DE2913549A1 - Chemisch induzierter fluoreszenz- immuntest und testreagens zu dessen durchfuehrung - Google Patents
Chemisch induzierter fluoreszenz- immuntest und testreagens zu dessen durchfuehrungInfo
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Description
Die Erfindung "betrifft einen chemisch induzierten Pluoreszenz-Immuntest
und eine Testpackung zu dessen Durchführung.
In den letzten Jahren hat die klinische Diagnose sowohl
in bezug auf die Art und Zahl der leicht und genau zu "bestimmenden
Substanzen als auch in bezug auf die Bestimmungsverfahren einen starken Aufschwung erfahren. Bei einer grossen
Gruppe von klinischen Tests werden organische Rezeptoren verwendet, die eine spezifische Bindung an eine bestimmte
räumliche und polare Anordnung eines anderen Moleküls eingehen. Meistens handelt es sich bei derartigen Verbindungen
um Antikörper, die zwischen der zu bestimmenden Verbindung oder Substanz und anderen Verbindungen oder Substanzen analoger Struktur unterscheiden können. Aufgrund der Bindung
des Rezeptors an einen markierten Liganden ist man in der Lage, zwischen markiertem Liganden, der rezeptorgebunden
ist, und ungebundenem markiertem Liganden zu unterscheiden.
Die beobachtete Wirkung der Bindung durch den Rezeptor hängt von der Markierung ab. In einigen Fällen bewirkt die Bindung
des Antikörpers nur eine Differenzierung bezüglich des Molekulargewichts zwischen gebundenem und ungebundenem markiertem
Liganden. In anderen Fällen kann die Anwesenheit des Rezeptors die Art des von der Markierung erhaltenen Signals
beeinflussen, so dass das S.ignal mit der Menge des an den
markierten Liganden gebundenen Rezeptors variiert. Eine
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weitere Abänderung besteht darin, dass der Eezeptor markiert und der Ligand unmarkiert ist. Wenn die Rezeptoren mit zwei
verschiedenen markierenden Substanzen (im folgenden kurz Marker) markiert sind, wobei diese Marker bei Vorliegen in
enger Nachbarschaft zueinander einer Wechselwirkung unterliegen,
so beeinflusst die Ligandenmenge das Ausmass der gegenseitigen Beeinflussung der Marker am Eezeptor.
Bei der Entwicklung eines Tests spielen verschiedene Ge-Sichtspunkte
eine Rolle: 1. Das auf Veränderungen der Konzentration
des Analyten zurückzuführende Signal; 2. eine einfache Versuchsdurchführung; 3· Veränderungen der Störfaktoren
von Probe zu Probe. Ferner ist bei der Entwicklung eines in der Praxis durchführbaren Tests unter anderem auch auf folgende
Punkte zu achten: Leichte Herstellung und Reinigung. der Reagentien, zur Verfügung stehende Ausrüstung, leichte
Automatisierung und Wechselwirkung mit Liganden.
In der klinischen Praxis besteht nach wie vor ein Bedarf nach neuen und genauen Verfahren, die für die verschiedensten
Liganden angewendet werden können oder die in speziellen Fällen, bei denen herkömmliche Verfahren nicht ohne weiteres
geeignet sind, Anwendung finden können.
Zum Stand der Technik wird auf die nachstehenden Druckschriften verwiesen: Ein Beispiel für einen Radioimmuntest findet
sich in der US-PS 3 709 868, für einen Spinimmuntest in der US-PS 3 960 834 und für Enzymimmuntests in der US-PS
3 654 090 und der DE-AS 22 23 385. Ferner wird auf L. Brand
und J.R. Gohlke, Annual Review of Biochemistry, Bd. 41 (1972), S. 843 bis 868 und Stryer, Science, Bd. 162 (1968),
S. 526 verwiesen. Smith (FEBS Letters, Bd. 77 (1977), S.25) beschreibt einen Fluoreszenzimmuntest, bei dem Thyroxin an
eine fluoreszierende Verbindung gebunden wird und die fluoreszierende Verbindung auslöscht (quencht), wobei der Auslösch-
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Vorgang durch Bindung eines Antikörpers für Thyroxin umkehrbar
ist. In diesem Zusammenhang, wird auch auf Ullman und Mitarb., J. Biol. Chem., Bd. 251 (1976), S. 4-172 verwiesen.
Ein ausführlicher Übersichtsartikel über Chemilumineszenz
findet sich bei McCapra, Quarterly Reviexirs, Bd. (1966), S. 485.
Erfindungsgemäss wird ein kompetitiver Proteinbindungstest zur Verfugung gestellt, bei dem als zu analysierende Verbindung
oder Substanz (im folgenden kurz Analyt) ein Bestandteil eines aus einem Liganden und einem Rezeptor für
den Liganden bestehenden immunologischen Paars vorliegt. Der Test basiert auf der Anwesenheit des Analyten in einem
Testmedium, der das Ausmass, in dem eine Chemilumineszenzquelle
durch Energieübertragung auf eine auslöschende Verbindung oder Substanz (im folgenden kurz Quencher) ausgelöscht
(gequencht) wird, und zwar bei Vorliegen von relativ weiten Abständen. Durch Bindung (Konjugation) der Chemilumineszenzquelle
oder — für den Fall, dass die Chemilumineszenzquelle aus mehreren Bestandteilen besteht - eines
Bestandteils der Chemiluinineszenzquelle an einen Bestandteil des immunologischen Paars und durch Bindung eines
Quenchers an einen -Bestandteil des immunologischen Paars lassen sich Reagentien herstellen, die bei ihrer Vereinigung
im Testmedium je nach der Menge des. im Testmedium vorhandenen
Analyten unterschiedlich grosse Lichtemissionen ergeben.
Die Chemilumineszenzquelle oder deren Bestandteil sowie der Quencher können entweder an den Liganden oder an den
Rezeptor gebunden sein. Das erhaltene Reagens wird in einem wässrigen, normalerweise gepufferten Medium bei massigen
Temperaturen vereinigt und die Menge des emittierten Lichts wird bestimmt. Durch Vergleich mit Testmedien, die eine
bekannte Analytenmenge aufweisen, lässt sich eine quantitative
Beziehung zwischen den emittierten Lichtquanten und der
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Analytenmenge im Testmedium aufstellen.
Erfindungsgemäss werden auch Testpackungen zur Verfugung
gestellt, die die Reagentien in abgemessenen Mengen enthalten, so dass sie direkt verwendet oder leicht unter Bildung
von Reagenslösungen verdünnt werden können, so dass man die Konzentrationen erhält, bei denen sich eine optimale
Empfindlichkeit und Versuchsdurchführung ergibt.
Erfindungsgemäss wird die Erscheinung der Chemilumineszenz
.angewendet, um ein mit der Analytenmenge im Testmedium in Beziehung stehendes Signal zu erhalten. Beim Analyten handelt
es sich um einen Bestandteil eines aus Ligand und Rezeptor bestehenden immunologischen Paars. Bei Konjugation der
Ghemilumineszenzquelle oder - falls diese Quelle aus mehr als einem Bestandteil besteht - eines Bestandteils der Chemilumineszenzquelle
mit einem Bestandteil des immunologischen Paars und bei Konjugation eines Quenchers mit einem Bestandteil
des immunologischen Paars beeinflusst die Anwesenheit eines Analyten die Quenchermenge, die sich in quenchendem
Abstand zur gebundenen Chemilumineszenzquelle befindet. Die in der Probe vorhandene Analytenmenge lässt sich bestimmen,
indem man das Ghemilumineszenzreagens und das Quencherreagens, wobei sich die beiden Markierungen an unterschieden
liehen Molekülen befinden, und je nach Bedarf zusätzliche Bestandteile des immunologischen Paars mit dem Analyten im
Testmedium vereinigt, gegebenenfalls für die Chemilumineszenz erforderliche Hilfsreagentieix zusetzt, die aus dem
Testmedium emittierte Lichtmenge bei einer speziellen Wellen— länge oder einem Wellenlängenbereich misst und mit einem
Medium mit bekannter Analytenmenge vergleicht.
Das erfindungsgemässe Verfahren beruht auf der Feststellung,
dass bei Vorhandensein eines Farbstoffs innerhalb eines begrenzten Abstands von einer c'hemiluminiszierenden Verbindung
oder Gruppe in erregtem Zustand, die chemilumines-
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zierende Verbindung oder Gruppe ihre Energie auf den Quencher
stossfrei und ohne Strahlungsemission übertragen kann. Der Quencher kann sodann die Strahlung bei einer höheren
Wellenlänge als die chemilumineszierende Verbindung oder
Gruppe emittieren oder kann die Energie durch strahlungslosen Zerfall verlieren. Man kann den Bestandteil der Chemi
lumineszenzquelle und den Quencher entweder an den Liganden oder den Rezeptor binden, so dass bei einer Kombination der
beiden Kon jugate die Menge des sich im quenchenden Abstand zur Chemilumineszenzquelle befindlichen Quenchers durch
die Menge des im Testmedium vorhandenen Analyten beeinflußt vrird. JDie Natur und die Menge des aus dem Testmedium emittierten
Lichts ist somit eine Funktion des im Testmedium vorhandenen Analyten. Bei der Durchführung von Tests mit
bekannten Analytenmengen lässt sich eine quantitative Beziehung zwischen der Analytenmenge im Testmedium und der
aus dem Testmedium bei einer oder mehreren Wellenlängen emittierten Lichtmenge herstellen.
Nachstehend werden kurze Definitionen für hier verwendete Ausdrücke gegeben:
Analyt: Zu messende Verbindung oder Substanz. Es kann sich
um einen mono- oder polyepitopen, antigenen oder hapteni-
sehen Liganden, eine oder mehrere Verbindungen, die mindestens
ein gemeinsames epitopes Zentrum aufweisen, oder einen Rezeptor handeln.
Ligand: Beliebige Verbindung, für die ein Rezeptor natür-
lieh vorkommt oder hergestellt werden kann.
Ligandenanaloges; Modifizierter Ligand, der mit dem analogen
Liganden um den Rezeptor konkurrieren kann, wobei die Modifikation die Möglichkeit zur Verbindung mit einem
Marker oder mit einem "hubM-Kern bietet.
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Poly-(ligandenanaloges): Eine Hehrzahl von kovalent aneinander
gebundenen Lxgandenanalogen, in der Regel in bezug zu einem "hubu-Kern. d.h. eine Verbindung mit einer Mehrzahl
von epitopen Stellen» ("epitopic site" nachstehend als
epxtopes Zpntrum bezeichnet) die xn der Lage sind, mit dem
analogen Liganden um den Rezeptor zu konkurrieren.
Marker; Bestandteil einer Chemilumineszenzquelle oder eines
Quencherfarbstoffs, die ein lichtemittierendes reziprokes
Paar bilden, wobei der Quencherfarbstoff eine hohe Übergangswahrscheinlichkeit
der Energieabsorption von der
Chemilumineszenzquelle aufweist.
