DE3003959A1 - Konjugate aus ligandenanalogem und irreversiblem enzyminhibitor und deren verwendung zur bestimmung von liganden - Google Patents

Description

DIPL.-PHYS. M. GRITSCHNEDER '

DR. DIETER F. MORF , ...,_8Ol,_OHmd„„_M

DR.-ING. WALTER ABITZ Mund,.n. 4_: FebruarJ98

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Patentanwälte Tele_B«imme: Chemtndus München

Telox: (Ο)6 230Β2

ABBOTT LABORATORIES North Chicago, Illinois, V.St.A.

!Conjugate aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor und deren Verwendung zur Bestimmung von Liganden

030033/0727

DR.-ING. WALTER ABITZ DR. DIETER F. MORF DIPL.-PHYS. M. GRITSCHNEDER

Patentanwälte /jQ

M'"Inch en.

I ViiB'niudirl't / ^x'o«tal I ro.tfach ΒΘΟ1ΟΘ. SOOO München Ββ Fienzenauentraße SB

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Beschreibung

Es sind eine Reihe von Enzymimmuntests bekannt. Hierzu gehören Verfahren, bei denen ein Enzym an einen nachzuweisenden Antikörper oder Antigen gebunden wird. Die Konkurrenz zwischen der enzymraarkierten und der unbekannten Spezies um den an einen festen Träger gebundenen, bindenden Partner wird gemessen. Das in der Lösung verbleibende Enzym wird durch Umsetzung mit einem entsprechenden Substrat gemessen.

Homogene Enzymimmuntests werden in der US-PS 4 043 872 (Hapten an Enzym gebunden) und in der US-PS 4 065 354 (Hapten an Lysozym gebunden) beschrieben. Mit Enzymkofaktoren markierte Liganden sind in Analytical Biochemistry, Bd. 72 (1976), S. 271 und 283 beschrieben. In Derwendt Abstract B4, Natural Products week A26, S. 30 (DE-OS 2754 086) sind reversibel bindende Enzymmodulatoren als markierende Substanzen für Antigene, Antikörper, Hormone, Vitamine oder Arzneistoffe beschrieben..Aus der BE-PS 864 856 sind Konjugate bekannt, bei denen Methotrexat als an Ligandenanaloge gebundener

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Enzyminhibitor dient.

Das erfindungsgemasse Verfahren und die Reagentien zur Durch führung des Verfahrens unterscheiden sich vom Stand der Tech nik insbesondere dahingehend, dass an Ligandenanaloge konjugierte irreversible Enzyminhinbitoren verwendet werden. Die erfindungsgemäss eingesetzten Inhibitoren reagieren mit den Enzymen unter Bildung von kovalenten Bindungen, wobei sich die Enzymstruktur verändert und die enzymatische Aktivität irreversibel gehemmt wird. Insbesondere werden erfindungsgemäss irreversible Organophosphor-Enzyminhibitoren, die mit einem Enzym unter Bildung von kovalenten Bindungen reagieren, mit Ligandenanalogen konjugiert.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Liganden in zu untersuchenden Proben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man

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die zu untersuchende Probe mit einem aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor bestehenden Konjugat und einem bindenden Protein, das zur Bindung an den Liganden und das Konjugat aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor in der Lage ist, vermischt, wobei die Menge des durch das bindende Protein gebundenen Konjugats aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor in Beziehung zur Menge des Liganden in der zu untersuchenden Probe steht und wobei das bindende Protein den irreversiblen Enzyminhibitor bei der Bindung mit dem Ligandenanalogem-Bestandteil des Konjugats inaktiviert.

ein Enzym, das durch das nicht an das bindende Protein gebundene Konjugat aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor irreversibel gehemmt wird, zumischt und

Substrat für das Enzym zumischt und die Enzym-Substrat-Reaktion bestimmt.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Konjugate aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor, die sich als Reagentien zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eignen. Der irreversible Enzyminhibitor-Bestandteil des Konjugats reagiert mit dem Enzym unter Bildung von kovalenten Bindungen, wobei das Enzym inaktiviert wird. Das erfindungsgemasse Verfahren und die entsprechenden Reagentien eignen sich insbesondere zur Bestimmung von Arzneistoffen, Hormonen und dergleichen.

Insbesondere werden das erfindungsgemasse Verfahren und die entsprechenden Reagentien zur Bestimmung von Ligan-

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den in biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Plasma, Rückenmarkflüssigkeit, Amnionflüssigkeit und Urin, eingesetzt.

Unter dem Ausdruck "Ligand" sind erfindungsgemäss Haptene, Polypeptide, Proteine und Glycoproteine mit Molekulargewichten, die im allgemeinen unter 150 000 liegen, zu verstehen.

Haptene sind proteinfreie Körper, im allgemeinen von geringem Molekulargewicht, die bei Verabfolgung an Tiere durch Injektion keine Antikörperbildung induzieren, aber mit Antikörpern reagieren. Antikörper gegen Haptene werden erzeugt, indem man zunächst das Hapten mit einem Protein konjugiert und das Konjugat Tieren oder Menschen injiziert. Die gebildeten Antikörper werden nach herkömmlichen Verfahren zur Isolierung von Antikörpern isoliert. Für die Zwecke der Erfindung sollen die Antikörper im wesentlichen frei von Serumproteinmaterial, wie beim Test verwendete Indikatorenzyme oder Inhibitoren für die Antikörperbindung, sein. Derartige Proteine werden zweckmässigerweise durch Ionenaustauschchromatographie an einer mit Anionenaustauscher gepackten Säule oder durch andere geeignete Verfahren zur Abtrennung von Proteinen entfernt.

Spezielle Beispiele für Liganden, die gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren bestimmt werden können, sind Steroide, wie Östron, Östradiol, Cortisol, Testosteron, Progesteron, Cheno-desoxycholsäure, Digoxin, Cholsäure, Desoxycholsäure, Lithocholsäuren und Ester und Amide davon, Vitamine, wie Vitamin B_1? und Folsäure, Thyroxin, Trijodthyronin, Histamin, Serotonin, Prostaglandine, wie PGE, PGF und PGA, Adrenalin, Noradrenalin, Arzneistoffe, wie Opiate, Theophyllin und Dilantin, Barbiturate, wie Phenobarbital und Derivate davon, Carbamazepine und Aminoglycosid-Antibiotika, wie Gentamycin und Tobramycin.

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Beispiele für Polypeptide und Glycoproteine, die sich erfindungsgeraäss bestimmen lassen, sind Insulin, Blutplättchenfaktor 4 und Polypeptid-Determinanten von grossen Antigen en.

Bei Ligandenanalogen handelt es sich um funktionelle oder funktionalisierte Liganden, die sich zur Konjugation mit irreversiblen Enzyminhibitoren eignen. Entsprechende funktionelle Gruppen sind Säure-, Ester-, Amid-, Amin-, Hydroxyl-, Isocyanat und Isothiocyanatgruppen.

In Tabelle I sind Beispiele für Enzyme und irreversible Enzyminhibitoren, die erfindungsgemäss eingesetzt werden können, aufgeführt.

Tabelle I Irreversibler Inhibitor

Organophosphat-triester Organophosphat-diester Organophosphothioate

Alkylsulfonate Alkylisocyanat

p-Chlormercuribenzoat-Derivate

Enzyme

Trypsin

Acetylcholinesterase Butyrlcholinesterase Chymotrypsin Thrombin

Elastase

Adenosin-desaminase·. ■ Acetylcholinesterase Elastase

Trypsin

Chymotrypsin Papain

Alkohol-dehydrogenase Chymopapain

Clostridiopeptidase B

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Tabelle I (Forts.) Irreversibler Inhibitor Enzyme

(p-Chlormercuribenzoat- Adenosin-desaminase

Derivate Forts.) Lipase

ß-Amylase Pepsin

Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase

Luciferase

Aspartat-aminotransferase

Alanin-aminotransferase

Hexokinase

Substrat-Epoxide Pepsin

6-Diazo-5-oxo-L-norleucin- Glutaminase A

Derivat
Jodessigsäure-Derivate saure Desoxyribonuclease II

Alkohol-dehydrogenase

N-Bromsuccinimid-Derivate saure Desoxyribonucle

ase II

Dextranase

Irreversible Organophosphor-Enzyminhibitoren werden bevorzugt. In J.Am.Chem. Soc, Bd. 80 (1958), S. 456, J.Am.Chem. Soc, Bd. 82 (1960), S. 596 und Rec. Trav. Chim., Bd. (1967), S. 399 sind verschiedene Klassen von Organophosphor-Verbindungen beschrieben, die sich als irreversible Enzyminhibitoren eignen. Bevorzugte Organophosphor-Verbindungen, die sich zur Konjugation mit Ligandenanalogen eignen weisen die folgende allgemeine Formel auf:

R₁-^-S-CH₂-CH₂-B-(CH₂)_n~3 R₂

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in der B ein Stickstoff- oder Schwefelatom oder deren alkylierte Salze bedeutet, η den Wert 1 bis 10 und vorzugsweise 2 bis 8 hat, X eine funktionelle Gruppe, wie die Hydroxyl-, Amino-, Carboxyl- oder o(-Halogenmethylcarboxylgruppe mit Jod, Chlor oder Brom als Halogenatom bedeutet und R. und R_? Alkylreste mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Alkoxyreste mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellen. Die Alkylreste können durch Nitrogruppen, Halogenatome, Cyanogruppen, Benzylgruppen oder ähnliche Substituenten substituiert sein. Dem organischen Chemiker stehen eine Reihe von äquivalenten Strukturen zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Verfügung.

Weitere bevorzugte irreversible Enzyminhibitoren weisen die folgende allgemeine Formel auf:

^R4

R₃-P-O-

in der R_ die vorstehend für R₁ und R_? definierte Bedeutung hat und R^. eine übliche austretende organische Gruppe Cleaving group"), beispielsweise eine p-Nitrophenylgruppe oder eine gegebenenfalls durch Alkyl, Halogen oder Cyano substituierte' Hydroxychinolylgruppe darstellt.

Irreversible Enzyminhibitoren werden an Ligandenanalogen durch übliche bifunktionelle Brückengruppen der allgemeinen Formel

X-A-Y

gebunden, wobei X und Y funktionelle Gruppen darstellen, wie -OH, -NH₂, CO₂H (Ester), oder -CO-CH₂Z bedeuten, wobei Z Jod, Chlor oder Brom ist. A bedeutet den Rest -(CH ) wobei η einen Wert von 3 bis 20 hat. Die Alkylenkette kann"

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durch einen oder mehrere zweiwertige Gruppen unterbrochen sein, beispielsweise durch -0-, -CO-, -S-, -NH-, -CONH-, -CH=CH-, -C^C-, Phenylen und Sulfonium- und Ammoniumsalze. Die Alkylenkette kann durch herkömmliche Substituenten substituiert sein, beispielsweise durch Halogenatome, wie Jod, Brom, Chlor oder Fluor, Hydroxyl, Cyano, Phenyl, Amino, Carboxyl, organische Carboxylester, Alkyl mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen oder Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen. X-A-Y kann kleine Polypeptid- oder Polysaccharidketten bedeuten. Somit wird X-A-Y nach herkömmlichen Verfahren mit einem irreversiblen Enzyminhibitor und einem Ligandenanalogen unter Bildung von Amid-, Ester-, Amin-, Imin-, Sulfonamid-, Thioester-, Phosphat-, Thiophosphatbindungen oder ähnlichen Bindungen zwischen der Brückengruppe und dem irreversiblen Enzyminhibitor und dem Ligandenanalogen gebunden.

