CH641569A5

CH641569A5 - Procede et reactif pour determiner un ligand dans un echantillon.

Info

Publication number: CH641569A5
Application number: CH87780A
Authority: CH
Inventors: Houston Frederick Voss; Jacob Plattner; Thomas Raymond Herrin
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 1979-02-05
Filing date: 1980-02-04
Publication date: 1984-02-29
Also published as: JPS55104896A; AU528592B2; BE881557A; ES8101647A1; CA1137077A; GB2043245A; FR2447966A1; IT8019675A0; DE3003959C2; SE448259B; DE3003959A1; FR2447966B1; AT365781B; ES488263A0; GB2043245B; ZA80371B; AU5476380A; NL8000698A; IT1130254B; SE8000843L

Description

La présente invention concerne un procédé de détermination

23. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce d'un ligand dans un échantillon et un réactif pour la mise en œuvre qu'il répond à la formule: du procédé, consistant en un conjugué analogue de ligand/inhibiteur enzymatique irréversible.

60 On connaît de nombreuses techniques enzymatiques de détermination immunologique. Parmi elles figurent des techniques selon les-VCH* ' 3 quelles on fixe une enzyme à un anticorps ou à un antigène à détec ter. On mesure la compétition entre l'espèce à marquage enzymatique et l'espèce inconnue vis-à-vis du partenaire fixant fixé à un 65 support solide. On mesure l'enzyme restant dans la solution par réaction avec un substrat.

24. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce Des techniques de détermination immunologique enzymatique qu'il répond à la formule: homogène sont décrites dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique

CH,

O s 3

HNCCH20-^3 -NHCOCHjN^

^CH, 2 5

w3 ? .

Sv/\S-P-OC,H-^3

641 569

4

N° 4043872 (haptène fixé à une enzyme) et N° 4065354 (haptène fixé au lysosyme). Des ligands marqués par un cofacteur enzymatique sont décrits dans «Analytical Biochemistry», 72, 271 et 283 (1976). On trouvera décrits dans «Derwendt Abstract B4, Natural Products Week A26», p. 30 de DT2754-086, des modulateurs de la fixation enzymatique réversible utiles comme substances de marquage des antigènes, des anticorps, des hormones, des vitamines ou des médicaments. Le brevet belge N° 864856 décrit des conjugués préparés à partir de méthotrexate comme inhibiteur enzymatique fixé à des analogues de ligand.

Le procédé et le réactif de l'invention sont particulièrement remarquables en ce qu'ils impliquent l'emploi d'inhibiteurs enzymati-ques irréversibles conjugués à des analogues de ligand. Ces inhibiteurs réagissent avec les enzymes pour former des liaisons covalentes qui modifient la structure de l'enzyme et inhibent ainsi de façon irréversible l'activité enzymatique. En particulier, des inhibiteurs enzy-matiques irréversibles organophosphorés qui réagissent avec une enzyme pour former des liaisons covalentes sont conjuguées à des analogues de ligand.

L'invention concerne un procédé pour déterminer des ligands dans des échantillons, qui consiste à mélanger à l'échantillon un conjugué analogue de ligand/inhibiteur enzymatique irréversible et une protéine fixante pouvant se fixer au ligand et au conjugué analogue de ligand/inhibiteur enzymatique irréversible, dans lequel la quantité de conjugué analogue de ligand/inhibiteur enzymatique irréversible fixée par la protéine fixante est en relation avec la quantité de ligand présente dans l'échantillon, cette protéine fixante inactivant l'inhibiteur enzymatique irréversible lorsqu'elle est fixée à la portion d'analogue de ligand du conjugué; à mélanger une enzyme qui est inhibée de façon irréversible par le conjugué analogue de ligand/inhibiteur 30 enzymatique irréversible non fixé par la protéine fixante; à mélanger un substrat à l'enzyme, puis suivre la réaction enzyme-substrat. L'invention concerne également des conjugués analogues de ligand/inhibiteur enzymatique irréversible utiles comme réactifs dans le procédé ci-dessus. 35

La portion d'inhibiteur enzymatique irréversible du conjugé réagit avec l'enzyme pour former des liaisons covalentes et inactiver ainsi l'enzyme. Le procédé et le réactif de l'invention sont particulièrement utiles pour déterminer des médicaments, des hormones et similaires. 40

L'invention va maintenant être décrite en détail.

L'invention concerne un procédé et un réactif pour déterminer des ligands dans des liquides biologiques tels que le sérum, le plasma, le liquide céphalo-rachidien, le liquide amniojique et l'urine.

Dans la présente description, le terme ligand désigne des haptè- 45 nés, des polypeptides, des protéines et des glycoprotéines ayant des poids moléculaires généralement inférieurs à 150000.

Les haptènes sont des corps non protéiques généralement de bas poids molédulaire, qui ne provoquent pas la formation d'anticorps lorsqu'on les injecte à un animal, mais qui réagissent avec les anti- 50 corps. Pour former des anticorps dirigés contre les haptènes, on conjugue tout d'abord l'haptène à une protéine et on injecte le conjugué à un animal ou à l'homme. On isole les anticorps produits selon des techniques classiques d'isolement des anticorps. Ces anticorps doivent être pratiquement dépourvus de matières protéiques sériques 55 telles que les enzymes indicatrices utilisées dans la détermination ou les inhibiteurs de la fixation enzymatique. On élimine facilement ces matières par Chromatographie par échange ionique sur une colonne échangeuse d'anions ou selon une autre technique de séparation appropriée des protéines. 6"

Comme exemples de ligands que l'on peut déterminer selon le procédé de l'invention figurent des stéroïdes tels que l'œstrone, l'œstradiol, le cortisol, la testostérone, la progestérone, l'acide chénodésoxycholique, la digoxine, l'acide cholique, l'acide désoxy-cholique, l'acide lithocholique et leurs dérivés de type ester et amide; 65 des vitamines telles que la vitamine B12 et l'acide folique; la thy-roxine, la triiodothyronine, l'histamine, le sérotonine, les Prostaglandines telles que les PGE, PGF et PGA; l'adrénaline, la noradréna-

line et des médicaments tels que les opiacés, la théophylline, la diiantine; des barbituriques tels que le phénobarbital et ses dérivés et les carbamazépines; des antibiotiques aminoglycosidiques tels que la gentamycine et la tobramycine.

On peut citer comme exemples de polypeptides et de glycoprotéines que l'on peut déterminer selon le procédé de l'invention l'insuline, le facteur plaquettaire 4 et les déterminants polypeptidiques des gros antigènes.

Les analogues de ligand sont des ligands fonctionnels ou fonctionnalisés, que l'on peut conjuguer à des inhibiteurs enzymatiques irréversibles. Des groupes fonctionnels appropriés sont les groupes acide, ester, amide, amine, hydroxy, isocyanate et isothiocyanate.

Des exemples d'enzymes et d'inhibiteurs enzymatiques irréversibles utilisables dans le procédé selon l'invention figurent dans le tableau I.

Tableau I

Inhibiteurs irréversibles Triesters organophosphoriques Diesters organophosphoniques Organophosphothioates

Alkylsulfonates Isocyanates d'alkyle

Dérivés de type p-chloromercuribenzoate

Enzymes Trypsine

Acétylcholinestérase Butyrylcholinestérase Chymotrypsine Thrombine Elastase

Adénosine-désaminase Acétylcholinestérase Elastase Trypsine Chymotrypsine Papaïne

Alcool-déshydrogénase Chymopapaïne Clostridiopeptidase B Adénosine-désaminase Lipase ß-Amylase Pepsine

GlycéraIdéhyde-3-phosphate-

déshydrogénase Luciférase

Aspartate-aminotransférase Alanine-aminotransférase Hexokinase Pepsine

Glutaminase A Acide désoxyribonucléase ii Alcool-déshydrogénase Acide désoxyribonucléase ii Dextranase

On préfère les inhibiteurs enzymatiques irréversibles organophosphorés. On trouvera décrites dans «J. Am. Chem. Soc.», 80, 456 (1958); «J. Am. Chem. Soc.», 82, 596 (1960) et «Ree. Trav. Chim.», 86, 399 (1967) diverses catégories de composés organophosphorés qui constituent des inhibiteurs enzymatiques irréversibles appropriés. Les composés organophosphorés préférés utiles pour la conjugaison aux analogues de ligand sont représentés par la formule suivante:

0

R! —P—S—CH2—CH2 —B—(CH2)n—X

1

r2

où B représente un atome d'azote ou de soufre ou leurs sels alkylés; n a une valeur de 1 à 10 et, de préférence, de 2 à 8; X représente un radical fonctionnel tel qu'hydroxy, amino, carboxy ou a-halogéno-méthylcarboxy dont le radical halogéno est un radical iodo, chloro

Epoxydes de substrat Dérivés de diazo-6-oxo-5

L-norleucine Dérivés de l'acide iodoacétique

Dérivés de type N-bromosuccinimide

5

641 569

ch3-^>-s-ch2ch2-och2ch3

CH,

Théophylline ?

CH,

Acide cholique ch,

ho ou bromo; r, et r2 représentent un radical alkyle comportant 1 à Dilantine 10 atomes de carbone, ou alcoxy comportant 1 à 10 atomes de carbone. Le radical alkyle peut être substitué par des substituants nitro, halogéno, cyano, benzyle ou similaires. Il est évident pour l'homme de l'art qu'il existe une grande diversité de structures équivalentes convenant à la mise en pratique du procédé selon l'invention.

Un autre radical d'inhibition enzymatique irréversible préféré est représenté par la formule: Digoxine

î

r3-p-o-I

r4

où r3 a la définition précédemment indiquée pour r, et r2, et r4 représente des groupes organiques labiles courants tels que p-nitro-phènyle, hydroxyquinolyle ainsi que quinolyle à substitution alkyle,

halogéno ou cyano.

Les inhibiteurs enzymatiques irréversibles sont fixés aux analogues de ligand par des groupes de pontage bifonctionnels classiques correspondant aux composés de formule générale:

X-A-Y

où X et Y représentent des groupes fonctionnels tels que — OH,

—NH2, —C02H (et esters), —CO—CH2Z, où Z représente I, Cl ou Br, et A représente — (CH2)n — où n a une valeur de 3 à 20. La chaîne alkylénique peut être interrompue par un ou plusieurs groupes bivalents tels que — O—, —CO—, —S—, — NH—,

—CONH —, —CH = CH—, —CH=CH—, -C=C-, phénylène et sels de sulfonium et d'ammonium. La chaîne alkylène peut être substituée par des substituants courants tels que des substituants halogéno (I, Br, Cl, F), hydroxy, cyano, phényle, amino, carboxy, esters carboxyliques, alkyle comportant 1 à 7 atomes de carbone, et alcoxy comportant 1 à 3 atomes de carbone. X—A—Y peut représenter une petite chaîne polypeptidique ou polysaccharidique. On fait réagir X—A—Y selon des techniques classiques avec un inhibiteur 35 enzymatique irréversible et un analogue de ligand pour former des liaisons amide, ester, amine, imine, Sulfonamide, thioester, phosphate, thiophosphate et similaires entre le groupe de pontage et l'inhibiteur enzymatique irréversible et l'analogue de ligand.

Plus généralement, on fixe une chaîne latérale sur un ligand ou 40 un analogue de ligand et on fait réagir le produit avec un inhibiteur enzymatique irréversible convenablement fonctionnalisé pour qu'il réagisse avec la chaîne latérale du ligand ou de l'analogue de ligand.