(a) Chemilumineszenzmarker: Eine Verbindung, die als solche
oder in Kombination mit anderen Verbindungen ein Molekül in einem elektronisch angeregten Zustand bildet, wobei das
Molekül unter Lichtemission in einen energieärmeren Zustand
übergehen kann und wobei sich insgesamt gesehen eine chemische Veränderung von einer oder mehreren dieser Verbindungen
ergibt.
(b) Quencher: Ein Molekül., das in der Lage ist, die chemilumineszierende
Lichtemission zu hemmen, wenn es sich vom Chemilumineszenzmolekül in einem kurzen, aber nicht-stossen-
den Abstand, im allgemeinen weniger als etwa 100 A, befindet,
wobei das Molekül die Energie, die anderenfalls als chemilumineszierendes Licht ausgestrahlt würde, aufnimmt.
Tatsächlich ist es für die Quenchwirkung nicht erforderlich, dass der Quencher der nächste Nachbar zur Chemilumineszenzquelle
ist.
30
30
Marker-Konjugat: Der Marker, d.h. entweder eine Verbindung
. der Chemilumineszenzquelle oder der Quencher,ist entweder über eine Bindung oder eine verknüpfende Kette an einen
Bestandteil des immunologischen Paars gebunden, wobei nicht beide an dasselbe Molekül gebunden sind. Das Konjugat
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r -j
weist mindestens einen Marker auf. Es können eine Mehrzahl
von Markern an den Bestandteil des immunologischen Paars oder eine Mehrzahl von derartigen Bestandteilen an den
Marker gebunden sein. Es können auch eine Mehrzahl von Lif.
ganden und Markern gebunden sein, d.h. es können PoIy-(Iigandenanaloge)-Polymarker
vorliegen. Insbesondere kann, wenn ein Enzym einen Bestandteil der als Marker verwendeten
Chemilumineszenzguelle darstellt, eine Mehrzahl von Ligandenanalogen an das Enzym unter Bildung eines PoIy-(Iigandenanalogen)-Markers
gebunden sein.
Rezeptorr Beliebige Verbindungen oder Zusammensetzungen,
die in der Lage sind, eine spezielle räumliche und polare Organisation eines Moleküls, d.h. ein epitopes Zentrum,
zu erkennen. Beispiele für Rezeptoren sind natürlich auftretende Rezeptoren, Antikörper, Enzyme, Lectine und I"ab-Fragmente.
Die Rezeptoren können in bezug auf die Rezeptorstellen monovalent oder polyvalent sein. Im allgemeinen
sind sie polyvalent, d.h. es handelt sich um Antikörper. Für einen spezifischen Liganden stellt ein Rezeptor einen
"Antiliganden" dar. Der Rezeptor-Antiligand und der reziproke Ligand bilden ein immunologisches Paar.
Poly-(ligandenanaloges)-Marker; Eine Zusammensetzung, in
der eine Mehrzahl von Ligandenanalogen und ein oder mehrere
Marker aneinander gebunden sind, wobei das Ligandenanaloge und der Marker benachbart sind, so dass bei Bindung des
Rezeptors an das Ligandenanaloge sich die Markierung am markierten Rezeptor innerhalb eines quenchenden Abstands
vom reziproken Marker befindet. Sofern ein Enzym Teil der
Chemilumineszenzquelle ist und es sich beim Liganden um einen haptenischen Liganden handelt, können eine Mehrzahl
von Ligandenanalogen an das Enzym gebunden sein. Eine andere
Möglichkeit besteht darin, dass eine Mehrzahl von
Ligandenanalogen und ein·oder mehrere Marker an einen
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wasserlöslichen, polyfunktionellen "trab"-Kern gebunden
sind.
Das erfindungsgemässe Bestimmungsverfahren wird in einer
wässrigen, im allgemeinen homogenen Zone im allgemeinen (aber nicht notwendigerweise) bei einem massigen pH-Wert,
vorzugsweise in der Nähe des Empfindlichkeitsoptimums, durch
geführt. Die Testzone zur Bestimmung des Analyten wird
unter Verwendung einer entsprechenden Testlösung, die im
^O allgemeinen gepuffert ist, der unbekannten Probe, die einer
■ Vorbehandlung unterzogen worden sein kann, des mit der Chemilumineszenzquelle markierten Reagens , des mit dem
quenchermarkierten Reagens (einschliesslich Poly-(ligandenanalogem)-Polymarker)
und des Liganden bzw. Antiliganden hergestellt. Die Anwesenheit des Antiliganden oder Liganden
zusammen mit einer vorbestimmten Menge an Antiligandem im Testmedium steuert das Ausmass, in dem der Quencher
in quenchenden Abstand zur Chemilumineszenzquelle kommt.
Bei der Herstellung der Quencher- und Chemilumineszenzreagentien gibt es die folgenden vier Grundmöglichkeiten:
(1) Die chemilumineszierende Gruppe (Chemiluminescer) ist an den Liganden unter Bildung eines chemilumineszierend
markierten Liganden gebunden und der Quencher ist an
den Rezeptor unter Bildung eines quenchermarkierten Antiliganden gebunden;
(2) der Quencher ist an den Liganden unter Bildung eines quenchermarkierten Liganden gebunden und die chemilumineszierende
Gruppe ist an den Rezeptor unter Bildung eines chemilumineszierend markierten Antiliganden
gebunden;
(3) die chemilumineszierende Gruppe ist an den Rezeptor unter Bildung eines chemilumineszierend markierten
Antiliganden gebunden und der Quencher ist an den
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' Rezeptor unter Bildung eines quenchermarkierten Antiliganden
gebunden; und
(4-) die chemilumineszierende Gruppe ist an den Liganden unter Bildung eines chemilumineszierend markierten
Liganden gebunden und der Quencher ist an den Liganden unter Bildung eines quen'chermarkierten Liganden gebunden.
Bei den beiden erstgenannten Kombinationen befindet sich bei einer Vereinigung der Reagentien der Quencher in quenchendem
Abstand zur chemilumineszierenden Gruppe. Die Anwesenheit eines Analyten, d.h. entweder eines Liganden
oder Antiliganden, verringert die Menge der zwischen der chemilumineszierenden Gruppe und dem Quencher übertragenen
Energie, indem die Anzahl der Quenchermoleküle im Bereich des quenchenden Abstands von der chemilumineszierenden
Gruppe verringert wird. Bei der dritten Kombination muss ein polyepitoper Ligand (einschliesslich Poly-(ligandenanaloge))für
einen Antiliganden oder einen monoepitopen Liganden als Analyt zugesetzt werden. Bei Vorliegen eines
polyepitopen Liganden wird mit zunehmender Konzentration des polyepitopen Liganden ein zunehmendes Quenchen bis
zum Erreichen eines Maximums festgestellt, wonach ein abnehmendes Quenchen mit weiter zunehmender Konzentration
des polyepitopen Liganden folgt. Somit ergibt sich eine
biphasische Reaktion, so dass es zur Ermittlung eines diskreten Ergebnisses wesentlich ist zu wissen, auf welchem
Kurventeil man sich befindet. Im Gegensatz dazu trägt bei einem Poly-(ligandenanalogen) die Anwesenheit eines monoepitopen
Liganden zu einer Verminderung des Quenchens bei. Bei Vorliegen eines Rezeptors als Analyt ergeben erhöhte
Rezeptorkonzentrationen auch eine Verminderung des Quenchens.
Wenn die chemilumineszierende Gruppe und der Quencher beide an einen Liganden gebunden sind, kann eine Bestimmung des
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Liganden oder des polyvalenten Antiliganden durchgeführt
werden. Bei der Bestimmung eines Liganden werden die zweifach markierten Konjugate zusammen mit dem Antiliganden
verwendet, was die chemilumineszierende Gruppe und den Quencher in quenchenden Abstand zueinander bringt. Die
Zugabe des Liganden verringert die Menge der chemilumineszierenden
Gruppe und der Markierung, die sich in quenchendem Abstand befinden. Zur Bestimmung des Antiliganden werden
die zweifach markierten Konjugate verwendet. Bei steigenden
Mengen an Antiligandem ergibt sich eine Abnahme der Chemilumineszenz auf ein Minimum und anschliessend eine
Zunahme mit steigender Antiligandenkonzentration. Sofern
man unsicher ist, auf welchem Teil der biphasischen Kurve man sich befindet, so erhält man durch eine oder mehrere
^5 Verdünnungen der Probe eine Information über die genaue
Konzentration.
Unter Quenchen ist lediglich die Energieübertragung von der chemilumineszierenden Gruppe auf den Quencher zu verstehen.
Das Ergebnis dieser Energieübertragung ist, dass Licht einer einzelnen Wellenlänge oder eines Wellenlängenbereichs,
das sonst durch die chemilumineszierende Gruppe auf andere Weise emittiert worden wäre, auf den Quencher
übertragen wird, der dann fluoreszieren kann, wobei Licht bei einer höheren Wellenlänge im Vergleich zur Energieabsorption
emittiert wird. Je nach der Quantenausbeute der Emission der chemilumineszierenden Gruppe, der Ausbeute
der Energieübertragung von der chemilumineszierenden Gruppe zum Quencher und der Quantenausbeute der Emission
des Quenchers sowie je nach dem beobachteten Wellenlängebereich
können grössere oder kleinere Lichtmengen aufgrund des Quenchvorgangs beobachtet werden. Unter der Bezeichnung
Quenchen ist deshalb nicht zu verstehen, dass notwendigerweise eine Verminderung des beobachteten Signals
erfolgt. Beobachtet man das durch den Quencher emittierte
J- 909842/0782
Γ 21
Licht, so ergibt ein erhöhtes Quenchen tatsächlich ein
zunehmend grosses Signal.
Eine spezielle Situation ist bei kleinen Haptenen mit einem
'Molekulargewicht von etwa 125 bis 2000 gegeben. Bei diesen Haptenen kann eine wesentlich verringerte Chemilumineszenz
erreicht werden, d.h. ein Quenchen, ohne dass der Quencher an den Rezeptor gebunden ist. Insbesondere ist
dies der Fall, wenn es sich bei dem Rezeptor um einen Antikörper handelt. Obgleich die Signalverminderung nicht
ebenso gross ist, wie wenn der Quencher an den Rezeptor gebunden ist, so ergibt sich doch eine für die Durchführung
einer Bestimmung ausreichende Verminderung. Mit Ausnahme der Verwendung eines Rezeptors ohne Quencher wird die
Bestimmung auf die gleiche Weise durchgeführt, wobei das
durch die chemilumineszierende Gruppe emittierte Licht
abgelesen wird.
Zur Durchführung des Tests wird im allgemeinen ein wässriges
Medium verwendet. Es können auch andere polare Lösungsmittel verwendet werden, im allgemeinen sauerstoffhaltige
organische Lösungsmittel mit 1 bis 6 und insbesondere mit 1 bis 4- Kohlenstoffatomen, wie Alkohole und Äther.