Im allgemeinen wird eine Seitenkette an einem Liganden oder Ligandenanalogen gebildet und das Produkt mit einem irreversiblen Enzyminhibitor, der zur Umsetzung mit der Seitenkette am Ligandenanalogen mit entsprechenden funktionellen Gruppen versehen ist, umgesetzt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, eine Seitenkette am irreversiblen Enzyminhibitor zu bilden und mit einem entsprechenden Liganden oder Ligandenanalogen umzusetzen. Somit eignen sich Produkte der Formel

irreversibler Enzyminhibitor - A - Ligandenanaloges als Reagentien.

Nachstehend sind Beispiele für erfindungsgemäss verwendbare Konjugate angegeben.

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Thyroxin

3 Z=O

CH₃-P-S-CH₂-CH₂-S-(CH₂)_ß

-NH-C-CH-

CH₂-^O>-0-iO^-0H

OCH₂CH₃ CH₃

CH₃OSO₃

Cho !säure

Ch₃-P-SCH₂CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-C-(CH₂)₃-NH-C-C H₂-CH₂-CH

OCH₂CH₃

Dilantin

CH₃-P-S-CH₂CH₂-S-OCH-CH₀ CH

Digoxin

+ CH HO CH-

CH.

CH₃OSO₃

.-NH-C-O-

OH

Theophyllin

CH-,-Ρ-

ην,ΠΛ s-υη-ν,Πη

-NH-8-

OCH₂CH₃

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Choisäure . _CIL

HO CH

CO-NH- (CH₂) ₅-CONH- (CH₂) j.-0-P-O-

CH₃-OSO₃

Digoxin

Digoxin

CH₂-CH₃

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Folsäure

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H₅N

OOH

;onh(ch₂)₄s-

5-P-OC₂H₅

P .

Methotrexat

Η2ΝγΝγΝ*	Cortisol	CH3	COOH
	Jn:h2n-<c?	>-C0NHCH
NH2	* 7	(CH2)2
		CONH(CH
		CH-OH I
	Hovj
CH3 Y	fr

>-OC₂H₅ CH₀

CH₂O-I

COl

S-P-OC₂H₅

CH.

03 0-0 3SA0

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Valoesäure

CO₂H
Ch-CH₂CH₂CH₂NHCO

ί^η

CH₂ 2

Sulfolithocholylglycin

CH.

Lidocain

HNCCH₂O

3NC

(CH S

^CH3 C H

³ /^C2^H5

-NHCOCH₂I" CH,

-OC₂H₅

OH-(O!

_T CH,-C-NH

-0-(O^—CH₂-OH-CNH (CH, ,)_o-S-i>-CH-

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Gentamicin

(Bindung an eine Aminogruppe. _CHCCHCHS I__CH

von Gentamycm) 2 2 22 22 j

Tobramycin

(Aminogruppe von Tobramycin-)""

CH₂

CONHCH₂Ch₂SCH₂CH₂SP-CH₃

Ic₂H₅

B12	B12	?	(CH2) g S/	i
		-CNH-		S^S-P-O
(Vitamin				CH3

^T3 0

- Ii

CH,-C-

J^ 3

-CH-CNH-(CH₂)g-S-(CH₂)2"S-P-CH

OH-(O )- CK O ) -CH_n-CH-CNH- (CH₃ )g-S- _v w«₂ ,

CH₃ 0-C₄H₉

FSO₃

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Bindende Proteine sind Antikörper oder andere spezifische bindende Proteine, wie thyroidbindendes Globulin, die zur Bindung an den zu bestimmenden Liganden und den Ligandenanalogen-Bestandteil des Konjugats aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor in der Lage sind. Bei Bindung des bindenden Proteins an das Ligandenanaloge wird der irreversible Enzyminhibitor inaktiviert. Die beim erfindugsgeraässen Verfahren ablaufenden Reaktionen lassen sich durch folgendes Schema wiedergeben:

L +

^k2 LAI + Enz > Enz-I + X

L = Ligand; ^> = bindendes Protein; LAI = Konjugat aus

irreversiblem Enzyminhibitor und Ligandenanalogem; Enz = Enzym; Enz-I = inaktiviertes Enzym; X = Reaktionsnebenprodukt; k"₉^k'p , wobei in den meisten Fällen k'_? fast gleich 0 ist, was bedeutet, dass das bindende Protein das LAI-Konjugat inaktiviert.

Die Reaktion kann kinetisch oder durch Endpunktsmessung bestimmt werden. Bei kinetischen Verfahren wird die Umsetzung - d Enz = kp /7~LAI_7/~Enz_7" verfolgt. Bei Verfahren dt

mit Endpunktbestimmung wird ein Enzymüberschuss eingesetzt und die Reaktion zu 99 Prozent beendet.

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Bevorzugte Konjugate in Verbindung mit Acetylcholinesterase (E.C.3.1.1.7) sind Verbindungen der allgemeinen Formel

R' -P-S-CH₂-CH₂-B · - (CH₂) ^NH-C-.Hapten O-R" O

in der R' und R" Alkylreste mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeuten, η einen Wert von 2 bis 8 hat und B' den Rest -S- oder entsprechende Sulfoniumsalze darstellt. Beim Hapten handelt es sich um ein eine Carbonsäure enthaltendes Hapten oder ein so modifiziertes Hapten, das es eine Carbonsäure enthält. Beide werden als Ligandenanaloge bezeichnet. Die Erfindung umfasst auch die entsprechenden Methylsulfoniumsalze.

Besonders bevorzugte Konjugate sind solche, in denen R' und R" jeweils Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen und η den Wert 2 bis 6 hat, unter Einschluss der entsprechenden Sulfoniumsalze. Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel

CH₃-P-S-CH₂-CH₂-S-(CH₂)₆-NH-C- Hapten

•in der R" eine Äthyl- oder n-Butylgruppe und die entsprechenden Sulfoniumsalze bedeutet, zum Beispiel

CH₇-P-S-CH^-CH₀-S- (CH₀ ) -NH-C- Hapten ■5 I * * ζ. η

O-R" ⁺

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IS

3003359

wobei als Gegenion Jodid, Methylsulfat oder dergleichen vorliegt. Dem Fachmann sind eine Reihe von äquivalenten und damit austauschbaren Anionen geläufig. Verbindungen, in denen η den Wert 2 bis 6 aufweist, werden ebenfalls bevorzugt.

Weitere bevorzugte Verbindungen zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens sind:

O >-0- (CH₀) -NH,-?- (H.apten)

All I

CH₃OSO₃

in der R"¹ einen Alkylrest mit 1 bis 10 und vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet und η einen Wert von 1 bis 12 hat, und

-0-P-O- (CH-) -NH-CO- (CH₀) -NH-C- (H.apten) ι zn ζ η ι

0 0

in der R"' einen Alkylrest mit 1 bis 10 und vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, η den Wert 2 bis 8 hat und L ein biologisch verträgliches Gegenion, wie Methylsulfat, Jodid oder dergleichen, darstellt.

Somit sind Gegenstand der Erfindung auch analytische Reagentien, die Konjugate aus irreversiblen Enzyminhibitoren und Ligandenanalogen enthalten.

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Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich durch folgendes Schema wiedergeben:

2L + 2LAI + 2 > 1 > L >— + LAI > + L + LAI

Somit konkurrieren der Ligand (L) und das Konjugat aus Ligandenanalogem und irreversiblem Inhibitor (LAI) um das bindende Protein ( > ). Das an LAI gebundene bindende Protein inaktiviert den Inhibitor, während freies LAI zur irreversiblen Hemmung des Enzyms zur Verfügung steht. Je grosser die Menge an in der zu untersuchenden Probe vorhandenem Liganden ist, desto geringer ist die Menge des an das bindende Protein gebundenen LAI, so dass mehr Enzym durch freies LAI gehemmt wird. Das nicht gehemmte Enzym reagiert mit einem geeigneten Substrat. Die Enzym-Substrat-Reaktion wird aufgezeichnet.

Kolorimetrische Analysen werden zweckmässigerweise mit einem bichromatischen Spektrophotometer gemäss den US-PSen 3 748 044, 3 831 618, 3 833 304, 3 900 289, 3 817 425 und 3 811 780 durchgeführt. Die zu untersuchenden Proben können vorbehandelt werden, um störende Proteine zu entfernen oder zu inaktivieren. Derartige störende Proteine können durch Fällung mit organischen Lösungsmitteln, wie Äthanol, Methanol oder dergleichen, entfernt werden. Auch eine Wärmebehandlung bei basischen pH-Werten kann eine Entfernung von störenden Proteinen bewirken. Häufig ist es erwünscht, die zu untersuchenden Proben mit starken Säuren oder Basen weiter zu behandeln, um das zu untersuchende Hapten vom Protein abzutrennen. In einigen Fällen ist es lediglich erforderlich, die störenden Proteine spezifisch zu inaktivieren. Beispielsweise wird Serum-cholinesterase spezifisch durch spezifische Inhibitoren gehemmt, die eine selektive Aktivität

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gegen Pseudocholinesterase aufweisen. Beispiele für derartige Verbindungen sind Orphenadrin, N-Methyl-orphenadrin, Phenathiazine, Bis-ß-methylcholinester von Phthalsäure, Chinidin und Artan sowie dessen quaternäre Alkylsalze.

Typischerweise wird Digoxin in mit N-Methylorphenadrin behandeltem Serum kinetisch bestimmt, wobei eine Verbindung
der Formel

-S-(CH₂)_g

als Konjugat aus irreversiblem Enzyminhibitor und Ligandenanalogem verwendet wird, das mit Digoxin in der zu untersuchenden Probe um Digoxin-Antikörper konkurriert. Nach einer kurzen Inkubationsdauer wird Acetylcholinesterase zugesetzt. Das nicht-gehemmte Enzym wird durch Umsetzung mit
Acetylthiocholin unter Freisetzung von Thiocholin gemessen. Das freigesetzte Thiocholin wird nach weiterer Umsetzung mit 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) kolorimetrisch gemessen. Die Umsetzung wird bei 412 nm aufgezeichnet. Zur Bestimmung der unbekannten Proben wird eine Eichkurve aufgestellt.

Das erfindungsgemässe Verfahren und die entsprechenden Reagentien eignen sich auch zur Bestimmung von bindenden Proteinen, wie Antikörpern. Dabei wird das Ligandenanaloge, das den bindenden Partner für das zu bestimmende bindende Protein darstellt, mit einem irreversiblen Enzyminhibitor konjugiert. Die bindenden Proteine in den zu bestimmenden Proben werden ermittelt, indem man ein Konjugat aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor zumischt, wobei

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das Ligandenanaloge des Konjugats spezifisch an das zu bestimmende Protein gebunden werden kann. Anschliessend wird ein durch den irreversiblen Inhibitor des Konjugats irreversibel hemmbares Enzym und hierauf ein Substrat für das Enzym zugesetzt. Die Umsetzung wird aufgezeichnet. Da das bindende Protein den irreversiblen Enzyminhibitor inaktiviert, ist die Enzymaktivität umso grosser, je grosser die Menge an bindendem Protein ist.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine Lösung von 7,8 g 6-Aminocapronsäure und 5,0 g Natriumhydrogencarbonat in 50 ml Wasser wird tropfenweise mit 16 g N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid in 60 ml Tetrahydrofuran versetzt. Das 'Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wird das Tetrahydrofuran unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird auf den pH-Wert 3 angesäuert und mit Methylenchlorid extrahiert. Nach Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Entfernen des Magnesiumsulfats durch Abfiltrieren wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Durch Umkristallisation aus Essigsäureäthylester/Hexan erhält man N-Benzyloxycarbonyl-6-aminocapronsäure.

