden, ist, wobei das Enzym im Komplex (gebunden an einen der Bestandteile des Komplexes) einen wesentlichen Anteil

809885/0851

-¹ seiner -Aktivität behält. Im allgemeinen bleiben mindestens etwa 20 Prozent der ursprünglichen Aktivität des Enzymkonjugats und vorzugsweise mindestens etwa 30 und insbesondere mindestens 50 Prozent erhalten. Es ist deshalb· wünschenswert, dass Enzyme und Enzymkon-

jugate so verwendet werden, dass die Inaktivierung des Enzyms durch Bindung des Antiliganden an den Liganden verringert wird. Es können zwar beliebige Enzyme verwendet werden, meistens finden jedoch bestimmte Enzyme den Vorzug. Bei der ¥ahl eines Enzyms ist es wünschenswert, dass das Enzym nach der Konjugation eine hohe Wechselzahl (turnover rate) aufweist, dass das Enzym ohne signifikanten Aktivitätsverlust gelagert werden kann, dass ein zweokmässiger Test für das Enzym zur Verfugung steht, der eine spektrophotometrische Bestimmung erlaubt, und dass der pH-Wert für die optimale Wechselzahl genügend nah am pH-Optimum für die Bindung des Antiliganden an den Liganden liegt. Selbstverständlich muss für die erfindungsgemässen Zwecke auch ein makromolekularer Enzyminhibitor zur Verfugung stehen, der nach der Bindung des Antiliganden an den Liganden von einer Annäherung an das Enzym abgehalten wird. Ferner ist es auch wünschenswert, dass Enzymsubstrate zur Verfügung stehen, die verglichen mit der Annäherung des Enzyminhibitors an das Enzym nicht von einer Annäherung an das aktive Zentrum des Enzyms abgehalten werden. Im allgemeinen weisen die Substrate Molekulargewichte unter 5OOO, vorzugsweise unter etwa 2000 und insbesondere unter etwa 1000 auf.

In der nachstehenden Tabelle sind verschiedene Enzyme zusammengestellt, für die das erfindungsgemässe Verfahren von besonderem Interesse ist. Die Enzymnamen entsprechen der I. ILB. -Klassifikation.

809885/0851

2830882

1. Oxidoreduktase

1.1 Wirkung auf die CH-OH-Gruppe von Donatoren 1.1.1 Mit HAD oder MADP als Akzeptor

1. Alkonol-dehydrogenase 6. Glycerin-dehydrogenase

26. Glyoxylat-reduktase

27. L-Lactat-dehydrogenase 37- Malat-denydrogenase

4-9 . Glue ο s e-6-pho sphat-dehydrogenas e

17. Mannit-1-phosphat-dehydrogenas e

.1.1.2 Mit Cytochrom als Akzeptor 3. L-Lactat-dehydrogenase 1.1.3 Mit O₂ als Akzeptor 4-. Glucose-oxidase . 9- Galactose-oxidase

1.2 Wirkung auf die CH-MHp-Gruppe von Donatoren I.4.5 Mit O₂ als Akzeptor

2. L-Aminosäure-oxidase

3. D-Aminosäure-oxidase

1.6 Wirkung auf reduziertes FAD oder EADP als Donator I.6.99 Mit anderen Akzeptoren Diaphorase

1.10 Wirkung auf Diphenole und verwandte Substanzen.als Donatoren

I.IO.3 Mit O₂ als Akzeptor

1. Polyphenol-oxidase 3. Ascorbat-oxidase

1.11 Wirkung auf H₂O₂ als Akzeptor 1.11.1

6. Katalase

7. Peroxidase 3- Hydrolasen

3.1. Wirkung auf Esterbindungen 3.1.1 Carbonsäureester-hydrolasen 7- Cholinesterase

809885/0851

; - 3-1-3 Phosphorsäuremonoester-hydrolasen

1. alkalisehe Phosphatase 3.1 - 4 Phosphorsäuredi ester-hydrolasen

3- Phospholipase C

3.2 ¥irkung auf G-lycosyl-verbindungen 3-2.1 Glyeosid-hydrolasen i. oc-Amylase

4. Cellulase 17. Lysozym

23. ß-Galactosidase

27. Amylglucosidase • 31· ß-Glucuronidase 3.4- Wirkung auf Peptidbindungen 3.4.2 Peptidyl-aminosäure-hydrolasen 1. Carboxypeptidase A

3.4.4 Peptidyl-peptid-hydrolase

5. oc-Chymotrypsin 10. Papain

3-5 Wirkung auf C-U-Bindungen mit Ausnahme von Peptidbindungen

3-5-1 In linearen Amiden

5· Urease 3.6 Wirkung auf Säureanhydridbindungen 3.6.I In Phosphorylgruppen enthaltenden Anhydriden 1. Anorganische Pyrophosphatase

4. Lyasen

4.1 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Lyasen 4.1.2. Aldehyd-lyasen

7. Aldolase 4.2 Kohlenstoff-Sauerstoff-Lyasen

4.2.1 Hydrolasen

1. Kohlensäureanhydrase 4.3 Kohlenstoff-Stickstoff-Lyasen 4.3-1 Ammoniaklyasen 3. Histidase

809885/08B1

Γ

Enzyminhibitoren

Enzyminhibitoren sind Makromoleküle, die auf das Enzym einwirken oder mit diesem reagieren, so dass die Wechselzahl des Enzyms wesentlich verringert wird und vorzugs-5

weise auf O geht. Die Enzyminhibitoren können ihre Wirkung entweder auf physikalischem oder auf chemischem Wege erzielen. Eine physikalische Hemmung kann auf zwei verschiedenen Wegen erfolgen. Entweder verhindert die Inhibitormasse die Annäherung des Enzymsubstrats oder die Bindung des Enzyminhibitors an das Enzym ergibt eine Konformationsänderung,' . die die Enzymaktivität beeinflusst. In einigen Fällen können beide Wirkungen gleichzeitig auftreten. In den meisten Fällen handelt es sich bei den physikalischen Inhibitoren

um Antikörper, die das Enzym binden (Antienzym). Es können 15

entweder ganze Antikörper oder Fab-Fragmente verwendet werden. Eine Anzahl von Antikörpern mit Hemmwirkung auf Enzyme sind im Handel erhältlich. Es können auch einzelne Enzyme als Antigene für die Herstellung von hemmenden Antienzymen verwendet werden.

Bei chemisch wirkenden Inhibitoren tritt eine chemische Reaktion zwischen dem Inhibitor und dem Enzym ein. Es können insbesondere Inhibitoren verwendet werden, die mit dem Enzym reagieren und dabei die enzymatische Aktivität verringern oder ganz beseitigen. Es sind eine Reihe von irreversibel wirkenden Inhibitoren (Inaktivatoren) bekannt, die für bestimmte Enzyme spezifisch wirken und die verwendet werden können, soweit aus ihnen sogenannte "hub"-Makromoleküle entstehen und diese die Hemmwirkung behalten.

Nachstehend sind eine Reihe von Inhibitoren und die entsprechenden Enzyme, die von diesen Inhibitoren gehemmt werden, zusammengestellt.

809885/0851 _j

-39 -

Enzym. f-Cjstathionase

Alanin-racemase

Tryptophanase Tryjptophan-synthase und (aoßo) Lactat-oxidase Monoamin-oxidase;

Plasma-amin-oxidase

ß-Cystathionase

Aspartat-aminotrarisferase /-Aminobutt ersäxire-aketoglutarat-transami- nase Eormylglycinamid-ribonucleotid-amidotrans- f erase Inhibitor

2-Amino-4-pentinsäure (I) 2-Amino-A~chlor-A~pentensäure (II) 3-3-Pichloralanin (III) 3,3,3-Trichloralanin (IV)

(IV) D-Cycloserin

(IV)

(IT)

2-Bydroxyl-3-butinsäure N, ίΓ-Tr ime thyl-2-pr op inylamin ß-Aminopropionitril 2-Bromethylamin 2-Propinylamin 2-Chlorallylamin Phenylglycin ρ-Ni tr ophenyl glyc in Aminoacetonitril

(IV)

2-Amino-3-hydroxypropyl-1-3'-carboxy-3^f-amino-1'-propenyl-1— ether

L-2-Amino-A—methoxy-trans-3-butensäure
Ethanolamin-O-sulfat

Transpeptidase (membrangebunden) Albiziin
Azaserin

Diazooxonorleucin Diazooxoanorvalin

6-Aminopenicillansäure

809885/0851

Enzym _^_ . Inhibitor

Bg-gebundene Enzyme ^ ^^-Aminocephalosporinsäure

Mimosin

Serin-protease Physostigim

Glutamin-synthetase Methionin-sulfoximin

Eotlauf-Toxin (wildfire toxin)

Enzyme mit einem Bedarf Dextranblau an Nucleotiden wie
Malatdehydrogenase und
Lactatdehydrogenas e

Peroxidase o-Dianisidin-dextran

Kompetitive, reversible Inhibitoren können verwendet werden, sind aber nicht bevorzugt, da sie mit dem Substrat um das Enzym konkurrieren und in unterschiedlichem Ausmass die enzymatisch^ Ee akti ons geschwindigkeit der Enzyme, die im mit nicht-gebundenem Enzym markierten Rezeptor vorhanden sind, verringern.