Im allgemeinen sind diese Kolösungsmittel in Mengen von höchstens etwa 40 Gewichtsprozent und insbesondere von
höchstens etwa 20 Gewichtsprozent vorhanden.
Der pH-Wert des Mediums beträgt im allgemeinen etwa 5 bis
12 und insbesondere etwa 7 bis 10. Bei Verwendung von Enzymen als Teil der Chemilumineszenzquelle beträgt der
pH-Wert vorzugsweise 7 bis 9· Zur Einstellung des pH-Werts
und zu dessen Aufrechterhaltung während der Bestimmung können verschiedene Puffer angewendet werden.
Beispiele dafür sind Borat-, Phosphat-, Carbonat-, Tris- und Barbitalpuffer. Die Art des Puffers ist nicht kritisch,
909842/0782
Γ - 22 -
wenngleich, bei speziellen Tests "bestimmte Puffer besonders
bevorzugt sein können.
Zur Durchführung des Tests werden im allgemeinen massige c .die
° Temperaturen angewendet. Vorzugsweise sind/Temperaturen
während des gesamten Tests konstant. Im allgemeinen eignen sich Temperaturen von etwa 10 bis 500G und insbesondere
von etwa 15 bis 400C.
Die Konzentration des zu bestimmenden Analyten beträgt
_a. -15
im allgemeinen etwa 10 bis 10 ^m und insbesondere etwa 10 bis 10" ^ m. Die in Präge kommenden Konzentrationen betragen anders ausgedrückt etwa 10 ^ bis 10 g/ml.
im allgemeinen etwa 10 bis 10 ^m und insbesondere etwa 10 bis 10" ^ m. Die in Präge kommenden Konzentrationen betragen anders ausgedrückt etwa 10 ^ bis 10 g/ml.
Abgesehen von der in Frage kommenden Analytenkonzentration
wird die Konzentration der Reagentien normalerweise auch von anderen Gesichtspunkten bestimmt, beispielsweise davon,
ob der Test qualitativ, halbquantitativ oder quantitativ durchgeführt werden soll, welche Vorrichtung verwendet
wird und welche Art von Reagentien eingesetzt werden. Obgleich im allgemeinen zur Erzielung einer möglichst
hohen Testempfindlichkeit die Konzentration der Reagentien unter Berücksichtigung der Analytenkonzentration festgelegt
wird, werden die einzelnen Reagentienkonzentrationen
empirisch festgelegt. Da die Bindungskonstante und das Bindungsprofil von Rezeptoren beispielsweise bei Antikörpern
je nach Blutart variieren,kann jede neue Charge
von Antikörpern verschiedene Konzentrationsverhältnisse
der verschiedenen Reagentien erforderlich machen.
30
Im allgemeinen entspricht bei mono- und polyepitopen
Ligandenanalyten die Antiligandenkonzentration, bezogen auf die bindenden Stellen, der interessierenden Minimalkonzentration,
bezogen auf die bindenden Stellen, und
nicht mehr als dem etwa 50-fachen der interessierenden
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Γ
Maximalkonzentration, bezogen auf die bindenden Stellen, vorzugsweise dem etwa 1- bis 10-fachen und insbesondere
dem etwa 1- bis 3-fachen der interessierenden Maximalkonzentration, bezogen auf die bindenden Stellen.
Bei polyepitopen Ligandenrezeptoranalyten betragen die Iquivalentverhältnisse
von markiertem Liganden oder Ligandem zu Rezeptoranalyt im allgemeinen etwa das 0,01-fache der
interessierenden Minimalkonzentration und nicht mehr als etwa das 100-fache der interessierenden Maximalkonzentration,
bezogen auf die bindenden Stellen. Der in Verbindung mit dem markierten Liganden oder dem Liganden verwendete markierte
Rezeptor liegt im allgemeinen in der etwa 0,01- bis 100-fachen Konzentration des Liganden oder markierten Liganden,
bezogen auf die bindenden Stellen, vor.
Pur polyepitope Ligandenanalyten beträgt bei Verwendung
eines markierten Liganden dessen Konzentration im allgemeinen mindestens das etwa 10~ -fache und insbesondere das
etwa 10~ -fache der interessierenden Minimalkonzentration.
Insbesondere entspricht in diesem Tall die Konzentration des markierten Liganden etwa der interessierenden Minimalkonzentration
und übersteigt in etwa die interessierende Maximalkonzentration nicht. Der Anteil an markiertem Rezeptor
beträgt im allgemeinen mindestens das etwa 0,1-fache
der Konzentration des markierten Liganden, bezogen auf die bindenden Stellen, und nicht mehr als etwa das 100-fache
der Konzentration des markierten Liganden, bezogen auf die
bindenden Stellen.
30
30
Für monoepitope Ligandenanalyten und monoepitope Ligandenrezeptoranalyten
beträgt bei Verwendung eines markierten Liganden (einschliesslich Poly-(ligandenanaloge)-Marker)
die Konzentration des markierten Liganden, bezogen auf die bindenden Stellen, im allgemeinen mindestens das 10"* -fache
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-24- 29135A9
der interessierenden Minimalkonzentration., vorzugsweise
mindestens das 10 -fache der interessierenden Minimalkonzentration
und insbesondere liegt diese Konzentration im Bereich von et\ia. der interessierenden Minimalkonzentra-
^ tion bis zur interessierenden Maximalkonzentration. Bei Verwendung eines Poly-(ligandenanalogen) zusammen mit
markiertem Antiliganden liegt die Konzentration des PoIy-(ligandenanlogen)
innerhalb der gleichen Bereiche, wie sie für den markierten Liganden angegeben sind. Die Antiligandenkonzentration
wurde vorstehend bereits erwähnt.
Die Reihenfolge der Zugabe der verschiedenen Eeagentieii
kann stark variieren und hängt davon ab, ob eine Gleichgewichts- oder Geschwindigkeitsmessung vorgenommen wird.
Ferner hängt sie von der Art der Eeagentien, der Geschwindigkeit, mit der sich das Gleichgewicht" zwischen Ligand
und Antiligand einstellt und der Art der Chemilumineszenzquelle ab. Wenn die Chemilumineszenzquelle aus mehreren
Bestandteilen besteht, wovon einer dieser Bestandteile ein Marker ist, kann die Chemilumineszenz zu einem beliebigen
Zeitpunkt durch Zugabe der anderen Bestandteile der Chemilumineszenzquelle eingeleitet werden. In den Fällen,
wo die Chemilumineszenzquelle aus mehreren Bestandteilen besteht, können die markierten Eeagentien und die unbekann-
te Probe gleichzeitig vereinigt x^erden, wonach die Zugabe
der anderen Bestandteile der Chemilumineszenzquelle folgt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Analyten mit
dem markierten Antiliganden zu vereinigen, anschliessend den markierten· Liganden zuzusetzen und schliesslich die
restlichen Bestandteile der Chemilumineszenzquelle zuzugeben. Zwischen den einzelnen Zugaben können Inkubationszeiten
liegen. In den Fällen, in denen die Chemilumineszenzquelle nur aus einem Bestandteil besteht, wird normalerweise
der markierte Rezeptor mit dem Analyten ver-
einigt, wonach die Zugabe des markierten Liganden erfolgt.
L 9098A2/0782 _J
γ -ι
Je nach, der angewendeten Verfahrensweise, dem Gleichgewichts-
oder ETichtgleichgewichtszustand, der Bindungsgeschwindigkeit des Antiliganden an den Liganden und den
markierten Liganden und. den relativen Konzentrationen des Liganden, des markierten Liganden und des markierten Antiliganden
können eine oder mehrere Inkubationsstufen vorgenommen werden. Im allgemeinen liegen zwischen den einzelnen
Zugaben wenige Sekunden bis mehrere Stunden, vorzugsweise nicht mehr als 16 Stunden und insbesondere nicht
mehr als 6 Stunden. Im allgemeinen betragen die Inkubationszeiten etwa 1/2 Minute bis 1 Stunde und insbesondere
etwa 0,15 Minuten bis 30 Minuten. Da das Endergebnis von
abhängt, den Ergebnissen von Eichsubstanzen/ die im wesentlichen auf
die gleiche Weise und nach Möglichkeit auf identische Weise behandelt worden sind, sind die spezielle Verfahrensweise
und die vorstehend genannten Zeiten nicht kritisch, solange sich bei verschiedenen Analytenkonzentrationen signifikante,
reproduzierbare Unterschiede ergeben.
Je nach Wahl des Testablaufs, der verwendeten Vorrichtung
und der vorliegenden Analytenkonzentration können die Testvolumina von nur etwa 1 ul, vorzugsweise etwa 25}il bis höchstens
5 ml, vorzugsweise höchstens 2 ml, betragen.
Die Messung hängt von der Zählung der aus dem Testmedium
emittierten Lichtquanten ab. Es können verschiedene Vorrichtungen verwendet werden, wie Szintillationszähler oder
Photozellen, die zur Lichtmessung bei einer Wellenlänge
oder innerhalb eines Wellenlängenbereichs in der Lage sind. 30
Die Hauptbestandteile beim erfindungsgemässen Test zur
Bestimmung von Analyten, die gegebenenfalls in jedem einzelnen
Fall verwendet werden,sind: Markierter Ligand (unter Einschluss von Poly-(ligandenanalogem)-Marker);
L 9 0 984 2/078 2 -J
γ -ι
Markierter Antiligand; Ligand; Antiligand; und zusätzliche
Bestandteile der Chemilumineszenzquelle.
Analyt
Die erfindungsgemäss bestimmten Ligandenanalyten sind mono- oder polyepitop. Bei den polyepitopen Ligandenanalyten handelt es sich normalerweise um Poly-(aminosäuren), d.h. um Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren und entsprechende Kombinationen. Beispiele für derartige Kombinationen sind Bakterien, Viren, Chromosomen, Gene, Mitochondrien, Zellkerne und Zellmembranen.
Die erfindungsgemäss bestimmten Ligandenanalyten sind mono- oder polyepitop. Bei den polyepitopen Ligandenanalyten handelt es sich normalerweise um Poly-(aminosäuren), d.h. um Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren und entsprechende Kombinationen. Beispiele für derartige Kombinationen sind Bakterien, Viren, Chromosomen, Gene, Mitochondrien, Zellkerne und Zellmembranen.
In den meisten Fällen weisen die erfindungsgemäss bestimmten
polyepitopen Ligandenanalyten ein Molekulargewicht von mindestens etwa 5000 und im allgemeinen von mindestens
etwa 10 000 auf. Bei Poly-(aminosäuren) liegt das Molekulargewicht im Bereich von etwa 5000 bis 5 Millionen
und insbesondere von etwa 20 000 bis 1 Million. Bei den Hormonen liegt das Molekulargewicht im allgemeinen im Bereich
von etwa 5000 bis 60 000.