Eine Lösung von 4,09 g dieser Verbindung in 40 ml Dioxan wird mit 2,3 g N-Hydroxysuccinimid und 4,12 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Weitere 10 ml Dioxan werden zur Unterstützung der Reagensübertragung verwendet. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wird filtriert und das Filtrat mit 2,06 g 5-Aminopentanol in 5 ml Wasser versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde gerührt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird

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mit Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte werden mit Wasser und konzentrierter Natriumchloridlösung gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Magnesiumsulfats durch Filtrieren wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird 2 mal aus Essigsaureäthylester kristallisiert. Man erhält N-(5-Hydroxypentyl)-6-benzyloxycarbonylaminohexanamid vom F. 92,5 bis 94°C.

4,0 g dieses Produkts werden in Gegenwart von Palladium-auf-Kohlenstoff in Äthanol unter einem geringen Wasserstoffdruck reduziert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält N-(5-Hydroxypentyl)-6-aminohexanamid.

Eine Lösung des ^-Acetyloxy-S-chloroformyloxy-^-hydroxycard-20(22)-enolid-Derivats von Digoxigenin (vgl. US-PS 3 981 982) in 40 ml Dioxan wird mit 575 mg N-Hydroxysuccinimid versetzt. Das Gemisch wird in einem kalten Wasserbad gekühlt und mit 0,695 ml Triäthylamin versetzt. Nach 3-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Gemisch abfiltriert. Das Filtrat wird mit einer Lösung von 973 mg N-(5-Hydroxypentyl)-6-aminohexanamid und 378 mg Natriumhydrogencarbonat in 20 ml Wasser und 10 ml Äthanol versetzt. Nach 1 Stunde wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wird mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wird abfiltriert. Der nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird an 200 g Kieselgel chromatographiert.

Durch Elution mit 5 bis 15-prozentigem Methanol in Methylenehlorid erhält man 12-Acetyloxy-3-_/~N-( 12-hydroxy-6-oxo-7-

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azadodecyl)-carbamoyloxy_/-i4-hydroxycard-20(22)-enolid der Formel

η η

HO.- (CH₂) ₅-N-(jj- (CH₂) ₅-N-C-0
O O

2,70 g der vorstehenden Verbindung werden in 50 ml Methanol gelöst. Hierauf werden 50 ml Wasser und sodann 10 ml Triäthylamin zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Der nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird an einer mit 150 g Kieselgel gepackten Säule chromatographiert und mit 2 Liter 10-prozentigem Methanol in Methylenchlorid eluiert. Man erhält 3-_/N-(l2-Hydroxy-6-oxo-7-azadodecyl ) -carbamoyloxy_7-i4-hydroxycard-20(22)-enolid.

Eine Lösung von 170 mg Triäthylammoniumäthyl-7-chinolylphosphat in 10 ml Wasser wird über 15 ml Sulfonsäureharz in der Pyridiniumform gegeben. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt. Das wasserfreie Pyridin wird vom erhaltenen Rückstand abgedampft. Der Rückstand wird mit 253 mg 3-]_ N-(12-Hydroxy-6-oxo-7-azadodecyl)-carbamoyloxy_/-i4-hydroxycard-20(22)-enolid versetzt. Vom Rückstand wird wasserfreies Pyridin 3 mal abgedampft. Der Rückstand wird in 1,0 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und mit 145 mg kristallisiertem Tris-isopropylbenzolsulfonylchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird Eis zugegeben. Nach 30 Minuten wird das Gemisch

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S/j

rait Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridlösung wird mit Wasser, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird abgedampft. Der Rückstand wird mehrmals mit Toluol versetzt, wobei das Toluol zur Entfernung des Pyridins jeweils abgedampft wird. Schliesslich wird der Rückstand an Kieselgel unter Verwendung von 5 bis 10-prozentigem Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel chromatographiert. Man erhält eine Verbindung der Formel

HO

-O-P-O- (CH₂) 5-N-C- (CH₂) g-N-C-

CH

OH

OCH₂CH₃

100 mg dieser Verbindung und 23 /Jl Dimethylsulfat werden in 0,50 ml Aceton gelöst. Nach 4 Stunden werden weitere 60 ul Dimethylsulfat in 2 ml Aceton zugesetzt. Sodann wird das Gemisch über Nacht stehengelassen. Die Acetonlösung wird zu Diäthyläther gegeben. Man erhält die Verbindung der Formel I in Form eines weissen Niederschlags.

O HO

CH

^-O-p-O- (CHO .-N-C-

2^j5

CH₃OSO₃

03QQ33/0~727

Einfluss von Antikörper auf die Hemmwirkung von Verbindung I

Eine Vorratslösung von Verbindung I (4,6 χ 10 m in Methanol) wird mit 0,1m Phosphatpuffer van pH 7,0 mit einen Gehalt an 0,1 Prozent Gelatine auf das 200-fache verdünnt. Digoxin-Antikörper wird gemäss den Angaben von Tabelle I in Phosphat-Gelatine-Puffer verdünnt. 50 )x\ Phosphat-Gelatine-Puffer vom pH-Wert 7,0 mit der angegebenen Antikörperkonzentration werden in Probengefässe eines bichromatischen Spektrophotometers (Modell ABA-100, Abbott Laboratories) gegeben. Diese 50 )x\ werden jeweils mit 1 )x\ der Arbeitslösung von Verbindung I versetzt, so dass sich eine endgültige Konzentration von

4.5 x 10 m ergibt. Antikörper und Verbindung I (Inhibitor) werden 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann werden die Proben jeweils mit 1 μ\ einer Enzymlösung

(9,5 χ 10 m Acetylcholinesterase aus E.electricus in Phosphat-Gelatine-Puffer vom pH-Wert 7,0) versetzt. Die endgültige Enzymkonzentration beträgt 1,9 x 10" m. Die Proben werden im Verhältnis 1/26 mit Testpuffer verdünnt. Bei diesem Testpuffer handelt es sich um Phosphat-Gelatine-Puffer vom

-4
pH-Wert 7,0 mit 5 x 10 m Acetylthiocholin als Substrat und

1.6 χ 10 m 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (DTNB). Die mit der Zeit eintretende Absorptionsänderung wird nach 5 Minuten im bichromatischen Analysengerät, das mit einem 415/550 nm-Filter ausgerüstet ist, bei 30⁰C gemessen. Folgende Ergebnisse werden erhalten:

Tabelle II

ΔΑά/5 min. Enzym. .Antikörper Verbindung I_ nach einer Inkubationszeit von

10' 21» 43·

;ym.
fm) (mj (m)

1,9 χ 10"¹⁰ 0 0 0,220 0,221 0,222

1,9 χ 10"¹⁰ 9 χ 10~⁷ 4,5 x 10"⁷ 0,161 0,137 0,107

1,9 χ 10"¹⁰ 9 χ 10"⁸ 4,5 x 10"⁷ 0,089 0,027 0,005

1,9 χ 10"¹⁰ 0 4,5 x 10"⁷ 0,045 0,015 0,003

- 23 -030033/0727

Der Versuch wird wiederholt, mit der Abänderung, dass Digoxin in einer Konzentration von 2,5 x 10" m zu den Probengefässen gegeben wird. Auf diese Weise wird der spezifische Einfluss demonstriert. 50 ^uI Phosphat-Gelatine-Puffer werden in ein Probengefäss gegeben. Entweder enthält die Pufferlösung

-5

2,5 χ 10 m Digoxin oder stellt eine Kontrollprobe dar. Sodann wird das Probengefäss mit Digoxin-Antikörper in einer

_7
Endkonzentration von 9 x 10 m und mit der Verbindung I in einer Konzentration von 4,5 χ 10 m versetzt. Die Lösungen werden 15 Minuten inkubiert. Anschliessend wird wie vorstehend erläutert Enzym zugesetzt und die Bestimmung vorgenommen, Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

Δ Ad/5 min nach einer Enzym-Inhibitor-Inkubationszeit von Inkubationsgemisch 0,3' H! 19_*

Enzym allein (Kontrolle) Enzym + Verbindung I

Enzym + Verbindung I + Antikörper

Enzym + Verbindung I + Antikörper + Digoxin

Gemäss den vorstehenden Verfahrensweisen werden unter der Abänderung, dass die endgültige Antikörperkonzentration 4,5 χ 10 m beträgt, verschiedene Phosphat-Gelatine-Pufferlösungen mit der angegebenen Digoxinkonzentration hergestellt. Diese Lösungen werden jeweils durch Zusatz von Antikörper und Verbindung I, wie vorstehend erläutert, analysiert, wobei· die Inkubationszeit 2,5 Minutenbeträgt und die restliche Enzymaktivität nach 21 Minuten bestimmt wird.

o,	174	0	,169	0	,167
o,	162	0	,037	0	,013
o,	160	0	,129	0	,115
o,	160	0	,068	0	,038

- 24 -

030033/0727

mikromolar Digoxin Enzymaktivität

0,062	65 %
0,125	65 %
0,25	62 %
0,5	57 %
1,0	36 %

Gemäss dem vorstehenden Verfahren werden menschliche Humanseren mit den in der nachstehenden Tabelle angegebenen Digoxinkonzentrationen bestimmt.

N,N,N-Trimethyl-2-(o-methyl-/χ -phenylbenzyloxy)-äthylammoniummethylsulfat (N-Methylorphenadrin) wird durch Umsetzung von N,N-Dimethyl-2-(o-methyl- oc-phenylbenzyloxy)-äthylamin (Orphenadrin) mit Dimethylsulfat hergestellt. In einer Konzentration von 1 millimolar hemmt diese Verbindung menschliche Serumcholinesterase zu 99 Prozent, während die Hemmung von Cholinesterase aus E.electricus nur 25 Prozent beträgt.

N-fithylmaleinimid wird zum Blockieren von im menschlichen Serum enthaltenen Sulfhydrylgruppen verwendet.

