JPH0737982B2 - 抗胆汁酸抗体およびこれを用いた糞便中の胆汁酸検査方法 - Google Patents
抗胆汁酸抗体およびこれを用いた糞便中の胆汁酸検査方法Info
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- JPH0737982B2 JPH0737982B2 JP4361661A JP36166192A JPH0737982B2 JP H0737982 B2 JPH0737982 B2 JP H0737982B2 JP 4361661 A JP4361661 A JP 4361661A JP 36166192 A JP36166192 A JP 36166192A JP H0737982 B2 JPH0737982 B2 JP H0737982B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、糞便中の一次胆汁酸お
よび二次胆汁酸を免疫学的に検査するのに有効な抗胆汁
酸抗体およびこれを用いた糞便中の胆汁酸検査方法に関
する。
よび二次胆汁酸を免疫学的に検査するのに有効な抗胆汁
酸抗体およびこれを用いた糞便中の胆汁酸検査方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】近年、我が国においても大腸癌が著増し
つつあることは周知のことであり、その一因としては、
欧米型食事への質的変換が考えられる。また、この大腸
癌は予防的にも治療上においても早期に発見することが
重要である。この早期発見のための検査方法には、血液
中の腫瘍マーカー、糞便中の人血の検出、画像診断など
があり、これらの検査方法のうち、患者に負担をかけず
に、しかも、安価に行える検査方法としては、糞便中の
人血を検査する方法である。この検査方法は、癌組織か
らの出血によるヘモグロビンをモノクロナール抗体を用
いて検出するものであるが、癌以外の原因による出血と
の鑑別、ヘモグロビンの経時的変化などに問題があり、
良好な検査方法とはいえない。
つつあることは周知のことであり、その一因としては、
欧米型食事への質的変換が考えられる。また、この大腸
癌は予防的にも治療上においても早期に発見することが
重要である。この早期発見のための検査方法には、血液
中の腫瘍マーカー、糞便中の人血の検出、画像診断など
があり、これらの検査方法のうち、患者に負担をかけず
に、しかも、安価に行える検査方法としては、糞便中の
人血を検査する方法である。この検査方法は、癌組織か
らの出血によるヘモグロビンをモノクロナール抗体を用
いて検出するものであるが、癌以外の原因による出血と
の鑑別、ヘモグロビンの経時的変化などに問題があり、
良好な検査方法とはいえない。
【０００３】ところで、胆汁酸と大腸癌発生との因果関
係は、国内外の免疫学的研究および実験動物での研究に
よると、胆汁酸、特に二次胆汁酸が大腸癌発生過程でプ
ロモータ、いわゆる発癌の補助物質の役割を担っている
と指摘されてきた。実際に本願発明者らのパイロットテ
ストによると、大腸癌患者から多量の二次胆汁酸が検出
されることが認められている。
係は、国内外の免疫学的研究および実験動物での研究に
よると、胆汁酸、特に二次胆汁酸が大腸癌発生過程でプ
ロモータ、いわゆる発癌の補助物質の役割を担っている
と指摘されてきた。実際に本願発明者らのパイロットテ
ストによると、大腸癌患者から多量の二次胆汁酸が検出
されることが認められている。
【０００４】一方、肝臓で生成された胆汁酸は、一次胆
汁酸（コール酸：ＣＡ）として胆のうに排泄後、濃縮さ
れる。さらに、食事刺激により胆のうから腸管内に放出
された一次胆汁酸は脂肪、脂質などを乳化して腸壁から
の呼吸を容易にする作用をする。また、胆汁酸自身は回
腸末端を中心に、そのほとんどが再呼吸され、門脈を経
て肝臓に戻るクローズドループ的な腸肝循環を繰り返し
ているが、胆汁酸の一部は糞便中に排泄され、腸内細菌
により還元されて二次胆汁酸（デオキシコール酸：ＤＣ
Ａ）に変換される。従って、糞便中の胆汁酸には、主に
遊離型の二次胆汁酸が多く含まれる。また、臨床的に
は、各種消化管疾患や消化管切除後に便中胆汁酸の量、
組成に変化が生じていることも知られている。
汁酸（コール酸：ＣＡ）として胆のうに排泄後、濃縮さ
れる。さらに、食事刺激により胆のうから腸管内に放出
された一次胆汁酸は脂肪、脂質などを乳化して腸壁から
の呼吸を容易にする作用をする。また、胆汁酸自身は回
腸末端を中心に、そのほとんどが再呼吸され、門脈を経
て肝臓に戻るクローズドループ的な腸肝循環を繰り返し
ているが、胆汁酸の一部は糞便中に排泄され、腸内細菌