Die grosse Gruppe von Proteinen kann in verschiedene Gruppen eingeteilt werden, beispielsvreise Gruppen mit
ähnlichen Strukturmerkmalen, Gruppen mit besonderen biologischen Funktionen und Gruppen, die mit speziellen
Mikroorganismen im Zusammenhang stehen, insbesondere mit pathogenen Mikroorganismen.
Nachstehend sind strukturell verwandte Proteine aufgeführt: Protamine, Histone, Albumine, Globuline, Scleroproteine,
Phosphoproteine, Mucoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine,
Nucleoproteine und Glycoproteine.
Beispiele für nicht klassifizierte Proteine sind Somatotropin,
Prolactin, Insulin und Pepsin.
909842/0782
Γ · . ■
"* Eine Anzahl von Proteinen aus dem menschlichen Plasma
sind klinisch bedeutsam. Beispiele dafür sind: Präalbumin, Albumin, oc^-Lipoprotein, α,,-Säureglycoprotein, a^-Antitrypsin,
ou-Glycoprotein, Transcortin, ^.öS-Postalbumin,
tryptophanarmes α,,-Glycoprotein, oc^ χ-Glycoprotein,
thyroxinbindendes Globulin, Inter-oc-trypsin-inhibitor,
Gc-Globulin, (Gc 1-1; Gc 2-1; Gc 2-2), Haptoglobin (Hp 1-1; Hp 2-1; Hp 2-2), Ceruloplasmin, Cholinesterase,
O^-Lipoproteine, oCp-Macroglobulin, 0C2-HS-Glycoprotein,
Zn-a^-Glycoprotein, otp-Neuraminoglycoprotein, Erythropoietin,
ß-Lipoprotein, Transferin, Hämopexin, !"ibrinogen, Plasminogen, ß^-Glycoprotein I, ßo-Glycoprotein II,
Immuno globulin G (IgG) oder yG-Globulin der Formeln:
\r2 K2. oder f^ \~, Immunoglobulin A (IgA) oder /A-Globulin
der Formeln: («2/f ο)n oder (a.^ X p)n» Immunoglobulin
M (IgM) oder J^M-Globulin der Formeln: (^u, K^ oder
Qi2A2)^i Immunoglobulin D (IgD) oder j^D-Globulin CfD)
der Formeln: (.6 ^Ko) °d-er C ei 2^2^' £Dmun°gl°1:)Uli11 ^
(IgE) oder j^E-Globulin (/Έ) der Formeln: (£ 2 ^2) oder
(£ 2^-2^' freie /fund Λ-Ketten des Immunoglobulins, Komplementfaktoren:
C'1 (C'1g; C'1r; C'1s) C'2, C'3 (ß^A;
CC2D), C'4-, C'5, C6, C!7, C'8, C'9-
„,. Nachstehend sind die wichtigsten Blutgerinnungsfaktoren
aufgeführt:
909842/0782
- 28 - | 2913549 | Fibrinogen |
Name | Prothrombin | |
Internationale Bezeichnung | Thrombin | |
I | Gewebsthromboplastin | |
II | Proaccelerin, Accelerator- | |
Ha | globulin | |
III | Proconvertin | |
V und VI | Antihämophiles Globulin | |
(AHG) | ||
VII | ||
VIII | ||
IX Christmas-Faktor, Plasma-
Thromboplastin-Component (PTC)
X Stuart-Prower-Faktor,
Autoprothrombin III
XI Plasma-Thromboplastin-
Antecedent (PTA)
XII Hagemann-Faktor
XIII Fibrinstabilisierender
Faktor
Beispiele für wichtige Proteinhormone sind: Peptid- und Proteinhormone
Parathyroides Hormon (Parathormon), Thyrocalcitonin, Insulin,
Glucagon, Relaxin, Erythropoietin, Melanotropin (melanocytenstimulierendes
Hormon, Intermedin), Somatotropin (Wachstumshormon), Corticotropin (adrenocorticotropes Hormon),
Thyrotropin, follikelstimulxerendes Hormon, luteinisierendes
Hormon (interstitialzellenstimulierendes Hormon), luteomammotropes
Hormon (Luteotropin, Prolactin) und Gonadotropin (chorionisches Gonadotropin).
Secretin, Gastrin, Angiotensin I und II, Bradykinin und
Lactogen aus Humanplacenta.
L 909842/0782
Peptiditormone aus der Heurohypophyse
Oxytocin, Vasopressin, Eeleasing-Factors (EI1), wie CEF, LEF,
TEF, Somatotropin-BF, GBF, FSH-EF, PIF und MIF.
Weitere polymere Materialien von Interesse sind Mucopolysaccharide
und Polysaccharide.
Beispiele für antigene Polysaccharide, die sich von Mikroorganismen
ableiten sind:
Streptococcus pyogenes Diplococcus pneumoniae
Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoe,. -
Corynebacterium diphtheriae Actinobacillus mallei;
Actinobacillus whitemori Francisella tularensis
Pasteurella pestis Pasteurella pestis
Pasteurella multocida Bruce!la abortus
Haemophilus influenzae Haemophilus pertussis Treponema reiteri
Veillonella
Erysipelothrix Listeria monocytogenes Chromobacterium Mycobacterium tuberculosis Hämosensitin gefunden in
Erysipelothrix Listeria monocytogenes Chromobacterium Mycobacterium tuberculosis Hämosensitin gefunden in
Polysaccharid Polysaccharid
Polysaccharid Polysaccharid
Polysaccharid·. Eohextrakt
Lipopolysaccharid 'Polysaccharid
Polysaccharid·
Kapsuläres Antigen
Rohextrakt Polysaccharid roh
Pc-iysaccharid.
Lipopolysaccharid Polysaccharid Polysaccharid ■ Lipopolysaccharidi
Kochsalzextrakt von mit 90% Phenol extrahierten
Mykobakterien und PoIysaccharidfraktion
von Zellen und Tuberkulin
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Klebslella aerogenes Polysaccharide
Klebsiella cloacae Polysaccharid.
Salmonella typhosa Lipopolysaccharid. ,
Polysaccharid\
Salmonella typhi-murium; Polysaccharid
Salmonella derby
Salmonella pullorum
Shigella dysenteriae Polysaccharid
Shigella dysenteriae Polysaccharid
Shigella flexneri roh, Polysaccharid
Shigella sonnei
Rickettsiae Rohextrakt
> Candida albicans Polysaccharid ·
: Entamoeba histolytica . -Rohextrakt
Die zu bestimmenden Mikroorganismen können intakt, lysiert,
gemahlen oder anderweitig zerkleinert sein. Das erhaltene Präparat oder der erhaltene Anteil, beispielsweise durch
Extraktion, werden bestimmt. Beispiele für in Frage kommende Mikroorganismen sind:
Corynebacterium diptheriae
Pneumokokken
Diplococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Streptococcus salivarus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus albus
Staphylococcus albus
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NeisSerien
Neisseria ineningitidis Neisseria gonorrhoe
Enterobakterien "
Escherichia coli Aerobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae
Salmonella typhosa Salmonella choleraesuis Salmonella typhimurium
Shigella dysenteriae Shigella Schmitzii Shigella arabinotarda
Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei
andere Jarmbazillen
Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morgani Pseudomonas aeruginosa
Alcaligenes faecalis Vibrio cholerae coliforme Bakterien
Salmonell.en
Shigell en
Proteus- Arten
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Haemop'hilus-Bordetella-.Gruppe -
Haemophilias influenzae, H. ducreyi
H. hemophilus
H. aegypticus 5
H. parainfluencae-
Bordetella pertussis
in Pasteurellen
Pasteurella pestis Pasteurella tularensis
15
Brucellen
Bruceila rnelitensis Brucella abortus
Bruceila suis 20
Bacillus anthracis ge Bacillus subtilis
Bacillus megaterium Bacillus cereus
30 Anaerobe sporenbildende Bazillen
Clostridium botulinum Clostridium tetani
Clostridium perfringens 35
Clostridium novyi
Clostridium septicum
L- 9098.42/0782
Clostridium histoIyticum
Clostridium tertium
Clostridium bifermentans 5
Clostridium sporogenes
Mycobacterium tuberculosis hominis
Mycobacterium bovis
Mycobacterium avium
Mycobacterium leprae
Mycobacterium paratuberculosis
Actinomyceten (pilzähnliche Bakterien)
Actinomyces israelii 20
Actinomyces bovis Actinomyces naeslundii
Nocardia·asteroides Nocardia brasiliensis
Spirochaet.en
Treponema pallidum Spirillum minus
Treponema pertenue Streptobacillus moniliformis
Treponema carateum Borrelia recurrent!s
Leptospira icterohaeinorrhagiae Leptospira canicola
909842/0782 -J
Mycoplasma pneurnoniae
andere
pathogene -MkroOrganismen
5
Listeria monocytogenes
Erysipelothrix rhusiopathiae Streptobacillus moniliformis
^g Donvania granulomatis
Bartonella bacilliformis
Rickettsien ' ' "
Rickettsia prowazekii
Rickettsia mooseri Rickettsia rickettsii
Rickettsia conorii 20
australis
Rickettsia sibirica Rickettsia akari
Rickettsia tsutsugamushi
Rickettsia burnetii
Coxiella quintana
Chlamydien Ghlamydia-Arten (C.p'sittaci u. andere)
Pilze
Cryptococcus neoformans
Blastomyces dermatidis
L 909842/0782
.-■35-
Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis
Paracoccidioides brasiliensis
·
Candida albicans
Aspergillus fumigatus
Mucor corymblfer (Absidia coryiabifera)
Rhizopus oryzae Rhizopus arrhizus ^ Phycomycetes
Rhizopus nigricans Sporotrichum schenkii Ponsecaea pedrpsoi
Fonsecaea compacta Fonsecaea dermatitidis
Cladosporium carrionii
Phialophora verrucosa
Aspergillus nidulans Madurella mycetomi
Madurella grisea Allescheria boydii Phialosphora jeanselmei
Microsporum gypseum Trichophyton mentagrophytes
Keratinomyces ajelloi
Microsporum canis
Trichophyton rubrum
Microsporum andouini
L 9098A2/0782
Γ - 36 -
Adenoviren
Herpesviren
Herpes simplex Varicella
Herpes Zoster
Virus B
Cytomegalovirus 10
Variola
Vaccinia 15
Poxvirus bovis Paravaccinia Molluscum contagiosum
20
Poliovirus
Coxsackievirus
Echoviren
Ehinoviren
Myxoviren
-^-
-^-
Influenza (A, B, und:. C) Parainfluenza (1-4) Mumps-Virus
Newcastle - Disease-Virus
Masern-Virus Rinderpest-Virus
L 909842/0782 _J
Γ - Ύ? -
Bespiratory-Syncytial-Virus
RoteIn-Virus
Eastern-Equine-Eacephalitis-Virus
Western-Equine-Ea cephalitis-Virus
Sindbis-Virus 10
Chikugunya-Virus
Semliki-Forest-Viruc
Mayora-Virus .J5 St. Louis-Encephalitis-Virus
California-Encephalitis- Virus
Colorado-Tick-Fever-Virus Gelbfieber-Virus Dengue-Virus
Reovir en
Reovirus Typen 1-3 25
• Hepatitis -^Viren
Hepatitis A-Virus 3Q Hepatitis B-Virus
Tumorviren
Rauscher-Leukämie-Virus Gros s-Virus
Maloney-Leukämie-Virus Allergen.e
L 9098A2/0782
π
Das Molekulargewicht der mono ep i top en Ligandenanalyten beträgt im allgemeinen etwa 100 bis 2000 und insbesondere
125 bis 1000. Beispiele für in Frage kommende Analyten sind Arzneistoffe, Metaboliten, Pestizide und umweltverschmutzende
Substanzen. Beispiele für Arzneistoffe sind Alkaloide, insbesondere Morphinalkaloide, wie Morphin,
Codein, Heroin, Detromethorphan sowie deren Derivate und Stoffwechselprodukte, Kokainalkaloide, wie Kokain und
Benzoylecgonin sowie deren Derivate und Stoffwechselprodukte,
Ergotalkaloide, wie Lysergsäurediäthylamid, Steroidalkaloide,
Iminazoylalkaloide, Chinazolinalkaloide, Isochinolinalkaloide,
Chinolinalkaloide, wie Chinin und Chinidin, und Diterpenalkaloide sowie deren Derivate und Stoffwechselprodukte
.