Somit wird 1 μΐ konzentrierte Digoxin-Antikörper-Lösung in Phosphat-Gelatine-Puffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 50 millimolar N-Methylorphenadrin zu jeweils 50 ^l Serumstandard gegeben. Anschliessend wird N-Äthylmaleinimid jedem Serumstandard zugemischt, so dass sich eine Arbeitskonzentration von 1,6 millimolar ergibt. Diese Serumproben werden ferner mit 1 ^l einer Lösung der Verbindung I in 0,1 m Phosphat-Gelatine-Puffer vom pH-Wert 7,0 versetzt. Die endgültige Antikörperkonzentration beträgt 8,0 χ 10 m und die endgültige Konzentration an Verbindung I 1,5 x 10 nr. Diese Lösungen werden 12 Minuten inkubiert. Sodann wird, wie beim

- 25 030033/0727

vorstehenden Versuch, Acetylcholinesterase zugesetzt. Nach 26 Minuten wird die Messung im bichromatischen Spektrophotometer begonnen. Eine Probe aus jedem Gefäss wird 26-fach mit Testpuffer mit einem Gehalt an 1,6 χ 10 m DTNB, 5 x 10 m Acetyl-ß-methylthiocholin-jodid und 1 millimolar N-Methylorphenadrin in 0,1 m Phosphat-Gelatine-Puffer vom pH-Wert 7,0 verdünnt. Die endgültige Enzymkonzentration beträgt etwa 2 χ 10" m und die Küvettentemperatur 30⁰C. Nach 5 Minuten ergeben sich folgende Absorptionsänderungen:

Digoxinkonzentration im Serum Λ Ad/5 min (mikromolar)

0,1 0,096

0,13 · 0,089

0,17 0,083

0,26 0,077

0,34 0,073

0,51 0,063

0,64 0,060

0,85 0,047

1,30 0,035

Beispiel 2

4,08 g Cholsäure werden in 10 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 3,40 g Imidazol und sodann mit 3,60 g tert.-Butyldimethylsilylchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird das Gemisch in Wasser gegossen und filtriert. Der Niederschlag wird mit Wasser gewaschen und sodann in 30 ml Tetrahydrofuran und 3 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 2 ml Essigsäure versetzt. Nach 6 1/2 Stunden

- 26 -

030033/0727

ir-''

wird das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wird an 200 g Kieselgel unter Verwendung von 5-prozentigem Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel chromatographiert. Man erhält 3 «. -(tert .-Butyldimethylsilyloxy)-7oi, 1 2 <x-dihydroxy-5ß-cholan-24-säure vom F. 145,5 bis 148° der Formel

H₃ CH₃

CH₃-

f-f¹-⁰"'

CH, CH,

i₃ w«₃

2,092 g der vorstehenden Verbindung, 1,728 g N-(5-Hydroxypentyl)-6-aminohexanamid und 1,87 g N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin werden 24 Stunden in 175 ml Essigsäureäthylester unter Rückfluss erwärmt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei sich eine kristalline Verbindung abscheidet. Dieses Material wird aus Essigsäure äthylester umkristallisiert. Man erhält 260 mg 3oc-(tert.-Butyl dimethyl si IyI oxy) -7 oc_f 12 o<-dihydroxy-N-^ 12-hydroxy-6-oxo-7-azadodecyl_7-cholan-24-amid vom F. 145,5 bis 148⁰C der Formel

CONH-(CH₂)₅-CO-NH-(CH₂)₅~OH

- 27 -

030033/0727

3616

Eine Lösung von 424 mg Triäthylammonium-äthyl-7-chinolylphosphat in 10 ml Wasser wird über 15 ml Sulfonsäureharz
in der Pyridiniumform gegeben. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingedampft und das wasserfreie Pyridin 2 mal
vom Rückstand abgedampft. Der Rückstand wird mit 721 mg des vorstehend erhaltenen Alkohols versetzt. Wasserfreies Pyridin wird vom Rückstand 3 mal abgedampft. Sodann wird der
Rückstand in 1,0 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und mit 364 mg kristallisiertem Tris-isopropylbenzylsulfonylchlorid versetzt.

Das Reaktionsgemisch wird 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird Eis zugegeben. Nach einer 1/2 Stunde wird das Gemisch mit Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridlösung wird mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Abdampfen
des Lösungsmittels wird zur Entfernung von Pyridin mehrmals Toluol zugesetzt und abgedampft. Der Rückstand wird auf eine mit 50 g Kieselgel gepackte Säule aufgesetzt. Die Säule
wird mit 300 ml 5-prozentigem Methanol in Methylenchlorid
und 1000 ml 10-prozentigem Methanol in Methylenchlorid behandelt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man die
Verbindung der Formel:

CH.

HO

CO-NH-(CH₂J₅-CO

CH₃ CH₃

OH

0-CH₂-CH₃

- 28 -

030033/0727

3616

40 mg dieser Verbindung werden in 2 ml Aceton und 0,10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 40 ^iI Dimethylsulfat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Acetongemisch wird mit Diäthyläther versetzt und zentrifugiert. Der Niederschlag wird mit Diäthyläther behandelt. Man erhält die Verbindung II der Formel

HO CH

CH.

CH₃-

(ID

■Ή η C-ii«

CH₃OSO₃

Die Verbindung II wird zur Demonstration des Antikörpereinflusses auf Hemmung und Umkehrung durch Cholylglycin (GIygocholsäure) verwendet. Antikörper gegen Konjugate aus Cholylglycin und Rinderserumalbumin (BSA) werden in Kaninchen gebildet. Das Kaninchenserura wird nach üblichen Verfahren gewonnen. Die anti-Cholylglycin-IgG-Fraktion wird durch fraktionierende Fällung mit Ammoniumsulfat und Ionenaustauschchromatographie gewonnen. Die Antikörperkonzentration wird nicht ermittelt, wird aber in einer vereinigten Fraktion der Ionenaustauschsäule so eingestellt, dass sich die beste Modulation der Hemmung durch die Verbindung II ergibt. In einem Kontrollversuch zeigt IgG gegen Digoxin, das auf die gleiche Weise wie anti-Cholylglycin-IgG gereinigt ist, keinen Einfluss auf die Hemmaktivität, was eine spezifische Bindung

- 29 -

030033/0727

3616 -9 η

der Verbindung II anzeigt. Der Versuch wird mit einem bichromatischen Analysengerät (ABA-100, Abbott Laboratories) durchgeführt. Dabei wird folgende Einstellung verwendet:

Filter:	415/550 nm	2 min. versetzt
Temp. :	30°C	(Skala): 1
Rate mode:	*%»	(Karusseldrehung) : 2
Null :	0,000	Analysenzeit: 5 min.
Eichung:	0,500	1/26-Verdünnungsplatte
FRR:	An

Die Substratlösung und der Puffer werden in die erste Spritze der Verdünnungsplatte gegeben. Als Puffer wird 0,1 m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Gelatine verwendet. Als Substrat dient eine 5,0 χ 10 m Lösung von Acetylthiocholin mit 1,6 χ 10" m DTNB als Indikator. In der nachstehenden Tabelle sind die im Probengefäss befindlichen Reaktanten angegeben. In sämtlichen Fällen beträgt die Konzentration an Acetylcholinesterase (T.californica) etwa 2 χ 10" m und an Verbindung II (Inhibitor) 10 χ 10 m. Bei Zusatz von Cholylglycin beträgt dessen Konzentration im Probengefäss 10 m. Das Probengefäss enthält 0,1 m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Gelatine sowie die in der nachstehenden Tabelle angegebenen zusätzlichen Bestandteile.

Änderung von Ad in 5 min als Funktion der Zeit und der Reaktionsteilnehmer

Enzym-Inhibitor-Reaktionsteilnehmer Inkubationszeit Ad 5 min

T=13 T=25 T=36

E allein 0,246 0,237 0,234 0,230

E + I 0,226 0,072 0,025 0,013

E + I + Ab 0,235 0,192 0,164 0,147

(min)	T = O
o,	246
o,	226
o,	235
- 30
0300	33/0727

3616

Tabelle (Forts.)

Reaktions teilnehmer	I + Ab + CG	Enzym-Inhibitor- Inkubationszeit	: Acetylcholinesterase	0	T=13	0	AD 5	min	T=36
	Ab	(min) T= 0	: Verbindung II	0	,078	0	T = 25		,017
E +	A.b + CG	0,224	: Cholylglycin	0	,225	0	,032	0	,215
E +	CG	0,224		0	,223	0	,218	0	,207
E +	I + CG	0,225		0	,228	0	,216	0	,211
E +	Puffer allein	0,236		0	,062	0	,220	0	,013
E +	E :	0,224			,003		,022	0	,002
	I :	0,001				,001	0
CG :
Ab :
B e	: Antikörper gegen Cholylglycin konjugiert
i s ρ i e 1 3	mit BSA

100 ml Tetrahydrofuran werden nacheinander mit 17,0 g N-(tert.-Butoxycarbonyl)-4-aminobuttersäure (hergestellt gemäss Moreder u. Mitarb., Z. Physiol. Chem., Bd. 357 (1976), S. 1651), 10,6 g N-Hydroxysuccinimid und 18,9 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Das Filtrat wird mit 11,1 g 5-Amino-3-thia-1-pentanol in 150 ml Tetrahydrofuran versetzt. Nach 2 1/2-stündigem Rühren wird das Tetrahydrofuran abgedampft. Der Rückstand wird zwischen Methylenchlorid und Kochsalzlösung verteilt. Die Methylenchloridfraktion wird mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und getrocknet. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhält man 10-(tert.-Butoxycarbamoyl-7-oxo-6-aza-3)-thiadecanol der Formel

?^H3 f %

CH₃-C-O-C-NH-(CH₂)2-C-Nh-

C-CH

- 31 -

030033/0727

in Form eines Öls.

Unter inerter Atmosphäre werden 2,28 g dieser Verbindung, 1,45 g Diisopropyläthylamin und 1,8 g Methansulfonsäureanhydrid nacheinander bei O⁰C zu 20 ml Methylenchlorid gegeben. Nach 30 Minuten werden 2,0 g O-fithyl-methylphosphonothioat und 1,92 g Diisopropyläthylamin zugesetzt. Sodann lässt man die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen und erwärmt dann 1 1/2 Stunden auf 45°C. Hierauf wird die Lösung zwischen Kochsalzlösung und Methylenchlorid verteilt und nacheinander mit 5-prozentiger Salzsäure und gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat und Abfiltrieren des Magnesiumsulfats wird das Lösungsmittel abgedampft. Man erhält O-Äthyl- s-_/_~~10-( tert. -butoxycarbamoyl)-6-aza-7-oxo-3-thiadecyl_/-methylphosphonothioat der Formel

I Il

CH₃-C-O-C-NH-(CH₂)3-C-NH-CH₂-CH₂-S-CH₂-Ch₂-S-P-CH₃

in Form eines gelben Öls.

1,0 g dieser Verbindung werden bei Raumtemperatur in 4 ml 50-prozentiger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid gelöst. Das Gemisch wird 10 Minuten gerührt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird der Rückstand in einem Überschuss an Benzol gelöst. Das Benzol wird rasch abdestilliert, so dass Spuren von Trifluoressigsäure entfernt werden. Das verbleibende Öl wird in 2 ml Dimethylformamid gelöst. Nacheinander werden 1,08 g aktiver Succinimidester von Cholsäure und 37 mg Hydroxybenzotriazol zugesetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf 7,5 eingestellt.

- 32 030033/0727

Nach 6-stündigem Rühren wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird zwischen Kochsalzlösung und Methylenchlorid verteilt. Die Methylenchloridfraktion wird mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Nach Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Abfiltrieren des Magnesiumsulfats wird das Lösungsmittel

abgedampft . Man erhält N-_/_~~5-Aza-10-äthoxymethylphosphinyl-

thio-4-oxo-8-thiadecyl_7-3a, 7oc , 12tX-trihydroxy-Sß-cholan-24-amid der Formel III

0-CH₂-CH_{3 (III)}

A. Die Geschwindigkeitskonstante für die Hemmung von Cholinesterase durch die Verbindung III wird folgendermassen ermittelt:

Reagentien

Puffer: Die Arbeitslösungen sämtlicher Reagentien werden in 0,1 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Gelatine (Phosphat-Gelatine-Puffer) hergestellt. Lösung des Konjugats aus Ligandenanalogem und irreversiblem Inhibitor: Eine 6,7 x 10" m Arbeitslösung der Verbindung III in Phosphat-Gelatine-Puffer wird durch entsprechende Verdünnung aus einer 0,067 m Vorratslösung der Verbindung III in Methanol hergestellt.

Acetylcholinesterase: Eine Arbeitslösung mit 100 Einheiten Acetylcholinesterase pro 1ml in Phosphat-Gelatine-Puffer wird hergestellt. 1 Einheit der Enzymaktivität ist als die

- 33 0300 3 3/0727

3616

Enzymmenge definiert, die pro 1 Minute bei 25⁰C die Hydrolyse von 1 Mikromol Acetylcholin katalysiert. Unter der Annahme einer Wechselzahl (turnover number) von 5 x 10 min"

_7 beträgt die Enzymkonzentration in dieser Lösung 2 χ 10 m.