により還元されて二次胆汁酸（デオキシコール酸：ＤＣ
Ａ）に変換される。従って、糞便中の胆汁酸には、主に
遊離型の二次胆汁酸が多く含まれる。また、臨床的に
は、各種消化管疾患や消化管切除後に便中胆汁酸の量、
組成に変化が生じていることも知られている。
【０００５】糞便中の胆汁酸の分析は、胆汁酸の代謝機
序を知るうえで重要である。従来、このような胆汁酸分
析に際しての測定方法としては、主にＧＬＣ（Ｇａｓ−
Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）やＧＣ
−ＭＳ（Ｇａｓ−Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
ａｐｈｙ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｏｒｏｍｅｔｒｙ）法
があり、また、多数検体処理を目的とした人糞便中胆汁
酸の簡易測定法としては、ヒドロオキステロイド・デヒ
ドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤ，７α−ＨＳＤ）を用いた
方法や、その改良法としての酵素螢光法などが知られて
いる。
序を知るうえで重要である。従来、このような胆汁酸分
析に際しての測定方法としては、主にＧＬＣ（Ｇａｓ−
Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）やＧＣ
−ＭＳ（Ｇａｓ−Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
ａｐｈｙ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｏｒｏｍｅｔｒｙ）法
があり、また、多数検体処理を目的とした人糞便中胆汁
酸の簡易測定法としては、ヒドロオキステロイド・デヒ
ドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤ，７α−ＨＳＤ）を用いた
方法や、その改良法としての酵素螢光法などが知られて
いる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述し
たＧＬＣ法やＧＣ−ＭＳ法では、胆汁酸の分析操作が煩
雑で高度な知識と技術が必要となり、多数検体処理には
適さない。また、後者の酸素螢光法などでは、糞便中の
β−ヒドロキシ胆汁酸の問題や採便後の凍結乾燥便の作
製、および胆汁酸の抽出精製が必要であるため、多数検
体処理に難点があり、しかも総胆汁酸を測定するもので
あるため、一次胆汁酸と二次胆汁酸の量および組成が判
明せず、大腸癌スクリーニング検査としての有用性が低
いという問題があった。本発明は、上述のような問題を
解決するものであり、検査法が簡単で大量の検体処理を
可能にするとともに、大腸癌の早期発見および大腸癌の
潜在癌としての割り出しをも可能にした糞便中の一次胆
汁酸および二次胆汁酸を測定および検査する免疫学的検
査試薬として有効な抗胆汁酸抗体およびこれを用いた糞
便中の胆汁酸検査方法を提供することを目的とする。
たＧＬＣ法やＧＣ−ＭＳ法では、胆汁酸の分析操作が煩
雑で高度な知識と技術が必要となり、多数検体処理には
適さない。また、後者の酸素螢光法などでは、糞便中の
β−ヒドロキシ胆汁酸の問題や採便後の凍結乾燥便の作
製、および胆汁酸の抽出精製が必要であるため、多数検
体処理に難点があり、しかも総胆汁酸を測定するもので
あるため、一次胆汁酸と二次胆汁酸の量および組成が判
明せず、大腸癌スクリーニング検査としての有用性が低
いという問題があった。本発明は、上述のような問題を
解決するものであり、検査法が簡単で大量の検体処理を
可能にするとともに、大腸癌の早期発見および大腸癌の
潜在癌としての割り出しをも可能にした糞便中の一次胆
汁酸および二次胆汁酸を測定および検査する免疫学的検
査試薬として有効な抗胆汁酸抗体およびこれを用いた糞
便中の胆汁酸検査方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明の一次胆汁酸用の抗胆汁酸抗体は、抗コール酸
−２４−牛血清アルブミン−兎血清からなるものであ
る。また、本発明の二次胆汁酸用の抗胆汁酸抗体は、抗
デオキシコール酸−２４−牛血清アルブミン−兎血清か
らなるものである。また、本発明の糞便中の胆汁酸検査
方法は、一次胆汁酸用抗胆汁酸抗体を用いたＥＬＩＳＡ
法により糞便中の一次胆汁酸の濃度を測定し、二次胆汁
酸用抗胆汁酸抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により糞便中の