Sinon, on fixe une chaîne latérale sur l'inhibiteur enzymatique irréversible et on fait réagir le produit avec un ligand ou un analogue de 45 ligand approprié. Donc les composés de formule inhibiteur enzymatique irréversible — A— analogue de ligand constituent des réactifs appropriés.

Les formules développées suivantes illustrent des conjugués utilisables comme réactifs pour la mise en œuvre du procédé de l'inven- 50 tion.

Thyroxine

J ♦ S f r-?

ch3-p-s-ch2-ch2-s- (ch2) 6-nh-c-ch-ch2-^^-o-(o)~i

•<ch2)6

0

-NH-t-i

CHjNH-i

■CH,

H ©

CIMOSO-

t.

-ch2ch2-s-(ch2)6 h2ch3 ÓH3

0

-j?-S-CH2CH2-S-CH2CH2-NH-ë- (CH2) 5-\> och2ch3

v/"3

0-CH,-ch,chj

HO

Digoxine

OH

ch3-oso3

Digoxine

X 55

och2ch3

Acide cholique

OH

ch3oso3

s_?-o-ch2-ch3

c2«5

60 Acidefolique

?

0 II

fh3

ch3-p-sch2ch2-s-ch2-ch2-nh-c- (ch2) 3-nh-c-c hj-ch^ch

H2N

och2ch3

ho^ch

„>35?

Ì HH^XN*

4 « O

çooh

-ch2nh-< o)-conhçh

«?h2)2

?

60nh(ch2) 4s ^s-p-oc2h5

ch,

641 569

Méthotrexate h2N

ch,

300h

:HoN-{O)-CONHÇH

nh_

(CH2).

conh(ch2)4

Cortisol s-p-ocjhj

Acide valproïque f°2H

CH-CH2CH2CH2NH(j:0 ÇH2 <fH2

2 T2

CONH

•s-p-ch,

oc/s

Sulfolithocholylglycine

Lidocaïne ch,

? jrC

TCCH2Q-^ y-NHCOCH2N^ ch.

c2h5

I_CH3

l

Gentamycine

[gentamycine (par un radical amino)]

Tobramycine

[Tobramycine (radical amino)] -(j;o ch. I 2

fH2 V

conhch2ch2sch2ch2sp-ch3

B

12

10 jj>

(Vitamine B^2)-0 —CNH— (CH2) g£j^"\^S—iJ-QCjHj

CH.

® CH,-CH-CNH- (CH2) g-S- (CH2) 2-S-|-CH3

L, O-C.H

s—/ \ / 2

r i

20

4h9

PSO,

Les protéines fixantes sont des anticorps ou d'autres protéines 25 fixantes spécifiques telles que la thyréoglobuline que l'on peut fixer au ligand à déterminer et au fragment constitué d'analogue de ligand du conjugué analogue de ligand/inhibiteur enzymatique irréversible. Lorsque la protéine fixante est fixée à l'analogue de ligand, l'inhibiteur enzymatique irréversible est inactivé. 30 Les réactions impliquées dans le procédé selon l'invention sont illustrées ci-dessous:

Keq

L + L>

L + ; LAI + : LAI + Enz

K,

LAI + LAI:

Enz-I + X

LAI;

k'

+ Enz —Enz-I + X

40 L (ligand); > (protéine fixante); LAI (conjugué inhibiteur enzymatique irréversible/analogue de ligand); Enz (enzyme); Enz-I (enzyme inactivée); X (sous-produit réactionnel); k2»k'2 et, dans la plupart des cas, k'2 est presque réduit à zéro, si bien que la protéine fixante inactive le LAI.

45 On peut suivre la réaction selon des techniques cinétiques ou des techniques de détermination du point d'achèvement. On suit ainsi la réaction

-d Enz dt

= k2 [LAI] [Enz]

50

CH,-6H-£NH (CH2) g-S- (CH2) 2-S-j>-CH3

2-s-ï-ch3 i—c4h9

selon des techniques cinétiques. Si l'on utilise un excès d'enzyme et qu'on laisse à la réaction le temps d'aller jusqu'à 99% de son achèvement, ce système convient bien aux techniques par détermination du point d'achèvement.

55 Les conjugués que l'on préfère utiliser avec l'acétylcholinestérase (E.C.3.1.1.7) sont ceux qui répondent à la formule:

O

il

R' - P - S - CH2 - CH2 - B' - (CH2)n - NH - C -haptène

O—R"

O

f

-COCH2CH2CONHCH2CH2SCH2CH2-S-|-CH3

OC2Hs où R' et R" représentent un radical alkyle comportant 1 à 10 atomes de carbone, n a une valeur de 2 à 8 et B' représente — S — ou les sels de sulfonium correspondants. L'haptène est un haptène contenant 65 une fonction acide carboxylique ou un haptène modifié pour qu'il contienne une fonction acide carboxylique, ces deux haptènes étant appelés ici analogues de ligand. Les sels de méthylsulfonium correspondants conviennent également.

7

641 569

Les conjugués que l'on préfère tout particulèrement sont ceux où R' et R" représentent un radical alkyle comportant 1 à 4 atomes de carbone et n a une valeur de 2 à 6, ainsi que leurs sels de sulfonium. On préfère tout particulièrement les composés répondant à la formule:

O

CH3 - P - S - CH2 - CH2 - S - (CH2)6 - NH - C - haptène O-R"

où R" représente un radical éthyle ou butyle et les sels de sulfonium correspondants tels que:

O

ch,

O

ch3-p-s-ch2-ch2- s -(ch2)n-nh-c-haptène I +

O-R"

dont l'ion complémentaire-est un ion iodure, méthylsulfate ou similaires. Il est évident pour l'homme de l'art qu'il existe une grande diversité d'anions interchangeables équivalents. On préfère également les composés où n a une valeur de 2 à 6.

D'autres composés que l'on préfère dans la pratique de l'invention répondent aux formules:

C0«.

P-O-(CH-) -NH-C-(haptène)

i 'li,

CH.

CHjOSOj où R'" représente un radical alkyle comportant 1 à 10 atomes de carbone et, de préférence, 1 à 4 et n a une valeur de 1 à 12, et

-P-O-(CH-) -NH-CO-(CH,) -NH-C-(haptène) t 2 n 2 n ,,

0 O

1 t"

T»lf I "

i+

CH,

où R'" représente un radical alkyle comportant 1 à 10 atomes de carbone, de préférence 1 à 4, n a une valeur de 2 à 8 et L- représente un ion complémentaire compatible du point de vue biologique tel qu'un ion méthylsulfate, iodure et similaires.

L'invention concerne également des réactifs analytiques constitués de conjugués inhibiteur enzymatique irréversible/analogue de ligand.

La réaction du procédé analytique de l'invention correspond au schéma suivant:

2L + 2LAI + 2

- + LAI > L -f- LAI

Le ligand (L) et le conjugué analogue de ligand/inhibiteur enzymatique irréversible (LAI) entrent en compétition vis-à-vis de la protéine fixante (>—). La protéine fixante fixée au LAI inactive l'inhibiteur, tandis qu'il demeure du LAI libre pour inhiber de façon irréversible l'enzyme. Plus l'échantillon contient une quantité importante de ligand, plus la quantité de LAI fixée à la protéine fixante est faible et, par conséquent, plus il demeure de LAI libre pouvant inhiber l'enzyme. On fait réagir l'enzyme non inhibée avec un substrat approprié et on suit la réaction entre l'enzyme et le substrat.

On effectue de façon pratique l'analyse colorimétrique avec un spectrophotomètre bichromatique décrit dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique N°s 3748044, 3831618, 3833304, 3900289, 3817425 et 3811780.

On peut prétraiter les échantillons pour éliminer ou inactiver les protéines gênantes. On peut éliminer les protéines gênantes par précipitation avec des solvants organiques tels que l'éthanol, le métha-

nol et similaires. Le traitement par la chaleur à un pH basique est également efficace pour éliminer les protéines gênantes. Il est souvent souhaitable de traiter de plus les échantillons avec un acide fort ou une base forte pour séparer l'haptène à étudier des protéines. 5 Dans certains cas, il suffît d'inactiver de façon spécifique les protéines gênantes. Par exemple, on inhibe de façon spécifique la cholines-térase sérique avec des inhibiteurs spécifiques qui possèdent une activité sélective vis-à-vis de la pseudo-cholinestérase sérique. Les composés qui présentent cette activité sont l'orphénadrine, la N-méthyl-io orphênadrine, les phénathiazines, le bisester de la p-méthylcholine de l'acide phtalique, la quinidine ainsi que l'artane et ses sels alkyli-ques quaternaires.

De façon typique, on détermine la digoxine dans le sérum traité par la N-méthylorphénadrine selon un procédé d'analyse cinétique 15 et on utilise un composé de formule:

CH,

ch3-p-s-ch2-ch2-s-(ch2)6-nh-c-0

0-CH--CH,

1 3 I

25 comme conjugué inhibiteur enzymatique irréversible/analogue de ligand entrant en compétition avec la digoxine vis-à-vis d'un anticorps antidigoxine dans l'échantillon à analyser. Après une brève période d'incubation, on ajoute de l'acétylcholinestérase. On mesure l'enzyme non inhibée par réaction avec l'acétylthiocholine qui libère 30 de la thiocholine. On mesure la thiocholine libérée par colorimétrie après réaction avec le dithio-5,5' bis(acide nitro-2 benzoïque). On suit cette réaction à 412 nm. On utilise des standards pour préparer une courbe d'étalonnage à partir de laquelle on détermine les teneurs des échantillons analysés.

35 Le procédé et le réactif de l'invention s'appliquent également à la détermination de protéines fixantes telles que les anticorps. Dans cette technique, on conjugue, à un inhibiteur enzymatique irréversible, un analogue de ligand se fixant de façon spécifique à la protéine fixante à déterminer. Pour effectuer la détermination, on mélange à 40 l'échantillon contenant la protéine fixante un conjugué analogue de ligand/inhibiteur enzymatique irréversible dont le fragment analogue de ligand se fixe de façon spécifique à la protéine fixante à déterminer, puis on mélange une enzyme inhibée de façon irréversible par le fragment inhibiteur irréversible du conjugué, on ajoute un subs-45 trat de l'enzyme et on suit la réaction. Comme la protéine fixante inactive l'inhibiteur enzymatique irréversible, plus la quantité de protéine fixante est grande, plus l'activité enzymatique est importante.

L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants.

50

Exemple 1 :

A une solution de 7,8 g d'acide amino-6 caproïque et 5,0 g de bicarbonate de sodium dans 50 ml d'eau, on ajoute goutte à goutte 16 g de N-benzoyloxycarbonyloxysuccinimide dans 60 ml de tétra-55 hydrofuranne. On agite le mélange pendant 1 h à la température ordinaire, puis on chasse le tétrahydrofuranne sous pression réduite. On acidifie le résidu à pH 3, on extrait par le chlorure de méthylène et on sèche sur sulfate de magnésium anhydre. On chasse le sulfate de magnésium par filtration et on évapore le solvant. On recristallise 60 dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'hexane pour obtenir l'acide N-benzyloxycarbonylamino-6 caproïque.

A une solution de 4,09 g de ce composé dans 40 ml de dioxanne, on ajoute 2,3 g de N-hydroxysuccinimide et 4,12 g de dicyclohexyl-carbodiimide. On utilise 10 ml de dioxanne additionnels pour favori-65 ser le transfert réactionnel. On agite le mélange pendant une nuit à la température ordinaire. On filtre le mélange et on ajoute au filtrat 2,06 g d'amino-5 pentanol dans 5 ml d'eau. On agite le mélange réactionnel pendant 1 h, on concentre sous pression réduite et on

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8

extrait le résidu par le chlorure de méthylène. On lave l'extrait dans de l'eau et une solution concentrée de chlorure de sodium. On sèche la solution sur du sulfate de magnésium anhydre. On sépare le sulfate de magnésium par filtration et on chasse le solvant par éva-poration sous pression réduite. On cristallise deux fois le résidu dans 5 l'acétate d'éthyle pour obtenir le [N-(hydroxy-5 pentyl)benzyloxy-carbonylamino]-6 hexanamide; F. 92,5-94° C.

On réduit 4,0 g de cette matière avec du charbon palladié dans de l'éthanol sous une faible pression d'hydrogène. On élimine le catalyseur par filtration et on évapore le solvant sous pression réduite 10 pour obtenir le [N-(hydroxy-5 pentyl)amino]-6 hexanamide.

A une solution du dérivé de type acétoxy-12 chloroformyloxy-3 hydroxy-14 cardénolide-20(22) de la digoxigénine (brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3981982) dans 40 ml de dioxanne, on ajoute 575 mg de N-hydroxysuccinimide. On refroidit le mélange au bain- 15 marie froid et on ajoute 0,695 ml de triéthylamine. On agite le mélange à la température ordinaire pendant 3 h. On filtre le mélange et on ajoute le filtrat à une solution de 973 mg de [N-(hydroxy-5 pentyl)amino]-6 hexanamide et 378 mg de bicarbonate de sodium dans 20 ml d'eau et 10 ml d'éthanol. Après 1 h, on évapore le 20

solvant sous pression réduite et on dissout le résidu dans le chlorure de méthylène. On lave la solution dans le chlorure de méthylène avec de l'eau et une solution saturée de chlorure de sodium et on sèche sur sulfate de magnésium anhydre. On élimine le sulfate de magnésium par filtration et on évapore le solvant sous pression réduite. On 25 Chromatographie le résidu sur 200 g de gel de silice.

On élue avec du méthanol à 5-15% dans du chlorure de méthylène pour obtenir l'acétoxy-12 [N-(hydroxy-12 oxo-6 aza-7 dodécyl)-carbamoyloxy]-3 hydroxy-14 cardénolide-20(22) répondant à la formule: „ 30

ch3-co

35

ho-(ch. ) ,-n-c-(ch„),-n-c-0' 2 5,, 2 5 „

On dissout 2,70 g du composé ci-dessus dans 50 ml de méthanol et on ajoute 50 ml d'eau et 10 ml de triéthylamine. On laisse le mélange réactionnel reposer à la température ordinaire pendant une nuit. On évapore le solvant sous pression réduite et on Chromatographie le résidu obtenu sur une colonne de 150 g de gel de silice, puis on élue avec 21 de méthanol à 10% dans le chlorure de méthylène pour obtenir le [N-(hydroxy-12 oxo-6 aza-7 dodécyl)carbamoyl]-3 hydroxy-14 cardénolide-20(22).

On fait passer une solution de 170 mg de quinolyl-7 phosphate d'éthyle et de triéthylammonium dans 10 ml d'eau à travers 15 ml d'une résine de type acide sulfonique sous la forme pyridinium. On concentre la solution sous pression réduite et on évapore de la Pyridine anhydre du résidu. On ajoute au résidu 253 mg de [N-(hydroxy-12 oxo-6 aza-7 dodécyl)carbamoyloxy]-3 hydroxy-14 cardénolide-20(22). On évapore trois fois de la pyridine anhydre du résidu. On dissout le résidu dans 1,0 ml de pyridine anhydre et on ajoute 145 mg de chlorure de trisisopropylbenzènesulfonyle cristallisé. On agite le mélange réactionnel à la température ordinaire pendant

15 h. On ajoute de la glace et, après 0,5 h, on extrait le mélange avec du chlorure de méthylène. On lave la solution de chlorure de méthylène avec de l'eau, du bicarbonate de sodium saturé et du chlorure de sodium saturé, puis on sèche sur sulfate de magnésium anhydre. On chasse le solvant et on évapore plusieurs fois du toluène du résidu pour chasser la pyridine. On Chromatographie le résidu sur gel de silice avec comme éluant du méthanol à 5-10% dans du chlorure de méthylène pour obtenir un composé de formule:

CO*

-p-o-(ch ),-n-c-(ch,)c-n-c-0 t Z 5 „ 2 5 „

OCHjCHJ O O

On dissout 100 mg du composé ci-dessus et 23 ni de sulfate de dimé-thyle dans 0,50 ml d'acétone et, après 4 h, on rajoute 60 ni de sulfate de diméthyle dans 2 ml d'acétone et on laisse le mélange reposer pendant une nuit. On ajoute la solution acétonique à de l'éther éthy-lique pour obtenir un précipité blanc qui est un composé de formule:

■p-o-(ch,) „-h-c-(ch)5-n-c-i

I t J II £• ■» tt och-ch.

2 3

ch3oso3

Modulation par un anticorps de l'activité inhibitrice du composé I.

On dilue au 1/200 une solution stock du composé I (4,6 x 10~3M dans le méthanol) avec du tampon phosphate 0,1 M à pH 7,0 contenant 0,1% de gélatine. On dilue de l'anticorps antidigoxine dans du 40 tampon phosphate/gélatine, comme indiqué dans le tableau ci-après. On place 50 |il de tampon phosphate/gélatine à pH 7,0 ayant la concentration indiquée en anticorps dans les godets d'échantillon d'un spectrophotomètre bichromatique (modèle ABA-100 vendu par Abbott Laboratories). A chacun de ces 50 (il, on ajoute 1 ni de solu-45 tion de travail du composé I pour obtenir une concentration finale de 4,5 x 10~7M. On laisse l'anticorps et le composé I (inhibiteur) incuber pendant 10 à 15 min à la température ordinaire. Chaque échantillon reçoit 1 jj.1 de solution de travail d'enzyme (9,5 x 10~9M en acétylcholinestérase de E. electricus dans du tampon phosphate/ so gélatine à pH 7,0). La concentration finale en enzyme est de 1,9 x 10_10M. On dissout l'échantillon au V26 avec du tampon de détermination constitué de tampon phosphate/gélatine à pH 7,0 qui est 5 x 10-4M en acétylthiocholine (substrat) et 1,6 x 10~4M en dithio-5,5' bis(acide nitro-2 benzoïque) (DTNB). On mesure la va-55 riation de l'absorbance au cours du temps après 5 min avec l'analyseur bichromatique muni d'un filtre 415/550 nm à 30° C.

Les résultats sont les suivants:

Enzyme (M)

Anticorps (M)

Composé I (M)

AAd/5 min après un temps d'incubation de

10 min

21 min

43 mia

1,9x10-10

0

0,220

0,221

0,222

1,9 xlO-10

9x10-7

4,5xl0-7

0,161

0,137

0,107

1,9x10-10

9x10-8

4,5xl0-7

0,089

0,027

0,005

1,9x10-10

0

4,5x10-7

0,045

0,015

0,003

9

641 569

On répète l'expérience ci-dessus, si ce n'est qu'on ajoute de la digoxine à la concentration de 2,5 x 10_5M aux godets d'échantillon. On met ainsi en évidence la modulation spécifique. On ajoute 50 |il de tampon phosphate/gélatine à un godet d'échantillon. La solution-tampon soit est 2,5 x 10-5M en digoxine, soit constitue un témoin. 5

On ajoute aux godets d'échantillon une concentration finale en anticorps antidigoxine de 9 x 10_7M et une concentration en composé I de 4,5 x 10-7M. On laisse ces solutions incuber pendant 15 min, puis on ajoute l'enzyme et on analyse selon le mode opératoire précédent. Les résultats sont les suivants:

Mélange incubé

AAd/5 min après un temps d'incubation de l'inhibiteur enzymatique de

0,3 min

11 min

19 min

Enzyme seule (témoin)

0,174

0,169

0,167

Enzyme + composé I

0,162

0,037

0,013

Enzyme + composé I + anticorps

0,160

0,129

0,115

Enzyme 4- composé I + anticorps + digoxine

0,160

0,068

0,038

On reprend les modes opératoires ci-dessus, si ce n'est que la concentration finale en anticorps de l'échantillon est de 4,5 x 10~7M et on prépare diverses solutions de tampon phosphate/gélatine ayant 20 la concentration en digoxine indiquée. Pour analyser chacune de ces solutions, on ajoute l'anticorps et le composé I à la solution selon le mode opératoire précédent, on laisse s'écouler une période d'incubation de 2,5 min et on détermine l'activité enzymatique résiduelle après 21 min. • 25

Digoxine dans le sérum (nmol)AAdj5 min (suite)

Digoxine (fimol)

0,062

0,125

0,25

0,5

1,0

% d'activité enzymatique

65 65 62 57 36

On analyse, selon le mode opératoire ci-dessus, du sérum humain normal ayant les concentrations en digoxine indiquées dans le tableau ci-dessous.

On prépare le méthylsulfate de N,N,N-triméthyl (o-méthyl a-phénylbenzyloxy)-2 éthylammonium (N-méthylorphénadrine) par réaction de la N,N-diméthyl (o-méthyl a-phénylbenzyloxy)-2 éthyl-amine (orphénadrine) avec le sulfate de diméthyle. A la concentration de 1 mmol, ce composé inhibe plus de 99% de la cholinestérase du sérum humain et n'inhibe que 25% de la cholinestérase de E. electricus.

On utilise le N-éthylmaléimide pour bloquer les radicaux mer-capto de fond du sérum humain.

On ajoute 1 (il d'anticorps concentré antidigoxine dans du tampon phosphate/gélatine à pH 7,0 ayant une concentration en N-méthylorphénadrine de 50 mmol à 50 (il de chaque sérum standard, puis on ajoute du N-éthylmaléimide, en mélangeant, à chaque sérum standard pour obtenir une concentration de travail de 1,6 mmol. On ajoute également au sérum 1 jj.1 d'une solution de tampon phosphate/gélatine à pH 7,0 ayant une concentration en composé I de 0,1 M. La concentration finale en anticorps est de 8,0 x 10~7M et la concentration finale en composé I est de 4,5 x 10-?M. On laisse ces solutions incuber pendant 12 min, puis on ajoute de l'acétylcholinestérase comme précédemment. Après 26 min, on met le spectropho-tomètre bichromatique en marche et on dilue un échantillon de chaque godet au Vis avec du tampon de détermination constitué de tampon phosphate/gélatine 0,1M à pH 7,0 1,6 x 10~5M en DTNB, 5 x 10_4M en iodure d'acétyl P-méthylthiocholine et 1 mmol en N-méthylorphénadrine. La concentration enzymatique finale est d'environ 2 x 10~l'M et la température de la cuvette est de 30 ' C.

Les variations de l'absorbance après 5 min figurent ci-dessous.

Digoxine dans le sérum (fimol)AAd/5 min

0,1 0,096

0,13 0,089

0,17 0,083

0,26

0,077

0,34

0,073

0,51

0,063

0,64

0,060

0,85

0,047

1,30

0,035

Exemple 2:

On dissout 4,08 g d'acide cholique dans 10 ml de diméthyl-formamide anhydre et on ajoute 3,40 g d'imidazole, puis 3,60 g de 30 chlorure de tert.-butyldiméthylsilyle. On laisse le mélange réactionnel repose pendant une nuit à la température ordinaire. On verse le mélange réactionnel dans l'eau, on filtre et on lave le précipité à l'eau. On dissout le précipité dans 30 ml de tétrahydrofuranne et on ajoute 3 ml d'eau et 2 ml d'acide acétique. Après 6,5 h, on évapore le 35 solvant et on Chromatographie le résidu sur 200 g de gel de silice avec comme éluant du méthanol à 5% dans le chlorure de méthylène, pour obtenir l'acide tert.-butyldiméthylsilyloxy-3a dihydroxy-7a, 12a 5ß-cholano'ique-24, F. 145,5-148' C, répondant à la formule développée suivante:

45

®3

ch,

-Si O

ch, ch,

On porte à reflux 2,092 g du composé ci-dessus, 1,728 g de [N-(hydroxy-5 pentyl)amino]-6 hexanamide et 1,87 g de N-éthoxy-so carbonyléthoxy-2 dihydro-1,2 quinoléine dans 175 ml d'acétate d'éthyle pendant 24 h. On laisse le mélange réactionnel reposer à la température ordinaire pour obtenir un composé cristallin. On recristallise cette matière dans l'acétate d'éthyle pour obtenir 260 mg de tert.-butyldiméthylsilyloxy-3a dihydroxy-7a,12a N-[hydroxy-12 55 oxo-6 aza-7 dodécyl]cholanamide-24, F. 145,5-148° C, répondant à la formule développée suivante:

ch,

°fcH,

ch, ch,

ch,

Si—O1'

conh- (chj )s-c0-nh- (ch2 )s-oh

CH3

ch,

On fait passer une solution de 424 mg de quinolyl-7 phosphate d'éthyle et de triéthylammonium dans 10 ml d'eau à travers 15 ml d'une résine de type acide sulfurique, sous forme pyridinium. On

641 569

10

concentre l'éluat sous pression réduite et on évapore trois fois de la pyridine anhydre du résidu. On ajoute au résidu 721 mg de l'alcool ci-dessus. On évapore trois fois de la pyridine anhydre du résidu. On dissout le résidu dans 1,0 ml de pyridine anhydre et on ajoute 364 mg de chlorure de trisisopropylbenzènesulfonyle cristallisé. 5

On agite le mélange réactionnel à la température ordinaire pendant 15 h. On ajoute de la glace et, après 0,5 h, on extrait le mélange par le chlorure de méthylène. On lave la solution dans le chlorure de méthylène avec une solution saturée de bicarbonate de sodium et une solution saturée de chlorure de sodium, puis on sèche io sur sulfate de magnésium anhydre. On évapore le solvant et on évapore du toluène plusieurs fois du résidu pour éliminer la pyridine. On ajoute le résidu à une colonne de 50 g de gel de silice et on lave la colonne avec 300 ml de méthanol à 5% dans le chlorure de méthylène et 1000 ml d'éthanol à 10% dans le chlorure de méthy- 15 lène. On chasse le solvant pour obtenir un composé de formule:

On dissout 40 mg de ce composé dans 2 ml d'acétone et 0,10 ml de diméthylformamide, puis on ajoute 40 (il de sulfate de diméthyle. On laisse le mélange réactionnel reposer à la température ordinaire pendant une nuit. On ajoute le mélange acétonique à de l'éther éthy- 30 lique et on centrifuge. On triture le précipité avec de l'éther éthyli-que pour obtenir le composé II de formule:

ch3oso3

On utilise le composé II pour mettre en évidence la modulation par un anticorps de l'inhibition et l'inversion par la cholylglycine (acide glycocholique). On produit chez le lapin un anticorps dirigé contre le conjugué cholylglycine/sérum albumine bovine (SAB) et on recueille le sérum de lapin selon des techniques classiques. On obtient la fraction d'IgG anticholylglycine par fractionnement au sulfate d'ammonium et Chromatographie par échange d'ions. On ne détermine pas la concentration de l'anticorps, mais on l'ajuste dans un ensemble de fractions de la colonne échangeuse d'ions pour obtenir la meilleure modulation de l'inhibition par le composé II. Dans une expérience témoin, de l'IgG antidigoxine purifiée comme l'IgG anticholylglycine n'a pas d'effet sur l'activité de l'inhibition, ce qui indique une fixation spécifique par le composé II. On effectue l'expérience avec un analyseur bichromatique modèle ABA-100 (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) avec les réglages suivants:

Filtre: 415/550 nm

Température: 30° C

Mode d'allure: ~

Zéro: 0,000

Etalonnage: 0,500

FRR: en service

Décalage: 2 min

Echelle de déplacement: 1

Rotation de l'élément tournant: 2 tours

Temps d'analyse: 5 min

Plaque de dilution: Zm

On place la solution de substrat et de tampon dans la seringue primaire de la plaque de dilution. Le tampon est constitué de phosphate de potassium 0,1 M à pH 7,0 contenant 0,1% de gélatine. Le substrat est constitué d'acétylthiocholine à la concentration de 5,0 x 10-4M avec du DTNB à la concentration de 1,6 x 10~4M comme indicateur. Le tableau suivant montre les composés réagissants contenus dans les godets d'échantillon. Dans tous les cas, la concentration en acétylcholinestérase (T. californica) est d'environ 2 x 10_10M et la concentration du composé II (inhibiteur) est de 10 x 10_7M. Lorsqu'on ajoute de la cholylglycine, sa concentration dans le godet d'échantillon est de 10~3M. Les godets d'échantillon contiennent du tampon phosphate de potassium 0,1 M à pH 7,0 additionné de 0,1 % de gélatine ainsi que les composés indiqués dans le tableau.

Variation de l'absorbance en 5 min en fonction du temps et des composants de la réaction.

Composants de la réaction

Temps d'incubation de l'inhibiteur enzymatique (min)

AAd/5 min

T = 0

T = 13

T = 25

T = 36

E seule

0,246

0,237

0,234

0,230

E + I

0,226

0,072

0,025

0,013

E + I + Ab

0,235

0,192

0,164

0,147

E + I + Ab + CG

0,224

0,078

0,032

0,017

E + Ab

0,224

0,225

0,218

0,215

E + Ab + CG

0,225

0,223

0,216

0,207

E + CG

0,236

0,228

0,220

0,211

E + I + CG

0,224

0,062

0,022

0,013

Tampon seul

0,001

0,003

0,001

0,002

E = acétylcholinestérase

I = composé II

CG = cholylglycine

Ab = anticorps anticonjugué cholylglycine/SAB

Exemple 3: Dans 100 ml de tétrahydrofuranne, on ajoute successivement

17,0 g d'acide N-tert.-butoxycarbonylamino-4 butyrique préparé selon le procédé de Moreder et coll., «Z. Physiol. Chem.», 357, 1651

11

641 569

(1976), 10,6 g de N-hydroxysuccinimide et 18,9 g de dicyclohexyl-carbodiimide. On agite ensuite le mélange pendant 2 h. On sépare par filtration la dicyclohexylurée produite et on ajoute au filtrat 11,1g d'amino-5 thia-3 pentanol-1 dans 150 ml de tétrahydrofu-ranne. Après 2,5 h d'agitation, on évapore le tétrahydrofuranne et s on soumet le résidu à un partage entre le chlorure de méthylène avec une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium, on sèche et on chasse le solvant pour obtenir une huile qui est le tert.-butoxycar-bamoyl-10 oxo-7 aza-6 thia-3 décanol de formule:

ch3 o

O

ch3-c-0-c-nh-(ch2)3-c-

ch,

-nh-ch2-ch2-s-ch2-ch2-oh

Sous une atmosphère inerte, on ajoute successivement 2,28 g de 15 ce composé, 1,45 g de diisopropyléthylamine et 1,8 g d'anhydride méthanesulfonique à 20 ml de chlorure de méthylène à 0° c. Après 20 min, on ajoute au mélange réactionnel 2,0 g de méthylphospho-nothioate de O-éthyle et 1,92 g de diisopropyléthylamine. On laisse la solution se réchauffer à la température ordinaire, puis on chauffe 20 à 45 " c pendant 1,5 h. On soumet la solution à un partage entre l'eau salée et le chlorure de méthylène et on lave successivement avec de l'acide chlorhydrique à 5% et une solution saturée de bicarbonate de sodium, puis on sèche sur sulfate de magnésium anhydre. On sépare par filtration le sulfate de magnésium et on évapore le solvant 25 pour obtenir une huile jaune qui est le méthylphosphonothioate de O-éthyle et de S-(tert.-butoxycarbamoyl-10 aza-6 oxo-7 thia-3 décyle) de formule:

ch3 o

O

o ch3-c-0-c-nh-(ch2)3-c-nh-ch2-i

CH3

-ch2-s-ch2-ch2-s-p-ch3

o-ch2-ch3 35

A la température ordinaire, on dissout 1,0 g de ce composé dans 4 ml d'acide trifluoroacétique à 50% dans le chlorure de méthylène et on agite le mélange pendant 10 min. On évapore le solvant sous pression réduite et on dissout le résidu dans un excès de benzène. On 40 chasse rapidement le benzène par distillation pour éliminer les traces d'acide trifluoroacétique. On dissout l'huile résiduelle dans 2 ml de diméthylformamide et on ajoute successivement 1,08 g de l'ester actif succinimidique de l'acide cholique et 37 mg d'hydroxybenzo-triazole. On ajuste le pH de la solution à 7,5 avec de la triéthyl- 45 amine. Après 6 h d'agitation, on chasse le solvant par évaporation sous pression réduite, puis on soumet le résidu à un partage entre l'eau salée et le chlorure de méthylène. On lave la fraction de chlorure de méthylène avec une solution saturée de bicarbonate de sodium et on sèche sur sulfate de magnésium anhydre. On sépare le 50 sulfate de magnésium par filtration et on chasse le solvant par évaporation pour obtenir le N-[aza-5 éthoxyméthylphosphynylthio-10 oxo-4 thia-8 décyl]trihydroxy-3cc,7a,12a 5ß-cholanamide-24 répondant à la formule:

0

s-p-ch3 o-ch„-ch

55

(III)

60

A. On estime de la façon suivante la constante de vitesse de l'inhibition de l'acétylcholinestérase par le composé III.

On utilise les réactifs suivants. 65

Tampon: on prépare les solutions de travail de tous les réactifs dans du tampon phosphate de sodium 0,1M à pH 7,0 contenant 0,1% de gélatine (phosphate/gel).

Solution de conjugué analogue de ligand/inhibiteur enzymatique irréversible: on prépare la solution de travail constituée d'une solution 6,7 x 10~6M du composé III dans du tampon phosphate/gel, par dilution d'une solution stock 0,067M du composé III dans le méthanol.

Acétylcholinestérase: on prépare une solution de travail à 100 unités d'acétylcholinestérase par millilitre dans du tampon phosphate/gel. Une unité d'activité enzymatique est par définition la quantité d'enzyme qui catalyse l'hydrolyse de 1 |tmol d'acétylcholine par minute à 25" C. Si l'on admet que l'indice de renouvellement est de 5 x 105 min- la concentration de l'enzyme dans cette solution est de 2 x 10_7M.

Substrat: dans chaque cas, on mesure l'activité enzymatique dans du tampon phosphate/gel 4,88 x 10~4M en acétylcholine et 1,56 x 10-4M en.DTNB.

Pour mesurer la constante de vitesse de pseudo-premier ordre de la réaction d'inhibition, on mélange 10 ni de la solution de travail du conjugué à 500 ni de tampon phosphate/gel. Au temps zéro, on ajoute 5 |il (0,5 unité) de solution d'acétylcholinestérase, on mélange par vortex et on incube à la température ordinaire. A des intervalles périodiques, on mesure la quantité d'activité enzymatique résiduelle par prélèvement d'une portion de 10 ni mélange de cette portion avec 1,0 ml de solution de substrat et mesure de la vitesse d'accroissement de l'absorbance à 410 nm (AA/At) avec un spectrophotomè-tre Varian Super Scan 3. On calcule la constante de vitesse de pseudo-premier ordre estimée (k](estj) selon l'équation suivante:

M(est.)

(AA/At)t2 _ —ln (AA/At)tt t2 -ti où t2 et tt sont les temps après l'addition de l'enzyme auxquels on mesure l'activité résiduelle (AA/At). Pour calculer ensuite la constante de vitesse de second ordre estimée de la réaction d'inhibition on divise k1(est j par la concentration du conjugué dans la réaction (1,3 x 10_7M). Les valeurs obtenues selon cette méthode figurent dans le tableau suivant.

Temps (min)

0,5 2,5 5,0

Activité (unités d'absorbance par minute)

9,45 xlO-4 6,87 xlO-4 4,87 xlO-4

Un graphique de l'activité — ln en fonction de t a une pente de 0,147 min-1 comme constante de vitesse de pseudo-premier ordre avec un coefficient de corrélation de 0,998. La constante de vitesse de second ordre apparante calculée est donc de 1,1 x 106 1-mol- ■•min- On peut également effectuer la mesure avec un spec-trophotomètre bichromatique.

B. On démontre de la façon suivante l'utilité de l'emploi de l'acétylcholinestérase et du composé III comme réactifs pour déterminer la concentration en cholylglycine.

On utilise les réactifs suivants.

Standards de cholylglycine (tampon): on prépare des solutions de cholylglycine dans du tampon phosphate de sodium 0,1 M à pH 7,0 contenant 0,1% de gélatine, à des concentrations de 10-3, 10~4, 10~5, 10-6 et 10~7M. On prépare les solutions standards à partir d'une solution stock de glycocholate de sodium 0,01 M dans l'eau.

Anticorps anticholylglycine: pour préparer la fraction d'IgG d'antisérum de lapin, on mélange des quantités égales d'une solution saturée de sulfate d'ammonium et de sérum. On centrifuge le précipité et on le dialyse contre du phosphate de potassium 0,02M à pH 8,0. On filtre ensuite le dialysat et on le Chromatographie sur une colonne de DEAE cellulose équilibrée dans du phosphate de potassium 0,02M à pH 8,0. Pour obtenir la solution de travail de l'anticorps, on regroupe les fractions appropriées choisies selon le profil d'élution. L'analyse Scatchard de cette solution indique deux catégories d'anticorps avec des constantes de fixation de 1 x 107 et

641 569

12

1 x 106M-1 et des capacités de fixation correspondantes de 2,2 xlO-6 et 3,2xl0-5M.

On prépare des solutions de composés III, d'acétylcholinestérase et de substrat comme précédemment décrit dans la partie A du présent exemple.

Pour mesurer la concentration de la cholylglycine dans le tampon phosphate/gel, on combine dans le godet d'échantillon de l'analyseur cinétique bichromatique 96 ni de tampon phosphate/gel, 20 ni de la solution appropriée de cholylglycine, 4 ni d'une solution 3,35 x 10-6M du composé III et 16 ni de la solution d'anticorps anticholylglycine. On ajoute les réactifs dans l'ordre indiqué. On ajoute ensuite 10 ni d'huile de silicone pour éviter l'évaporation. Après 5 min d'incubation à la température ordinaire, on met en marche l'analyseur cinétique bichromatique de façon que l'ensemble des godets d'échantillon tourne à la vitesse normale de 1 tr/5 min. Lorsque chaque godet d'échantillon arrive en position d'échantillonnage, on y prélève 4 ni (0,09 unité) que l'on ajoute dans la solution d'acétylcholinestérase. Les concentrations finales sont de 9,6 x 10~8M pour le composé III, 1,67 x 10~4 à 1,67 x 10-8M pour la cholylglycine et 5,7 x 10~ 10M pour l'acétylcholinestérase. Après une incubation de 12 min, on mesure l'importance de l'activité enzymatique résiduelle par introduction d'une portion de 10 ni dans la cuvette de l'analyseur cinétique bichromatique (37° C) et mélange avec 250 ni de solution de substrat. La dilution au Vze du contenu des godets d'échantillon a pour effet d'arrêter la réaction d'inhibition et de diluer l'enzyme dans une gamme de concentrations où l'on peut facilement mesurer son activité. L'activité enzymatique est indiquée par la différence entre les absorbances (Ad) observée en 5 min à 415 nm et 550 nm. Les résultats figurent dans le tableau suivant.

Cholylglycine (M)

1,67x10-1,67x10-1,67x10-1,67x10-

Cholylglycine dans

Cholylglycine dans le

le sérum godet d'échantillon

AAd/5 min

(M)

8,5 xlO-7

8,5xl0-8

0,733 ±0,032

l,8xl0-6

1,8 xlO-7

0,733±0,016

1,1 xlO-5

1,1x10-6

0,500 ±0,023

l,0xl0-4

l,0xl0-5

0,204 ±0,016

l,0xl0-3

l,0xl0-4

0,161+0,005

estérase du composé III. Les solutions de travail de tampon phosphate/gel, d'anticorps anticholylglycine, de composé III, d'acétylcholinestérase et de substrat sont les mêmes que celles utilisées en A 15 du présent exemple. Dans les godets d'échantillon de l'analyseur cinétique bichromatique, on ajoute dans l'ordre indiqué diverses quantités de tampon phosphate/gel, diverses quantités de solution d'anticorps (indiquées dans le tableau suivant), 2nl de solution du composé III et 10 ni d'huile de silicone pour éviter l'évaporation. 2o Après une incubation de 5 min à la température ordinaire, on ajoute 6nl (0,06 unité) d'acétylcholinestérase comme décrit en B du présent exemple. Le volume total des réactifs dans chaque godet d'échantillon est de 60 ni- Les concentrations finales sont de 1,1 x 10~7M pour le composé III et de 2 x 10~9M pour l'acétyl-25 cholinestérase. Les résultats figurent dans le tableau suivant.

AAd*l5 min

0,499 ±0,013 0,453 + 0,025 0,300+0,011 0,143+0,002 l,67xl0-4 0,103 ±0,001

* Ad comme défini dans le texte. Les valeurs sont la moyenne ± l'écart type. Chaque valeur correspond à une mesure en triple.

On détermine les concentrations en cholylglycine du sérum de façon semblable à celle décrite dans les exemples précédents. Pour effectuer cette expérience, on prépare des solutions standards de cholylglycine dans le sérum par dilution d'une solution aqueuse 0,01M de glycocholate de sodium dans du sérum humain normal, ayant une concentration endogène en cholylglycine de 7,7 x 10_7M, comme l'indique la détermination radio-immunologique (Kit CGRIA d'Abbott Laboratories). Les concentrations totales en cholylglycine des solutions dans le sérum figurent dans le tableau suivant. Toutes les autres solutions sont les mêmes que celles décrites en A et B ci-dessus, si ce n'est que la solution de substrats contient 1,0 mmol par litre de N-méthylorphénadrine pour inhiber la pseudo-cholinestérase sérique.

Aux godets d'échantillon de l'analyseur bichromatique, on ajoute dans l'ordre 39 ni de tampon phosphate/gel, 6(xl de la solution standard appropriée de cholylglycine dans le sérum humain normal, 2 ni d'une solution 3,35 x 10~âM du composé III, 8 ni de la solution d'anticorps anticholylglycine et 10 ni d'huile de silicone. Après 5 min d'incubation à température ordinaire, on ajoute 5 ni (0,05 unité) d'acétylcholinestérase comme décrit en B du présent exemple. Les concentrations finales sont de 1,1 x 10~7M pour le composé III, 8,5 x 10-8 à 1,0 x 10_3M pour la cholylglycine et 1,7 x 10_9M pour l'acétylcholinestérase. Après 12 min d'incubation à la température ordinaire, on mesure l'activité enzymatique résiduelle de chaque godet d'échantillon comme décrit en B du présent exemple. Les résultats figurent dans le tableau suivant.

(Tableau en tête de la colonne suivante)

C. On détermine de la façon suivante l'efficacité de l'anticorps anticholylglycine à moduler l'activité d'inhibition de l'acétylcholin-

30

35

Anticorps

Pourcentage du anticholylglycine

AAd/5 min signal de l'enzyme

(Ml)

non inhibée

0

0,095 ±0,004

8,5

2

0,480 ±0,027

43

4

0,706 ±0,084

63

6

0,856 ±0,048

77

8

0,919±0,018

82

10

0,890 ±0,040

80

12

0,899 ±0,020

80

40

Exemple 4:

A une solution de 5 g d'amino-6 hexanol dans 50 ml de chlorure de méthylène à 0' C, on ajoute goutte à goutte 9,3 g de dicarbonate de ditert.-butyle. On laisse la solution revenir à la température ordinaire et on agite pendant 17 h. On lave la solution avec de l'acide 45 citrique aqueux, du bicarbonate de sodium aqueux et on sèche sur sulfate de magnésium et on évapore le solvant pour obtenir une huile jaune. On purifie l'huile sur gel de silice avec du méthanol à 3% dans le chlorure de méthylène comme éluant pour obtenir le N-tert.-butoxycarbonylamino-6 hexanol répondant à la formule déve-50 loppée suivante:

ch3 o ch3

-oh

A 5,9 g de ce composé et 3,06 g de triéthylamine dans 50 ml de chlorure de méthylène, on ajoute 3,47 g de chlorure de méthanesul-fonyle. On agite la solution pendant 30 min et on la lave successive-60 ment avec de l'acide citrique aqueux et du bicarbonate de sodium aqueux, puis on la sèche sur sulfate de magnésium anhydre. On sépare par filtration le sulfate de magnésium, puis on chasse le solvant par évaporation pour obtenir le méthanesulfonate de N-tert.-butoxycarbonylamino-6 hexyle. On ajoute 6,2 g de ce produit 65 que l'on n'a pas purifié dans 10 ml de diméthylformamide à une solution de 2,5 g de P-mercaptoéthanol dans 60 ml de diméthylformamide anhydre contenant 3,5 g de tert.-butylate de potassium. On agite le mélange pendant 17 h à la température ordinaire. On verse le

13

641 569

mélange réactionnel dans de l'eau et on extrait par le chlorure de méthylène. On lave l'extrait organique avec trois portions de 100 ml d'eau et on sèche sur sulfate de magnésium anhydre. On sépare le sulfate de magnésium par filtration et on chasse le solvant par éva-poration. On purifie l'huile résiduelle par Chromatographie sur gel de silice avec comme éluant du méthanol à 5% dans le chlorure de méthylène pour obtenir le N-tert.-butoxycarbonyl amino-9 thia-3 nonanol-1, répondant à la formule:

O

II

t-butyl - O - C - NH(CH2)6 - S - (CH2)2 - OH

On refroidit à 0° C une solution de 2 g de ce produit et 1,4 g de diisopropyléthylamine dans 20 ml de chlorure de méthylène et on ajoute 1,64 g d'anhydride méthanesulfonique. Après 30 min, on ajoute 1,86 g de diisopropyléthylamine et 2,0 g d'acide O-éthyl-méthylphosphonothioïque en maintenant le mélange réactionnel à 0: C. On laisse la solution revenir à la température ordinaire en 30 min, puis on la porte à reflux pendant 2,5 h. Après refroidissement à la température ambiante du produit dans le chlorure de méthylène, on le lave avec du bicarbonate de sodium aqueux et on sèche sur sulfate de magnésium anhydre. On sépare par filtration le sulfate de magnésium et on chasse le solvant par évaporation sous ' pression réduite. On purifie le produit brut par Chromatographie sur colonne avec comme éluant du méthanol à 1 % dans le chlorure de méthylène pour obtenir le méthylphosphonothioate de O-éthyle et de S-[(N-tert.-butoxycarbonylamino)-9 thia-3 nonyle] répondant à la formule développée suivante: ,

O P /

Il II /

t-butoxy - C - NH - (CH2)6 — S—(CH2)2 —S—P—CH3/

I / och2//ch3

On agite 250 mg de ce composé dans un mélange 2/fde chlorure de méthylène et d'acide trifluoroacétique pendant 1 h à la température ordinaire. On chasse le solvant par évaporation sous pression réduite. On dissout le sel obtenu dans 6 ml de dioxanne et on ajoute 320 mg de diisopropyléthylamine. On ajoute ensuite 620 mg de l'ester N-hydroxysuccinimidique de la N-acétyl L-thyroxine et on agite le mélange pendant 16 h. On verse le mélange réactionnel dans 50 ml de chlorure de méthylène et on lave successivement avec de l'acide citrique aqueux et du bicarbonate de sodium aqueux. On sèche la solution sur sulfate de magnésium anhydre. On élimine le sulfate de magnésium par filtration et on chasse le solvant par évaporation sous pression réduite. On Chromatographie l'huile résiduelle sur du gel de silice avec comme éluant du méthanol à 1 %

dans le chlorure de méthylène. Après recristallisation dans l'acétoni-trile, on obtient le N-(éthoxyméthylphosphinylthio-9 thia-7 nonyl) Na-acétylthyroxinamide répondant à la formule développée suivante:

o t\ tv "

x \nh-c-ch3 o

//<:h2-°,-°-nh-(ch2)6"s"(ch2)2"s"^"ch3 (lv)

/ l/ ° ô-CH2-CH3

A une solution de 50 mg de ce composé dans 1,5 ml de chlorure de méthylène, on ajoute 10,7 mg de fluorosulfonate de méthyle. Il se forme un solide en 2,5 h. On décante le solvant et on triture le précipité avec de l'éther anhydre pour obtenir une poudre qui est le sel de sulfonium de formule:

o

I v 1^ "

x nh-c-chj ch3 o

H<^G^S^2-™-S-NH-(CH2)6t2-(CH2)2-STCH3 (V)

fso3"

La constante de vitesse du composé V déterminée selon le procédé décrit en A de l'exemple III est la suivante:

Courbe standard de la thyroxine établie avec le composé V

Constante de vitesse de second Concentration en inhibiteur ordre l-moh'-min*1

1,0 xlO8 5,0 x 10~9M

Composé V

Réactifs:

A. Ce réactif contient 0,1 unité/ml (1,4 x 10~10M) d'acétylcholinestérase (E. electricus) et 1 x 10~8M d'anticorps IgG antithy-roxine, purifié comme précédemment décrit, dans du tampon phosphate 0,1 M à pH 7,0 contenant 0,1 % de gélatine et 1,0 mmol en N-méthylorphénadrine et 0,25 mmol en acide anilino-8 naphtalènesul-fonique.

B. Le réactif constituant le substrat est du tampon phosphate 0,1 M à pH 7,0 ayant une concentration de 1,0 mmol en acétylthio-choline et de 0,32 mmol en DTNB.

C. On prépare une solution de travail ayant une concentration de 2,5 x 10_7M en composé V dans du tampon phosphate/gel 0,1M.

On effectue la détermination par mélange de 5 ni de sérum contenant diverses quantités de thyroxine et 250 p.1 de réactif A. On incube les mélanges pendant 5 min à 37° C. On ajoute 10 ni de réactif C et 250 ni de réactif B. On effectue la lecture après des intervalles de 5 min avec un analyseur bichromatique muni d'un jeu de filtres 415/550 nm.

Courbe standard pour le sérum

Concentration initiale de la AAd/5 min (415/550 nm)

tyroxine dans le sérum (M)

0,6xl0-8 0,980

2,6xl0-8 0,927

5,2x 10-8 0,902

l,0xl0-7 0,793

2,1 x 10-7 0,599

3,1 x10-7 0,578

On détermine la concentration d'échantillons inconnus à partir de la courbe standard.

On détermine la constante de vitesse du composé IV selon le procédé décrit en A de l'exemple 3.

Composé IV

Constante de vitesse de second Concentration en inhibiteur ordre l-moh Lmin~1

3,5 x10e 2,5 x 10_8M

On prépare une courbe standard pour la détermination de la thyroxine dans le sérum avec le composé IV selon une modification du mode opératoire décrit pour le composé V.

Réactif A : Il est constitué de tampon phosphate/gel à pH 7,0 ayant une concentration de 1 mmol en N-méthylorphénadrine et contenant 7 mg/ml de salicylate de sodium. L'activité cholinestérasi-que est de 0,07 unité/ml (7 x 10-l'M) et la concentration en anticorps antithyroxine est de 1,4 x 10-8M, cette concentration étant exprimée en fonction des sites de fixation.

Réactif B: C'est le même que le réactif B ci-dessus.

Réactif C: C'est une solution de travail 5 x 10_7M en composé IV dans le tampon phosphate/gel 0,1 M.

Pour effectuer la détermination, on utilise 10 ni de sérum mélangé à 250 ni de réactif A et 10 ni de réactif C. On incube le mélange pendant 10 min à 37 C avant d'ajouter 250 ni de réactif B. La courbe standard pour la détermination d'échantillons inconnus est la suivante:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

641 569

14

Concentration initiale de la

AAd/5 min thyroxine dans le sérum (M)

0

0,646

5x10-«

0,588

1,5x10-7

0,525

3,1x10-7

0,480

5x10-7

0,518

1 x 10-6

0,484

5x10-6

0,426

ïh-c-ch,

ch2-ch-jj:-nh-ch2-ç-nh-

<fH2>6

O o

Il II

t-butyl—O—C—NH—CH2—C —NH—(CH2)6 ■

I

O—CH,—CH,

O

(ch2)2

0= ?-CH,

o-ch2-ch3

Exemple 5:

On reprend le mode opératoire de l'exemple 4 en remplaçant l'amino-6 hexanol respectivement par l'amino-4 butanol, l'amino-5 thia-3 pentanol et le N-glycyl amino-6 hexanol-1 pour obtenir: le N-tert.-butoxycarbonylamino-4 butanol-1

O

II

t-butyl—O—C—NH—(CH2)4—OH

20

le N-tert.-butoxycarbonylamino-5 thia-3 pentanol-1 O

II

t-butyl—O — C—NH—(CH2)2—S—(CH2)2—OH, et ^

le N-[N'-tert.-butoxycarbonylglycylamino-6 hexanol-1

O O

Il II

t-butyl - O - C - NH - CH2 - C - NH - (CH2)6 - OH 3o et on fait réagir ces alcools avec le chlorure de méthanesulfonyle, le p-mercaptoéthanol, l'anhydride méthanesulfonique et l'acide O-éthylméthylphosphonothioïque, comme il convient, pour obtenir des chaînes inhibitrices de couplage répondant aux formules: 35

O O

Il II

t-butyl - O - C - NH - (CH2)4—S - (CH2)2 — S — P — CH3

I

0-CH2-CH3 40

O O

Il II

t-butyl - O - C - NH - (CH2)2 - S - (CH2)2 - S - P - CH3

et le sel de sulfonyle correspondant (composé VI). Ces composés ont respectivement des constantes de vitesse de second ordre de 2,5 x 106 et 1,7 x 109 l-mol-'-min-1 à des concentrations en inhibiteur respectives de 5 x 10-8 et 2,5 x 10-11M.

HO

|H-C-CH3 j) -CH-C-NH-CH.-C-

ch3oso3

CH2 "jf"NH"CH2"C"NH" (CH2) 6 (|H2J 2

+

i

(VI)

0=P-CH,

OCH2-CH3

45

—s—(ch2)2—s—p—ch3

I 50

o-ch2-ch3

Sinon, on utilise l'acide O-butylméthylphosphonothioïque pour obtenir des composés tels que:

55

O

II

t-butyl - O - C - NH - (CH2)6 - S - (CH2)2 -

O

Il 60

-s-p-ch3

och2-ch2-ch2-ch3

On débloque ces agents intermédiaires et on les fait réagir avec l'ester N-hydroxysuccinimidique de la N-acétyl L-thyroxine pour 65 obtenir des conjugués tels que le N-[(éthoxyméthylphosphinylthio)-12 thia-10 aza-3 oxo-2 dodécyl] N°-acétylthyroxinamide répondant à la formule suivante:

Exemple 6:

On fait réagir une solution de 32 g de N-benzyloxycarbonyloxy-succinimide dans 100 ml de têtrahydrofuranne avec 15 g d'amino-6 hexanol-1 dans 30 ml d'un mélange en parties égales de méthanol et de têtrahydrofuranne. On agite le mélange réactionnel pendant une nuit à la température ordinaire, puis on le verse dans de l'eau. On extrait le mélange obtenu avec du chlorure de méthylène, on lave la couche organique avec une solution de chlorure de sodium, on sèche sur sulfate de magnésium anhydre, puis on sépare par filtration le sulfate de magnésium et on chasse le solvant par évaporation. On recristallise le produit dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther pour obtenir le N-benzyloxycarbonylamino-6 hexanol-1, F. 81,5-83' C répondant à la formule suivante:

o

:h2-o-c-nh-(ch2)6-oh

A 21 g de ce composé dans 100 ml de pyridine anhydre, on ajoute 10,53 g de chlorure de méthanesulfonyle entre 0 et 5° C. On verse le mélange réactionnel dans l'eau froide et on extrait par l'éther. On lave la solution éthérée, on la sèche et on chasse le solvant pour obtenir le méthanesulfonate de N-benzyloxycarbonylamino-6 hexyle sous la forme d'un solide cireux.

A une solution de 7,8 g de P-mercaptoéthanol dans 50 ml de di-méthylformamide, on ajoute 5,15 g de mêthylate de sodium en refroidissant au bain-marie glacé. On ajoute la totalité du méthanesulfonate N-benzyloxycarbonylamino-6 hexyle obtenu ci-dessus dans 150 ml de diméthylformamide à la solution de P-mercaptoéthanol dans une atmosphère inerte à 0° C. On agite le mélange pendant 2 h à la température ordinaire et on verse dans une solution de chlorure de sodium.

On extrait par le chlorure de méthylène, on lave et on sèche la couche de chlorure de méthylène, puis on évapore le chlorure de méthylène, on lave et on sèche la couche de chlorure de méthylène, puis on évapore le chlorure de méthylène pour obtenir un solide. On recristallise dans l'acétate de méthyle pour obtenir le N-benzyloxycar-bonylamino-9 thia-3 nonanol-1. On place dans un appareil d'hydrogénation de Parr une solution de 9,5 g de ce composé dans 160 ml de méthanol contenant 1,1 Eq d'acide chlorhydrique concentré et 9,5 g de noir de palladium. Après 3 h, on sépare le catalyseur par filtration et on chasse le méthanol pour obtenir le chlorhydrate d'amino-9 thia-3 nonanol-1, F. 69-72' C.

A une solution de 3,49 mg d'acétoxy-12 chloroformyloxy-3 hydroxy-14 cardénolide-20(22) (brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3981982) dans 60 ml de têtrahydrofuranne, on ajoute 829 mg de

15

641 569

N-hydroxysuccinimide et 0,988 ml de triéthylamine à 0° C. Après 3 h d'agitation à 0° C, on sépare par filtration le chlorhydrate de triéthylamine solide et on ajoute au filtrat une solution de 1,5 g de chlorhydrate d'amino-9 thia-3 nonanol-1 et 0,97 ml de triéthylamine dans 6,5 ml de méthanol. On agite le mélange obtenu pendant 1 h à la température ordinaire, puis on évapore partiellement sous pression réduite. On dilue le résidu avec une solution aqueuse de chlorure de sodium et on extrait par le chlorure de méthylène. On lave la phase organique, on sèche et on évapore le solvant pour obtenir un liquide visqueux. On Chromatographie sur gel de silice avec du méthanol à 2-4% dans le chlorure de méthylène pour obtenir l'acétoxy-12 [N-(hydroxy-9 thia-7 nonyl)carbamoyloxy]-3 hydroxy-14 cardé-nolide-20(22).

A une solution de 2 g de ce composé dans 15 ml de méthanol, on ajoute 430 mg de carbonate de potassium anhydre pulvérisé. Après 35 min d'agitation à la température ordinaire, on dilue le mélange réactionnel avec un excès de chloroforme, on filtre sur célite et on évapore partiellement le solvant sous pression réduite. On dissout le résidu dans le chlorure de méthylène, on lave successivement avec des solutions d'acide chlorhydrique 0,1N et de chlorure de sodium, et on sèche sur le sulfate de magnésium anhydre. On sépare par filtration le sulfate de magnésium et on évapore le solvant pour obtenir un produit brut. On Chromatographie sur gel de silice avec un mélange de méthanol et de chlorure de méthylène comme éluant pour obtenir le [N-(hydroxy-9 thia-7 nonyl)carbamoyloxy]-3 dihydr-oxy-12,14 cardénolide-20(22).

A une solution de 0,725 g de cette matière dans 3 ml de têtrahydrofuranne anhydre, on ajoute successivement 0,265 ml d'éthyldiiso-propylamine et 0,265 g d'anhydride méthanesulfonique dans 0,75 ml de têtrahydrofuranne à —20° C. Après agitation à —10° C pendant 35 min, on ajoute au mélange une solution de 0,784 g de O-éthyl-méthylphosphonothioate de dicyclohexylammonium dans 2 ml de chlorure de méthylène. On agite pendant 5 h à la température ordinaire, puis on soumet le mélange réactionnel à un partage entre le chlorure de méthylène et l'acide chlorhydrique dilué. On lave la phase organique avec une solution de chlorure de sodium, on sèche et on évapore le solvant pour obtenir un produit brut. Par Chromatographie sur gel de silice avec comme éluant du méthanol à 2,5-5% dans le chlorure de méthylène, on obtient le [N-(éthoxyméthylphos-phinylthio-9 thia-7 nonyl)carbamoyloxy]-3 dihydro-12,14 cardén-olide-20(22) répondant à la formule développée suivante:

ho oh o

• o u

xnh-(ch2 ) 6-s-ch2-ch2-s-p-ch3

o-ch2-ch3

On traite un mélange de 25 mg de ce composé avec 0,5 ml d'iodure de méthyle et plusieurs gouttes de chlorure de méthylène. Après 3 d de repos à l'obscurité, on chasse le solvant par évaporation pour obtenir l'iodure de méthylsulfonium correspondant (composé VII) répondant à la formule:

ch.

oh v 4* "

hh-(chj)g-s-ch2-ch2-s-p-chj ch3 o-ch2-ch3

On reprend essentiellement les modes opératoires décrits dans l'exemple 3 pour préparer une courbe standard de détermination dans le sérum à partir du composé VII. On utilise les standards de digoxine de coffrets de détermination radio-immunologique du commerce contenant 0, 1, 2 et 4 ng/ml de digoxine. La concentration finale en anticorps antidigoxine est de 0,2 x 10~9M; on utilise dans le mélange de la réaction immunologique et le mélange servant de substrat la N-méthylorphénadrine 2,5 x 10~3 et 1 x 10~3M, respectivement, pour bloquer la pseudo-cholinestérase sérique. Les résultats de la détermination de la courbe standard sont les suivants:

Standards de digoxine AAd/5 min

0 0,639

0,5 ng/ml 0,614

1,0 ng/ml 0,583

2,0 ng/ml 0,527

4,0 ng/ml 0,462

A partir de cette courbe standard, on peut déterminer des teneurs de digoxine dans des échantillons de sérum.

Exemple 7:

On fait réagir goutte à goutte une solution de 31,5 g de l'ester N-hydroxysuccinimidique de la N-benzyloxycarbonylglycine [«J. Am. Chem. Soc.», 86, 1839 (1964)] dans 100 ml de têtrahydrofuranne avec 12 g d'amino-6 hexanol-1 dans 50 ml de méthanol à 50% dans le têtrahydrofuranne. On agite le mélange réactionnel pendant 12 h à 23: C, puis on le verse dans de l'eau. On lave à fond à l'eau le précipité obtenu, on filtre et on sèche pour obtenir du N-benzyloxy-carbonylglycylamino-6 hexanol-1 brut. Le composé pur recristallisé dans l'acétate d'éthyle a un point de fusion de 104-105° C.

On refroidit dans un bain-marie glacé une solution de 15 g de ce composé dans 70 ml de pyridine et on ajoute en 5 min 4,17 ml de chlorure de méthanesulfonyle froid. Après 2 h d'agitation entre 0 et 5° C, on verse le mélange réactionnel dans de l'eau glacée et on recueille par filtration le précipité formé. On recristallise le solide dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'hexane pour obtenir le méthane-sulfonate de N-benzyloxycarbonylglycylamino-6 hexyle, F. 82-83° C.

On ajoute une solution de 16,5 g de ce composé dans 75 ml de diméthylformamide à une solution froide de 4,0 g de P-mercaptoéthanol dans 25 ml de diméthylformamide contenant 2,65 g de méthylate de sodium dans une atmosphère inerte. On agite le mélange réactionnel pendant 2 h à la température ordinaire et on le verse dans une solution de chlorure de sodium. On extrait cette solution avec du chlorure de méthylène et on traite de façon habituelle par lavage, séchage et évaporation, pour obtenir le N-benzyloxycar-bonylglycylamino-9 thia-3 nonanol-1. On recristallise dans l'acétate d'éthyle pour obtenir le composé pur fondant à 99-100° C.

On traite une solution de 1,15 g de cet alcool dans 7 ml de chloroforme avec 0,387 g de chlorure de thionyle. On agite le mélange pendant 1,5 h à la température ordinaire et on évapore les matières volatiles sous pression réduite. On ajoute une solution de 1,04 g du solide résiduel dans 3 ml de diméthylformamide à une solution de O-éthylméthylphosphonothioate de sodium (préparé à partir de 2,69 mmol d'hydrure de sodium et 0,377 g d'acide O-éthylméthyl-phosphonothioïque) dans 1 ml de diméthylformamide. Après 16 h d'agitation à 60° C, on verse le mélange dans une solution de chlorure de sodium et on extrait par le chlorure de méthylène. On lave la phase organique, on sèche et on chasse le solvant pour obtenir une huile. On Chromatographie sur gel de silice avec du méthanol à 2-4% dans le chlorure de méthylène pour obtenir le méthylphospho-nothioate de O-éthyle et de S-(N-benzyloxycarbonylglycylamino-9 thia-3 nonyle) ayant la formule développée suivante: oo o

/ ch2-0-c-nh-ch2-c-nh(ch2)6-s-ch2"ch2-s-p-ch3 o-chj-chj

On hydrogène dans un appareil de Parr pendant 2 h une solution de 6 g de N-benzyloxycarbonylglycylamino-9 thia-3 nonanol-1 dans

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

641 569

16

100 ml de méthanol contenant 1,1 Eq d'acide chlorhydrique concentré et 6 g de noir de palladium. On sépare par filtration le catalyseur au palladium et on évapore le solvant pour obtenir le chlorhydrate de N-glycylamino-9 thia-3 nonanol-1 répondant à la formule:

HCl • H2N - CH2 - CO - NH - (CH2)6 - S - CH2 - CH2 - OH

A une suspension agitée de 5 g de diphénylhydantoïne sodique dans 35 ml de diméthylformamide anhydre, on ajoute 3,04 g de bro-moacétate d'éthyle. On agite le mélange pendant 3 h à la température ordinaire et on évapore le diméthylformamide sous pression réduite. On soumet le résidu à un partage entre du chlorure de méthylène et une solution de chlorure de sodium. On lave la phase organique, on sèche et on chasse le solvant pour obtenir le dérivé N-alkylé de la diphénylhydantoïne, F. 179-180° C. A 4,5 g de ce composé dans 50 ml de têtrahydrofuranne, on ajoute 2,17 g d'hy-droxyde de potassium dans 15 ml d'eau. On agite le mélange pendant 12 h et on chasse le solvant sous pression réduite. On dilue le résidu avec 35 ml d'eau et on extrait la solution aqueuse avec de l'éther. On acidifie la solution aqueuse avec de l'acide chlorhydrique 6N pour précipiter l'acide N-diphénylhydantoïnyl-2 acétique.

A une solution de 1,25 g de ce composé de 0,500 g de N-hydroxysuccinimide dans 5 ml de têtrahydrofuranne à 40% dans le diméthylformamide, on ajoute 0,906 g de dicyclohexylcarbodiimide et on refroidit la réaction. Après 3 h d'agitation à la température ordinaire, on sépare par filtration la dicyclohexylurée et on ajoute au filtrat 1,09 g de chlorhydrate de N-glycylamino-9 thia-3 nonanol-1 et 0,41 g de triéthylamine. On agite le mélange réactionnel pendant 12 h à la température ordinaire, puis on soumet à un partage entre le chlorure de méthylène et une solution saturée de chlorure de sodium. On lave la couche organique, on la sèche et on évapore le solvant pour obtenir une huile. Par Chromatographie sur gel de silice, on obtient le [(N-diphénylhydantoïnyl)-2 acétamido]-12 oxo-11 aza-10 thia-3 dodécanol-1, ayant la formule développée suivante:

Nffl, -C-NH-CH. -C-NH- (CH, ),-S-CH„ -CH, -OH

On fait réagir ce composé avec du O-éthylméthylphosphono-thioate de sodium selon les procédés précédemment décrits dans le présent exemple, pour obtenir le méthylphosphonothioate de O-éthyl et de S-{[(N-diphénylhydantoïnyl)-2 acétamido]-12 oxo-11 aza-10 thia-3 dodécyle} répondant à la formule développée suivante:

\ «v. M It If f XH, -C-NH-CH, -C-NH- (CH, ) , -S - (CH, ), -S -P-CH.

"2 " "" v°"2 6 2 2,2 (VIII) och2CH3

On chauffe à 65-70° C une solution de 0,512 g de ce composé et 0,119 g de sulfate de diméthyle dans 1 ml de têtrahydrofuranne dans une atmosphère inerte. On chasse le solvant sous pression réduite. On reprend le résidu dans le chloroforme et on ajoute de l'éther éthylique pour obtenir un précipité de méthylsulfate de méthylphosphonothioate de O-éthyle et de S-{[(N-diphénylhydantoïnyl)-2 acét-amido]-12 oxo-11 aza-10 thia-3 dodécyle} répondant à la formule:

h vL 00 CHj 0

/ CH2-C-NH-CH2-C-NH-(CH2)6-S-CHz-CH2-S-P-CH3

+ Ô-CHj-CHJ

CH OSO,"

(IX) 3 3

Les composés VIII et IX ont des constantes de vitesse de second ordre en ce qui concerne l'inhibition de l'acétylcholinestérase, déterminées selon les procédés précédemment décrits, respectivement de 6,8x 10s l-mol_1-min-1 et 1,4 x 109 l-mol_1*min_1. Cette inhibition est modulée par un anticorps antidilantin. Une courbe standard typique dans un tampon correspondant au composé IX a les valeurs suivantes:

Concentration en dilantin AmAd/5 min (mol/l)

0 83,5

10-7 74,1

10-6 62,5

IO-5 47,2

Exemple 8:

Selon les modes opératoires de l'exemple 7, avec du bromo-4 butyrate d'éthyle, on prépare l'acide (N-diphénylhydantoïnyl)-4 butyrique, F. 147-148° C.

On condense 15,88 g de l'ester de N-hydroxynorbornène-5 dicarboximide-2,3 de la N-carbobenzyloxy ß-alanine [«Chem. Pharm. Bull.», 22,1857 (1974)] avec 5 g d'amino-5 thia-3 pentanol-1 selon les modes opératoires précédemment décrits pour obtenir le benzyloxycarbamido-9 oxo-7 aza-6 thia-3 nonanol-1, F. 99-101° C. On hydrogène ce composé pour obtenir le chlorhydrate d'amino-9 oxo-7 aza-6 thia-3 nonanol-1.

hc1nh2-ch2-ch2-c0-nh-ch2

-ch2-s-ch2-ch2-oh

On condense ce composé avec l'acide (N-diphénylhydantoïnyl)-4 butyrique selon les techniques précédemment décrites et on fait réagir le produit avec le O-éthylméthylphosphonothioate de sodium pour obtenir un conjugué de formule:

(CH2)3-C-HH-(CH2)2-C-NH-(CH2)2-S-(CH2)2-S-P

O-CHj-CHJ

(X)

Le conjugué X a une constante de vitesse de second ordre en ce qui concerne l'inhibition de l'acétylcholinestérase de 2,2 x 106 1-mol- '-min-l. Cette inhibition est modulée par la présence d'anticorps antidilantin. On peut préparer une courbe standard pour permettre la détermination du dilantin dans des échantillons de sérum.

Exemple 9:

A 204 mg de méthylphosphonothioate de O-éthyle et de S-[(tert.-butoxycarbonylamino)-5 thia-3 pentyle], on ajoute 20 ml d'un mélange en parties égales de chlorure de méthylène et d'acide trifluoroacétique et on agite à la température ordinaire pendant 1 h. On évapore le solvant et on forme un azéotrope avec le toluène pour éliminer l'acide trifluoroacétique résiduel. On dissout le résidu dans 2,0 ml de diméthylformamide et on ajoute 83 (il de triéthylamine, 140 mg d'acide (théophyllinyl-3)-6 hexanoïque, préparé selon le procédé de W. Traube, «Ber.», 36, 3035 (1900), 140 mg d'hydroxybenzotriazole, 113 mg de dicyclohexylcarbodiimide et 1 ml de diméthylformamide. On agite le mélange réactionnel à la température ordinaire pendant 6 h et on chasse le solvant par évaporation sous pression réduite. On dissout le résidu dans le chlorure de méthylène, on lave successivement avec du bicarbonate de sodium et du chlorure de sodium saturé et on sèche sur sulfate de magnésium anhydre. On élimine le sulfate de magnésium par filtration et on chasse le solvant par évaporation. On purifie le résidu par Chromatographie sur gel de silice avec du méthanol à 10% dans le chlorure de méthylène comme éluant pour obtenir le N-{[(éthoxy-méthylphosphinylthio)-2 éthylthio]-2 éthyl} méthyl-1 dioxo-2,6 té-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

17

641 569

trahydro-1,2,3,6 7H-purinyl-3 hexanamide, F. 103-106° C répondant à la formule suivante:

CH. O

2)5~c"nh~ch2"ch2"s"ch2"ch2"s"p"ch3

Ö O-CHj-CHJ

Ce composé a une constante de vitesse de second ordre relative à l'inhibition de l'acétylcholinestérase de 5,5 x 106 l-mol-'-min-1. Cette inhibition est modulée par un anticorps antithéophylline. On utilise ce composé pour déterminer la théophylline dans le sérum sanguin selon les procédés précédemment décrits.

Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention.

Claims

641 569

2

REVENDICATIONS

1. Procédé pour déterminer des ligands dans des échantillons à analyser, caractérisé en ce qu'il consiste à mélanger avec l'échantillon à analyser un conjugué analogue de ligand/inhibiteur enzymati-que irréversible et une protéine fixante pouvant se fixer au ligand et au conjugué analogue de ligand/inhibiteur enzymatique irréversible, et en ce que la quantité de conjugué analogue de ligand/inhibiteur enzymatique irréversible fixée par la protéine fixante est en relation avec la quantité de ligand dans l'échantillon à analyser, cette protéine fixante inactivant l'inhibiteur enzymatique irréversible lorsqu'elle est fixée à la portion d'analogue de ligand du conjugué; à mélanger un enzyme qui est inhibé de façon irréversible par le conjugué analogue de ligand/inhibiteur enzymatique irréversible non fixé par la protéine fixante; à mélanger un substrat de l'enzyme et à suivre la réaction entre l'enzyme et le substrat.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme est l'acétylcholinestérase et l'inhibiteur enzymatique irréversible est un inhibiteur enzymatique organophosphoré qui réagit avec l'acétylcholinestérase pour former des liaisons covalentes.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on traite l'échantillon à analyser qui est un échantillon de sérum, de façon à inactiver ou à éliminer la cholinestérase sérique.
4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le substrat de l'enzyme est l'acétylthiocholine, et en ce qu'on suit la réaction entre l'enzyme et le substrat par mesure spectrophotomêtrique de la réaction de la thiocholine avec le dithio-5,5' bis(acide nitro-2 benzoïque).
5. Réactif analytique pour la mise en œuvre du procédé selon la revendicaiton 1, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un conjugué analogue de ligand/inhibiteur enzymatique irréversible.
6. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'inhibiteur enzymatique irréversible est un inhibiteur enzymatique irréversible organophosphoré de l'acétylcholinestérase.
7. Réactifs analytiques selon la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule:

0 O

Il II

R' - P - S - CH2 - CH2 - B' - (CH2)n - NH - C - haptène

1

0

1

R"

où n a une valeur de 2 à 8, R' et R" représentent chacun un radical alkyle comportant 1 à 10 atomes de carbone et B' représente — S— ou le sel de sulfonium correspondant.
8. Composés selon la revendication 7, caractérisés en ce que R' et R" représentent un radical alkyle comportant 1 à 4 atomes de carbone et n a une valeur de 2 à 6.
9. Réactifs analytiques, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule:

ÌfY\ »

-NR-C0~(CHo) -NH-C-haptène + t 2 n z n H

H, O-R"' O

13

:=o

çj ch3-|»-s-ch2-ch2-^- (ch2) g-nh-c-dh-ch.

? # Il ch3-p-sch2ch2-s-ch2-ch2-nh-c- (ch2) 3-nh-c-c hjj-chj-ch r . s fH3

HO^CH-j ch och2ch3
12. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce 10 qu'il répond à la formule: ~

ï II

ch3-j>-s-ch2ch2-s-(ch2)g-nh-fc-ch2nh-fc-ch2- w och2ch3 ch3

ch30s03
13. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule: 0

„ts

î - i?

ch3-p-s-ch2ch2-^-(ch2)g-nh-c-o- oh och2ch3 ch3

i"
14. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule:

ff 0 v/*3

ch3~f~s"ch2ch2~s"ch2ch2"nh"^"{ch2) 5—^>* 0

och2ch3
15. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce 35 qu'il répond à la formule:

c0^ra-tCH,>k-conh-(cb2)s-0-p-o—iocî^

. , V 1 WC3Ä3

ho-i

~ ~ V

ch3-0s03
16. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce

« qu'il répond à la formule:

O

V

55

O

s-p-0-c4h9

Ìh,

où R'" représente un radical alkyle comportant 1 à 10 atomes de carbone, n a une valeur de 2 à 8 et L~ est un ion complémentaire biologiquement compatible.
10. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule:
17. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule:

O

och2ch3

ch30s03

1 i
11. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule:

O

s—I-o-ch2-ch3 ^h3 c2h5

641 569
18. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule:

çooh

H2ii^nyN«S T

H^JvN^--CH2NH-^O^-C0NHCH

o ^

conh (ch2) 4s—-^s-f-ocjhg oh s i

I

ch?-ch-c;

nh (ch2 ) g-s- (ch2 ) 2-s-j>-ch3

o-c4h9

r
25. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule:
19. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce [Gentamicine (radical amino)] q qu'il répond à la formule: ||

- coch2ch2conhch2ch2sch2ch2 - s - p - ch3

oc2h5

h2n ch,

çooh

'^h 2n- ^o^-conhçh nh-

(çh2)2

onh(ch2)4s-

'S-,-OC2H5 CH,
20. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule:

20
26. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule:

[Tobramiclne (radical amlno3-<^0

ch-I 2

?H2

CONHCH2CH2SCH2CH2SP-CH3 2HS

25 27. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule:

? 5

(Vitamine B12 )-0 -CNH- (CHj) g^-v^-S-^-OCjHg

CH,

30
28. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule:

O

s-p-oc2h5
21. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce 35 qu'il répond à la formule:

<p02H

ch-ch2ch2ch2nh<^0

i-£>og>

OH'

CH3"C"Î1" p ch2-ûh-cnh-(ch2)g-^-(ch2>2-s-|-ch3 ch, 0_c4h9

I

<fH2

çh,

<rH2

ch-

îc fl ?

âN/^S-^-CH3

oc2h5
22. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule:

fs03
29. Réactif analytique selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il répond à la formule:

j nh-c-c

-ch,
;h.

H0_V_^~0\_^ch2"ch"c"nh" (ch2) 6"è" (ch2) 2~s~^~ch3 1 O Ih

CHj-CHJ

50

fso-

/C2H5

_ P-OC,Hc

I 2 5

ch3 55