Substrat: In jedem einzelnen Fall wird die Enzymaktivität in Phosphat-Gelatine-Puffer mit einem Gehalt an 4,88 χ 10" m

-4
Acetylthiocholin und 1,56 χ 10 m DTNB gemessen.

Die Geschwindigkeitskonstante der pseudo-ersten Ordnung für die Hemmungsreaktion wird gemessen, indem man 10 ^l der Arbeitslösung des Konjugats mit 500 ^uI Phosphat-Gelatine-Puffer vermischt. Zum Zeitpunkt 0 werden 5^il(0,5 Einheiten) der Acetylcholinesteraselösung zugesetzt. Nach gründlichem Vermischen wird bei Raumtemperatur inkubiert. In regelmässigen Abständen wird die verbleibende Enzymaktivität gemessen, indem man 10^1-Aliquotmengen entnimmt, mit 1,o ml Substratlösung vermischt und die Geschwindigkeit der Absorptionszunahme bei 410 nm (ΔΑ/At) in einem Spektrophotometer (Varian Super Scan 3) misst, Die geschätzte Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster Ordnung (K./ . s) wird gemäss Gleichung 1 berechnet:

(AA/At)t,

= - In ■- -- ■ *l(est.)

wobei t„ und t₁ die Zeiten nach der Enzymzugabe, bei denen die restliche Aktivität (A Α/Δ t) gemessen wird, bedeuten. Die geschätzte Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung für die Hemmreaktion wird sodann berechnet, indem man K₁, , _Λ"

I (est.;

durch die Konzentration des Konjugats bei der Reaktion (1,3 χ 10 m) dividiert. Die nach dieser Berechnungsmethode erhaltenen Werte sind nachstehend zusammengestellt.

- 34 030033/0727

to

	3003959
Zeit (min)	Aktivität (Absorptionseinheiten/min)
0,5 2,5	9,45 x 10~4 6,87 x 10~4
5,0	4,87 x 10~4

Durch Auftragung von -In Aktivität gegen t erhält man eine

_ -ι
Steigung von 0,147 min" als Geschwindigkeitskonstante pseudoerster Ordnung mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,998. Die berechnete anscheinende (apparent) Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung beträgt sodann 1,1 χ 10 Liter Mol" min" . Die Messung kann auch mit einem bichromatischen Spektrophotometer vorgenommen werden.

B. Nachstehend wird die Verwendung von Acetylcholinesterase und von Verbindung III als Reagentien zur Bestimmung der Konzentration von Cholylglycin erläutert.

Folgende Reagentien werden verwendet: Cholylglycin-Eichlösungen (Puffer): Lösungen von Cholylglycin in 0,1 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Gelatine werden hergestellt. Die Cholylglycin-Konzentrationen betragen 10" , 10~ , 10 , 10" und 10 m. Die Eichlösungen werden aus einer Vorratslösung von 0,01 m Natriumglycocholat in Wasser hergestellt. Anticholylglycin-Antikörper: Die IgG-Fraktion von Kaninchen-Antikörper wird erhalten, indem man gesättigte Ammoniumsulfatlösung und das entsprechende Serum in gleichen Teilen vermischt. Der entstandene Niederschlag wird abzentrifugiert und gegen 0,02 m Kaliumphosphat vom pH-Wert 8,0 dialysiert. Das Dialysat wird filtriert und sodann an einer mit DEAE-Cellulose ge- · packten Säule, die mit 0,02 m Kaliumphosphat vom pH-Wert 8,0 äquilibriert worden ist, chromatographiert. Die Antikörper-Arbeitslösung wird erhalten, indem man die entsprechenden,

- 35 030033/0727

durch das Elutionsprofil bestimmten Fraktionen, vereinigt. Eine Scatchard-Analyse dieser Lösung ergibt zwei Klassen von

Y f\ 1

Antikörpern mit Bindungskonstanten von 1 χ 10 und 1 χ 10 m~ mit entsprechenden Bindekapazitäten von 2,2 χ 10~ und 3,2 χ 10~⁵ m.

Die Lösungen von Verbindung III, Acetylcholinesterase und Substrat werden auf ähnliche Weise wie in Abschnitt A dieses Beispiels hergestellt.

Zur Messung der Konzentration an Cholylglycin in Phosphat-Gelatine-Puffer werden 96^1 Phosphat-Gelatine-Puffer, 20 der entsprechenden Cholylglycinlösung, t ill einer 3,35 x 10" m Lösung von Verbindung III und 16 ^uI der Anticholylglycin-Antikörperlösung im Probengefäss des bichromatischen, kinetischen Analysengeräts vereinigt. Die Reagentien werden in der angegebenen Reihenfolge zugesetzt. Um eine Verdampfung zu verhindern werden sodann 10^1 Siliconöl zugegeben. Nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wird das bichromatische, kinetische Analysengerät angeschaltet, so dass sich das Karussel mit den Probengefässen mit der normalen 5-minütigen Umdrehung bewegt. Wenn die einzelnen Probengefässe in der Probenstellung ankommen, werden jeweils 4 ^uI (0,09 Einheiten) der Acetylcholinesteraselösung zugesetzt. Die endgültigen Konzentrationen

8 4

betragen 9,6 χ 10 m für Verbindung III, 1,67 x 10 bis 1,67 x 10 m für Cholylglycin und 5,7 χ 10 m für Acetylcholinesterase. Nach einer Inkubationszeit von 12 Minuten wird die restliche Enzymaktivität gemessen, indem man eine 10 Aliquotmenge in die Küvette (37°C) des bichromatischen, kinetischen Analysengeräts gibt und mit 250 ^l Substratlösung vermischt. Die 26-fache Verdünnung des Materials des Probengefässes dient dazu, die Hemmreaktion zu stoppen und das Enzym auf einen Konzentrationsbereich, in dem die Aktivitätsmessung leicht durchgeführt werden kann, zu verdünnen. Die Enzym-

- 36 030033/0727

Hb

aktivität wird als die innerhalb von 5 Minuten entstehende Absorptionsdifferenz (Ad) angegeben. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

Cholylglycin (m)	X	ίο"8	Ad*/5	,499	min
1,67	X	ΙΟ"7	0	,453	+, 0,013
1,67	X	ίο"6	0	,300	_+ 0,025
1,67	X	ΙΟ"5	0	,143	_+ 0,011
1,67	X	ίο"4	0	,103	+ 0,002
1,67	0	+ 0,001

* Die Werte sind Mittelwerte _+ 1 Standardabweichung. Die einzelnen Werte geben jeweils die Ergebnisse eines Dreifachversuchs an.

Die Cholylglycinkonzentrationen im Serum werden auf ähnliche Weise wie in den vorstehenden Beispielen bestimmt. Für diesen Versuch werden Cholylglycin-Eichserumlösungen hergestellt, indem man eine 0,01 m wässrige Lösung von Natriumglycocholat mit normalem mensbhlichem Serum verdünnt. Dieses menschliche Serum weist eine endogene Cholylglycinkonzentration von 7,5 x

10 m auf, was sich durch radioimmunologische Bestimmung ergibt (CGRIA-Testpackung, Abbott Laboratories). Die Gesamtkonzentrationen an Cholylglycin in den Serumlösungen sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt. Sämtliche andere Lösungen entsprechen den vorstehenden Abschnitten A und B, mit der Ausnahme, dass die Substratlösung 1,0 mMol N-Methylorphenadrin pro 1 Liter zur Hemmung von Serum-Pseudocholinesterase enthält.

In die Probengefässe des bichromatischen Analysengeräts werden nacheinander 39 ,ul Phosphat-Gelatine-Puffer, 6^nI der entsprechenden Cholylglycin-Eichlösung in normalem menschlichen Serum, 2^1 einer 3,35 x 10" m Lösung von Verbindung III, 8^1 der Anticholylglycin-Antikörperlösung und 1

- 37 030033/0727

Siliconöl gegeben. Nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden 5^1 (0,05 Einheiten) Acetylcholinesterase wie in Abschnitt B dieses Beispiels zugesetzt. Die endgültigen
Konzentrationen betragen 1,1 χ 10 m für Verbindung III,
8,5 x 10 bis 1,0 χ 10~³ m für Cholylglycin und 1,7 x 10"⁹ m für Acetylcholinesterase. Nach einer Inkubationszeit von 12
Minuten bei Raumtemperatur wird die verbleibende Enzymaktivität in den einzelnen Probengefässen gemäss Abschnitt B dieses Beispiels gemessen. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt.

Ad/ 5 min

Cholylglycin	(m)	ΙΟ"7	Cholylglycin	5	(m)	ίο"8
im Serum	,5 x	ΙΟ"6	im Probengefäss	8	X	ΙΟ"7
	,8 χ	ΙΟ"5		1	X	ίο-6
8	,1 χ	ίο"4	8,	0	X	10"5
1	,0 χ	ΙΟ"3	1,	0	X	10-"
1	,0 χ	1,	X
1		1,
1	1,

0,733 + 0,032 0,733 + 0,016 0,500 + 0,023 0,204 _+ 0,016 0,161 + 0,005

C. Die modulierende Wirkung von Anticholylglycin-Antikörper
auf die Hemmwirkung der Verbindung III gegenüber Acetylcholinesterase wird folgendermassen bestimmt. Die Arbeitslösungen von Phosphat-Gelatine-Puffer, Anticholylglycin-Antikörper, Verbindung III, Acetylcholinesterase und Substrat werden gemäss Abschnitt A dieses Beispiels hergestellt. In die Probengefässe
des bichromatischen, kinetischen Analysengeräts werden in der angegebenen Reihenfolge verschiedene Mengen an Phosphat-Gelatine-Puffer, verschiedene Mengen an Antikörperlösung (vgl.
nachstehende Tabelle), 2 ^uI der Lösung von Verbindung III und 10 ul Siliconöl zur Verhinderung von Verdampfung gegeben.

Nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden 6

- 38 030033/0727

(0,06 Einheiten) Acetylcholinesterase geraäss Abschnitt B dieses Beispiels zugegeben. Das Gesaratvolumen der Reagentien in den einzelnen Probengefässen beträgt 60 ^uI. Die endgültigen Konzentrationen betragen 1,1 χ 10 m für Verbindung III und

_q
2 χ 10 m für Acetylcholinesterase. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt.

Anticholylglycin Antikörper Oil)	0	Ad/5 min	prozentualer Anteil an nicht gehemmtem Enzym
0	0	,095 _+ 0,004	8,5
2	0	,480 + 0,027	43
4	0	,706 _+ 0,084	63
6	0	,856 + 0,048	77
8	0	,919 + 0,018	82
10	0	,890 + 0,040	80
12		,899 _+ 0,020	80
Beispiel 4

Eine Lösung von 5 g 6-Aminohexanol in 50 ml Methylenchlorid wird bei 0⁰C tropfenweise mit 9,3 g Di-tert.-butyldicarbonat versetzt. Man lässt die Lösung auf Raumtemperatur erwärmen und rührt sie 17 Stunden lang. Anschliessend wird die Lösung mit wässriger Citronensäurelösung und wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und sodann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und Eindampfen des Lösungsmittels erhaltene gelbe Öl wird an Kieselgel unter Verwendung von 3 Prozent Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel gereinigt. Man erhält N-tert.-Butoxycarbonyl-6-aminohexanol der Formel

- 39 030033/0727

CH₃ O CH₃-O-O-C-NH(CH₂)g-OH

*3

5,9 g dieser Verbindung und 3,06 g Triäthylamin in 50 ml Methylenchlorid werden mit 3,47 g Methansulfonylchlorid versetzt. Die Lösung wird 30 Minuten gerührt und mit wässriger Citronensäurelösung und wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und sodann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und Eindampfen des Lösungsmittels erhält man N-tert.-Butoxycarbonyl-6-aminohexyl-methansulfonat. 6,2 g dieses Produkts werden ohne weitere Reinigung in 10 ml Dimethylformamid zu einer Lösung von 2,5 g ß-Mercaptoäthanol in 60 ml wasserfreiem Dimethylformamid mit einem Gehalt an 3,5 g Kalium-tert.-butylat gegeben. Das Gemisch wird 17 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wird das Reaktionsgemisch in Wasser gegossen und mit Methylenchlorid extrahiert. Der organische Extrakt wird 3 mal mit 100 ml Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wird abfiltriert und das Lösungsmittel abgedampft. Das verbleibende Öl wird chromatographisch an Kieselgel unter Verwendung von 5 Prozent Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel gereinigt. Man erhält N-tert.-Butoxycarbonyl-g-amino-S-thia-1-nonanol der Formel

0
tert.-Butyl-O-C-NH(CH₂)₆-S-(CH₂)₂-0H

Eine Lösung von 2 g dieses Produkts und 1,4 g Diisopropyläthylamin in 20 ml Methylenchlorid wird auf 0⁰C gekühlt und mit 1,64 g Methansulfonsäureanhydrid versetzt. Nach 30 Minuten werden 1,86 g Diisopropyläthylamin und 2,0 g O-Äthyl-methyl-

- 40 030033/0727

3616 SO

thiophosphonsäure zugesetzt, wobei das Reaktionsgemisch auf 0⁰C gehalten wird. Anschliessend lässt man die Lösung innerhalb von 30 Minuten auf Raumtemperatur kommen und erwärmt hierauf 2 1/2 Stunden unter Rückfluss. Nach dem Abkühlen des Produkts in Methylenchlorid wird mit wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene rohe Produkt wird säulenchromatographxsch unter Verwendung von 1 Prozent Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel gereinigt. Man erhält O-Äthyl-S-(N-tert.-butoxycarbonyl-9-amino-3-thianonyl)-methylthiophosphonat der Formel

υ
tert. -B-utoxy-C-NH- (CH₂) g-S- (CH₂) ₂~S-

-CH₃ OCH₂-CH₃

250 mg dieser Verbindung werden in einem 2 : 1-Gemisch von Methylenchlorid und Trifluoressigsäure 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Salz wird in 6 ml Dioxan gelöst und mit 320 mg Diisopropyläthylamin versetzt. Anschliessend werden 620 mg N-Hydroxysuccinimidester von N-Acetyl-L-thyroxin zugesetzt. Das Gemisch wird 16 Stunden gerührt. Anschliessend wird das Reaktionsgemisch in 50 ml Methylenchlorid gegossen und nacheinander mit wässriger Citronensäurelösung und wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Öl wird an Kieselgel unter Verwendung von 1 Prozent Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel chromatographiert. Nach Umkristallisation aus Acetonitril erhält man 9-(Athoxymethylphosphinylthio)-7-thianonyl-N-acetyl-thyroxinamid der Formel IV

- 41 -

030033/0727

NH-C-CH₃ -CH-C-NH-

(CH₂)_g-S- (CH₂)₂-S-t>-CH₃

)-CH--CH-

* (IV)

Eine Lösung von 50 mg dieser Verbindung in 1,5 ml Methylenchlorid wird mit 10,7 mg Methylfluorsulfonat versetzt. Innerhalb von 2 1/2 Stunden bildet sich ein Feststoff. Das Lösungs mittel wird dekantiert und der Niederschlag mit wasserfreiem Diäthyläther verrieben. Man erhält das Sulfoniumsalz der Formel V

J-

CH₂-CH-C-NH-(CH₂)g±S-(CH₂

NH-C-CH, CH,

-S- (CH₂) ^S-P-

)-CH₂-CH₃

FSO₃

in Form eines Pulvers.

Die Geschwindigkeitskonstante für die Verbindung V wird gemäss dem Verfahren von Beispiel 3 A ermittelt:

Geschwindigkeits- _T ..,.,_nv,

konstante zweiter Inhibitor-

Konstante zweiter , , kon7pntratinn

Ordnung, Liter Mol 'min ' Konzentration

Verbindung V 1,0 χ 10⁸ 5,0 χ 10~⁹ m

Thyroxin-Eichkurve unter Verwendung der Verbindung V Reagentien:

A.· Ein Reagens mit einem Gehalt an 0,1 Einheiten/ml (1,4 χ 10 m) Acetylcholinesterase (E.electricus) und 1 χ 10~° _m Thyro-

- 42 -

Q30033/0727

xin-IgG-Antikörper (auf ähnliche Weise, wie vorstehend beschrieben, gereinigt) in 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Gelatine, 1,0 millimolar N-Methylorphenadrin und 0,25 millimolar 8-Anilinonaphthalinsulfonsäure.

B. Substratreagens mit einem Gehalt an 1,0 millimolar Acetylthiocholin und 0,32 millimolar DTNB in 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0.

C. Arbeitslösung mit einem Gehalt an 2,5 x 10 m Verbindung V in 0,1 m Phosphat-Gelatine-Puffer.

Die Bestimmung wird durchgeführt, indem man 5 )il Serum mit einem Gehalt an unterschiedlichen Mengen an Thyroxin mit 250 Reagens A vermischt. Das Gemisch wird 5 Minuten bei 37 C

inkubiert. Diese Lösung wird mit 1O_xJuI Reagens C und 250 Reagens B versetzt. Die Ablesungen werden in Abständen von 5 Minuten unter Verwendung eines bichromatischen Analysengeräts mit einer 415/550 nm Filtereinrichtung vorgenommen.

Serum-Ε ichkurve

Ursprüngliche Thyroxinkonzentration im Serum Cm)

0,6 χ 10~⁸ 2,6 χ 10"⁸ 5,2 χ 10~⁸

.,0 χ 10~⁷ . 2,1 χ 10"⁷

3.1 x 10~⁷

Die Konzentrationen in unbekannten Proben werden unter Verwendung der Eichkurve ermittelt.

- 43 030033/0727

.A Ad/5 min	,980
415/550 nm	,927
0	,902
0	,793
0	,599
0	,578
0
0

Die Geschwindigkeitskonstante für die Verbindung IV wird gemäss Beispiel 3 A ermittelt.

Geschwindigkeitskonstante zweiter ₁ - Inhibitor-Ordnung, Liter Mol" min" konzentration

Verbindung IV 3,5 x 10⁶ 2,5 x 10~⁸ m

Thyroxin-Eichkurven auf Serumbasis werden mit der Verbindung IV aufgestellt, wobei das für Verbindung V beschriebene Verfahren modifiziert wird.

Reagens A enthält 1 millimolar N-Methylorphenadrin und 7 mg/ml Natriumsalicylat in Phosphat-Gelatine-Puffer vom pH-Wert 7,0. Die Cholinesterase-Aktivität beträgt 0,07 Einheiten/ml (7 x 10" m) und die Konzentration an Thyroxin-Antikörper 1,4 χ

10" m, bezogen auf bindende Stellen.

Reagens B entspricht dem vorstehend erläuterten Reagens B.

_7 Reagens C ist eine Arbeitslösung mit einem Gehalt an 5 χ 10 m Verbindung IV in 0,1 m Phosphat-Gelatine-Puffer.

Die Bestimmung wird durchgeführt, indem man 10 ^uI Serum mit 250/Ul Reagens A und 10 ^uI Reagens C vermischt. Das Gemisch

wird 10 Minuten bei 37 C inkubiert, wonach 250^uI Reagens B zugesetzt werden. Zur Bestimmung von unbekannten Proben wird folgende Eichkurve aufgestellt:

ursprüngliche Thyroxin-

konzentration im Serum (m) A Ad/5 min

0 0,646

5 χ 10~⁸ 0,588

1,5 x 10~⁷ 0,525

3,1 x 10~⁷ 0,480

5 χ 10~⁷ 0,518

_ I4I4 _

CA

1 χ 1Ο~⁶ 0,484

5 x 10"⁶ 0,426

Beispiel 5

Man verfährt wie in Beispiel 4, ersetzt aber 6-Aminohexanol durch 4-Aminobutanol, 5-Amino-3-thiapentanol bzw. N-Glycyl-6-amino-1-hexanol. Man erhält:

N-tert.-Butoxycarbonyl-4-amino-1-butanol

der Formel

tert.-Butyl-O-C-NH-(CH₂)^-OH;

N-tert.-Butoxycarbonyl-5-amino-3-thia-1-pentanol der Formel

tert.-Butyl-O-C-NH-(CH₂)₂~S-(CH₂)₂~0H und Ν_λ~*Ν' ^ert. -But oxy carbonyl) -glycyl_/ -6-amino-1 hexanol

der Formel „ ~

tert.-Butyl-0-C-NH-CH₂-CNH(CH₂)₆~0H

Diese Alkohole werden mit Methansulfonylchlorid, ß-Mercaptoäthanol, Methansulfonsäureanhydrid und 0-Äthyl-methylthiophosphonsäure, sofern geeignet, umgesetzt, wodurch man Inhibitorarme zum Kuppeln der folgenden Formeln erhält:

- 45 -

η ■> η ο 3 3

3616

SS

O O

P Il

tert.-Butyl-O-C-NH-(CH₂)₄~S-(CH₂)2"S-P-

!(-CH₂-CH₃

O I

tert.-Butyl-O-C-NH-(CH₂)₂-S-(CH₂J₂-S-P-CH₃

0-CH₂-CH₃

Q O

tert.-BUtYl-O-C-NH-CH₂-C-NH-(CH₂)_g-S-(CH₂)₂~S-P-CH₃

0-CH₂-CH₃

Bei Umsetzung mit O-Butyl-methylthiophosphonsäure erhält man z.B. eine Verbindung der Formel

9 I

tert.-BUtYl-O-C-NH-(CH₂)g-S-(CH₂)₂-^sJ?-^CH3

OCH₂-CH₂-CH₂-CH₃

Diese Reagentien-Zwischenprodukte werden deblockiert und sodann mit dem N-Hydroxysuccinimidester von N-Acetyl-L-thyroxin umgesetzt, wodurch man beispielsweise das Konjugat N-_/_~~12-(Äthoxymethylphosphinylthio)-10-thia-3-aza-2-oxododecyl_/-N acetylthyroxinamid der Formel

-L

-C-NH-CH₂-C-

NH-C-CH

CH₂-CH-C-NH-CH₂-C-NH-

S
(

(CH₂)₂ .

O=?-CH-

0-CH₂-CH₃

030033/0727

SG

und das entsprechende Sulfoniumsalz der Formel VI

NH-C-CH₃ O CH₃

I I +I

CH₂-CH-C-NH-CH₂-C-NH-(CH₂J₆-O-(CH₂)

O=P-CH₃

OCH₂-CH₃ CH₃OSO₃ (VI)

erhält. Diese Verbindungen weisen Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung von 2,5 x 10 bzw. 1,7 x 10 Liter Mol" min~

Q A Λ

bei Inhibitorkonzentrationen von 5 x 10~ m bzw. 2,5 x 10" m auf.

Beispiel 6

Eine Lösung von 32 g N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid in 100 ml Tetrahydrofuran wird mit 15 g 6-Amino-1-hexanol in 30 ml 50-prozentigem Methanol in Tetrahydrofuran umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und sodann in Wasser gegossen. Das erhaltene Gemisch wird mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wird mit Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfatsund Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Produkt wird aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält N-(Benzyloxycarbonyl)-6-amino-1-hexanol der Formel

OH

ή-CH₂-O-C-NH-(CH₂ )g-

- 47 030033/0727

vom F. 81,5 bis 83°C.