二次胆汁酸の濃度を測定し、この測定結果を基に一次胆
汁酸（ＣＡ）と二次胆汁酸（ＤＣＡ）の濃度比（ＤＣＡ
／ＣＡ）を算出することを特徴とする。
に本発明の一次胆汁酸用の抗胆汁酸抗体は、抗コール酸
−２４−牛血清アルブミン−兎血清からなるものであ
る。また、本発明の二次胆汁酸用の抗胆汁酸抗体は、抗
デオキシコール酸−２４−牛血清アルブミン−兎血清か
らなるものである。また、本発明の糞便中の胆汁酸検査
方法は、一次胆汁酸用抗胆汁酸抗体を用いたＥＬＩＳＡ
法により糞便中の一次胆汁酸の濃度を測定し、二次胆汁
酸用抗胆汁酸抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により糞便中の
二次胆汁酸の濃度を測定し、この測定結果を基に一次胆
汁酸（ＣＡ）と二次胆汁酸（ＤＣＡ）の濃度比（ＤＣＡ
／ＣＡ）を算出することを特徴とする。
【０００８】
【作用】本発明においては、抗コール酸の環式化合物の
２４位に牛血清アルブミンを持つ兎血清から作製した抗
胆汁酸抗体を用いることにより、糞便中の一次胆汁酸と
特異的に反応し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で簡便
に測定できる。そして、抗デオキシコール酸の環式化合
物の２４位に牛血清アルブミンを持つ兎血清から作製し
た抗胆汁酸抗体を用いることにより、糞便中の二次胆汁
酸と特異的に反応し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で
簡便に測定できる。また、一次胆汁酸と二次胆汁酸の測
定濃度比を求めることにより、大腸癌発生のプロモータ
的要素となる糞便中の二次胆汁酸量を的確に把握できる
とともに、大腸癌の早期発見および潜在癌の診断に大き
く寄与し得る。
２４位に牛血清アルブミンを持つ兎血清から作製した抗
胆汁酸抗体を用いることにより、糞便中の一次胆汁酸と
特異的に反応し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で簡便
に測定できる。そして、抗デオキシコール酸の環式化合
物の２４位に牛血清アルブミンを持つ兎血清から作製し
た抗胆汁酸抗体を用いることにより、糞便中の二次胆汁
酸と特異的に反応し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で
簡便に測定できる。また、一次胆汁酸と二次胆汁酸の測
定濃度比を求めることにより、大腸癌発生のプロモータ
的要素となる糞便中の二次胆汁酸量を的確に把握できる
とともに、大腸癌の早期発見および潜在癌の診断に大き
く寄与し得る。
【０００９】
【実施例】次に、本発明による人糞便中の一次胆汁酸に
特異的に反応する抗コール酸−２４−牛血清アルブミン
−兎血清、および人糞便中の二次胆汁酸に特異的に反応
する抗デオキシコール酸−２４−牛血清アルブミン−兎
血清の作製方法について説明する。
特異的に反応する抗コール酸−２４−牛血清アルブミン
−兎血清、および人糞便中の二次胆汁酸に特異的に反応
する抗デオキシコール酸−２４−牛血清アルブミン−兎
血清の作製方法について説明する。
【００１０】（抗コール酸−２４−牛血清アルブミン−
兎血清） （ａ） コール酸４１ｍｇをジオキサン１ｍｌで溶か
し、この水溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミト２３ｍ
ｇ、１−エチル−３−カルボジイドヒドロ塩化物３８ｍ
ｇを加え、室温で３時間反応させる。 （ｂ） この反応液に酢酸エチル４ｍｌと蒸留水４ｍｌ
を加え、抽出後水層を捨てる。新たに蒸留水４ｍｌを加
えて再度抽出を行い、水層除去後に酢酸エチル層を無水
酢酸ナトリウムで脱水し、蒸発乾固することにより、コ
ール酸活性エステルを得る。 （ｃ） 次に、乾固物であるコール酸活性エステル３０
ｍｇをジメチルホルムアミド１ｍｌで溶かし、この溶液
を、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１００ｍｇを蒸留水４
ｍｌで溶かした牛血清アルブミン水溶液にｐＨを１ＮＮ
ａＯＨにより７〜８に保ちながら、ゆっくり加える。 （ｄ） 約３０分経過後、蒸留水に対して一昼夜透析し
て抗原を生成する。 （ｅ） 得られた抗原を１回当り１ｍｇ、家兎に４か月
に亘り授与し、兎生体内にコール酸に体し特異抗体とな
る抗コール酸抗体を産生させ、これを採取することによ
り抗コール酸−２４−牛血清アルブミン−兎血清（以
下、単に抗コール酸抗血清という。）を得る。 この抗コール酸抗血清は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ
Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａａｓｓ
ａｙ）法による人糞便中の一次胆汁酸の分画測定に使用
される。
兎血清） （ａ） コール酸４１ｍｇをジオキサン１ｍｌで溶か
し、この水溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミト２３ｍ
ｇ、１−エチル−３−カルボジイドヒドロ塩化物３８ｍ
ｇを加え、室温で３時間反応させる。 （ｂ） この反応液に酢酸エチル４ｍｌと蒸留水４ｍｌ
を加え、抽出後水層を捨てる。新たに蒸留水４ｍｌを加
えて再度抽出を行い、水層除去後に酢酸エチル層を無水
酢酸ナトリウムで脱水し、蒸発乾固することにより、コ
ール酸活性エステルを得る。 （ｃ） 次に、乾固物であるコール酸活性エステル３０
ｍｇをジメチルホルムアミド１ｍｌで溶かし、この溶液
を、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１００ｍｇを蒸留水４
ｍｌで溶かした牛血清アルブミン水溶液にｐＨを１ＮＮ
ａＯＨにより７〜８に保ちながら、ゆっくり加える。 （ｄ） 約３０分経過後、蒸留水に対して一昼夜透析し
て抗原を生成する。 （ｅ） 得られた抗原を１回当り１ｍｇ、家兎に４か月
に亘り授与し、兎生体内にコール酸に体し特異抗体とな
る抗コール酸抗体を産生させ、これを採取することによ
り抗コール酸−２４−牛血清アルブミン−兎血清（以
下、単に抗コール酸抗血清という。）を得る。 この抗コール酸抗血清は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ
Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａａｓｓ
ａｙ）法による人糞便中の一次胆汁酸の分画測定に使用
される。
【００１１】（抗デオキシコール酸−２４−牛血清アル
ブミン−兎血清） （ａ） デオキシコール酸４０ｍｇをジオキサン１ｍｌ
で溶かし、この水溶液にＮ−ヒドロキシスリシンイミド
２３ｍｇ、３−ジメチルアミノプロピル カルボジイド
ヒドロ塩化物３８ｍｇを加え、室温で３時間反応させ
る。 （ｂ） この反応水溶液に酢酸エチル４ｍｌを加え、抽
出後水層を捨てる。新たに蒸留水４ｍｌを加えて再度抽
出を行い、水層除去後に酢酸エチル層を無水酢酸ナトリ
ウムで脱水し、蒸発乾固することにより、デオキシコー
ル酸活性エステルを得る。 （ｃ） 次に、乾固物であるデオキシコール酸活性エス
テル３０ｍｇをジメチルホルムアミド１ｍｌで溶かし、
この溶液を、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１００ｍｇを
蒸留水４ｍｌで溶かした牛血清アルブミン水溶液にｐＨ
を１ＮＮａＯＨにより７〜８に保ちながら、ゆっくり加
える。 （ｄ） 約３０分経過後、蒸留水に対し一昼夜透析して
抗原を得る。 （ｅ） 得られた抗原を１回当り１ｍｇ、家兎に４か月
に亘授与し、兎生体内にデオキシコール酸に対し特異抗
体となる抗デオキシコール酸抗体を産生させ、これを採
取することにより抗デオキシコール酸−２４−牛血清ア
ルブミン−兎血清（以下、単に抗デオキシコール酸抗血
清という。）を得る。 この抗デオキシコール酸抗血清は、ＥＬＩＳＡ法による
人糞便中の二次胆汁酸の分画測定に使用される。
ブミン−兎血清） （ａ） デオキシコール酸４０ｍｇをジオキサン１ｍｌ
で溶かし、この水溶液にＮ−ヒドロキシスリシンイミド
２３ｍｇ、３−ジメチルアミノプロピル カルボジイド
ヒドロ塩化物３８ｍｇを加え、室温で３時間反応させ
る。 （ｂ） この反応水溶液に酢酸エチル４ｍｌを加え、抽
出後水層を捨てる。新たに蒸留水４ｍｌを加えて再度抽
出を行い、水層除去後に酢酸エチル層を無水酢酸ナトリ
ウムで脱水し、蒸発乾固することにより、デオキシコー
ル酸活性エステルを得る。 （ｃ） 次に、乾固物であるデオキシコール酸活性エス
テル３０ｍｇをジメチルホルムアミド１ｍｌで溶かし、
この溶液を、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１００ｍｇを
蒸留水４ｍｌで溶かした牛血清アルブミン水溶液にｐＨ
を１ＮＮａＯＨにより７〜８に保ちながら、ゆっくり加
える。 （ｄ） 約３０分経過後、蒸留水に対し一昼夜透析して
抗原を得る。 （ｅ） 得られた抗原を１回当り１ｍｇ、家兎に４か月
に亘授与し、兎生体内にデオキシコール酸に対し特異抗
体となる抗デオキシコール酸抗体を産生させ、これを採