Heben den vorstehend aufgeführten, speziellen Enzymen können Tiele verwandte Enzyme verwendet werden, die durch die gleichen irreversiblen Inhibitoren inaktiviert werden. Es können auch viele Derivate von nicht-kompetitiven Inhibitoren hergestellt werden, die eine Hemmung durch Retention des aktiven Molekül teils hervorrufen können.

Handelt es sich beim Inhibitor nicht um ein Makromolekül, d.h. um ein Molekül mit einem Molekulargewicht von mehr als 2000 und insbesondere von mehr als 5000, so kann der Inhibitor an einen "hub"-Kern konjugiert werden, so dass er die erforderliche Grosse erhält, dass eine Annäherung an den Komplex verhindert wird. Bei der Konjugation des Inhibitors an einen "hub"-Kern wird eine Yerbindungsstelle gewählt, die von dem Inhibitorteil, der an der Hemmreaktion beteiligt ist, entfernt liegt. Somit werden im allgemeinen

809885/0851

vorzugsweise Inhibitoren verwendet, die Stellen aufweisen, die für die Hemmwirkung nicht kritisch sind, und die mit Enzymen, die in bezug auf die strukturellen Erfordernisse dea? entsprechenden Substrate nicht zu spezifisch sind, reagieren, lachstehend sind Beispiele für mit Proteinmolekülen konjugierte Inhibitoren und für entsprechende Enzyme, die durch diese Inhibitoren gehemmt werden, aufgeführt.

<0—s

CH-OP Protein

Protein-|>yruvat-

dehydrogenase'

ihymidylat-¹ synthetase

A=O, NH, CH₂
P = PO₂H

Zur Verknüpfung des Inhibitors mit einem Makromolekül können herkömmliche Verfahren angewendet werden. Das jeweilige Verfahren hängt vom speziellen Inhibitor und von der Natur des "hub"-Eerns ab. In einigen Fällen kann das Vorliegen einer nicht-kovalenten Bindung des Inhibitors an ein Makromolekül vorliegen, wenn eine starke spezifische oder nicht-spezifische Bindung an den "huV-Kern besteht, wobei noch eine Hemmung ermöglicht wird.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Sämtliche Temperaturangaben sind in ⁰C angegeben. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich alle Prozent- und Teilangaben auf das Gewicht, mit Ausnahme von Flüssigkeitsgemischen, bei denen sich diese Angaben auf das Volumen beziehen. Sofern nichts anderes angegeben ist, werden für die verschiedenen Reaktionen handelsübliche Produkte eingesetzt. Erläuterung

809885/0851

^Γ - 4-2 -

. ¹ von Abkürzungen: DMF = Dimethylformamid; THF = Tetrahydrofuran; G-6-PDH = Glucose-6-phosphat-dehydrogenase; BSA = Einderserumalbumin; ESA = Kaninchens erumaTbumin; HEP =

Eettich-peroxidase; T-3 = Trijodthyronin. 5

Beispiel 1

Konjugation von mit li-Methyl-liiF-dicarboxymethylaminanhydrid amidiertem Trijodthyronin mit G-6-PDH (L, mesenteroides)

A. Die Umsetzung wird in einem 25 ml fassenden, mit einer Folie umwickelten Kolben, der mit einem Magnetrühr er ausgerüstet ist und unter Argonatmosphäre steht, durchgeführt. Eine Lösung von.0,591 g Or-J-Methyiester-hydrochlorid wird in einem Lösungsmittelsystem aus 2 ml DME¹ und 2 ml THF gebildet. Diese Lösung wird mit 146 μΐ Triethylamin (1,25 Äquivalente) versetzt. Die Lösung wird 15 Minuten gerührt. Anschliessend werden 0,130 g (1,20 Äquivalente) H-Methyliminodiessigsäureanhydrid (MMIDA-anhydrid) in einer einzigen Portion zugesetzt. Bei Dünnschichtchromatographie an ergibt sich eine vollständige Umsetzung (Lösungsmittel-

system für die Dünnschichtchromatographie Essigsäure/Methanol/Chloroform = 5 ·' 10 : 85). Das Lösungsmittel wird mit einem Eotationsverdampfer entfernt, wobei zunächst eine Wasserstrahlpumpe und gegen Ende eine mechanische Vakuumpumpe verwendet wird. Die Wasserbadtemperatur steigt dabei 25

nicht über 30⁰C. Der erhaltene Eückstand wird in 8,5 ml wasserfreiem THF gelöst. Die Lösung wird mit 76 ml Essigsäureethylester versetzt. Das Gemisch wird gründlich geschüttelt. Die erhaltene Suspension wird mit Hilfe der Schwerkraft filtriert. Das FiItrat wird in einem Scheide-

trichter mit 10 ml Wasser und sodann mit 20 ml gewaschen und sodann zur Trocknung 2 mal mit je 15 ml einer gesättigten Salzlösung versetzt. Eine weitere Trocknung wird mit MgSO^ durchgeführt, welches anschliessend mit Hilfe der Schwerkraft abfiltriert wird. Das Lösungsmittel wird am Eotations-

verdampfer entfernt. Das Produkt wird in Chloroform sus-

L 809885/0851

r -ι

.¹ pendiert. Anschliessend wird-die Suspension mit Petrolether als Kolösungsniittel versetzt. Das Lösungsmittel wird sodann durch Filtration entfernt. Das feste Produkt wird in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Nach der Trocknung erhält man 0,34-6 g 1-3-MEMIDA in Form eines weissen Pulvers..

B. In 1 ml THP werden 2,21 χ 10~² g N-Hydroxysuccinimid gelöst. Getrennt davon werden in 1 ml wasserfreiem THF 3,61 x 10 g Dicyclohexylcarbodiimid gelöst. In einen Reaktionskolben werden 7 mg des vorstehend erhaltenen T-3-MEfflDA und 344·/U-I wasserfreies THF gegeben. Das Reaktionsgemisch wird auf Eisbadtemperatur gekühlt. Anschliessend werden 46 μΐ der NHS-Lösung und 55 ,¹¹I der DCC-Lösung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird gegen Lichteinstrahlung geschützt und etwa 27 "fS Stunden im Kälteraum. (2°C) gerührt. Hierauf wird die Lösung durch einen Glaswollpfropfen filtrxert. Das FiItrat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der erhaltene weisse Feststoff wird in etwa 1 ml einer Mischung von 20 Prozent η-Hexan in CI^CIo gelöst und mit einer mit Cellulosepulver gepackten Säule der Abmessungen 0,6 χ 4,5 cm im gleichen Lösungsmittel chromatographiert. Die Elution wird mit dem vorgenannten Lösungsmittel mit schwerkraftbedingter Strömungsgeschwindigkeit durchgeführt. Es wird etwa die 2-fache Menge des Säulenvolumens an Laufmittel verwendet. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von etwa 0,25 ml aufgefangen. Die Fraktionen 2 bis 5 werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in wasserfreiem Diglykoldimethylether gelöst.