21 g dieser Verbindung werden in 100 ml wasserfreiem Pyridin bei 0 bis 5°C mit 10,53 g Methansulfonylchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird in kaltes Wasser gegossen und mit Diäthyläther extrahiert. Die Ätherlösung wird gewaschen und getrocknet. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhält man N-(Benzyloxycarbonyl)-6-aminohexyl-methansulfonat als wachsartigen Feststoff.

Eine Lösung von 7,8 g ß-Mercaptoäthanol in 50 ml Dimethylformamid wird unter Kühlung in einem Eisbad mit 5,15 g Natriummethylat versetzt. Das gesamte, vorstehend erhaltene N-(Benzyloxycarbonyl)-6-aminohexylmethansulfonat wird in 150 ml Dimethylformamid bei 0⁰C unter einer inerten Atmosphäre zu der Lösung von ß-Mercaptoäthanol gegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann in eine Natriumchloridlösung gegossen.

Nach Extraktion mit Methylenchlorid, Waschen und Trocknen der Methylenchloridphase und anschliessendem Eindampfen des Methylenchlorids erhält man einen Feststoff. Nach Umkristallisation aus Essigsäureäthylester erhält man N-(Benzyloxycarbonyl)-9-amino-3-thia-1-nonanol. Eine Lösung von 9,5 g dieser Verbindung in 160 ml Methanol mit einem Gehalt an 1,1 Äquivalenten konzentrierter Salzsäure und 9,5 g Palladium-Mohr wird in eine Parr-Hydriervorrichtung gegeben. Nach 3 Stunden wird der Katalysator abfiltriert und das Methanol entfernt. Man erhält 9-Amino-3-thia-1-nonanol-hydrochlorid vom F. 69 bis 72°C.

Eine Lösung von 3,49 mg ^-Acetyloxy-S-chlorformyloxy-iU-hydroxycard-20(22)-enolid (vgl. US-PS 3 981 982) in 60 ml Tetrahydrofuran wird bei 0 C mit 829 mg N-Hydroxysuccinimid

- 48 030033/0727

Si

und 0,988 ml Triäthylamin versetzt. Nach 3-stündigem Rühren bei O C wird das feste Triäthylamin -hydrochlorid abfiltriert. Das Filtrat wird mit einer Lösung von 1,5 g 9-Amino-3-thia-1-nonanol-hydrochlorid und 0,97 ml Triäthylamin in 6,5 ml Methanol versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und sodann unter vermindertem Druck teilweise eingedampft. Der Rückstand wird mit wässriger Natriumchloridlösung verdünnt und mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wird gewaschen und getrocknet. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels erhält man eine viskose Flüssigkeit. Nach Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung von 2 bis 4-prozentigem Methanol in Methylenchlorid erhält man 12-Acetyloxy-3-_/_~N-(9-hydroxy-7-thianonyl)-carbamoyloxy_/-i4-hydroxycard-20(22)-enolid.

Eine Lösung von 2 g dieses Produkts in 15 ml Methanol wird mit 430 mg pulverisiertem, wasserfreiem Kaliumcarbonat versetzt. Nach 35-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit einem Überschuss Chloroform verdünnt und durch Kieselgur (Celite) filtriert. Der nach dem teilweisen Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst, nacheiander mit 0,1 η Salzsäure und Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rohprodukt wird an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Methanol und Methylenchlorid als Elutionsmittel chromatographiert. Man erhält 3-_/~N-(9-Hydroxy-7-thianonyl)-carbamoyloxy_T-12,14-dihydroxycard-20(22)-enolid.

Eine Lösung von 0,725 g dieses Materials in 3 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wird bei -20 C nacheinander mit 0,265 ml Äthyldiisopropylamin und 0,265 g Methansulfonsäureanhydrid

- 49 030033/072 7'

S9

versetzt. Nach' 35-minütigem Rühren bei -1O°C wird eine Lösung von 0,784 g Dicyelohexylammonium-O-äthyl-methylthiophosphonat in 2 ml Methylenchlorid zugesetzt. Nach 5-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch zwischen Methylenchlorid und verdünnter Salzsäure verteilt. Die organische Phase wird mit Natriumchloridlösung gewaschen und getrocknet. Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rohprodukt wird an Kieselgel unter Verwendung von 2,5 bis 5-prozentigem Methanol in iNfethylenchlorid als Elutionsmittel chromatographiert. Man erhält 3-J_ N-J_ 9-(fithoxymethylphosphinylthio)-7-thianonyJL/-carbamoyloxy_7-12,i4-dihydroxycard-20(22)-enolid der Formel

TJH- (CH₀) ,-S-CH₀-CH₀-S-P-CH

0-CH₂-CH₃

Ein Gemis.ch aus 25 mg dieses Materials wird mit 0,5 ml Methyljodid und einigen Tropfen Methylenchlorid behandelt. Nach 3-tägigem Stehenlassen im Dunklen wird das Lösungsmittel abgedampft. Man erhält das Methylsulfoniumjodid der Formel VII

- 50 030033/0727

Co

CH ^(VII)

CH₃ 0-CH₂-CH₃

Geniäss Beispiel 3 wird für die Verbindung VII eine Eichkurve aufgestellt. Dazu werden für Radioimmun-Testpackungen bestimmte handelsübliche Digoxin-Eichlösungen mit 0, 1, 2, 4 ng/ml Digoxin verwendet. Die endgültige Konzentration für

-9 Digoxin-Antikörper beträgt 0,2 χ 10 m und für N-Methylorphenadrin 2,5 x 10 m bzw. 1 χ 10 m im Immunoreaktionsgemisch bzw. im Substratgemisch, um die Serum-Pseudocholinesterase zu blockieren. Folgende Ergebnisse werden erhalten:

Digoxm-	Ad/5 min
Eichlösung	0,639
0	0,614
0,5 ng/ml	0,583
1,0 ng/ml	0,527
2,0 ng/ml	0,462
4,0 ng/ml

Mit dieser Eichkurve lassen sich die Digoxin-Konzentrationen in unbekannten Serumproben ermitteln.

Beispiel 7

Eine Lösung von 31,5 g N-Hydroxysuccinimidester von N-Benzyloxycarbonylglycin (vgl. J. Am.Chem. Soc. Bd. 86 (1964), S. I839) in 100 ml Tetrahydrofuran wird tropfenweise mit 12 g 6-Amino-

- 51 -

030033/0727

G/l

1-hexanol in 50 ml 50-prozentigem Methanol in Tetrahydrofuran versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 12 Stunden bei 23°C gerührt und sodann in Wasser gegossen. Der erhaltene Niederschlag wird gründlich mit Wasser gewaschen, filtriert und getrocknet. Man erhält rohes N-(Benzyloxycarbonylglycyl)-6-amino-1-hexanol, das nach Umkristallisation aus Essigsäureäthylester einen F. von 104 bis 105°C aufweist.

Eine Lösung von 15 g dieser Verbindung in 70 ml Pyridin wird in einem Eisbad gekühlt und innerhalb von 5 Minuten mit 4,17 ml kaltem Methansulfonylchlorid versetzt. Nach 2-stündigem Rühren bei 0 bis 5 C wird das Reaktionsgemisch in eiskaltes Wasser gegossen. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert. Der Feststoff wird aus Essigsäureäthylester/Hexan umkristallisiert. Man erhält N-(Benzyloxycarbonylglycyl)-6-aminohexylmethansulfonat vom F. 82 bis 83⁰C.

Eine Lösung von 16,5 g dieser Verbindung in 75 ml Dimethylformamid wird unter inerter Atmosphäre zu einer kalten Lösung von 4,0 g ß-Mercaptoäthanol in 25 ml Dimethylformamid, das 2,65 g Natriummethylat enthält, gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann in eine Natriumchloridlösung gegossen. Nach Extraktion dieser Lösung mit Methylenchlorid und einer üblichen Aufarbeitung unter Waschen, Trocknen und Eindampfen erhält man N-(Benzyloxycarbonylglycyl)-9-amino-3-thia-1-nonanol. Nach Umkristallisation aus Essigsäureäthylester erhält man die reine Verbindung vom F. 99 bis 100⁰C.

Eine Lösung von 1,15 g dieses Alkohols in 7 ml Chloroform wird mit 0,387 g Thionylchlorid versetzt. Das Gemisch wird 1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Bestand-

- 52 030033/0727

3616 300395S

teile werden unter vermindertem Druck abgedampft. Eine Lösung von 1,04 g des restlichen Feststoffs in 3 ml Dimethylformamid wird zu einer Lösung aus Natrium-O-äthyl-methylthiophosphonat (hergestellt aus 2,69 mMol Natriumhydrid und 0,377 g O-Äthylmethylthiophosphonsäure) in 1 ml Dimethylformamid gegeben. Nach i6-stündigem Rühren bei 60°C wird das Gemisch in eine Natriumchloridlösung gegossen und mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wird gewaschen und getrocknet. Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Öl wird an Kieselgel unter Verwendung von 2 bis 4-prozentigem Methanol in Methylenchlorid chromatographiert. Man erhält O-Äthyl-S- ^"~N-(benzyloxycarbonylglycyl)-9-amino-3-thianonyl_T-methylthiophosphonat der Formel

OO L Λ -CH₂-O-C-NH-CH₂-C-NH (CH₂) ^S-CH₂

P 0

-CH₂-CH₃

Eine Lösung von 6 g N-Benzyloxycarbonylglyeyl-Q-amino-S-thia-1-nonanol in 100 ml Methanol mit einem Gehalt an 1,1 Äquivalenten konzentrierter Salzsäure und 6 g Palladium-Mohr wird 2 Stunden in einer Parr-Vorrichtung hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Eindampfen des Lösungsmittels erhält man N-Glycyl-9-amino-3-thia-1-nonanol-hydrochlorid der Formel

HCl * H₂N-CH₂-CO-NH-(CH₃)g-S-CH₂-CH₂-OH

Eine Suspension von 5 g Natrium-Diphenylhydantoin in 35 ml wasserfreiem Dimethylformamid wird unter Rühren mit 3,04 g Bromessigsäureäthylester versetzt. Das Gemisch wird 3 Stunden

- 53 -030033/0727-

3616 3003859

bei Raumtemperatur gerührt. Der nach dem Eindampfen des Dimethyl formamid s unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird zwischen Methylenchlorid und einer Natriumchloridlösung verteilt. Die organische Phase wird gewaschen und getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man das N-alkylierte Diphenylhydantoinderivat vom F. 179 bis 18O°C. 4,5 g dieser Verbindung werden in 50 ml Tetrahydrofuran mit 2,17 g Kaliumhydroxid in 15 ml Wasser versetzt. Das Gemisch wird 12 Stunden gerührt. Der nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird mit 35 ml Wasser verdünnt. Die wässrige Lösung wird mit Diäthyläther extrahiert. Sodann wird die wässrige Lösung mit 6 η Salzsäure angesäuert, um 2-(N-Diphenylhydantoinyl)-essigsäure auszufällen.

Eine Lösung von 1,25 g dieser Verbindung und 0,500 g N-Hydroxysucciniraid in 5 ml 40-prozentigem Tetrahydrofuran in Dimethylformamid wird mit 0,906 g Dicyclohexylcarbodixmid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird gekühlt. Nach 3-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wird mit 1,09 g N-Glycyl-9-amino-3-thia-1-nonanol-hydrochlorid und 0,41 g Triäthylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird sodann 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und hierauf zwischen Methylenchlorid und gesättigter Natriumchloridlösung verteilt. Die organische Phase wird gewaschen und getrocknet. Das nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Öl wird an Kieselgel chromatographiert. Man erhält 12-_/2-( Diphenylhydantoinyl )-acetamido__/-1i-oxo-IO-aza-3-thia-i-dodecanol der Formel

- 54 -·
030033/0727

3003353

NH-(CH₂)₆-S-CH₂-CH₂-OH

Diese Verbindung wird gemäss den vorstehenden Erläuterungen in diesem Beispiel mit Natrium-O-äthyl-methylthiophosphonat umgesetzt. Man erhält 0-Äthyl-S-_/_~~12-_/_~2-(N-diphenylhydantoinyl)-acetamido_7-11 -oxo-IO-aza-S-thiadodecy^T-methyl-thiophosphonat der Formel VIII

CH₂-C-NH-CH₂-C-NH- (CH₂) g-S-

OCH₂CH₃

(VIII)-

Eine Lösung von 0,512 g dieses Produkts und 0,119 g Dimethylsulfat in 1 ml Tetrahydrofuran wird 6 Stunden unter einer inerten Atmosphäre auf 65 bis 70 C erwärmt. Der nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird in Chloroform aufgenommen. Durch Zusatz von
Diäthyläther wird 0-Äthyl-S-_/~~12-/~2-(N-diphenylhydantoinyl)-acetamido_/-11-oxo-10-aza-3-thiadodecyl_7-methylthiophosphonatmethylsulfat der Formel IX

CH.

<f~~ ^CH₂-C-NH-CH₂-C-NH-(CH₂J₆-S-C

CH₃OSO₃

(IX)

-CH-

0-CH₂-CH₃

- 55 -

03 0 033/0727

3616 30Ö3S59

ausgefällt.

Die Verbindungen VIII und IX weisen Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung für die Hemmung von Acetylcholinesterase (bestimmt gemäss den vorstehend erläuterten Verfahren) von 6,8 χ 10⁵ Liter Melamin"¹ bzw. 1,4 χ 10⁹ Liter Melamin"¹ auf. Diese Hemmung wird durch Dilantin-Antikörper beeinflusst. Eine typische Eichkurve in Puffer ist nachstehend für die Verbindung IX angegeben:

Dilantin-Konzentration

Mol/Liter	mAd/5 min
0	83,5
ΙΟ"7	74,1
ΙΟ"6	62,5
ΙΟ"5	47,2
Beispiel 8

Gemäss Beispiel 7 wird unter Verwendung von 4-Brombuttersäureäthylester 4-(N-Diphenylhydantoinyl)-buttersäure vom F. 147 bis 148⁰C hergestellt.

15,88 g N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxamidester von N-Carbobenzyloxy-ß-alanin (vgl. Chem. Pharm. Bull., Bd. 22 (1974), S. 1857) werden gemäss den vorstehend beschriebenen Verfahren mit 5 g 5-Amino-3-thia-1-pentanol kondensiert. Man erhält 9-Benzyloxycarbamido-7-oxo-6-aza-3-thia-1-nonanol vom F. 99 bis 101 C. Durch Hydrierung dieses Materials erhält man 9-Amino-7-oxo-6-aza-3-thia-1-nonanol-hydrochlorid der Formel

HCl·NH₂-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-S-Ch₂-CH₂-OH

- 56 030033/0727

Dieses Produkt wird gemäss den vorstehend erläuterten Verfahren mit 4-N-(N-Diphenylhydantoinyl)-buttersäure kondensiert. Das erhaltene Produkt wird mit O-Äthyl-methylthiophosphonat umgesetzt. Man erhält ein Konjugat der Formel X

(CH₂) 2-C-NH-

Das Konjugat X weist eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung für die Hemmung von Acetylcholinesterase von 2,2 χ

— 1 — 1
Liter Mol min auf. Diese Hemmung wird in Gegenwart von Dilantin-Antikörper beeinflusst. Zur Bestimmung von Dilantin in Serumproben lässt sich eine Eichkurve aufstellen.

Beispiel 9

204 mg 0-Äthyl-S-/5~-(tert.-butoxycarbonylamino)-3-thiapentyl7-methyl-thiophosphonat werden mit 20 ml 50-prozentigem Methylenchlorid in Trifluoressigsäure versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das Lösungsmittel abgedampft und die restliche Trifluoressigsäure unter Verwendung eines Toluol-Azeotrops entfernt. Der Rückstand wird in 2,0 ml Dimethylformamid gelöst und mit 83 ul Triäthylamin, 14-0 mg 6-(3-Theophyllin)-hexansäure (hergestellt gemäss W. Traube, Ber., Bd. 36 (1900), S. 3 035), 140 mg Hydroxybenztriazol, 113 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 1 ml Dimethylformamid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst, mit Natriumhydrogencarbonatlösung und

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36,6

gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Der nach dem Abfiltrieren des Magnesiumsulfats und Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wird chromatographisch an Kieselgel unter Verwendung von 10-prozentigem Methanol in Methylenchlorid als EIutionsmittel gereinigt. Man erhält N-_/_ 2-/_ 2-(Äthoxymethylthiophosphinyl)-äthylthio_7-äthyl_7-1-methyl-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahydro-7H-purin-3-hexanamid vom F. 103 bis 106 C der Formel

CH

)-CH₂-CH₃

Diese Verbindung weist eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung für die Hemmung von Acetylcholxnesterase von 5,5 χ 10

— 1 —1
Liter Mol min auf. Diese Hemmung wird durch Theophyllin-Antikörper beeinflusst. Diese Verbindung wird gemäss den vorstehend erläuterten Verfahren zur Bestimmung von Theophyllin in Blutserum verwendet.

Ende der Beschreibung

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur Bestimmung von Liganden in zu untersuchenden Proben, dadurch gekennzeichnet, dass man

   - die zu untersuchende Probe mit einem aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor bestehenden Konjugat und einem bindenden Protein, das zur Bindung an den Liganden und das Konjugat aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor in der Lage ist, vermischt, wobei die Menge des durch das bindende Protein gebundenen Konjugats aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor in Beziehung zur Menge des Liganden in der zu untersuchenden Probe steht und wobei das bindende Protein den irreversiblen Enzyminhibitor bei .der Bindung mit dem Ligandenanalogen-Bestandteil des Konjugats inaktiviert,

   - ein Enzym, das durch das nicht an das bindende Protein gebundene Konjugat aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor irreversibel gehemmt wird, zumischt und

   - Substrat für das Enzym zumischt und die Enzym-Substrat-Reaktion bestimmt.

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   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Enzym Acetylcholinesterase und als irreversiblen Enzyminhibitor einen Organophosphor-Enzyminhibitor, der mit Acetylcholinesterase unter Bildung von kovalenten Bindungen reagiert, verwendet.

   3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Serumprobe zur Inaktivierung oder Entfernung von Serum-Cholinesterase behandelt.

   4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Enzymsubstrat Acetylthiocholin verwendet und die Enzym-Substrat-Reaktion spektrophotometrisch aufzeichnet, indem man die Umsetzung zwischen Thiocholin und 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) misst.

   5. Analytisches Reagens zur Bestimmung von Liganden in zu untersuchendem Proben, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Konjugat aus Ligandenanalogem und irreversiblem Enzyminhibitor.

   6. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim irreversiblen Enzyminhibitor um einen irreversiblen Organophosphor-Enzyminhibitor für Acetylcholinesterase handelt.-

   7. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es die allgemeine Formel

   ff

   ■II

   R¹ -P-S-CH₂-CH₂-B»- CCH₂) ^NH-C- Hapten

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   aufweist, in der η den Wert 2 bis 8 hat und R' und R" Alkylreste mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und B¹ den Rest -S oder ein entsprechendes Sulfoniumsalz bedeutet.

   8. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass R' und R" Alkylreste mit 1 bis H Kohlenstoffatomen bedeuten und η den Wert 2 bis 6 hat.

   9. Reagens der allgemeinen Formel

   ^-0-P-O- (CH₂) J₁-NH-CO- (CH₂) _n-NH-C-H.apten

   I A-R"' 0

   CH₃ L

   in der R"¹ einen Alkylrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, η den Wert 2 bis 8 hat und L ein biologisch verträgliches Gegenion darstellt.

   10. Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   :=o

   Ϊ ⁺ ■ F '

   CH₃-P-S-CH₂-CH₂-S-(CH₂)g-NH-C-CH-CHj-

   OCH₂CH CH₃

   CH₃OSO₃

   11. Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   CH₃-P-SCh₂CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-C- (CH₂) 3-NH-C-CH₂-CH₂-CH

   ^OCH2^CB3

   - 3 030033/0727

   3616

   12. Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   CH₃-P-S-CH₂CH₂-S-(CH₂J₆-NH-C-CH₂NH-C-CH₂

   H β

   YSQ>

   OCH₂CH₃ CH₃

   CH₃OSO₃

   13- Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   CH,-P-S-CH₀CH₀-S- (CH₀) ,-NH-C-O- KJ^ OH

   H₂CH₃

   ₂)₆-

   CH

   . Reagens nach Anspruch 5 der Formel O O

   CH₃-P-S-CH₂CH₂-S-CH₂CH₂-Nh-O- (CH₂) ₅-^

   OCH₂CH₃

   15- Reagens nach Anspruch 5 der Formel CH-

   • HO

   .-0-P-O-

   CO-NH-(CH₂)₅-CONH-(CH₂)₅~0-P

   CH₃-OSO₃

   030033/0727

   3616

   16. Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   CH.

   S-P-O-C₄H₉

   CH.

   17. Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   ; J-O-CH₂-CH.

   C₂H₅

   18. Reagens nach Anspruch 5 der Formel N COOH

   CONH(CH₂J₄S-

   ι)
   J-P-OC₂H₅

   - 5 -030033/0727

   3616

   19. Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   H₂N.

   CH

   COOH

   NH,

   h,n-(0>-conh(J:h

   (CH₂J₂ CONK (CH₂) ₄S-

   20. Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   S-P-OC₂H₅

   21. Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   2^H CH-CH₂CH₂CH₂NHCo

   Ab₂

   ^l2 ^l3

   - 6 030033/0727

   22. Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   CH.

   23- Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   CH,

   W₃

   O-^ VNHCOCH₂N

   !-P-OC₂H₅

   iü.

   24. Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   OHKO,

   J"

   J ·

   CH₃-C-IjIH _o -CH₂-CH-CNH (CH₂) g-S-(CH₂)₂-S-P-CH₃

   .C₄H₉

   25. Reagens nach Anspruch 5 der Formel Il

   (Aminogruppe von Gentamycin)-COCH₂CH₂CONHCH₂CH₂SCH₂CH₂-S-P-CH₃

   OC₂H₅

   - 7 030033/0727

   3616 S

   26. Reagens nach Anspruch 5 der Formel (Aminogruppe von Tobramycin)"^⁰

   27. Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   ? CNH (CH) SSP-

   CH

   (Vitamin B₁₂ )-O -CNH- (CH₂)

   28. Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   Il

   CH₃-C-NH ρ ₊

   OH-^o)-O-(O) -CH₀-CH-CNH-(CH₀)^-S-(CH₀) .,-S-?-

   »_O W»»— V»«i»— \Wtlp/ /Τ~"5~ (WIIj; _O ~ (O ~ < V-H^

   ^{J J} CH₃ 0-C₄H₉

   FSO₃

   29. Reagens nach Anspruch 5 der Formel

   -C-CH, CH., j J T 3

   "^CH-^C-NH-(CH₂) ₆ίέ-(CH₂) ₂-S-P-CH₃

   NH-C-CH, CH.,

   j J T 3

   ίέP

   -CH₂-CH₃

   - 8 030033/0727