取することにより抗デオキシコール酸−２４−牛血清ア
ルブミン−兎血清（以下、単に抗デオキシコール酸抗血
清という。）を得る。 この抗デオキシコール酸抗血清は、ＥＬＩＳＡ法による
人糞便中の二次胆汁酸の分画測定に使用される。
【００１２】次に、上述のように作製された抗コール酸
抗血清および抗デオキシコール酸抗血清を用いてＥＬＩ
ＳＡ法により、糞便中の一次および二次胆汁酸を検査す
る方法について述べる。
抗血清および抗デオキシコール酸抗血清を用いてＥＬＩ
ＳＡ法により、糞便中の一次および二次胆汁酸を検査す
る方法について述べる。
【００１３】（一次胆汁酸の検査）先ず、ヘモディア採
便容器の糞便液１滴に緩衝液５００μｌを加えて測定用
糞便希釈液を調整する。なお、緩衝液は、ｐＨ７．２・
０．０５Ｍのｐｈｏｓｐｈｅ ｂｕｆｆｅｒと、０．３
０ＭのＮａＣｌと、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）と、０．１％のＢＳＡと、０．１％のＮａ
Ｎ３とから作製される。次に、前記糞便希釈液５０μｌ
に抗コール酸抗血清を１５０００倍に希釈した５０μｌ
の抗コール酸抗血清液と、酵素標識抗原である５０μｌ
の酵素標識コール酸液とからなる混合液中に第二抗体固
相化プレートを浸漬して２５℃で３時間反応させる。そ
して、反応後の第二抗体固相化プレートを洗浄液により
３回洗浄する。次に、該プレートにσ−ニトロフェニル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシドからなる基質液（発色
液）を１５０μｌずつ加え、２５℃で９０分間反応させ
る。その後、０．２ＭＮａ２ＣＯ３からなる反応停止液
を１００μｌずつ加えて反応を停止させる。次に、マイ
クロプレート用分光光度計を用いて特定波長（４１４ｎ
ｍ）における吸光度を測定する。得られたプレートの吸
光度より標準曲線を作製し、これより糞便中の一次胆汁
酸の濃度を求める。
便容器の糞便液１滴に緩衝液５００μｌを加えて測定用
糞便希釈液を調整する。なお、緩衝液は、ｐＨ７．２・
０．０５Ｍのｐｈｏｓｐｈｅ ｂｕｆｆｅｒと、０．３
０ＭのＮａＣｌと、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）と、０．１％のＢＳＡと、０．１％のＮａ
Ｎ３とから作製される。次に、前記糞便希釈液５０μｌ
に抗コール酸抗血清を１５０００倍に希釈した５０μｌ
の抗コール酸抗血清液と、酵素標識抗原である５０μｌ
の酵素標識コール酸液とからなる混合液中に第二抗体固
相化プレートを浸漬して２５℃で３時間反応させる。そ
して、反応後の第二抗体固相化プレートを洗浄液により
３回洗浄する。次に、該プレートにσ−ニトロフェニル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシドからなる基質液（発色
液）を１５０μｌずつ加え、２５℃で９０分間反応させ
る。その後、０．２ＭＮａ２ＣＯ３からなる反応停止液
を１００μｌずつ加えて反応を停止させる。次に、マイ
クロプレート用分光光度計を用いて特定波長（４１４ｎ
ｍ）における吸光度を測定する。得られたプレートの吸
光度より標準曲線を作製し、これより糞便中の一次胆汁
酸の濃度を求める。
【００１４】表１は、一次胆汁酸における０〜３００ｎ
ｍｏｌ／ｍｌの各段階の標準濃度に対する吸光度の実験
結果を示す。
ｍｏｌ／ｍｌの各段階の標準濃度に対する吸光度の実験
結果を示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】また、図１は、一次胆汁酸（ＣＡ）と本発
明の抗コール酸抗血清との結合率（Ｂ／Ｂ０）を示す標
準曲線である。この図１に示す標準曲線は、ＥＬＩＳＡ
法の典型的な特性を表わしており、このことは、従来の
ような煩雑な処理および測定法を用いることなしに酵素
免疫検査法により、糞便中の一次胆汁酸を直接的にかつ
簡便に測定することができ、多数検体処理を低コストで
行うことが可能になる。
明の抗コール酸抗血清との結合率（Ｂ／Ｂ０）を示す標
準曲線である。この図１に示す標準曲線は、ＥＬＩＳＡ
法の典型的な特性を表わしており、このことは、従来の
ような煩雑な処理および測定法を用いることなしに酵素
免疫検査法により、糞便中の一次胆汁酸を直接的にかつ
簡便に測定することができ、多数検体処理を低コストで
行うことが可能になる。
【００１７】（二次胆汁酸の検査）一次胆汁酸の検査時
と同様に調製した糞便希釈液５０μｌに抗デオキシコー
ル酸抗血清を１５０００倍に希釈した５０μｌの抗デオ
キシコール酸抗血清液と、酵素標識抗原である５０μｌ