15
15
Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Steroide,
zum Beispiel die Östrogene, Gestagene, Androgene, Nebennierenrindensteroide,
Gallensäuren, cardiotone Glycoside und Aglycone, wie Digoxin und Digoxigenin, Saponin
und Sapogenine, sowie deren Derivate und Stoffwechselprodukte.
Hierzu gehören auch die mimetischen Steroidsubstanzen, wie Diäthylstilböstrol.
Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind Lactame mit
oder 6 Ringatomen, beispielsweise die Barbiturate, wie
Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantoin, sowie deren StoffWechselprodukte.
Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Aminoalkylbenzole
mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen in den Alkylresten, wie die Amphetamine, Catecholamine, zum Beispiel Ephedrin,
L-Dopa, Epinephrin, Narcein, Papaverin, sowie deren Stoffwechselprodukte und Derivate.
Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Benzhetero-
L 909842/0782 ->
cyclen, wie Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin,
sowie deren Derivate und Stoffwechselprodukte. Als heterocyclische
Ringe liegen dabei Azepine, Diazepine und Phenothiazine vor.
Eine weitere Gruppe von Arzneistoff en sind die Purine, wie Theophyllin, Coffein, sowie deren Stoffwechselprodukte und
Derivate.
Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind von Marihuana abgeleitete Verbindungen, wie Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.
Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Vitamine, beispielsweise die Vitamine A, B, C, D, E und K.
Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Prostaglandine, die sich in bezug auf Anzahl und Stellung von
Hydroxylgruppen und Doppelbindungen unterscheiden. 20
Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Antibiotika,
wie Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin, Tetracyclin,
Terramycin sowie deren Stoffwechselprodukte und Derivate.
Eine weitere Gruppe von Arzneistoffen sind die Nucleoside
und Nucleotide, wie ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidin mit den entsprechenden Zucker- und
Phosphatsubstituenten.
Beispiele für verschiedene einzelne Arzneistoffe sind Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin,
Nortriptylin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propanolol, Griseofulvin, Butyrophenone, Antihistaminika,
anticholinerge Arzneistoffe, wie Atropin, sowie deren
Stoffwechselprodukte und Derivate.
L- 909842/0782 -I
r
-no-
Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind Aminosäuren und kleine Peptide, wie die Polyjodthyronine, zum Beispiel
Thyroxin und Trijodthyronin, Oxytocin, ACTH, Angiotensin,
Gentamycin, Met- und Leu-enkephalin sowie deren StoffWechselprodukte und Derivate.
Beispiele für pathogene Stoffwechselprodukte sind Spermin, Galactose, Pheny!brenztraubensäure und Porphyrin vom
Typ 1.
10
10
In Präge kommende Pestizide sind polyhalogenierte Biphenyle,
Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte
Sulfenamide sowie deren Stoffwechselprodukte und Derivate.
15
15
Das Molekulargewicht der Bezeptoranalyten beträgt im allgemeinen
10 000 bis 2 χ 10 und insbesondere 10 000 bis
10 . Bei den Immunoglobulinen IgA, IgG, IgE und IgM beträgt das Molekulargewicht im allgemeinen etwa 160 000
bis etwa 10 . Das Molekulargewicht von Enzymen liegt im allgemeinen bei etwa 10 000 bis 600 000. Das Molekulargewicht
von natürlichen Rezeptoren schwankt stark und beträgt im allgemeinen mindestens etwa 25 000, kann aber
10 erreichen oder darüber hinaus gehen. Entsprechende Beispiele sind Avidin, thyroxinbindendes Globulin, thyroxinbindendes
Präalbumin und Transcortin. Marker
Quencher
Beim Quencher handelt es sich um ein chromophores MoIekül, das Licht der von der Chemilumineszenzquelle emittierten Wellenlänge absorbiert. Vorzugsweise absorbiert der Quencher das Licht bei einer Wellenlänge, die nahe bei der dem Emissionsmaximum entsprechenden Wellenlänge der Chemilumineszenzquelle liegt. Erwünscht ist eine hohe Ausbeute der Energieübertragung, die erreicht wird, wenn der Quencher sich in realtiv naher Wachbarschaft zur
Beim Quencher handelt es sich um ein chromophores MoIekül, das Licht der von der Chemilumineszenzquelle emittierten Wellenlänge absorbiert. Vorzugsweise absorbiert der Quencher das Licht bei einer Wellenlänge, die nahe bei der dem Emissionsmaximum entsprechenden Wellenlänge der Chemilumineszenzquelle liegt. Erwünscht ist eine hohe Ausbeute der Energieübertragung, die erreicht wird, wenn der Quencher sich in realtiv naher Wachbarschaft zur
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r ■ . ■
_ ZL-I _
Chemilumineszenzquelle befindet«, Normalerweise absorbiert
der Quencher Licht bei einer Wellenlänge von mehr als
O O
etxira 350 A und insbesondere von mehr als etwa 400 A.
Beispiele für verschiedene chromophore Verbindungen, die als Quencher verwendet werden können, sind die Xanthenfarbstoffe
wie die von 3j6-Dihydroxy-9-phenylxanthhydrol
abgeleiteten Fluoreseine sowie die Rosamine und Rhodamine,
die sich von 3,6-Diamino-9-phenylxanthhydrol ableiten.
Ehodamine und Fluorescine x^eisen eine 9-°-Carboxyphenylgruppe
auf und sind Derivate von 9-o-Carboxyphenylxanthhydrol.
Entsprechende handelsübliche Verbindungen weisen Substituenten am Phenylrest auf, die als Bindungsstellen oder als
Bindungsfunktionalitäten verwendet werden können. Beispielsweise sind Fluoresceine erhältlich, die durch Amino-
oder Isothiocyanatgruppen substituiert sind.
Beispiele für weitere Farbstoffe, die als Quencher ver-
^ wendet werden können, sind 3-Phenyl-7-isocyanatocumarin,
Acridine, wie 9-Isothiocyanatoacridin und Acridinorange,
ir-Cp-(2-Benzoxazolyl)-phenyl)-Eialeinimid, Benzoxadiazole,
wie 4-Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol und 7-(p-Methoxybenzylamino)-4~nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol,
Stilbene, wie 4-Dimethylamino-4'~isothiocyanatostilben und
4-Dimethylamino—4'-maleinimidostilben, N,N'-Dioctadecyloxacarbocyanin-p-toluolsulfonat,
Pyrene, wie 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentrisulfonsäure
und 1-Pyrenbuttersäure, Merocyanine, wie Merocyanin 540, Bengalrosa, 2,4-Diphenyl-3(2H)-furanon,
Cyanine, Anthrachinone, Porphyrine, Triarylmethane sowie andere leicht zugängliche Farbstoffe,
die eine quenchende Wirkung aufweisen. Diese Farbstoffe können entweder zur Konjugation geeignete aktive funktioneile
Gruppen aufweisen oder aber es lassen sich derartige funktioneile Gruppen leicht einführen.
909842/0782 -J
Die Absorptions- und Emissionseigenschaften von Farbstoffen ändern sich beim Übergang vom gelösten Zustand
zum gebundenen Zustand unter- Bindung an ein Protein oder an einen Liganden. Deshalb beziehen sich die angegebenen
Wellenlängenbereiche und Eigenschaften der Farbstoffe jeweils auf den Farbstoff in der angewendeten Form und
nicht auf einen nicht-konjugierten und in einem beliebigen Lösungsmittel vorliegenden Farbstoff. Im Überlappungsbereich
zwischen Chemilumineszenzquelle und Queneher ist es erwünscht, dass der Quencher eine hohe Übergangswahrscheinlichkeit
aufweist.
Schliesslich können auch "blaue fluoreszierende Proteine" und/oder "grüne fluoreszierende Proteine", die normalerweise
mit bestimmten bakteriellen Luciferasen assoziiert sind, wie Luciferase aus Photobacterium fisheri, ebenfalls
als Quencher verwendet werden.
Die Chemilumineszenzquelle kann aus einem oder mehreren,
im allgemeinen 2 oder 3 Bestandteilen bestehen. Es ist zwar durchaus möglich, ein einzelnes Molekül zu verwenden,
das thermisch labil ist und bei der Zersetzung chemiluminesziert, beispielsweise bestimmte Dioxetane, jedoch
sind diese Moleküle aus einer Reihe von Gründen für die Praxis und insbesondere für den Handel weniger gut geeignet.
Diese Reagentien können bei ausreichenden niedrigen Temperaturen hergestellt und gelagert werden, wobei
ihre Zersetzungsgeschwindigkeit vertretbar gering ist. Anschliessend können diese Reagentien unmittelbar
vor der Verwendung erwärmt werden. Eine solche Verfahrensweise ist jedoch im allgemeinen unzweckmassig, selbst
wenn diesbezüglich gewisse Parallelen zum Radioimmuntest
bestehen. Vorzugsweise besteht die Chemilumineszenzquelle aus mindestens 2 Bestandteilen. Der Grossteil
·- 909842/0782 -J
Γ
der nachfolgenden Erörterungen bezieht sich auf den letztgenannten
Fall.
Zur Vereinfachung werden die Chemolumineszenzquellen in
2 Gruppen eingeteilt: Solche mit und ohne Beteiligung einer enzymatischen Katalyse.
Von den Chemilumineszenzquellen, bei denen keine enzymatische Katalyse beteiligt ist, können nur solche Quellen
verwendet werden, die unter Bedingungen, bei denen weder die Bindung des Rezeptors an den Liganden inhibiert oder
der Rezeptor und der Ligand mit unannehmbarer Geschwindigkeit während der Messdauer abgebaut werden, chemilumineszieren.
Im allgemeinen sind Chemilumineszenzquellen, die von nicht-wässrigen Lösungsmitteln und starken basischen
Bedingungen (pH-Wert >11) abhängen,ungeeignet. Es können aber entsprechende Techniken angewendet werden, beispielsweise
rasch ablaufende Einspritz- oder Fliesstechniken, bei denen die modulierte Emission im wesentlichen beendet
ist, bevor das Protein denaturiert ist und eine wesentliche Disassoziation auftritt. Nach dem Injizieren der Base
beobachtet man einen Lichtsprung (Burst), der gemessen werden kann.
Es wurde festgestellt, dass verschiedene Verbindungsgruppen unter verschiedenen Bedingungen 'chemilumineszieren.
Eine derartige Gruppe stellen die 2,3-Dihydro-1,4~phthalazindione
dar. Die bekannteste Verbindung ist Luminol, d.h.. die 5-Amino verbindung. Andere Verbindungen dieser
Gruppe sind die 5-Amino-6,7>8-trimethoxy- und Dimethylamino/~ca_7benz-analogen.
Diese Verbindungen werden mit alkalischem Wasserstoffperoxid oder mit Calciumhypochlorit
und einer Base zum Lumineszieren gebracht. Die 2,4-,5-Tri^·
phenylimidazole stellen eine weitere Gruppe von Verbindüngen
dar, wobei Lophin der Trivialname für das Ausgangs-
909842/0782
Γ -η
^ produkt ist. Beispiele für chemilumineszierende analoge
Verbindungen sind die Verbindungen mit p-Dimethyl amino und -Methoxysubstituenten.
Eine weitere Gruppe von chemiluinineszierenden Verbindungen
sind die Indolen-3-yl-hydroperoxide, sowie deren Vorläufer
und Derivate.
Eine weitere Gruppe sind die Bis-9,9l-^iacridiniumsalze,
wie Lucigenin /![,N'-Dimethyl-S^'-biacridiniumdinitrat.
Diese Verbindungen chemilumineszieren nach Vereinigung
mit alkalischem Wasserstoffperoxid.
Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind die in der 9-Stellung
substituierten Acridiniumsalze. Spezielle Derivate davon sind die Carbonsäureester, insbesondere die
Arylester, Acylderivate, insbesondere die Benzoylderivate,
sowie die Cyanoderivate. Zur Einleitung der Chemilumineszenz
wird alkalisches Wasserstoffperoxid verwendet.
Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind verschiedene Acylperoxyester und Hydroperoxide, die in situ durch Vereinigung
mit bestimmten Verbindungen, wie 9}10-Βχρ1ιβην1-anthracen,
hergestellt werden können.
Eine weitere Gruppe von Chemilumineszenzquellen sind bestimmte Hydroperoxide, wie Tetralinhydroperoxid in Kombination
mit Metallkomplexen, insbesondere Porphyrine und Phthalocyanine, wobei als Metalle Eisen oder Zink .vorliegen.
Bevorzugt sind solche Systeme, die eine ausreichende Quantenausbeute der Emission von der Chemilumineszenz-
quelle beim pH-Wert 11 oder darunter, vorzugsweise 10 35
oder darunter, ergeben. Ferner werden solche Systeme be-
L- 909842/0782
vorzugt, die sich, eines Katalysators bedienen,, der an einen
Bestandteil des immunologischen Paars gebunden sein kann. Sofern kein Katalysator beteiligt ist„ ist die Verbindung,
die sich unter Emission von Licht zersetzt, an einen Bestandteil des immunologischen Paars gebunden» In diesen
Fällen ist die Anzahl der chemilumineszierenden Moleküle auf die Moleküle, die gebunden sind, beschränkt.
Eine weitere Gruppe von Verbindungen sind solche, die unter enzymatischer Katalyse chemilumineszieren. Es gibt 2 Gruppen
von enzymatisch katalysierten Chemi lumineszenz que 11 en. Bei
der ersten Gruppe handelt es sich um Verbindungen, die in Kombination mit alkalischem Wasserstoffperoxid chemilumineszieren.
Bei Verwendung einer Peroxidase, wie Meerettichperoxidase oder Katalase, zusammen mit Wasserstoffperoxid
und der chemilumineszierenden Gruppe entsteht Chemilumineszenz. Ein Beispiel für derartige Systeme sind die 2,3-Dihydx'o-1,4-phthalazindione.
Bei der zweiten Gruppe der enzymatischen Chemilumineszenzquellen handelt es sich um die
Luciferine und deren Analoge sowie um Luciferasen.
Die Liganden lassen sich in 2 Kategorien einteilen, nämlich Haptene, deren Molekulargewicht im allgemeinen 125 bis 5000,
vorzugsweise etwa 125 bis 2000 und insbesondere etxra. 125
bis 1000 beträgt, und Antigene, deren Molekulargewicht im allgemeinen mindestens etwa 2000, vorzugsweise mindestens
etwa 5000 und bei Vorhandensein als Teil von Zellen, Viren, Chromosomen und dergleichen mehr als 10 Millionen beträgt.
Die meisten Antigene von diagnostischem Interesse weisen
ein Molekulargewicht von höchstens 1 Million, vorzugsweise etwa höchstens 600 000 und insbesondere von etwa 10 000
bis 350 000 auf.
Bei der Markierung handelt es sich entweder um einen Quencher
mit einem Molekulargewicht von etwa 125 bis 1000 oder
L 909842/0782
um einen Bestandteil der Chemilumineszenzquelle, "bei dem
es sich. 12m ein kleines Molekül mit einem Molekulargewicht von etwa 125 "bis 1000 oder um ein grosses Molekül, beispielsweise
um ein Enzjm. oder Hämin mit einem Molekulargewicht
von etwa 10 000 bis etwa 250 000 und vorzugsweise
von etwa 10 000 bis 150 000 handeln kann.
Je nach der Art des Liganden und des Markers, kann die
Eigenschaft der markierten Verbindung stark variieren. Zunächst wird auf das Quencher-Hapten-Reagens näher einge-'
gangen. Da beide Moleküle klein sind ergibt sich im allgemeinen ein 1 : 1-Verhältnis mit einer relativ kurzen verknüpfenden
Gruppe zwischen Quencher und Haptenteil.
Bei Beteiligung eines Antigens können ein oder mehrere
Quencher an das Antigen gebunden sein. Im allgemeinen liegt mindestens etwa 1 Quenchermolekül pro 100 000 Molekulargewichtseinheiten,
vorzugsweise mindestens etwa 1 Quenchermolekül pro 50 000 Molekulargewichtseinheiten sowie im
allgemeinen nicht mehr als etwa 1 Quenchermolekül pro 1000 Molekulargewichtseinheiten und vorzugsweise höchstens etwa
1 Quenchermolekül pro 2000 Molekulargewi chtseinheiten vor. Bei Antigenen mit einem Molekulargewicht von 10 000 bis
3OO 000 beträgt die Anzahl der Quenchermoleküle etwa 2 bis
30, vorzugsweise etwa 2 bis 20 und insbesondere etwa 2 bis
16. Handelt es sich bei dem gebundenen Bestandteil der Chemulumineszenzquelle um ein kleines Molekül, d.h. mit
einem Molekulargewicht von etwa 125 "bis 1000, so liegt im allgemeinen
ein 1:1-Verhältnis von Chemilumineszenzbestandtexlen
zu Hapten im Reagens aus Chemilumineszenzbestandteil und Hapten vor. Bei Antigenen beträgt die Anzahl von kleinen
chemilumineszierenden Bestandteilen im allgemeinen mindestens
1, vorzugsweise mindestens 1 pro 100 000 Molekular-
eewichtseinheiten und insbesondere mindestens 1 pro 50 000
35
Molekulargewichtseinheiten sowie im allgemeinen höchstens
L 9 09842/0782
Γ "1
1 pro 1000 Molekulargewichtseinheiten und insbesondere höchstens 1 pro 2000 Molekulargewichtseinheiten.
Bei Vorliegen von Antigenen und grossen (über 10 000) Bestandteilen
der Chemilumineszenzquelle können die Verhältnisse stark variieren, wobei entweder eine Mehrzahl von
Chemilumineszenzbestandteilen an den autigenen Liganden
oder eine Mehrzahl von Liganden an den Chemilumineszenzbestandteil gebunden sein können. Im allgemeinen beträgt
das Verhältnis von Antigen zum Chemilumineszenzbestandteil etwa 0,05 bis 20 und vorzugsweise etwa 0,01 bis 10, wobei
die Chemilumineszenzquelle und das Antigen Molekulargewichte im Bereich von etwa 10 000 bis 300 000 aufweisen.
Die Art der verknüpfenden Gruppe hängt stark von den speziellen, zu verbundenen Materialien ab. Im allgemeinen
x^eisen die verknüpfenden Gruppen bis zu etwa 20 Atomen
in der Kette auf, wobei es sich um Kohlenstoff-,
Sauerstoff-, Stickstoff- und/oder Schwefelatome handelt, wobei Kohlenstoff-, Sauerstoff- und Stickstoffatome bevorzugt
sind und die Stickstoffatome nur durch Kohlenstoffatome
substituiert sind oder neutral sind, sofern sie durch Kohlenstoff- und Wasserstoffatome substituiert sind, beispielsweise
Amidogruppen. In der US-PS 3 817 837 sind eine
grosse Anzahl von entsprechenden verknüpfenden Gruppen aufgeführt.
Bei Vorliegen eines Poly-(ligandenanalogen)-Markers kann
ein hub-Kern verwendet werden, bei dem es sich normaleren
weise um ein wasserlösliches Polymerisat und insbesondere um eine Poly-(aminosäure) oder ein Polysaccharid handelt.
Im allgemeinen beträgt das Molekulargewicht des hub-Kerns etwa 25 000 bis 600 000 und insbesondere etwa 30 000 bis
300 000. Das Molekulargewicht von Enzymen, die an das
nc .
Ligandenanaloge gebunden werden können, beträgt etwa
009842/0782
Γ "I
15 000 bis 300 000. Die vorstehend erläuterten verknüpfenden Gruppen können auch zur Verknüpfung von Marker und
Ligandenanalogem an den hub-Kern oder das Enzym verwendet werden.
Beispiele für funktionelle Gruppen in den verknüpfenden Resten sind Alkylamin-, Amid-, Amidin-, Thioamid-, Harnstoff-,
Thioharnstoff- und Guanidingruppen. Spezielle Beispiele sind Carbonsäuren in Verbindung mit Diimiden,
gemischte Anhydride mit Carbonatmonoestern, Aldehyde in Verbindung mit Reduktionsmitteln, wie Borhydride, Imidoester,
aktive Carbonsäureester, wie M-Hydr-oxysuccinimid-
oder p-Witrophenylester, Isocyanate, Isothiocyanate und
aktive Halogenide.
15
15
Der Rezeptor kann entweder mit dem Quencher oder dem Chemilumineszenzbestandteil
markiert sein. Handelt es sich bei dem Marker um ein kleines Molekül mit einem Molekulargewicht
von etwa 125 bis 1000, so liegt im allgemeinen mindestens 1 Marker pro Rezeptor und höchstens etvra. 1
Marker pro 1500 Molekulargewichtseinheiten des Rezeptors, Vorzugspreise höchstens etwa 1 Marker pro 2500 Molekulargewichtseinheiten
und insbesondere höchstens etwa 1 Marker pro 5000 Molekulargewichtseinheiten des Rezeptors vor.
Handelt es sich bei dem Rezeptor um einen Antikörper (IgG) beträgt die Anzahl der Marker im allgemeinen etwa
2 bis 20 und vorzugsweise etwa 2 bis 12. Handelt es sich bei dem Marker um ein Makromolekül mit einem Molekular—
gewicht von etwa 10 000 bis 300 000, so liegen im allgemeinen 1 bis 10 Marker und vorzugsweise etwa 1 bis 6 Marker
vor.
Die Art der Konjugation an den Rezeptor ist vorstehend 3^ erläutert.
909 842/0782
Γ
Testpackungen
Um beim erfindungsgemässen Test reproduzierbare Ergebnisse
zu erhalten, ist es wünschenswert, die kritischen Reagentien in vorbestimmten Verhältnissen zur Verfügung zu
stellen, so dass die Testempfindlichkeit ihr Optimum erreicht. Bei der Bestimmung von Liganden gehören zu den
kritischen Reagentien: Markierter Ligand unter Einschluss von Poly-(ligandenanalogem)-Marker und markierter Rezeptor.
Bei der Rezeptorbestimmung kann auch der Ligand ein kritisches Reagens sein. Abgesehen von der bevorzugten Massnahme,
die kritischen Reagentien in vorbestimmten Verhältnissen zur Verfügung zu stellen, ist es häufig auch wünschenswert,
dass Hilfssubstanzen, wie Puffer und Stabilisatoren,
den kritischen Reagentien beigefügt werden, so dass trockene Pulver oder Konzentrate entstehen, die direkt unter
Bildung von Testlösungen verdünnt werden können, so dass es nicht notwendig ist, die verschiedenen Materialien
abzuwiegen.
In den Testpackungen werden die Reagentien in relativen Anteilen zur Verfugung gestellt, so dass die Testempfindlichkeit
auf den in Frage kommenden Konzentrationsbereich optimal eingestellt werden kann. Einem oder beiden Reagentien
können Puffer, inerte Proteine, wie Albumine, Stabilisatoren, wie Natriumazid, und ähnliche Verbindungen
einverleibt werden. Vorzugsweise werden die Reagentien als trockene Pulver, insbesondere im Fall von markierten polyepitopen
Liganden und Rezeptoren,zur Verfügung gestellt. Die Herstellung von Pulvern aus diesen Materialien kann
durch Lyophilisation erfolgen.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich sämtliche Prozent- oder
Teilangaben auf das Gewicht. Ausgenommen davon sind Flüssigkeitsgemische,
bei denen sich die Angaben auf das Volumen beziehen.
098A2/0782
"" Beispiel 1
Konjugation von Meerrettichperoxidase an Human-· jT-Globulin*
(MKG) j
Es wird das von Hakane und Kawaoi in J. Hist. Cyto., Bd.
(1974), S. 1084 bis 1091 angegebene Verfahren angewendet.
Zu 1 ml 0,3 m Natriumhydrogencarbonatpuffer vom pH-Vert
8,1 werden 6 mg Meerrettichperoxidase (HRP) und 100^1 einer
1-prozentigen wässrigen Lösung von 2,4-Dinitro-1-fluor-
benzol gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde inkubiert. An-10
schliessend wird das Gemisch gegen 0,01 m Hatriumcarbonatpuffer
vom pH-Wert 9,5 2 Stunden dialysiert, worauf sich eine Dialyse gegen 0,3 m Natriumhydrogencarbonatpuffer vom
pH-Wert 8,1 anschliesst.
Etwa 1,5 ml der vorstehend hergestellten HEP-Lösung werden
zu 1 ml 0,4- m Natriumperjodatlösung gegeben. Das Gemisch
wird 4-5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.
Diese Lösung wird sodann mit 25 μΐ 0,32 m wässrigem Äthylenglykol
versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde stehengelassen und anschliessend 2 Stunden in einem Kollodiumsack gegen
0,01 m Natriumcarbonatlösung vom pH-Wert 9,5 dialysiert. Der im Dialysesack verbliebene Rückstand wird mit 5 mg
hlgG vereinigt. Das Gemisch wird 1 Stunde stehengelassen. Sodann werden 15 mg Natriumborhydrid zugegeben. Das Gemisch
wird 1,25 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann über Nacht in einem Kollodiumsack gegen PBS vom
pH-Wert 7 dialysiert. Der Rückstand im Dialysesack wird sodann an Sephadex G-200 unter Verwendung von 0,01 m
PBS vom pH-Wert 7 chromatographiert. Die Fraktionen werden aufgefangen. In der Fraktion 7 werden spektrophotometrisch
2,5 χ 10~7 m hlgG und 4,95 χ ΙΟ"? m HRP festgestellt.
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r ■ ~ι
1
Beispiel 2
In ein mit einem Rührstab ausgerüstetes Fläschchen werden
5 mg lyophilisiertes Kaninchen-anti-(hlgG) (Miles Laboratories,
Lot 18, Code 64-155) gegeben. Bas Gemisch, wird in
0,5 ml wässrigem Matriumphosphat vom pH-¥ert 8,0 gelöst
und der pH-Wert wird mit wässriger Natriumcarbonatlösung
auf 9 eingestellt. Eine Lösung von 0,3 mg Fluoresceinisothiocyanat
in 0,3 ml Dimethylformamid wird unter heftigem Rühren innerhalb von etwa 40 Sekunden zugesetzt. Das
Gemisch, wird weitere 60 Minuten gerührt. Anschliessend wird das Reaktionsgemisch an einer mit Sephadex G-25 gepackten
Säule Chromatographiert und fraktioniert. Man erhält eine
Fraktion mit einem Gehalt an 2,4 mg/ml anti-(hlgG) mit einem Verhältnis von Fluorescein : anti-hlgG von etwa 5 : 1 ·
Anschliessend wird der folgende erfindungsgemässe Test
bei Raumtemperatur durchgeführt. Hierzu werden die folgenden Lösungen verwendet: 1,86 mg/ml hlgG in Wasser, 0,023
mg/ml Fluorescein-anti-(hIgG)-Konjugat (gemäss obigen Ausführungen
hergestellt) und 2,5 χ 10 m HRP-hlgG-Konjugat.
Zusätzlich werden jeweils 100 ^uI wässrige Lösungen von
10~^ m Luminol und 1O--5 m Wasserstoffperoxid zugesetzt.
In der nachstehenden Tabelle sind die Mengen der einzelnen
zugesetzten Materialien sowie die Ergebnisse als gezählte
Ereignisse pro 0,1 Minute in verschiedenen Abständen vom Mischzeitpunkt zusammengestellt.
Tabelle . , _. _
—:—■■
innerhalb von 6 see. ge-
hlgG Fluorescein- HRP-hlgG, zählte Ereignisse (in
^uI anti-(hlgG), ^l ^uI tausend) zum angegebenen
Zeitpunkt (min) ab ' Mischung
0 0 25
35 1 5 25
2,5 5 25
5 5 25
10 5 25
L 909842/0782
5 , | 15 | 60 |
23,3 | 38,3 | 56,8 |
27,2 | 41,1 | 60,8 |
34,9 | 50,3 | 71,3 |
36,8 | 44,7 | 81,7 |
49,8 | 66,0 | 78,9 |
Zur.Zählung wird ein ß-Mate Scintillation Counter (Nicht-Koinzidenz-Ausführungsform)
verwendet.
Aus den vorstehenden Ergebnissen ergibt sich, dass eine Eichkurve zur Bestimmung der Analytenmenge in einem Testmedium aufgestellt werden kann. Dieses Verfahren ist sehr
einfach, da die Reagentien rasch vereinigt und die Ablesung innerhalb sehr kurzer Zeit vorgenommen werden kann.
Ferner stabilisieren sich die Ablesungen nach etwa 1/2 Stunde, so dass der Ablesezeitpunkt weniger kritisch wird.
Der vorstehend beschriebene Test erlaubt es, eine grosse Anzahl von Analyten auf zweckmässige Weise quantitativ zu
bestimmen. Ferner ermöglicht es dieses Verfahren ein
Signal durch Verwendung eines katalytisehen Systems (enzymatisches
oder nicht-enzymatisches System), das für jedes im Medium vorhandenes Analytenmolekül eine Mehrzahl von
Ereignissen liefert, zu verstärken. Ausserdem werden bei diesem Verfahren Probleme durch Lichtstreuung und Protein-
absorption und -emission, die zu einer Störung der Ergebnisse führen können, vermieden.
8Ο98Λ2/0782
Claims (32)
1. die Probe,
2. das Konjugat mit Chemilumineszenzmarkierung,
3. das Konjugat mit Quenchermarkierung und
4. beliebige zusätzliche Bestandteile der Chemilumineszenzquelle,
mit der Massgabe dass,
a. wenn es sich beim Analyten um einen monoepitopen Liganden handelt und keiner der Marker an den Liganden
gebunden ist, in der Testlösung ein PoIy-(ligandenanaloges) vorhanden ist,
b. wenn es sich beim Analyten um einen mehrwertigen
Antiliganden für den monoepitopen Liganden handelt, ein Poly-(ligandenanaloges)-Marker oder ein PoIy-(ligandenanaloges)
oder eine Kombination aus Ligand
mit Quenchermarkierung und Ligand mit Chemiltimines-
zenzmarkierung in der Testlösung vorhanden ist und,
wenn es sich bei dem Analyten um einen einwertigen Antiliganden handelt, ein Poly-(ligandenanaloges)-Marker
in der Testlösung vorhanden ist,
c. wenn es sich bei dem Analyten um einen Antiliganden
für den polyepitopen Liganden handelt und keiner
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1 der Marker ligandengebunden ist, ein Ligand in der
Testlösung vorhanden ist und,
d. wenn es sich bei dem Analyten um einen polyepi-5
topen Liganden handelt und sowohl der Quenchermarker
als auch der Ghemilümineszenzmarker ligandengebunden
sind, ein Antiligand in der Testlösung vorhanden ist,
10 wobei das Ligandenanaloge mindestens ein epitopes Zentrum mit dem Liganden gemeinsam hat und mit dem Liganden
um den Antiliganden konkurrxeren kann, und
B. die von der Testlösung emittierte.Lichtmenge bei min-15
destens einer Wellenlänge misst und mit der von einer Testlösung mit bekannter Analytenmenge emittierten
Lichtmenge vergleicht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
20 die Testlösung einen pH-Wert von etwa 5 bis 11 und eine Temperatur von etwa 10 bis 500C aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Analyten um einen haptenischen Liganden
25 mit einem Molekulargewicht von etwa 125 "bis 2000 handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich bei dem Analyten um ein Antigen mit einem Molekulargewicht von mindestens etwa 2000 handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Analyten .um einen Antiliganden handelt.
6. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Test-35 lösung, dadurch gekennzeichnet, dass
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- der Analyt Bestandteil eines aus einem monoepitopen Liganden mit einem Molekulargewicht von etwa 125 "bis
2000 und einem Antiliganden "bestehenden immunologischen Paars ist,
- der Antiligand an das epitope Zentrum des Liganden gebunden werden kann,
- ein lichtemittierendes reziprokes Paar als Marker verwendet wird,
- das lichtemittierende reziproke Paar aus einer mindestens einen Bestandteil aufweisenden Chemilumineszenzquelle
und einem Quencherfarbstoff, der das von der Chemilumineszenzquelle
emittierte Licht kollisionsfrei quenchen
kann, besteht,
- die Marker unter Bildung eines Konjugats mit Chemilumi-
neszenzmarkierung und eines Konjugats mit Quenchermarkierung
an Bestandteile des immunologischen Paars gebunden sind, wobei mindestens einer der
Marker nicht an einen Liganden gebunden ist, und
- in der Testlösung die Menge des Quenchers, der in quenchenden
Abstand zur Chemilumineszenzquelle gebracht ist, in Beziehung zur Analytenmenge in der Lösung steht,
wobei man zur Durchführung des Verfahrens A. zur Herstellung der Testlösung in einem wässrigen Medium
vom pH-Bereich 5 his 11 und einer Temperatur von
10 bis 500C folgende Bestandteile vereinigt:
1. die Probe,
2. das Konjugat mit Chemilumineszenzmarkxerung,
3- das Konjugat mit Quenchermarkierung und
4. beliebige zusätzliche Bestandteile der Chemilumineszenzquelle ,
mit der Massgabe, dass, wenn es sich beim Analyten um einen Antiliganden für den monoepitopen Liganden handelt
und keiner der Marker ligandengebanden ist, ein Poly-(ligandenanaloges)
in der Testlösung vorhanden ist, wobei das Ligandenanaloge des Poly-(ligandenanalogen)
ein epitopes Zentrum mit dem Liganden gemeinsam hat und
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in der lage ist mit dem Liganden um den Antiliganden zu konkurrieren, und
B. die von der Testlösung emittierte Lichtmenge bei mindestens
einer Wellenlänge misst und mit der von einer Testlösung mit bekannter Analytenmenge emittierten
Lichtmenge vergleicht.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Analyten um einen Antiliganden handelt.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Analyten um einen monoepitopen Liganden
handelt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass
die Chemilumineszenzquelle mindestens zwei Bestandteile
aufweist und einer der Marker an den Liganden und der andere an den Antiliganden gebunden ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9i dadurch gekennzeichnet, dass
es sich bei dem Liganden um ein Alkaloid handelt.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Liganden um ein Steroid handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Liganden um ein Lactam mit 5 oder 6
Ringgliedern handelt.
13- Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich bei dem Liganden um ein Aminoalkylbenzol mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen im Alkylrest handelt.
14-, Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich bei dem Liganden um einen Benzheterozyklus handelt
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15. Verfahren nach Anspruch 95 dadurch gekennzeichnet, dass
es sich bei dem Liganden um ein Purin handelt.
16. Verfahren nach Anspruch 9> dadurch gekennzeichnet, dass
es sich bei dem Liganden um eine Aminosäure handelt.
17- Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich bei der Aminosäure um Polyjodthyronin handelt.
18. Verfahren nach Anspruch 9> dadurch gekennzeichnet, dass
es sich bei einem der Bestandteile der Chemilumineszenzquelle um ein Enzym und bei dem Konjugat mit Chemilumineszenzmarkierung
um einen an dieses Enzym gebundenen Liganden handelt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich beim Enzym um eine Peroxidase und beim anderen Bestandteil der Chemilumineszenzquelle um Luminol handelt.
20. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Testlösung,
dadurch gekennzeichnet, dass
- der Analyt Bestandteil eines aus einem polyepitopen Liganden mit einem Molekulargewicht von mindestens etwa
Paars ist, 2000 und einem Antiligand bestehenden immunologischen/
- der Antiligand an die epitopen Zentren des Liganden gebunden werden kann,
- ein lichtemittierendes reziprokes Paar als Marker verwendet wird,
- das lichtemittierende reziproke Paar aus einer mindestens
einen Bestandteil aufweisenden Ghemilumineszenzquelle und einem Quencherfarbstoff, der das von
der Chemilumineszenzquelle emittierte Licht kollisions— frei quenchen kann, besteht,
- die Marker unter Bildung eines Konjugats mit Chemilumineszenzmarkierung
und eines Konjugats mit Quenchermarkierung
an Bestandteile des immunologischen Paars
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Γ -7- 291354s"1
gebunden werden, wobei mindestens einer der Marker
an einen Nichtliganden gebunden ist, - in der Testlösung die Menge des Quenchers, der in
quenchendem Abstand zur Chemiluminesζenzquelle gebracht
ist, in Beziehung zur Analytenmenge in der Lösung steht, wobei man zur Durchführung des Verfahrens
A. zur Herstellung der Testlösung in einem wässrigen Medium vom pH-Bereich 5 bis 11 und einer Temperatur von 10 bis
500C folgende Bestandteile vereinigt:
1. die Probe,
2. das Konjugat mit Chemilumineszenzmarkierung,
J. das Konjugat mit Quenchermarkierung und
4. beliebige weitere Bestandteile der Chemilumineszenzquelle
mit der Massgabe, dass, wenn es sich bei dem Analyten um einen Antiliganden handelt und keiner der Marker
ligandengebunden ist, der Ligand in der Testlösung vorhanden
ist, und
B. die von der Testlösung emittierte Lichtmenge bei mindestens
einer Wellenlänge misst und mit der von einer Testlösung mit bekannter Analytenmenge emittierten Lichtmenge
vergleicht.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich bei dem Analyten um einen Antiliganden handelt.
22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Analyten um einen polyepitopen Liganden
handelt.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass
die Chemilumineszenzquelle mindestens zwei Bestandteile aufweist und einer der Marker an einen Liganden und der
andere an einen Antiliganden gebunden ist.
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24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Liganden um ein Polypeptid handelt.
25. Verfahren nach Anspruch 24-, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich "bei dem Polypeptid um ein Globulin handelt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Globulin um ein Immunoglobulin handelt.
27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Polypeptid um ein Hormon handelt.
28. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bestandteil der Ghemilumineszenzquelle,
der an einen Bestandteil des immunologischen Paars gebunden ist, um ein Enzym handelt.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich bei dem Enzym um eine Peroxidase und bei einem anderen Bestandteil der Chemilumineszenzquelle um Luminol
handelt.
30. Verfahren zur Bestimmung von Humanglobulin in einer Testlösung,
dadurch gekennzeichnet, dass - anti-Humanglobulin als Reagens und ein lichtemittierendes
reziprokes Paar als Marker verwendet werden,
- das lichtemittierende reziproke Paar aus einer Chemilumineszenzquelle,
die eine Peroxidase und Luminol enthält, und einem Quencherfarbstoff, der das von der
. Chemilumineszenzquelle emittierte Licht quenchen kann, besteht,
- die Peroxidase an das Humanglobulin unter Bildung eines Humanglobulin-Peroxidase-Konjugats und der Quencherfarbstoff
an das anti-Humanglobulin unter Bildung eines Quencher-anti-Humanglobulin-Kon^jugats gebunden werden
und
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" - in der Testlösung die Menge des Quenchers, der in einen quenchenden Abstand zur Chemilumineszenzquelle gebracht
ist, in Beziehung zur Menge an Humanglobulin steht, wobei man zur Durchführung des Verfahrdns
A. zur Herstellung der Testlösung in einem wässrigen Medium vom pH-Bereich etwa 7 bis ΊΟ und einer Temperatur
von etwa 10 bis 500C folgende Bestandteile vereinigt:
1. die Probe,
2. das Peroxidase-Humanglobulin-Konjugat,
3. das Quencher-anti-Humanglobulin-Konjugat und
4-, beliebige zusätzliche Bestandteile der Chemilumineszenzquelle,
und
B. die von der Testlösung emittierte Lichtmenge bei mindestens einer Wellenlänge misst und mit der von einer
Testlösung mit bekannter Menge an Humanglobulin emittier ten Lichtmenge vergleicht.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich beim Quencherfarbstoff um Fluorescein handelt.
32. Testpackung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, enthaltend das Konjugat mit Chemilumineszenzmarkierung
und das Konjugat mit Quenchermarkierung in Mengenverhältnissen,
die eine optimale Durchführung, des Verfahrens ermöglichen.
33- Testpackung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass
es sich bei einem Bestandteil der Chemilumineszenzquelle um ein Enzym handelt.
34·. Testpackung nach Anspruch 33» dadurch gekennzeichnet, dass
das Enzym an den Liganden gebunden ist.
35- Testpackung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass
ein Bestandteil der Chemilumineszenzquelle und der Quencherfarbstoff beide an den Antiliganden gebunden sind.
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36- Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Testlösung,
bei dem
- der Analyt Bestandteil eines aus einem monoepitopen Liganden mit einem Molekulargewicht von etwa 125 bis 20Θ0
und einem Antiliganden bestehenden immunologischen Paars ist,
- der Antiligand an das epitope Zentrum des Liganden gebunden werden kann,
- ein Marker, der ein Bestandteil einer mindestens einen Bestandteil aufweisenden Ghemilumineszenzquelle ist,
verwendet wird und
- der Marker an den Liganden unter Bildung eines Konjugats
mit Chemilumineszenzmarkierung gebunden wird,
dadurch gekennzeichnet, dass man
A. zur Herstellung der Testlösung in einem wässrigen Medium
vom pH-Bereich 5 bis 11 und einer Temperatur von 10 bis
500C folgende Bestandteile vereinigt:
1. die Probe,
2. das Konjugat mit Chemilumineszenzmarkierung und
3. beliebige zusätzliche Bestandteile der Chemilumineszenzquelle,
mit der Massgabe, dass, wenn es sich bei dem Analyten
um einen Liganden handelt, Antiligand zugesetzt wird, und
B. die von der Testlösung emittierte Lichtmenge bei mindestens einer Wellenlänge misst und mit der von einer
Testlösung mit bekannter Analytenmenge emittierten Lichtmenge vergleicht.
L 909842/0782
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