C. In 2 ml wasserfreiem 0,05 m Carbonatpuffer vom pH-Wert 9 werden 12,1 mg lyophilisiertes G-6-PDH (L. mesenteroides) gelöst. Die Lösung wird über Nacht gegen 350 ml des gleichen Puffers dialysiert. Der Rückstand im Dialyseschlauch wird mit Dialysat auf ein Volumen von 3 ml eingestellt.

809885/0851

γ -ι

· 'Die Lösung wird sodann mit dem gleichen Puffer auf eine Konzentration von 2,16 mg/ml Enzym eingestellt. 3 ml der Lösung werden in einen Reaktionskolben gegeben, der mit einem Rührer ausgerüstet ist. Die Lösung wird über Nacht in einem Eisbad gekühlt. Sodann werden unter Kühlung 1 ml DMF in einer Geschwindigkeit von 15O,ul pro Minute zugegeben. Anschliessend wird ein Volumen von 1 ml entfernt. Die verbleibenden 3 ml werden nach folgenden Angaben mit. T-3-MEMIDA-EHS-Ester in einer Konzentration von 0,385 Äquivalenten pro p.1 versetzt. Es werden zwei Zugaben von 10^nI, anschliessend eine Zugabe von 2O_xUl, sodann zwei Zugaben .von. je 30 jxL vorgenommen, wobei Abstände von 20 Minuten zwischen den einzelnen Zugaben eingehalten werden. Bach geder Zugabe wird die enzymatisch^ Aktivität in Gegenwart und Abwesenheit von anti-T-3· ermittelt. Das Reaktionsgemisch wird in einen 23 mm-Spectrapor-Dialysebeutel (Molekulargewicht-Ausschlussgrenze 25 000) gegeben und 2 mal gegen je 0,5 Liter einer 0,05 m Tris-HCl-Lösung mit einem Gehalt an 0,1 m KGl und 1 millimolar EaN^ vom pH-Wert 8,0 im Kälteraum dialysiert. Die Dialyse wird wiederholt. Der nach 10-minütigem Zentrifugieren bei 15 000 U/min und 2⁰C zur Entfernung des Dialyserückstands erhaltene Überstand wird an einer mit G-50M gepackten Säule der Abmessungen 0,9 x 98,5 cm in 0,05 m Tris-HOl-Puffer vom pH-Wert 8,0 mit einem Gehalt an 0,1 m KCl und 1 millimolar HaELz Chromatograph! ert. Die Elution wird mit dem vorgenannt en Puffer bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 Tropfen/min durchgeführt. Es werden Fraktionen von jeweils 20 Tropfen aufgefangen. Die Fraktionen 29 bis 33 werden vereinigt und 10 Minuten bei 1°0 und 1? 000 U/min zentrifugiert.

In eine kalte Reaktionsampulle (Pierce Reactivial), die mit einem Rührstab versehen ist, werden 3 ml der vorgenannten Lösung und 1 ml einer kalten 4 m neutralisierten Hydroxylaminlösung in Wasser innerhalb von 5 Minuten langsam zugegeben, wobei gerührt wird. Mach 10-minütiger "Umsetzung bei

_L 809885/0851 _,

Λ Eisbadtemperatur wird die Reaktion weitere 90 Minuten bei Baumtemperatur fortgesetzt. Sodann wird das Reaktionsgemisch an einer mit Sephadex G-5OM gepackten Säule im vorstehend erläuterten Tris-Puffer chromatographiert und mit dem gleichen Puffer "bei Raumtemperatur eluiert. Die Abmessungen der Säule sind 0,9 x 98 cm. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 4 Tropfen/min. Es werden Fraktionen von 20 Tropfen aufgefangen. Die Fraktionen 29 bis 34 werden vereinigt und im Kälteraum unter Verwendung einer Vorrichtung mit einem Coilodiumbeutel mit einer Molekulargewichts-Ausschlussgrenze von 25 000 eingeengt. Der. Rück stand wird mit 2 ml des vorstehend erläuterten Txis-HCl-Puffers eingestellt. Ein 1 ml-Aliquotanteil wird 2 mal gegen je 250 ml kalten 50 millimolaren Carbonatpuffer vom pH-Wert 9 »05 dialysiert.

Aufgrund einer Proteinbestimmung nach Lowry und einer radioaktiven Zählung (das MEMIDA ist mit C markiert) wird eine Anzahl von etwa 16 T-3-Gruppen pro Enzym berechnet.

Beispiel2 Herstellung eines Kon,jugats aus Digoxin und G-6-PDH

A. Eine klare Lösung von 228 mg (0,59 Millimol) 3-Ketodigoxigenin, 140 mg (0,64 Millimol) Carboxymethoxylaminhydrochlorid und 294 mg (3,6 Millimol) Natriumacetat in

18 ml Methanol (getrocknet über Molekularsieb 3A) wird 3 Stunden'unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Die dünnschichtchromatographische Analyse eines Aliquotanteils ergibt eine vollständige Bildung des Oxinderivats (R--Wert = 0,33» Kieselgelplatte, Laufmittel: Essigsäure, Methanol und CHGl₅ = 0,5 : 1: 10). Das erhaltene Reaktionsprodukt wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird bei 5 bis 10°C in 32 ml 5-prozentiger Eatriumhydrogencarbonatlösung gelöst. Die Lösung wird 3 mal mit je 20 ml Chloroform extrahiert. Die ITatriumhydrogencarbonatphase wird bei 5 bis 10⁰C mit 28 ml 1 '.n Salzsäure auf den pH-Wert 2 bis 3 angesäuert und

809885/0851

Γ Π

10 mal mit je 25 ml Essigsäureethylester extrahiert. Die Essigsäureethylesterextrakte werden mit gesättigter Matriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Each dem Eindampfen des Lösungsmittels erhält man einen Feststoff, der nach Kristallisation aus einer Mischung von Methanol, Essigsäure ethyl ester und Hexan 188 mg weissen Feststoff vom I. 202 bis 220⁰C (Zers.) ergibt.

B. Ein trockener Kolben, der mit einem Serumstopfen und einem Trockenrohr versehen ist, wird mit 25,05 mg (0,05 Millimol) des Oxims und 250 yß. DMP (getrocknet über 4-⁰A-MoIekularsieb) versetzt. Durch den Serumstopfen werden 7,1 ,ul (0,052 Millimol) wasserfreies Triethylamin mit einer Spritze zugesetzt, wobei bei Eaumtemperatur gerührt wird. Fach dem Abkühlen des Gemisches auf -14°C werden 9,34,Ul (0,05 Millimol) Ethylenglykolchlorameisensäureester (carbitol chloroformate) unter die Oberfläche der Lösung gegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt.

In einem getrennten Kolben werden 2 ml Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G-6-PDH) in einer Konzentration von etwa 1 bis 2 mg/ml in 0,055 m Tris-Puffer vom pH-Wert 8,1 unter Rühren mit 20 mg Dinatriumsalz von Glucose-6-phosphat und mit 40 mg ITADH versetzt. Während der Umsetzung werden AIiquotanteile entnommen, deren enzymatische Aktivität bestimmt

einen
wird, indem man ./' · 5 ^uI-Aliquotanteil der verdünnten Enzymlösung mit 1 ml Puffer und 50 pl Substrat verdünnt, die erhaltene Lösung in einen 1,5 ml Probenbehälter einführt und eine Durchflusszelle verwendet. Die Ablesung der enzymatischen

30' Aktivität wird in Abständen von 60 Sekunden in einem GiIf ord-Spectrophotometer vorgenommen. Das Gemisch wird sodann auf O⁰C gekühlt und langsam unter Rühren mit 1,08 ml Carbitol versetzt, das mit einer Spritze unter die Oberfläche der Lösung gegeben wird. Fach 30-minütigem Stehenlassen wird der gebildete Niederschlag 4 Minuten mit einer Brinkman-Zentrifuge ab zentrifugiert. Der abgetrennte Überstand wird mit 1 η

L 809885/0851 _ι

r .■■■.■

- NaOH-LÖsung auf einen pH-¥ert von etwa 9,0 gebracht. Zu diesem Zeitpunkt wird die enzymatisch^ Aktivität kontrolliert.

Die Enzymlösung wird unter Rühren mit 1 pl Aliquotanteilen des auf die vorstehende Weise hergestellten gemischten Anhydrids in einer Geschwindigkeit von etwa 1 ^μΐ pro 1 Minute versetzt. Mach Zugabe von 10 ^uI des gemischten Anhydrids wird die prozentuale Hemmung und die prozentuale Inaktivierung ermittelt. Die prozentuale Hemmung wird bestimmt, indem man etwa 5 p3- ' vollaktives Antidigoxin im vorgenannten Test verwendet. Etwa 35 "bis 4-5 p3- ctes gemischten Anhydrids werden zugesetzt, um eine Hemmung von etwa 50 Prozent und eine Inaktivierung von etwa 36 Prozent zu erzielen. Nach Erreichen der gewünschten Hemmung und Inaktivierung wird das Enzymkonjugat durch Dialyse gegen 0,055 m Tiris-HCl-Puffer vom pH-Wert 8,1 mit einem Gehalt an 0,05 Prozent ITaN-, und 0,005 Prozent Thiomersal gereinigt.

Gemäss dem vorstehend 'beschriebenen Verfahren erhält man in einer ersten Umsetzung ein Enzymkonjugat mit 5 an das Enzym gebundenen Digoxingruppen, wobei das Enzym zu 36 Prozent inaktiviert und zu 50 Prozent gehemmt ist. In einer zweiten Reaktionsfolge erhält man ein Enzymkonjugat mit 9»2 Digoxingruppen, wobei eine 4-8-prozentige Inaktivierung und 62-prozentige Hemmung vorliegt.

Beispiel 3 Konjugation von menschlichem /^-Globulin (hlffG) an HRP

-Ä- 10,95 S lyophilisiertes HRP werden in 0,5 ml 0,3 m NaHCO₃-Puffer vom pH-Wert 8,6 gelöst. Die Lösung wird in einen Dialysebeutel gegeben und gegen 5OO ml eiskalten Puffer (vgl. oben) 3 Stunden im Kälteraum dialysiert. Sodann wird der pH-Wert der Lösung auf 8,1 eingestellt und die Lösung ,-r^

wird weitere 4- Stunden dialysiert. Das Volumen der HRP-Lösung

809885/0851

Γ Π

wird mit Dialysat.. auf 2 ml eingestellt. Nach spectrophotometrischer Analyse ergibt sich eine Konzentration von 3 »46 mg/ ml.

B. 1,5 ml der vorstehenden Lösung werden "bei Eaumtemperatur unter Rühren mit 100 ;ul einer 1-prozentigen Lösung von Fluordinitrobenzol in 95-piOzentigem Ethanol versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde gerührt, wobei direkter Lichteinfall vermieden wird. Anschliessend werden 1 ml einer 40 millimolaren Perjodatlösung zugesetzt. Das Gemisch wird unter den gleichen Bedingungen 1/2 Stunde gerührt. Anschliessend werden 0,5 ml einer 0,34 m wässrigen Ethyl englykoll ö sung zugesetzt. Nach weiterem Rühren von 1 Stunde unter den gleichen Bedingungen wird das Reaktionsgemisch in einen Dialysebeutel gegeben und 3 mal gegen Je 900 ml 10 millimolaren NaHCO.,-Puffer vom pH-Wert 9»5 im Kälteraum dialysiert.

C. 9₅7 mg lyophilisiertes hlgG (Miles Laboratories, lyophilisiert und mit DEAE-Cellulöse behandelt, Chargen Nr. 24) werden in 0,5 ml 10 millimolarem NaHCO^-Puffer vom pH-Wert 9,5 gelöst. Die Lösung wird 2 mal gegen je 500 ml eiskalten Puffer (vgl. oben) dialysiert. Anschliessend wird die Lösung mit Dialysat auf ein Volumen von 1,2 ml eingestellt. Nach 4-minütigem Zentrifugieren mit einer Brinkman-Mikrozentrifuge bei 2 bis 4°C ergibt die spectrophotometrische Analyse eine Konzentration von 5»28. mg/ml.

D. Der dialysierte Rückstand des HRP-Dialdehyds (5,2 mg HRP, 1,3 χ 10"'¹ ^uMoI) wird bei. 2 bis 4°C unter Rühren mit 0,95 ml

des dialysierten hlgG-Rückstands (5 mg, 3*1 x 10 versetzt. Das Gemisch wird 45 Minuten gerührt. Anschliessend wird das Gemisch mit 5 mg (1,32 χ 10 Mol) NaBH. versetzt. Das Gemisch wird 4 1/2 Stunden bei 2 bis 4°C gerührt und sodann 2 mal gegen je 300 ml PBS (10 millimolar Na₂HPO^, 0,15 m NaCl, pH-Wert 7»0) im Kälteraum dialysiert. Der Dialyse-

L 809885/0851 _J

Γ Π

~⁴⁹~ 283Q862

- !rückstand wird mit einer Collödiumbeutel-Vorrichtung (MoIekulargewichts-Äusschlussgrenze 25 000) im Kälteraum weiter auf ein Volumen von etwa 1 ml eingeengt und sodann im Kälteraum 2 AnUt en mit einer Brinkman-Mikr ο zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird an einer mit Sephadex G-200 gepackten Säule (Gel in PBS) chromatographiert. Zur Elution mrd der vorgenannte PBS-Puffer verwendet. Die Strömungsgeschwindigkeit "beträgt 1 Tropfen pro 30 Sekunden. Es werden !Fraktionen von jeweils 20 Tropfen aufgefangen. Der Arbeitsdruck "beträgt 15 cm. Die Chromatographie wird bei Raumtemperatur durchgeführt.

Die verschiedenen Fraktionen werden spectrophotometrisch analysiert. Ferner wird ihre enzymatisch« Aktivität bestimmt. Die Fraktion 48 enthält 1,65 χ 10~⁶ m HRP und 1,32 χ 10~ m hlgG, entsprechend einem Verhältnis von hlgG zu HRP von 0,80. Der Enzymtest wird weiter unten erläutert.

Beispiel 4 Konjugation von hlgG an G-6-PDH

Ein mit Eis gekühlter Reaktionskolben wird mit 0,42 xiMol £/ C__7-hIgG in 0,5 m NaHCO,-Puffer vom pH-Wert 10 versetzt Anschliessend werden 0,52 g (4,2 χ 10""* m) Ethylacetimidat in 3 ml entionisiertem Wasser, das mit Natriumhydroxid auf

den pH-Wert 10 eingestellt ist, zugegeben. Nach. 5-Rühren bei 4⁰C wird das Gemisch 25 Minuten "bei Raumtemperatur gerührt. Eine zweite Zugabe der gleichen Menge an Ethylacetimidat wird unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten Zugabe vorgenommen. Sodann wird die Reaktionslösung

in einen Dialysebeutel übertragen und 3 mal bei 2°C gegen je 1400 ml 0,5 m K₂HPO^ dialysiert. Nach dem Einstellen des pH-Werts mit konzentrierter Salzsäure auf 7*8 wird die Lösung im Beutel in zwei Teile geteilt und 30 Minuten bei 12 K und 2⁰C in einer Sorval-Zentrifuge zentrifugiert. Die

Lösung wird sodann in einer Collodiumbeutel-Apparatur gegen

PBS vom pH-Wert 7₅8 eingeengt.
, 809885/0 8 51 .

Durch 9-stündige Behandlung auf einem siedenden Wasserbad wird Sephadex G-200 gequollen. Hit dem gequollenen Sephadex G-200 wird eine Säule der Abmessungen 2 χ 89 cm in PBS vom pH-Wert 6,7 geschüttet. Ein Teil der vorgenannten Lösung wird auf die Säule aufgesetzt. Die Fraktionen werden mit PBS vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,02 Prozent MaM₅ eluiert. Die mit dem ungleichmässig arbeitenden Fraktionssammler erhaltenen Fraktionen 113 t>is 145 werden vereinigt und gegen 100 millimolaren Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 dialysiert, wobei 1 mal gegen 1200 ml und 2 mal gegen 1000 ml Puffer dialysiert wird. Das ursprüngliche Volumen beträgt 38 ml und das Endvolumen 35 ml. Die Lösung wird sodann mit einer Collodiumbeutel-Vorrichtung auf ein Volumen von 6,2 ml mit einem Gehalt an 2,36 mg/ml hlgG eingeengt.

_Q

B. 1 ml der vorgenannten Lösung (1,48 χ 10 Mol hlgG) wird mit 1 ml 0,06 m Uatriumperjodat (6 χ 10"-⁷ Mol) in Wasser vom pH-Wert 8,1 versetzt. Das Gemisch wird 3 1/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das Gemisch mit 1 ml 0,16 ι wässrigem Ethylenglykol versetzt. Das Gemisch wird 11/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wird das Reaktionsgemisch in einen Dialysebeutel gegeben und 3 mal gegen 5OO ml 50 millimolaren NaHCO^-Puff er vom pH-Wert 9 und anschliessend gegen 5OO ml 200 millimolaren HaHCO,-Puffer vom pH-Wert 8,8 dialysiert.

C. Etwa 3,5 ml G-6-PDH (L.mesenteroides, Chargen Br. 6A053-402) werden gründlich gegen 200 ml 200 millimolaren NaHCO^-Puffer vom pH-Wert 8,8 dialysiert.

Die Lösungen von hlgG (2,27 mg, 1,42 χ 10~⁸ Mol) und G-6-PDH (8,82 mg, 8,48 χ 10 Mol) werden vereinigt, wodurch sich ein Gesamtvolumen von 6,6 ml ergibt. Diese Lösung wird gerührt und mit einem Eisbad gekühlt. Anschliessend wird das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt und weitere 4 Stunden gerührt.

_L 809885/08 51 _,

γ -ι

Λ Nach dem Abkühlen des Gemisches in einem Eis/Wasserbad werden 5 mg NaBH₂, zugesetzt. Das Gemisch wird 5 1/2 Stunden in einem Eisbad stehengelassen. Anschliessend wird die Lösung in einen Dialysebeutel gegeben und gründlich bei 2 bis 4°C gegen 10 millimolaren K₂HPO^-PUff er mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl vom pH-Wert 9 dialysiert. Hierauf wird das Reaktionsgemisch in einer Collodiumbeutel-Vorrichtung gegen PBS vom pH-Wert 7»O auf ein Volumen von 2,4 ml eingeengt.

.Eine Säule der Abmessungen 2 χ 84 cm wird mit Sephadex G-200 in PBS vom pH-Wert 7,0 geschüttet. Das Reaktionsgemisch wird auf die Säule aufgesetzt und mit PBS vom pH-Wert 7»0 bei Raumtemperatur eluiert, wobei Fraktionen mit 40 Tropfen aufgefangen werden. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 5 Tropfen/ min, wobei ein Druckkopf von etwa 18 cm verwendet wird. Die Fraktionen werden auf ihre enzymatische Aktivität und auf ihre Radioaktivität untersucht. Der Enzym te st ist weiter unten erläutert.

Beispiel" 5
Konjugation von o-Dianisidin an Dextran 10

Eine Lösung von 0,5 g Dextran 10 in 2 ml Wasser wird auf 4°C gekühlt und mit 250 >ul einer Lösung von 100 mg/ml CNBr in Wasser von 4°C versetzt. Der pH-Wert wird durch kontinuierliche Zugabe von 1 η NaOH auf 11 gehalten. Nach 5 Minuten' wird ein 200 ^iL-Aliquotanteil entnommen und mit Aceton versetzt. Die Lösung wird 5 Minuten bei 4°C und 10 K zentrifugiert. Όer Zentrifugenrückstand wird isoliert und in einem Gemisch aus DMF/0,1 m Hydrogencarbonatpuffer vom pH-Wert 9 gelöst. Eine Lösung von 20 mg o-Dianisidin pro 1 ml im gleichen Gemisch wird zugesetzt, wobei sich ein Mol verhältnis von Dextran 10 zu o-Dianisidin von 1 : 10 ergibt. Der pH-Wert wird auf 9 eingestellt. Sodann wird das Reaktionsgemisch über Nacht im Dunklen unter leichtem Rühren stehengelassen. Anschliessend wird das Gemisch mit 100 ^uI 1 m wässrigem 1-Amino-2-

L 809885/08 51 _,

γ -ι

-propanol versetzt. Der pH-Wert wird mit 1 η HCl auf 9 eingestellt. Anschliessend wird das Gemisch. 3 Stunden "bei Raumtemperatur im Dunklen stehengelassen. Sodann wird der pH-Wert auf 7 eingestellt. Fach 5-minütiger Zentrifugation bei 4-⁰C und 10 K wird der Überstand isoliert.

Eine mit Sephadex G-25 gepackte Säule der Abmessungen 2 χ 40 cm in 0,01 m PO.-Puffer mit einem Gehalt an 0,2 m UaCl vom pH-Wert 7 wird mit dem vorstehenden Überstand versetzt. Das Produkt wird mit dem gleichen Puffer mit einer Geschwindigkeit von 35 ml/Std. eluiert. Es werden Fraktionen von 80 Tropfen aufgefangen, wobei die Säule im Dunklen gehalten wird. Die Fraktionen 21 bis 25 werden vereinigt.

' Beispiele

Konjugation von Rettich-Peroxidase (HRP) an anti-(hlgG)

In einen Dialysebeutel werden 4- ml anti-(hlgG) (]F -spezifisch; Dako Chargen Hr. 015, Titer 600 ug/ml) mit einem Gehalt an 8,5 mg/ml gegeben. Sodann wird 3 mal gegen je 350 ml 0,1 m

Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7i5 "bei 2 bis 4-°C in einem Kälteraum dialysiert. Der Rückstand wird mit 5,1 ml Dialysat verdünnt und 10 Minuten bei 2 bis 4-⁰C und 15 000 U/min zentrifugiert.

^Λ°

Ein/ml fassender Rundkolben wird mit 5 ml (32,3 mg) der vorstehend erhaltenen anti-(hIgG)-Lösung mit einem Gehalt an 6,4-5 mg/ml versetzt. Unter Kühlung in einem Eisbad und unter Rühren werden 15 /Hl einer 1,5 x 10 m Lösung von Sl /I

/~ C_7-Es s igs äure anhydr id in Benzol zugegeben. Nach 2 3/4-Stunden wird die Reaktion durch Zugabe einer wässrigen Lösung von 2 m Hydroxylamin und 2 m NaCl gestoppt. Fach dem Entfernen des Eisbads wird das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Dialyse gegen 350 ml 0,1 m Natriumphosphatlösung mit einem Gehalt an 0,1 m Natriumsulfat vom pH-Wert 7,1 wird der Rückstand an G-25 M-GeI, das mit dem vorge-

8 09885/0851

Γ

- - 53 -

nannten Dialysepuffer gequollen ist, in einer Säule der Abmessungen 2 χ 44 cm chromatographiert. Die ELution wird mit dem gleichen Puffer vorgenommen. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 10 Tropfen/min (36 ml/Std.). Es werden Fraktionen mit einem Volumen von 2,4 ml aufgefangen.

Die die Eadioaktivität enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Es ergibt sich ein Gesamtvolumen von 23 ml mit einem Gehalt an 31,5 mg anti-(hlgG). Ein Anteil von 22,5 ml (30,8 mg) des anti-(hlgG) werden in einen Dialysebeutel gegeben und 3 mal gegen 1 Liter eiskalte, zu 50 Prozent gesättigte Ammoniumsulfatlösung im Kälteraum dialysiert.

Rettich-Peroxidase (Sigma YI, Chargen Nr. 650-9530) werden in gesättigter Ammoniumsulfatlösung gelöst. Man erhält eine Lösung mit einem Gehalt an 6,5 mg/ml. Ein 1 ml-Aliquotanteil wird 4 Minuten im Kälteraum zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen.. Der Zentrifugationsrückstand wird in 5 ml eiskalter 0,3 m Natriumhydrogencarbonatlösung vom pH-Wert 8,5 gelöst und 3 mal gegen je 400 ml 0,3 m Natriumhydrogencarbonatpuffer vom pH-Wert 8,5 im Kälteraum dialysiert.

Das dialysierte anti-(hlgG) wird mit Dialysat auf 17 ml verdünnt, wodurch sich eine Konzentration von 1,81 mg/ml ergibt. Ein 3 ml-Aliquotanteil (5»^ mg) dieser Lösung bei 50-prozentiger Sättigung mit Ammoniumsulfat wird. 5 Minuten bei 2 bis 4°C und 10 000 U/min zentrifugiert. Der Überstand

millimolarer wxrd verworfen. Der Niederschlag wird in 0,5 ml 10/ Natriumhydrogencarbonat/Natriumcarbonat-Puffer vom pH-Wert 9*5 gelöst. Die Lösung wird 3 mal gegen je 350 ml des gleichen Puffers dialysiert. Der aus Rettich-Peroxidase bestehende Rückstand wird mit dem Dialysat auf 1,1 ml verdünnt. Die UV-Analyse eines Aliquotanteils ergibt eine Konzentration von 6,31 mg/ml.

0,8 ml der vorstehenden HRP-Lösung werden zu 0,2 ml Eatrium-

809885/0851

γ -ι

hydrogencarbonatpuffer gegeben, wobei sich ein Gesamtvolumen von 1 ml ergibt. Unter Rühren werden 100 ^uI einer 1-prozentigen Lösung von 2,4-Dinitrofluorbenzol in 95-P^ozentigem Ethanol zugegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raum-' temperatur gerührt, und dabei gegen Licht geschützt. Anschliessend wird das Gemisch tropfenweise mit 1 ml einer wässrigen 30,2 millimolaren Natriumperjodadlösung versetzt. Das.Gemisch wird 1/2 Stunde gerührt und dabei gegen Licht geschützt. Hierauf wird 1 ml einer wässrigen 0,34 m Ethylenglykollösung zugesetzt. Das Gemisch wird eine 3/4 Stunde gerührt und anschliessend 2 mal gegen je 350 ml eines eiskalten 10 millimolaren Natriumhydrogencarbonat/Natriumcarbonat-Puffers vom pH-Wert 9₅5 dialysiert.

Ein Reaktionskolben wird mit 1 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 4,5 mg/ml anti-(hlgG) im Natriumhydrogencarbonat/ Natriumcarbonat-Puffer versetzt. Anschliessend wird die Lösung des Reaktionsprodukts aus Rettich-Peroxidase und Per-Jodad zugesetzt. Das HRP/anti-(hIgG)M-Yerhältnis beträgt 4,2.Nach 30-minütigem Rühren werden 5 »05 mg Natriumborhydrid zugesetzt. Sodann wird das Gemisch 5 1/2 Stunden bei Eisbadtemperatur gerührt. Anschliessend wird gegen 350 ml einer 0,1 m Natriumphosphatlösung vom pH-Wert 7»1 mit einem Gehalt an 0,1 m Natriumsulfat und hierauf gegen wässriges gesättigtes Ammoniumsulfat dialysiert. Der Rückstand wird 4 Minuten bei 2 bis 4⁰C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Der Rückstand wird in 0,4 ml Phosphat-Sulfat-Puffer gelöst. Die Lösung wird an einer mit Sephadex G-200-Säule (Gel im gleichen Puffer gequollen) der Abmessungen 1,5 x 88 cm chromatographiert. Die Elution wird mit dem gleichen Puffer vorgenommen. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 2 Tropfen/min. Es werden Fraktionen von 20 Tropfen aufgefangen. Die Fraktionen mit einer Absorption im UV-Bereich bei 403 und 280 nm werden vereinigt und gegen gesättigte Ammoniumsulfatlösung dialysiert. Der Rückstand wird 5 Hinuten bei

809885/0851

-;¹ . 2 bis 4°C und-15 000 U/min zentrifugiert. Der tiberstand wird verworfen. Der Niederschlag wird in 0,4 ml des Phosphat-Sulfat-Puffers gelöst. Die Lösung wird an einer mit Sephadex G-200 (mit dem gleichen Puffer gequollen) gepackten Säule der Abmessungen 1,5 x 88 cm chromatographiert. Die ELution wird mit dem gleichen Puffer vorgenommen. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 2 Tropfen/min. Es werden Fraktionen von 20 Tropfen aufgefangen. Fraktionen, deren. W-Absorption auf die Anwesenheit des gewünschten Konjugats hindeutet, werden zu 3 Fraktionen vereinigt und auf HRP getestet. Zur Stabilisierung des Proteins werden alle Fraktionen auf eine Konzentration von 1 Prozent Hühnereialbumin, gebracht. Die Fraktion I enthält 4,18 χ 10"^m-. anti-(hlgG) und 5,25 χ 10 ' m HRP und weist eine spezifische Aktivität von 119 Iü/mg auf. Die Fraktion II enthält 1,08 χ 10~⁶m' anti-(hlgG) und

η
4,6 x 10 ' m HRP und weist eine spezifische Aktivität von

309 nj/mg auf. Die Fraktion III enthält 5,1 χ 10"^; anti-(hlgG) und 7556 x 10 ' m HRP und weist eine spezifische Aktivität von 684 IU/mg auf.
20

Nachstehend sind erfindungsgemässe Tests erläutert.

Im. ersten Test wird das T-3-Konjugat an Glucose-6-phosphat- ■ dehydrogenase verwendet. 5,ul einer 1 : 10-Verdünnung des Produkts von Beispiel 1 in 50 millimolarem Tris-HCl mit einem Gehalt an 0,1 Prozent RSA vom pH-Wert 7*9 werden mit folgenden Bestandteilen versetzt: 1,8 ml einer wässrigen, 50 millimolaren T;ris-HCl-Lösung mit einem Gehalt an 0,1 Prozent RSA vom pH-Wert 7,9, 50^uI 0,1 m ß-HAD vom pH-Wert 5,0 und 25^uI anti-T-3-Serum. Die Lösung wird 20 Minuten bei 30⁰C inkubiert und sodann mit 100^1 0,066 m G-6-P im Testpuffer ohne RSA und mit 2/ΐ1 anti-G-6-PDH in 25^nI Puffer in der angegebenen Reihenfolge versetzt. Der Test wird bei 340 nm bei 3O⁰C abgelesen. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird 4 Minuten lang verfolgt. Der Test wird wiederholt, mit der

80988 5/0851

283Q862

■- ¹ Abänderung, dass 25 pi- Puffer durch. 25 ;xL anti-T-3 ersetzt werden. Nach 4- Minuten beträgt die Absorption bei 34-0 nm in Abwesenheit von anti-T-3 0,012 und in Anwesenheit von anti-T-3- 0,020. Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass man die Menge eines Antiliganden, in diesem Fall anti-T-3, mit dem erfindungsgemässen Verfahren bestimmen kann. Ferner ist festzustellen, dass das Enzymkonjugat nur 5*7 Prozent der ursprünglichen enzymatischen Aktivität aufweist und eine Haptenzahl von etwa 16 hat. Die Gegenwart der grossen Anzahl von Hapteneapro Enzym sowie die geringe Aktivität haben die Wirkung, dass die Empfindlichkeit des Tests wesentlich vermindert 'wird.

Im nächsten Test zur Bestimmung von Digoxin wird das Produkt von Beispiel 2 verwendet. 5,57 χ 10"^ g (7,13 χ 10~⁶ Mol) Digoxin werden in 10 ml wasserfreiem DMF gelöst. Eine Reihe von Verdünnungen wird mit Aliquotanteilen der DMF-Lösung durchgeführt. Der Test wird ausgeführt, indem man 25^uI des Digoxin-G-6-PDH-Konjugats mit 1 ml Puffer verdünnt. Der Puffer ist hergestellt worden, indem man 0,25 S Hühnereialbumin in 250 ml einer wässrigen 50 millimolaren Tris-Hd-Lösung mit einem Gehalt an 1 millimolar UaIT, vom pH-Wert 758 löst, wodurch sich eine 0,1-proζentige Hühnereialbuminlösung vom pH-Wert 7»8 ergibt. Die Lösung wird sodann mit einem vorinkubierten Gemisch von 25 ,ul Antidigoxin (1 ^uI Antidigoxin verdünnt mit Puffer), 1 ml Testpuffer und 2^il Digoxinlösung versetzt. Nach 10-minütiger Inkubation bei 30⁰C werden 50 ;ul 80 millimolares ß-HAD vom pH-Wert 5,1 bei 30⁰C zugesetzt. Das Gemisch wird 1/2 Minute bei 34-0 nm bei 30⁰C getestet.

Anschliessend werden 5 ^l anti-G-6-PDH zugesetzt. Der Test wird 51/2 Minuten bei 30⁰C bei 34-0 nm abgelesen. In der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse zusammengestellt.

809885/0851

	- 57 -	II	v1	*	v2	>a;	o,	7
	Tabelle	36,5+	0,5	58,8 +	*	o,	3
Probe+ Nr.	Digoxin, mx6,77 (im Test)	43,0+	0,5	55,0 +	o,	7
1	O	56,0+	0,5	19,5 ±	1,	O
2	1x10~9	59,5+	0,5	15,0 +
3	1x10~8
4	1x1 O*"7

*v : Absorptionsdifferenz innerhalb der ersten halben Minute;

*v : Absorptionsdifferenz innerhalb der nächsten 5 1/2 Minuten.

Die Ergebnisse stellen die Mittelwerte von zwei Ablesungen dar und sind entsprechend korrigiert.

⁺ Konzentration in der Testlösung:

-1Ω

Digoxin-G-6-PDH-Konjugat 4,3 χ 10 m

■ Anti-(digoxin) 4,0 χ 10~⁸ m.

ρ
Die Ergebnisse von ν zeigen, dass die Digoxinkonzentration über einen 10 -Bereich bei sehr niedrigen Konzentrationen

-8 -9
wie etwa 10 bis 10 m Digoxin bestimmt werden kann.

Der nächste Test erläutert die Eignung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Bestimmung von Antigenen im Vergleich zu den vorstehend aufgeführten Haptenen. Dabei werden 2_yul HRP-hlgG— Konjagat mit 200^uI Puffer, der mit 20,Ul hlgG und 2^ anti-hlgG versetzt ist, verdünnt. Das Gemisch wird 1/2 Stunde bei 30⁰C inkubiert. Anschliessend werden 4^uI anti-EEP zugesetzt, wonach eine weitere Inkubationszeit von 1/2 Stunde folgt. Das Gemisch wird sodann mit 1,8 ml Puffer mit einem Gehalt an 0,22 millimolar o-Dianisidin und 10 ml 22 millimolarem Wasserstoffperoxid versetzt. Die Absorptionsänderung bei 460 nm bei 3O⁰C innerhalb von 1 Minute wird von Beginn

809885/0851

-¹ der Reaktion an ermittelt. Die Endkonzentrationen "betragen 1,3 χ 1O~\ für das HEP-hlgG-Konjugat, 3,7 χ 10~⁸ m für anti-hlgG und 4·,6 χ 10 m für anti-HEP. Der verwendete Puffer enthält 0,01 m ffatriumphosphat, 0,05 m Natriumsulfat, 0,1 Prozent Hühnerei albumin und 4-, Q Prozent Polyethylenglykol 6000 vom pH-Wert 7,0.

In der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse bei verschiedenen hlgG-Konz ent rat ionen angegeben. 10

Tabelle III

Probe	hlgG m	Geschwindigkeit der	144
Hr.	(im Test)	Absorptionsänderung, OD/min	84
1	O	144,	87
2 -	1 χ 1Ο~7	96,	126
3	1 χ 10"8	93,	138
4	1 χ 10~9	123,	138
5	1 χ 10"	135,
6	1 χ 10"11	138,

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, dass erfindungs-

gemäss ein empfindlicher Test zur Bestimmung von menschlichem 25

/(^-Globulin zur Verfügung gestellt wird, wobei Konzentra-

—10
tionen bis herunter zu 10 m nachgewiesen werden können. Perner hat die Bestimmung den Vorteil, dass sie nach einigen einfachen Zugaben und Inkubationsschritten, für die insgesamt etwa 1/2 Stunde erforderlich ist, rasch durchgeführt werden kann. Es wird eine einfache spektrophotometrische Ausrüstung verwendet, wobei die Ablesung im sichtbaren Bereich erfolgt.

Beim nächsten Test wird hlgG unter Verwendung des Konjugats ⁰^ von Beispiel 4 und des Enzyms G-6-PDH bestimmt. Die Fraktion

809885/0851

Γ -η

- .42 des genannten Präparats -wird verwendet. Der Test wird durchgeführt, indem man ein Gemisch aus 0,2 ml der Fraktion 42 in 0,2 ml einer 3»68 χ 10 ^ m Lösung von anti-hlgG in. Puffer mit einem Gehalt an 10 millimolar Natriumphosphat und 50 millimolar Natriumsulfat vom pH-Wert 7,48 herstellt. Die

—2 Konzentration des hlgG in der !Fraktion 42 beträgt 2,54 χ mg/ml und die Konzentration von G-6-PDH beträgt 1,58 χ 10 mg/ml. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 3O⁰G inkubiert. Sodann wird eine Lösung von 1,6 ml Puffer, 0,05 ml G-6-P und 0,05 ml MAD hergestellt und 3 Minuten in einer Küvette bei inkubiert. Als Puffer wird 50 millimolar er Iris-HCl-Puffer mit einem Gehalt an 0,1 Prozent ESA und 1 millimolar EaII₅, vom pH-Wert 7>8 verwendet. Die G-6-P-Lösung weist eine Konzentration von 140 millimolar im Puffer ohne HSA und die NAD-Lösung eine Konzentration von 80 millimolar in entionisiertem Wasser vom pH-Wert 5 auf. Die Küvette wird sodann mit 0,05 ml cLes vereinigten Produkts aus Konjugat und antihlgG, das vorinkubiert worden ist, versetzt. Die Lösungen werden durch Umdrehen der Küvette vermischt. Die Ablesung wird 2 1/2 Minuten bei 340 nm vorgenommen. Sodarm wird die Ablesung unterbrochen. 1 yß. anti-G-6-PDH werden zugesetzt, wodurch sich ein Überschuss an anti-G-6-PDH im Testmedium ergibt. Die Lösung wird durch Umdrehen vermischt. Die Ablesung wird 5 Minuten bei 340 nm vorgenommen.

Das Verfahren wird mit der Abänderung wiederholt, dass anstelle der 0,2 ml anti-hlgG 0,2 ml PBS vom pH-Wert 7 verwendet werden.

Die Geschwindigkeit zwischen der ersten und zweiten Minute, angegeben in Milliabsorptionseinheiten/min beträgt in Abwesenheit von anti-G-6-PDH <51,8 und zwischen der fünften und vierten Minute der 5-Minuten-Periode 22,2 in Gegenwart von anti-G-6-PDH, wenn anti-(hlgG) vorhanden ist. In Ab-Wesenheit von anti-(hlgG) ergeben sich Werte von 52*4 bzw. 2,3.

809885/08 51

Aus den vorstehenden Ergebnissen zeigt sich, dass man die Anwesenheit von anti-hlgG bei äusserst geringen Konzentrationen feststellen kann. Ferner lässt sich hlgG bestimmen, da die Anwesenheit von hlgG im Testmedium die Wirkung hat, dass die Menge des hlgG, das für eine Bindung an das hlgG-G-6-PDH-Konjugat zugänglich ist;, verringert wird.

Beim nachstehend erläuterten letzten Test wird ebenfalls hlgG als Beispiel für Antigene verwendet. Dabei wird die Wirkung von zugesetztem Antikörper bzw. einer Kombination von Antikörper und Antigen gezeigt. Der Test zeigt auch die Verwendung eines Enzyminhibitor-Substrats, das das Enzym inaktiviert, so dass innerhalb einer kurzen Zeit nach Zugabe

aller Eeagentien ein stabiler Wert beobachtet wird. 15

Zur Durchführung dieses Tests werden 0,5 ml gemäss Beispiel 5 hergestelltes Dextran-10-o-dianisidin im Verhältnis 1 : mit dem vorstehend für HRP-angegebenem Puffer verdünnt.

Eine ausreichende Menge HRP-hlgG—Konjugat wird zugesetzt, —Pt so dass sich eine Endkonzentration von 1,4 χ 10" m ergibt.

Ferner werden gegebenenfalls 20 ^uI wässriges anti-hlgG (Miles Labs, Charge Fr. 20, 9,6 mg/ml) und hlgG (Endkon-

—6

zentration 10 ) zugesetzt. Es folgt eine 20-minütige Inkubationszeit bei Raumtemperatur. Das Gemisch wird sodann mit 5 /U-I 22 millimolarem HpOp versetzt. Die Absorptions änderung innerhalb 1 Minute bei 460 nm wird bei 30⁰C bestimmt. Eine zweite Ablesung wird nach 10 Minuten vorgenommen, wobei sich keine weitere signifikante Absorptionsänderung feststellen lässt. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengefasst.

809885/0851

tabelle IV

mOD Ab (hlgG) hlgG 1 min. 10 min.

- 362, 302 390, 365

+ - 230, 217 295, 295

+ + . 328, 334- 365, 365

Der Zusatz von anti-(hlgG) verringert wesentlich die Menge an o-Dianisidin, die in einer bestimmten Zeit umgesetzt wird. Die Zugabe von anti-(hlgG) und hlgG verringert die Menge an anti-(hlgG) die zur Bindung an das Enzymkonjugat zur Verfügung steht, und erlaubt eine schnellere Umwandlung,

bevor das zugängliche Enzym im wesentlichen inaktiviert ist. Bei Anwendung- dieser Verfahrensweise entfällt die Notwendigkeit, die Ablesungen der Absorption genau in einer bestimmten Zeit vorzunehmen, da nach einigen Minuten die Ablesung relativ lang gut konstant bleibt.
20

Aus den vorstehenden Ergebnissen ergibt sich, dass erfindungsgemäss ein empfindliches und genaues Verfahren zur Bestimmung von äugserst geringen Ligandenkonzentrationen unter Einschluss von Hapten- und Antigenliganden, zur Verfügung gestellt wird. Ferner hat das erfindungsgemässe Verfahren den Vorteil, dass Enzyme leicht markiert werden können, wobei sie einen wesentlichen Anteil ihrer ursprünglichen Aktivität sowohl nach Konjugation als auch nach Bindung von Anti-

liganden an das Konjugat beibehalten. Ferner wird zufällig 30

anwesendes natives Enzym gehemmt, so dass die Notwendigkeit, die Aktivität des Enzyms in der Probe zu bestimmen, entfällt. Die Verfahrensweise zur Durchführung des erfindungsgemässen Tests ist einfach. Es können überall zur Verfugung stehende

Spectrophotometer verwendet werden. Ferner läuft der er-35

findungsgemässe Test auf eine Enzymbestimmung hinaus, eine

Technik, die dem Personal weitgehend vertraut ist. ^L i09885/0iS1

Claims (12)

1. VOSSIUS · VOSSIUS · HILTL · TAUCHNER · HEUNEMANN

   SIEBERTSTRASSE 4- · 8OOO MÖNCHEN 86 - PHONE: (O89) 4-7 4-O 75 CABLE: BENZOLPATENT MÜNCHEN -TELEX 5-29 433 VOPAT D

   u.Z.: M 790

   Case: 3652-104H

   SYVA COMPANY

   PaIo Alto, California, V.St.A.

   "Homogener, kompetitxver Antienzym-Bindungstest und Reagenz zur Durchführung des Verfahrens"

   —■

   Priorität: 14. Juli 1977, V.St.A., Nr. 815,487 14. Juli 1977, V.St.A., Nr. 815,632

   Patentansprüche

   ²⁵ ?1.)Verfahren zum Nachweis eines zu analysierenden Bestandteils (Analyt) in einer Probe, der ein Bestandteil eines immunologischen Paars ist, das aus den reziproken Bestandteilen Ligand und Ligandenrezeptor besteht, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem wässrigen Medium folgende Bestandteile vereinigt:

   (A) die Probe,

   (B) ein Enzymkonjugat, wobei das Enzym an einen der Bestandteile des immunologischen Paars gebunden (konjugiert) ist und das Enzym einen wesentlichen Anteil seiner Aktivität behält, wenn das Enzym-

   _L 809885/0851

   INSPECTED

   konjugat an den reziproken Bestandteil des immunologischen Paars unter Bildung eines Komplexes gebunden ist,

   (C) einen Enzyminhibitor, wobei der Inhibitor an einer

   Hemmung des Enzyms gehindert wird, wenn das Enzym im Komplex vorliegt, und

   (D) wenn es sich beim Enzymkonjugat und dem Analyten um den gleichen Bestandteil des immunologischen Paars handelt, den reziproken Bestandteil des immunologisehen Paars,

   mit der Massgabe, dass, wenn es sich um einen monoepitopen Liganden handelt und das Enzym mit dem Antiliganden konjugiert ist, ein Poly- (llgandenanaloges) im Testmedium enthalten ist, und

   die enzymatisch^ Aktivität im Medium im Vergleich zur enzymatischen Aktivität eines Mediums mit einer bekannten Analytenmenge bestimmt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein wässriges Medium mit einem pH-Bereich von 5 bis 10 "¹¹³^d einem Temperaturbereich von 10 bis 50⁰C verwendet und den Enzyminhibitor nach Vereinigung der Reagentien (A), (B) und (D) zusetzt.
3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Enzyminhibitor Antienzym verwendet.
4. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch

   gekennzeichnet, dass man als Enzyminhibitor einen irreversiblen Inhibitor verwendet.
5. 5. Verfahren nach den Ansprüchen Λ und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Enzyminhibitor einen reversiblen Inhibitor verwendet.

   809885/0851
6. 6. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten,.-der ein Bestandteil eines immunologischen Paars, das aus den reziproken Bestandteilen Ligand und Ligandenrezeptor besteht, ist, in einer Probe, dadurch gekennzeich net, dass man in einem wässrigen Medium folgende Bestandteile vereinigt:

   (A) die Probe,

   (B) einen enzymgebundenen Liganden, der nach Bindung an den Rezeptor einen wesentlichen Anteil seiner Aktivität behält,

   (C) einen Ligandenrezeptor, der, wenn der Ligand den Analyten darstellt, in der Lage ist, eine spezifische Bindung an den Liganden und den enzymgebundenen Liganden einzugehen, und

   (E) einen Enzyminhibitor, wobei der Inhibitor an einer Hemmung des enzymgebundenen Liganden gehindert ist, wenn der Rezeptor an den enzymgebundenen Liganden gebunden ist, und

   die enzymatische Aktivität im Medium im Vergleich mit der enzymatischen Aktivität eines Mediums mit einer bekannten Analytenmenge bestimmt.
7. 7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Enzyminhibitor einen reversiblen Inhibitor verwendet.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichne t, dass man als reversiblen Inhibitor ein Antienzym verwendet.
   30
9. 9- Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Enzyminhibitor einen irreversiblen Inhibitor verwendet.

   80988 5/0851

   ■ t-
10. 10. Verfahren nach. Anspruch- 9, dadurch gekenn-· zeichnet, dass man als irreversiblen Inhibitor ein Substrat für das Enzym und den enzymgebundenen Liganden verwendet.
    5
11. 11. Verfahren zum Nachweis eines Liganden in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem wässrigen Medium folgende Bestandteile vereinigt:

    (A) die Probe,

    (B) einen enzymgebundenen Liganden, der einen wesentlichen Anteil seiner Aktivität nach Bindung an einen Ligandenrezeptor behält,

    (C) einen Ligandenrezeptor, der in der Lage ist, eine spezifische Bindung an den Liganden und den enzym-• gebundenen Liganden einzugehen und

    (D) einen Enzyminhibitor, der ein mit dem Enzym unter enzymatischer Hemmung reagierendes Enzymsubstrat ist, das an einer Reaktion mit dem Enzym gehindert ist, wenn der Ligandenrezeptor an den enzymgebundenen Liganden gebunden ist, und

    die enzymatische Aktivität im Medium im. Vergleich zur enzymatischen Aktivität eines Mediums mit einer bekannten Analytenmenge bestimmt.
12. 12. Eeagentiensatz (Testpackung) zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Enzymkonjugat, den reziproken Bestandteil des immunologischen Paars, wenn es sich beim Anaiyten und dem Enzymkonjugat um den gleichen Bestandteil des immunologischen Paars handelt, und einen Enzyminhibitor, wobei die einzelnen Bestandteile in solchen Verhältnissen vorliegen, dass das Verfahren im wesentlichen mit optimalen Ergebnissen abläuft.

    809885/0851