の酵素標識デオキシコール酸液とからなる混合液中に第
二抗体化プレートを浸漬して２５℃で３時間反応させ
る。そして、反応後の第二抗体固相化プレートを洗浄液
により３回洗浄する。次に、該プレートにσ−ニトロフ
ェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドからなる基質液
（発色液）を１５０μｌずつ加え、２５℃で９０分間反
応させる。その後、０．２ＭのＮａ２ＣＯ３からなる反
応停止液を１００μｌずつ加えて反応を停止させる。次
に、マイクロプレート用分光光度計を用いて特定波長
（４１４ｎｍ）における吸光度を測定する。得られたプ
レートの吸光度より標準曲線を作製し、これより糞便中
の一次胆汁酸の濃度を求める。
と同様に調製した糞便希釈液５０μｌに抗デオキシコー
ル酸抗血清を１５０００倍に希釈した５０μｌの抗デオ
キシコール酸抗血清液と、酵素標識抗原である５０μｌ
の酵素標識デオキシコール酸液とからなる混合液中に第
二抗体化プレートを浸漬して２５℃で３時間反応させ
る。そして、反応後の第二抗体固相化プレートを洗浄液
により３回洗浄する。次に、該プレートにσ−ニトロフ
ェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドからなる基質液
（発色液）を１５０μｌずつ加え、２５℃で９０分間反
応させる。その後、０．２ＭのＮａ２ＣＯ３からなる反
応停止液を１００μｌずつ加えて反応を停止させる。次
に、マイクロプレート用分光光度計を用いて特定波長
（４１４ｎｍ）における吸光度を測定する。得られたプ
レートの吸光度より標準曲線を作製し、これより糞便中
の一次胆汁酸の濃度を求める。
【００１８】
【実施例】表２は、二次胆汁酸における０〜３００ｎｍ
ｏｌ／ｍｌの各段階の標準濃度に対する吸光度の実験結
果を示す。
ｏｌ／ｍｌの各段階の標準濃度に対する吸光度の実験結
果を示す。
【００１９】
【表２】
【００２０】また、図２は、二次胆汁酸（ＤＣＡ）と本
発明の抗デオキシコール酸抗血清との結合率（Ｂ／
Ｂ０）を示す標準曲線である。この図２に示す標準曲線
は、ＥＬＩＳＡ法の典型的な特性を表わしており、この
ことは従来のような煩雑な処理および測定法を用いるこ
となしに酵素免疫検査法で、糞便中の二次胆汁酸を直接
的かつ簡便に測定することができ、多数検体処理を低コ
ストで行うことが可能になる。
発明の抗デオキシコール酸抗血清との結合率（Ｂ／
Ｂ０）を示す標準曲線である。この図２に示す標準曲線
は、ＥＬＩＳＡ法の典型的な特性を表わしており、この
ことは従来のような煩雑な処理および測定法を用いるこ
となしに酵素免疫検査法で、糞便中の二次胆汁酸を直接
的かつ簡便に測定することができ、多数検体処理を低コ
ストで行うことが可能になる。
【００２１】表３は、一次および二次胆汁酸とこれに対
応する抗コール酸抗体および抗デオキシコール酸抗体と
の交叉率（特異性）を示す実験結果である。
応する抗コール酸抗体および抗デオキシコール酸抗体と
の交叉率（特異性）を示す実験結果である。
【００２２】
【表３】
【００２３】表３から明らかなように、一次胆汁酸に相
当するコール酸、グリココール酸、タウロコール酸は抗
コール酸抗体と特異的に反応することが認められ、ま
た、二次胆汁酸に相当するデオキシコール酸、グリコデ
オキシコール酸、タウロデオキシコール酸は抗デオキシ
酸抗体と特異的に反応することが認められた。
当するコール酸、グリココール酸、タウロコール酸は抗
コール酸抗体と特異的に反応することが認められ、ま
た、二次胆汁酸に相当するデオキシコール酸、グリコデ
オキシコール酸、タウロデオキシコール酸は抗デオキシ
酸抗体と特異的に反応することが認められた。
【００２４】次に、上述のようにして測定した一次胆汁
酸（ＣＡ）と二次胆汁酸（ＤＣＡ）の組成比（ＣＡ／Ｄ
ＣＡ）と大腸癌との関係を表４について説明する。
酸（ＣＡ）と二次胆汁酸（ＤＣＡ）の組成比（ＣＡ／Ｄ
ＣＡ）と大腸癌との関係を表４について説明する。
【００２５】
【表４】
【００２６】表４は、国際的に広く用いられているＤｕ
ｋｅｓ分類による大腸癌の臨床例を基に便中胆汁酸の組
成と比率を示したものである。この表４から明らかなよ
うに、大腸癌患者の７症例のうち、糞便中の胆汁酸代謝
の動態は、術後６例については一次胆汁酸（ＡＣ）より
二次胆汁酸（ＤＣＡ）の濃度が顕著な高値傾向にあるこ
とが認められた。また、術後では５例にＤＣＡの顕著な
減少と４例にＣＡの顕著な増加傾向が認められた。ま
た、症例によっては微妙な両者の異なった動態も認めら
れるが、ＤＣＡ／ＣＡ比で解析すると、全症例とも術前
値に比し術後は低値傾向にあることが認められる。従っ
て、ＣＡとＤＣＡの比率による評価法は臨床的に有利で
あると考えられる。
ｋｅｓ分類による大腸癌の臨床例を基に便中胆汁酸の組
成と比率を示したものである。この表４から明らかなよ
うに、大腸癌患者の７症例のうち、糞便中の胆汁酸代謝
の動態は、術後６例については一次胆汁酸（ＡＣ）より
二次胆汁酸（ＤＣＡ）の濃度が顕著な高値傾向にあるこ
とが認められた。また、術後では５例にＤＣＡの顕著な
減少と４例にＣＡの顕著な増加傾向が認められた。ま
た、症例によっては微妙な両者の異なった動態も認めら
れるが、ＤＣＡ／ＣＡ比で解析すると、全症例とも術前
値に比し術後は低値傾向にあることが認められる。従っ
て、ＣＡとＤＣＡの比率による評価法は臨床的に有利で
あると考えられる。
【００２７】このように、大腸癌患者の術前、術後の糞
便中の一次胆汁酸、二次胆汁酸を測定し、その比率を求
めて解析することにより、糞便中胆汁酸のスクリーニン
グ測定法としての臨床的有用性を証明し、かつ大腸癌の
早期病変の発見あるいは潜在大腸癌の拾い上げの可能性
を向上できる。
便中の一次胆汁酸、二次胆汁酸を測定し、その比率を求
めて解析することにより、糞便中胆汁酸のスクリーニン
グ測定法としての臨床的有用性を証明し、かつ大腸癌の
早期病変の発見あるいは潜在大腸癌の拾い上げの可能性
を向上できる。
【図１】本実施例における一次胆汁酸の標準曲線を示
す。
す。
【図２】本実施例における二次胆汁酸の標準曲線を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 狩野 元成 東京都渋谷区代々木４−24−５−505 (72)発明者 松本 勝 埼玉県富士見市西みずほ台１−４−４− 502 (72)発明者 和田 浩 埼玉県富士見市渡戸２−16−19 (72)発明者 茂手木 皓喜 東京都文京区千石１−８−13 (56)参考文献 特開 平１−175945（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−324358（ＪＰ，Ａ)
Claims (3)
- 【請求項１】 抗コール酸−２４−牛血清アルブミン−
兎血清からなる一次胆汁酸用の抗胆汁酸抗体。 - 【請求項２】 抗デオキシコール酸−２４−牛血清アル
ブミン−兎血清からなる二次胆汁酸用の抗胆汁酸抗体。 - 【請求項３】 一次胆汁酸用抗胆汁酸抗体を用いたＥＬ
ＩＳＡ法により糞便中の一次胆汁酸の濃度を測定し、二
次胆汁酸用抗胆汁酸抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により糞
便中の二次胆汁酸の濃度を測定し、この測定結果を基に
一次胆汁酸（ＣＡ）と二次胆汁酸（ＤＣＡ）の濃度比
（ＤＣＡ／ＣＡ）を算出することを特徴とする糞便中の
胆汁胆酸検査方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4361661A JPH0737982B2 (ja) | 1992-12-14 | 1992-12-14 | 抗胆汁酸抗体およびこれを用いた糞便中の胆汁酸検査方法 |
| US08/258,483 US5601993A (en) | 1992-12-14 | 1994-06-10 | Anti-bile acid antibodies and method for assaying bile acids in feces by using the same |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4361661A JPH0737982B2 (ja) | 1992-12-14 | 1992-12-14 | 抗胆汁酸抗体およびこれを用いた糞便中の胆汁酸検査方法 |
| US08/258,483 US5601993A (en) | 1992-12-14 | 1994-06-10 | Anti-bile acid antibodies and method for assaying bile acids in feces by using the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06180319A JPH06180319A (ja) | 1994-06-28 |
| JPH0737982B2 true JPH0737982B2 (ja) | 1995-04-26 |
Family
ID=26581304
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4361661A Expired - Fee Related JPH0737982B2 (ja) | 1992-12-14 | 1992-12-14 | 抗胆汁酸抗体およびこれを用いた糞便中の胆汁酸検査方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5601993A (ja) |
| JP (1) | JPH0737982B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2638521B2 (ja) * | 1994-11-24 | 1997-08-06 | 有限会社ビー・エス・アール | Ｅｌｉｓａによる血清中胆汁酸類の測定による肝疾患決定法 |
| US20070092401A1 (en) * | 2005-10-26 | 2007-04-26 | Feier Liao | Devices and methods for sample collection and analysis |
| CN105301255B (zh) * | 2014-04-18 | 2016-09-07 | 安徽大千生物工程有限公司 | 一种测定人体甘胆酸含量的试剂盒制备方法 |
| CN106226512B (zh) * | 2016-07-29 | 2018-10-16 | 胡清 | 一种试剂盒、试剂盒的制备方法及利用该试剂盒实现的外周血甘氨胆酸的检测方法 |
| CN110025633B (zh) * | 2019-05-29 | 2021-08-10 | 河南城建学院 | 一种兔胆粉的制备方法 |
| US20220333156A1 (en) * | 2019-09-18 | 2022-10-20 | Technosuruga Laboratory Co., Ltd. | Sample preservation solution, and analysis device and analysis method using the same |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4207308A (en) * | 1976-09-02 | 1980-06-10 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of Veterans Affairs | Process for purifying iodinated bile acid conjugates |
| US4264514A (en) * | 1977-11-14 | 1981-04-28 | Abbott Laboratories | Method and reagents for measuring the level of conjugated bile acids |
| US4256724A (en) * | 1978-02-21 | 1981-03-17 | Becton, Dickinson And Company | Method for non-covalent coating of antibodies on solid substrates |
| US4273866A (en) * | 1979-02-05 | 1981-06-16 | Abbott Laboratories | Ligand analog-irreversible enzyme inhibitor conjugates and methods for use |
| JP3155961B2 (ja) * | 1987-12-30 | 2001-04-16 | 煕 中島 | 抗ビリルビンモノクローナル抗体固定担体およびその製造方法 |
| JPH04324358A (ja) * | 1991-04-24 | 1992-11-13 | Teikoku Seiyaku Co Ltd | 糞便中のヒトヘモグロビン測定法 |
-
1992
- 1992-12-14 JP JP4361661A patent/JPH0737982B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-06-10 US US08/258,483 patent/US5601993A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5601993A (en) | 1997-02-11 |
| JPH06180319A (ja) | 1994-06-28 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |