DE2916783B2

DE2916783B2 - Verfahren zur immunologischen Bestimmung einer Gallensäure oder ihres Konjugats

Info

Publication number: DE2916783B2
Application number: DE2916783A
Authority: DE
Inventors: Phillip C. Grayslake Ill. Miller
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1978-04-26
Filing date: 1979-04-25
Publication date: 1981-07-16
Also published as: CA1093962A; IT7922140A0; NL7902396A; ES479985A1; DE2916783A1; AU4563479A; SE7903645L; GB2020014A; IT1112580B; FR2424536A1; JPS54149700A; GB2020014B; DE2916783C3; BE875854A; AU527381B2

Description

Die Synthese von Gallensäuren aus Cholesterin in der Leber ist einer der wichtigsten katabolischen Vorgänge, welchen Cholesterin unterliegt. Schätzungsweise werden beim Menschen mehr als 80% des biologischen Cholesterins in der Leber in verschiedene Gallensäuren und Gallensäurekonjugate umgewandelt.

Die primären Gallensäuren, d. h. Chol- und Chenodesoxycholsäure, werden durch die Leber gewöhnlich in Form der Glycin- oder Taurinkonjugate ausgeschieden und in der Gallenblase gespeichert. Obwohl einige Gallensäuren von der Gallenblase in das Blut resorbiert werden, werden die meisten mit der Galle durch den gewöhnlichen Gallengang in das Lumen des Duodenums ausgeschieden, wo sie die Resorption des Cholesterins und die Verdauung und Resorption der Fettsäuren erleichtern. Die unverbrauchten konjugierten Gallensäuren werden in den das Duodenun durchdringenden Blutgefäßen resorbiert und kehren durch das Leberpfortensystem in die Leber zurück. Die

ίο im Duodenum nicht resorbierten Gallensäuren werden durch die Darmflora in sekundäre Gallensäuren, z. B. Lithochol- oder Desoxycholsäure, umgewandelt Die sekundären Gallensäuren werden teilweise in das Blut resorbiert und gelangen durch das Leberpfortensystem

is zurück in die Leber, in der Lithocholsäure weiter zu Sulfolithocholsäure metabolisiert wird. Bei gesunden Personen werden die Gallensäuren durch die Leber vom periteralen Kreislauf abgezogen und zurückgeführt Wenn die Hepatocyten dagegen durch Infektion, Chemikalien oder mechanische Hindernisse geschädigt wurden, ist der enterohepatische Kreislauf der Gallensäuren gestört Diese Störung kann sich durch erhöhte Gallensäurespiegel im peripheren Kreislauf bemerkbar machen.

Stoffwechselstörungen bei Lebererkrankungen oder -störungen können daher am Gehalt der Gallensäuren oder Gallensäurekonjugate im Serum erkannt werden. Bereits 1948 berichteten Sherlock und Walshe, CHn. Sei. 6, 223, daß die gesamten Serumgallensäuren bei hep&tobiliären Erkrankungen zunehmen. Diese Beobachtung wurde in den darauffolgenden Jahren bestätigt Die in Form der Konjugate von Cholsäure bestimmten Serumgallensäuren haben sich als das empfindlichste Indiz für Lebei erkrankungen im Vergleich zu Tests auf Serumbilirubin, Proteine, die Prothrombinzeit und die Bromsulphthaleinretention erwiesen; vgl. M. G. Korman et al, J. New Engl. F. Med. 290(1974), 1399. Demers und Hepner, Am. J. din. Path. 66 (1976), 831, berichten, daß Gehalte an Serumgallensäuren, insbesondere Sulfolithocholylglycin (SLCG), sehr empfindliche Indikatoren für Funktionsstörungen der Leberzellen sind. Die Feststellung der Gegenwart spezieller Gallensäuren oder ihrer Konjugate im Serum kann ein wertvolles Diagnosehilfsmittel bei der Beurteilung der Leberfunktion darstellen, und es wurden bereits mehrere Tests zur Bestimmung der Menge dieser Gallensäuren entwickelt Zu den erfolgreichsten derzeit angewendeten Tests

gehören die Gasflüssigkeitschromatographie [Sandberg et al, Lipid Res. 6 (1965), 182], ein enzymatischer Test

so unter Verwendung von Hydroxysteroid-Dehydrogenase [G. M. Murphy, Ann. Clin. Biochem. 9 (1972), 67], und die Radioimmunoassay(RIA)-Methoden [Simmonds et al, Gastroenterology 65 (1973), 705} Die RIA-Methoden werden aufgrund ihrer Empfindlichkeit, Spezifität und Zweckmäßigkeit bevorzugt

Ein Immuntest zum Nachweis und zur Bestimmung eines unbekannten Immunoreagens kann dadurch vorgenommen werden, daß man eine begrenzte Anzahl von spezifischen Bindungsstellen (Antikörpern) für ein Gemisch von markierten und unbekannten Reaktanten bereitstellt. Je größer die Zahl der durch den Antikörper gebundenen markierten Reaktanten ist, um so geringer ist die Konzentration der in der Probe vorhandenen unbekannten Reaktanten. Für eine genaue Bestimmung

b5 ist es notwendig, daß sowohl die markierten als auch die unbekannten Reaktanten für die Reaktion mit den bereitgestellten Bindungsstellen frei sind. Diese Freiheit, eine konkurrierende Reaktion mit dem markierten

Reaktanten einzugehen, wird häufig durch in der Serumprobe enthaltene andere Substanzen, gewöhnlich Proteine, wie Serumalbumin oder spezifische Bindungsproteine, behindert Die genannten bindenden Proteine verhindern, daß sich der zu bestimmende Reaktant ausschließlich mit dem bereitgestellten Antikörper verbindet, und beeinträchtigen daher die Genauigkeit des Tests.

Die Beseitigung des Bindungsproteinmaterials bei Serumgallensäuren-Immuntests wurde durch verschiedene Ex'raktionsprozesse erreicht, bei welchen das störende Protein mit Hilfe geeigneter Lösungsmitte) ausgefällt wird.

Es wurde auch eine Passage des Serums durch eine mit einem Ionenaustauscherharz (Amberlite XAD-2) gepackte Säule angewendet; vgL Matern et aL, Clin. Chim. Acta, Bd. 72 (1976), S. 39.

Bei allen herkömmlichen Methoden wird das Serum nicht direkt analysiert, d.h. vor dem Immuntest muß irgendein zeitraubender Extraktionspro^eß eingeschoben werden.

Aus der FR-OS 23 48494 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Gallensäure-Glycin-Konjugaten bekannt, bei dem

— eine Serumprobe mit einem gegenüber dem Gallensäure-GIycin-Konjugat spezifischen Antiserum und einem mit Glycin konjugierten Derivat derselben Gallensäure, die mit einem Indikator markiert ist, vermischt wird,

— das Gemisch inkubiert wird, so daß sich das Konjugat der zu bestimmenden Gallensäun; und das markierte Konjugat mit den Antikörpern des Antiserums verbinden,

— die antikörpergebundenen Reaktanten von den gebundenen abgetrennt werden und

— die r », kierte gebundene Fraktion zur Bestimmung des relativen Anteils des speziellen Gallensäurekonjugats in der Probe durch Vergleich mit Standardproben gemessen wird.

Bei diesem Verfahren sind jedoch keine Vorkehrungen getroffen, den störenden Einfluß der vorerwähnten, in der Serumprobe vorhandenen bindenden Proteine auszuschalten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur direkten immunologischen Bestimmung von Gallensäuren in Flüssigkeiten, wie Serum, Urin oder Gallenflüssigkeit, zu schaffen, bei dem störende Einflüsse von bindenden Proteinen ausgeschaltet werden können, ohne daß eine vorherige Extraktion der zu untersuchenden Probe erforderlich ist.

Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist im Patentanspruch 1 gekennzeichnet. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Patentansprüchen 2—8 beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur qualitativen und quantitativen Bestimmung beliebiger Gallensäuren, wie Sulfothiocholsäure, Cholsäure, Chenodesoxycholsäure, Lithocholsäure oder Ursodesoxycholsäure und ihrer Aminosäurekonjugate, Sulfatester und Glucuronidkonjugate herangezogen werden. Die bedeutendsten Konjugate sind jene von Glycin und Taurin.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf Immuntests unabhängig von der angewendeten Markierungsmethode anwendbar. Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die spezielle Anwendung der Erfindung bei Radioimmunoassays, jedoch können die erfindungsgernäßen Vorteile auch bei mit Enzymen oder fluoreszie-

rend markierten Gallensäuren srbeitenden Tests verwirklicht werden.

Für die Bestimmung von Cbolsäiire wird als

Bindungshemmstoff vorzugsweise mit Barbital gepufferte 8-Anilino-l-naphthalinsa'fonsäure und für die Bestimmung von Sulfolithocholsäure vorzugsweise Natriumsylicylat verwendet

_|0 Beispiel 1

Radioimmunoassay auf Sulfolithocholylglycin

Dieses Beispiel erläutert eine Methode zur Bestimmung von Sulfolithocholylglycin (SLCG) in einer unextrahierten biologischen Flüssigkeit Es werden folgende Reagentien verwendet:

1. Für Standardtests geeignetes SLCG-Pulver wird nach der Methode von Palmer und Bolt J. Lipid Res. 12,671 (1971) hergestellt Das Pulver wird nach physikochemischen Methoden vollständig auf seine Identität und Reinheit geprüft und dient zur Herstellung der Standards, des Traceranalogen und Immunogens. Für die Herstellung der Standards

_Ί. wird zuerst eine Vorratslösung von SLCG zubereitet Eine bekannte Menge von SLCG-Pulver wird unter Verwendung von 0,08% Ammoniak in einer Lösung von 50 ml Wasser/Äthanol gelöst Die Vorratslösung wird dann auf die gewünschte Konzentration in einer Lösung von menschlichem Serumalbumin und Rinder-Gammaglobulin (BGG) in 0,9%iger Kochsalzlösung verdünnt

2. ¹²⁵J-SLCG-Tracer wird hergestellt indem man zuerst durch Kopplung von SLCG an Histamin Sulfolithocholylglycylhistamin (SLCG-H) erzeugt. Das SLCG-H wird dann mit Jodogen (Pierce Chemical Co, Rockford, Illinois) jodiert und mit Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey) gereinigt

3. SLCG-Antiserum wird gewonnen, indem man Kaninchen mit an Rinder-Serumalbumin kovalent gebundenem SLCG unter Verwendung von wasserlöslichem Äthylcarbodiimid immunisiert.

4. Natriumsalicylat (Reagensqualität) wird von mehreren Herstellern (J. T. Baker Chemical Co., Phillipburg, New Jersey und Mallinckrodt Chemical Co_n St. Louis, Missouri) erhalten.

5. Der beim SLCG-RIA verwendete Puffer ist 0,05 m Phosphat, pH 7,5, mit einem Gehalt von 0,9% Natriumchlorid, 0,02 m Natriumsalicylat, 0,75% Rinder-Gammaglobulin und 0,01% Thimerosal. Der Radioimmunoassay wird wie folgt durchgeführt:

SLCG-RIA-Testverfahren

Wenn eine Gruppe unbekannter Proben analysiert wird, muß jeweils eine Standardkurve aufgestellt werden.

1. Alle Testreagentien werden auf Raumtemperatur gebracht

2. Die Röhrchen werden für den Test wie folgt bezeichnet:

a) Die mit »TCT« (Gesamtzählröhrchen) markierten Röhrchen enthalten aliquote Mengen der '^J-Sulfoliihocholylglycylhistamin-Reagenslösung. Diese Röhrchen dienen zur Bestimmung der Gesamtradioaktivität.

b) Die Röhrchen 3 und 4 dienen zur Bestimmung der nicht-spezifischen Bindung (NSB), sofern diese Prüfung durchgeführt wird.

c) Die Röhrchen 5 bis 16 sind Standards, anhand welcher die Standardkurve aufgestellt wird:

Röhrchen 5 und 6, 0 μg/100 mlSLCG
Röhrchen 7 und 8, l(^g/100 ml SLCG
Röhrchen 9 und 10, 25 μg/100 ml SLCG
Röhrchen 11 und 12, 50 μg/100 ml SLCG
Röhrchen 13 und 14,100 μg/100 ml SLCG
Röhrchen 15 und 16,250 μg/100 ml SLCG.

d) Die Röhrchen 17 etc. dienen für unbekannte Proben (jeweils doppelt).

3. a) Man pipettiert 25 μΐ der SLCG-Standards in

die passend markierten Röhrchen 5 bis 16;

b) man pipettiert 25 μΐ der unbekannten Proben in die passend markierten Röhrchen beginnend mit 17;

c) man pipettiert 25 μΐ SLCG-Standard, 0μg/100ml, und 200 μΐ PBS-BGG-Puffer in die Röhrchen 3 und 4 (NSB).

4. Man pipettiert 200 μΐ ¹²⁵J-Sulfolithocholylglycylhi stamin-Reagenslösung in sämtliche Röhrchen, mischt am Probenmischer 3 bis 5 Sekunden oder schüttelt das Prüfröhrchengestell mit der Hand.

5. Man pipettiert vorsichtig und ohne Verzögerung μΐ SLCG-Antiserum (Kaninchen) in sämtliche Röhrchen, mit Ausnahme der Röhrchen 1 bis 4, mischt am Probenmischer 3 bis 5 Sekunden oder schüttelt das Prüfröhrchengestell mit der Hand.

6. Man bedeckt sämtliche Röhrchen mit Parafilm® oder einem entsprechenden Materia! und inkubiert lStd.bei37°C±2°C.

7. Nach der Inkubierung pipettiert man 2 ml PoIyäthylenglykollösung in sämtliche Röhrchen mit der Ausnahme der Röhrchen 1 und 2 (Gesamtzählröhrchen; TCT). Die während der Polyäthylenglykolzugabe verstreichende Gesamtzeit soll nicht mehr als

10 Min. betragen. Man mischt die Proben am Probenmischer 5 Sek. kräftig durch.

8. Sofort (innerhalb von 15 Min. nach der Polyäthylenglykolzugabe) zentrifugiert man die Polyäthylenglykol enthaltenden Röhrchen 10 Min. bei Raumtemperatur und 1000 χ g.

9. Man entnimmt die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge (ohne den Niederschlag aufzuwirbeln), dekantiert die überstehende Lösung und wischt den Röhrchenrand mit Löschpapier ab.

10. Man zählt die in jedem Röhrchen einschließlich TCT (1 und 2) verbliebene Radioaktivität während jeweils mindestens 1 Minute. Nötigenfalls subtrahiert man den Hintergrund und notiert das Resultat als Netto-cpm-Wert.

11. Man berechnet die Resultate.

Typische Resultate für den SLCG-Radioimmunoassay sind aus F i g. 1 ersichtlich, welche eine Standardkurve wiedergibt, die den Bereich der SLCG-Konzentration von 0 bis 250 u.g/100 ml umfaßt

Die Reproduzierbarkeit des SLCG-RIA ist aus Tabelle I ersichtlich, in welcher die Inter- und Intra-Test-Genauigkeit wiedergegeben ist Die Genauigkeit des SLCG-RIA wird dadurch ermittelt, daß man eine Gruppe von vier Serumproben jeweils zehnfach an drei aufeinanderfolgenden Testanlässen unter Verwendung einer Materialcharge testet. Drei Schätzungen der Variabilität werden berechnet: Inter-Test, Intra-Test und gesamte Variabilität X ist definiert als ganzer Mittelwert über die drei Testanlässe.

Die Genauigkeit des SLCG-RIA geht aus Tabelle II hervor, welche die Ermittlung von zu normalem menschlichen Serum gegebenem SLCG wiedergibt Die Tabelle zeigt eine gute Ermittlung von SLCG, was für eine hohe Genauigkeit spricht Die Probengruppen A, B, C und D sind abgestreifte normale menschliche Seren; NHS Nr. 118 und Nr. 127 sind Seren von freiwilligen Versuchspersonen. Zu der zu prüfenden Serumprobe werden 0,40,80 oder 120 μg/dl SLCG zugesetzt

Tabelle I

SLCG-RIA-Intra- und -Inter-Test-Genauigkeit

Probengruppe	INTRA-TEST	Basis Nr. 2	Basis Nr. 3	INTER-TEST	GESAMTER X
	Basis Nr. 1			Mittelwert der	ganzer Mittelwert
		π = 10	η = 10	Mittelwerte
	η = 10	11,1 !-ig/dl	9,1 ug/dl	n = 3	π = 30
SA-2 X	12,1 ug/dl.	1,1	0,9	10,8 μΕ/dl	10,8 μς/άΐ
S.D.	0,9	10,1%	10,5%	1,5	1,6
CV.	7,7%	44,4 μβ/dl	41,3 [ig/dl	14,0%	14,7%
SB-2 X	444 i^/dl	2,0	2,6	43,4 μg/dl	43,4 μ£/α1
S.D.	1,8	4,5%	6,2%	1,8	24
CV.	4,1%	82,3 μ_ε/ά1	79,9 με/ά\	4,2%	5,9%
SC-2 X	81,9 μg/dl	2,2	24	81,4 yg/dl	81,4 ^dI
S.D.	3,3	2,7%	3,2%	U	2,9
CV.	4,1%	147,1 j/g/dl	147,3 {xg/dl	1,5%	34%
SD-2 X	147,1 μβ/dl	6,0	6,9	147,2 fig/dl	147,1 μg/dl
S.D.	6,3	4.1%	4.7%	0,10	ta
CV.	4.3%		0,08%	4.2%

Tabelle II	Kein Zusatz von SLCG	40 y.g/dl	Ermittlung des zuge setzten SLCG in %	80 ug/dl	Ermittlung des zuge setzten SLCG in %	120 ug/dl	Ermittlung des zuge setzten SLCG in %	Mittel wert in	I
	9,96	47,09	92,8	81,59	89,5	108,15	81,8	88	i
Test der SLCG-Ermittlung	39,11	79,84	101,8	116,31	96,5	154,31	96,0	98	I
Probe	81,22	119,22	95,0	147,59	83,0	186,16	87,4	88	I
Gruppe A	157,71	191,48	84,4	225,09	84,2	<250		84
Gruppe B	33,8	77,5	94	119,1	107	160,2	105	102
Gruppe C	19,1	65,3	115	107,0	HO	148,0	107	111
Gruppe D
NHSNr. 118
NHS Nr. 127

F i g. 2 veranschaulicht die Wirkung von Serumproteinen auf den SLCG-RIA. Man vergleicht zwei Standardkurven, von denen eine (1) unter Verwendung eines Puffers und die zweite (2) unter Verwendung von nach der Methode von Simmonds et al., Gastroenterology (1973), 65, 705, hergestelltem SLCG-freiem Serum aufgestellt wird. Das Serum wird getestet, indem man die Entfernung von ³HSLCG-Tracer verfolgt, um sicher zu sein, daß das Serum frei von SLCG ist. Die beiden Kurven lassen sich nicht überlagern bzw. in Deckung bringen, woraus die Hemmwirkungen bzw. Beeinträchtigungen der Serumproteine , gegenüber dem SLCG-RIA hervorgehen, wenn man das SLCG nicht von den Serumproteinen extrahiert oder befreit.

F i g. 3 zeigt denselben Vergleich von zwei Standardkurven, von denen eine unter Anwendung eines Puffers und eine unter Anwendung eines gallenfreien Serums aufgestellt wurde. Dieser Vergleich wird jedoch unter Verwendung des vorgenannten Salicylatpuffers durchgeführt Die beiden Kurven lassen sich jetzt in Deckung bringen, woraus hervorgeht, daß Salicylat die Bindungswirkungen des Serumproteins beseitigt [J. Rudman, CHn. Invest 36 (1957), 530]. Die Salicylatpuffersysteme gestatten somit die direkte Durchführung des SLCG-RIA an unextrahierten Proben.

Der an normalen Versuchspersonen, die keine Nahrung zu sich nehmen, nach dem SLCG-RIA erzielte Mittelwert beträgt 0,7 mM. Dies steht in guter Übereinstimmung mit dem Mittelwert von 0,6 mM für normale Versuchspersonen, welcher von Campbell, Clinica Chimica Acta 631 (1975), 248-262, nach einer Gasflüssigkeitschromatographiemethode unter Ver- Wendung organischer Lösungsmittel und lonenaustauschsäulen zur Extraktion des SLCG vom Serum erhalten wurde.

B e i s ρ i e 1 2

Radioimmunoassay zur Bestimmung von Cholylglyrin

Dieses Beispiel zeigt, daß Cholylglycin in einer unextrahierten biologischen Flüssigkeit unter Verwendung einer mit Barbital gepufferten ANS als Bindungs- hemmstoff getestet werden kann. Es werden folgende Reagentien für den Test zubereitet:

1. Cholylglycin (CG) (Sigman Chemical Co, St Louis, Missouri) wird für Standards, Immunogen und Tracer verwendet Dieses Pulver wird nach physikochemischen Methoden vollständig auf seine Identität und Reinheit untersucht; man stellt fest.

65 daß es etwa 99% reines CG ist. Die Standards werden hergestellt, indem man eine bekannte Menge des CG-Pulvers in 50%igem wäßrigem Äthanol löst. Diese Vorratslösung wird dann in entweder einen Proteinpuffer oder einem gallensäurefreiem Serum verdünnt. Das gallensäurefreie Serum wird nach der Methode von Simmonds et al., Gastroenterology (1973), 65, 705, hergestellt. Das Serum wird getestet, indem man die Entfernung von ³HCG-Tracer verfolgt, um sicher zu sein, daß das Serum frei von CG ist.

2. ¹²⁵J-CG-Tracer wird hergestellt, indem man Tyrosin kovalent an Cholylglycin zur Bildung von Cholylglycyltyrosin (CGT) koppelt. Das CGT wird dann mit Hilfe von Chloramin-T jodiert und mit Hilfe von LH-20 Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey) gereinigt.

3. Ein CG-Antiserum wird erhalten, indem man Kaninchen mit an Rinderserumalbumin kovalent gebundenem CG unter Verwendung von wasserlöslichem Äthylcarbodiimid immunisiert.

4. 8-Anilino-l-naphthalinsulfonsäure (ANS) wird erhalten von Eastman Organic Chemicals (Rochester, New York).

5. Der beim Test verwendete Puffer ist 0,05 m Barbital pH 8,6, mit 0,4 millimolarer ANS, 0,75 g % Rinder-Gammaglobulin und 0,01 % Thimerosal.

Der Radioimmunoassay wird wie folgt durchgeführt:
CGRIA-Testverfahren

Bei der Analyse einer Gruppe unbekannter Proben wird jeweils eine Standardkurve aufgestellt:

1. Alle Testreagentien werden auf Raumtemperatur gebracht

2. Die Röhrchen werden für den Test wie folgt bezeichnet:

a) Die mit »TCT« (Gesamtzählröhrchen) bezeichneten Röhrchen enthalten aliquote Mengen der !^J-Cholylglycyltyrosm-Reagenslösung. Diese Röhrchen dienen zur Bestimmung der Gesamtradioaktivität

b) Die Röhrchen 3 und 4 dienen zur Bestimmung der nicht-spezifischen Bindung (NSB), sofern diese Prüfung durchgeführt wird.

c) Die Röhrchen 5 bis 16 sind Standards, mit Hilfe welcher die Standardkurve aufgestellt wird:

Röhrchen 5 und 6, Röhrchen 7 und 8,

Oug/lOOmlCG 25ug/100mlCG

Röhrchen 9 und 10, 100 μg/100 ml CG
Röhrchen 11 und 12, 250 μg/100 ml CG
Röhrchen 13 und 14,1000 μg/100 ml CG
Röhrchen 15 und 16,4000 μg/100 ml CG

d) Die Röhrchen 17 etc. dienen für unbekannte Proben (jeweils doppelt).

3. a) Man pipettiert 25 μΐ der CG-Standards in die

passend markierten Röhrchen 5 bis 16;

c) man pipettiert 25 μΐ CG-Standard, 0μg/100ml, und 200 μΐ 0,06 m Barbitalpuffer in die Röhrchen 3 und 4 (NSB).

4. Man pipettiert 200 μΐ > ²⁵J-Cholylglycyltyrosin-Reagenslösung in sämtliche Röhrchen. Man vermischt sämtliche Röhrchen mit Ausnahme der Röhrchen 1 und 2 (TCT) am Probenmischer 3 bis 5 Sekunden oder schüttelt das Prüfröhrchengestell mit der Hand.

5. Man pipettiert vorsichtig und ohne Verzögerung 200 μΐ CG-Antiserum (Kaninchen) in sämtliche Röhrchen, mit Ausnahme der Röhrchen 1 bis 4, mischt am Probenmischer 3 bis 5 Sekunden oder schüttelt das Prüfröhrchengestell mit der Hand.

6. Man bedeckt sämtliche Röhrchen mit Parafilm® oder einem entsprechenden Material und inkubiert 1 Stunde bei Raumtemperatur.

7. Nach der Inkubierung pipettiert man 2 ml PoIyäthylenglykollösung in sämtliche Röhrchen mit Ausnahme der Röhrchen 1 und 2 (Gesam'czählröhrchen;TCT). Die während der Polyäthylenglykolzugabe verstreichende Gesamtzeit soll nicht mehr als 10 Min. betragen. Man mischt die Proben am Probenmischer 5 Sek. kräftig durch.

9. Man entnimmt die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge (ohne den Niederschlag aufzuwirbeln), dekantiert die überstehende Lösung und wischt den Röhrchenrarid mit Löschpapier ab.

10. Man zählt die in jedem Röhrchen einschließlich TCT (1 und 2) verbliebene Radioaktivität während jeweils mindestens 1 Minute. Nötigenfalls subtrahiert man den Hintergrund und notiert das Resultat als Netto-cpm-Wert

11. Man berechnet die Resultate.

F i g. 4 zeigt die Wirkung von Serumproteinen auf den CG-RIA. Man vergleicht zwei Standardkurven, von denen eine untfr Verwendung eines Puffers und die zweite unter Verwendung eines CG-freien Serums (wie

Tabelle III

SLCG-RIA-Intra- und -Inter-Test-Genauigkeit

vorstehend beschrieben) aufgestellt wurde. Die beiden Kurven lassen sich nicht in Deckung bringen, was die Hemmwirkungen der Serumproteine gegenüber dem CG-RIA zeigt, wenn man das CG nicht extrahiert oder von den Serumproteinen befreit.

F i g. 5 veranschaulicht denselben Vergleich von zwei Standardkurven, von denen eine unter Verwendung eines Puffers und die zweite unter Verwendung eines CG-freien Serums aufgestellt wurde. Dieser Vergleich

ίο wird jedoch mit dem vorstehend beschriebenen Barbital-ANS-Puffer durchgeführt (vgl. die vorgenannten Erläuterungen bezüglich »Reagentien«). Die beiden Kurven lassen sich jetzt in Deckung bringen, woraus hervorgeht, daß Salicylat die Bindungswirkung des Serumproteins gegenüber CG beseitigt (J. Rudman, Clin. Invest. 36 [1957], 530). Das Barbital-ANS-Puffersystem ermöglicht somit eine direkte Durchführung des CG-RIA an unextrahierten Proben.

Bei normalen Versuchspersonen, welche keine Nahrung zu sich nehmen, beträgt der nach diesem CG-RIA erzielte Mittelwert 0,43 mM. Dies steht im Einklang mit vorher publizierten normalen Werten für einen CG-RIA, bei dem eine Extraktionsmethode vorgenommen wurde (Maters, Clinicia Chimica Acta 725 [1976], 39 bis 48).

Die Reproduzierbarkeit des CG-RIA wird durch Tabelle III veranschaulicht, in welcher die Inter- und Intra-Test-Genauigkeit des CG-RIA wiedergegeben wird. Die Genauigkeit wird durch Bestimmung einer Gruppe von vier Serumsammelproben bei jeweils 1Ofacher Durchführung an drei aufeinanderfolgenden Anlassen unter Verwendung einer Materialcharge ermittelt. Es werden drei Schätzungen der Variabilität berechnet: Inter-Test, Intra-Test und gesamte Variabilitat. X ist definiert als ganzer Mittelwert über die drei Testanlässe.

Die Genauigkeit des CG-RIA wird in Tabelle IV veranschaulicht, welche eine gute Gewinnung von normalem menschlichem Serum zugesetztem CG erkennen läßt Die gute Gewinnung zeigt eine hohe Genauigkeit an. Zur weiteren Bestätigung wird die Ermittlung unter Verwendung von Seren mit verschiedenen abnormalen Proteingehalten wiederholt (hypoalbumin, hypergammaglobulin und hypogammaglobulin).

Der mit Barbital-ANS-Puffer durchgeführte CG-RIA zeigt eine gute Gewinnung mit verschiedenen Gehalten an abnormalen Proteinen, woraus hervorgeht, daß der. Test für Seren mit Proteinabnormalitäten gut brauchbar ist

so Um die Brauchbarkeit des Tests für Harn und Galle nachzuweisen, werden Parallelitätsuntersuchungen durch Verdünnen mehrerer Harn- und Gallenproben durchgeführt Die verdünnten Proben ergeben mit der Standardkurve parallel verlaufende Kurven.

Probengruppe	INTRA-TEST	Basis Nr. 2	Basis Nr. 3	INTER-TEST	GESAMT
	Basis Nr. 1			Mittelwert der -	ganzer Mittelwert
		η =-- 10	n= 10	Mittelwerte
	π= 10		71 = 3	n=30

S.D.

CV.

79
2,8
3.6%

2,5
3,1%

75ji£/dl

5,9%

79
3,5
4,5%

78tig/dl

4,6

5,3%

	11	29	16 783	12	GESAMT
Fortsetzung					ganzer Mittelwert
Probengruppe	INTRA-TEST			INTER-TEST	Ii = 30
	Basis Nr. 1	Basis Nr. 2	Basis Nr. 3	Mittelwert tier Mittelwerte	240 ag/dl 18
	H = 10	η - H)	n = 10	n = 3	7,4%
CB-I X S.D.	254 fjLg/dl 21	238 ag/dl 97	231 ag/dl 11,8	241 ag/dl 11,8	1828 ag/dl 162
CV.	8,5%	4,1%	5,1%	4,9%	8,9%
CC-I X S.D.	1949 ijLg/dl	1722 ag/dl	1015 tjig/dl	1829 ag/dl 114	772 μg/ui 73
CV.	4,6%	9,6%	7,9%	6,2%	9,3%
CD-I X S.D.	858 ag/dl	710 ag/dl	753 ag/di	774 ag/di 76
CV.	4.7%	1.6%	6,1%	9,8%

Genauigkeit

Tabelle IV zeigt die tatsächliche Ermittlung von Seren mit abnormal geringen Konzentrationen von

gepulvertem Cholyglycin aus menschlichem Serum. Die 25 Immunoglobulin G. Die Proben 16, 17,18, 24, 27, 33, 34,

Proben A, B und C sind normale menschliche Seren. Die 35 und 36 sind menschliche Seren mit abnormal

Proben 14, 20, 21, 22, 23, 28, 29 und 30 sind menschliche erhöhten Konzentrationen von Immunoglobulin G.

Tabelle IV

Untersuchung der CG-Ermittlung

	Probe	Kein Zusatz von CG	9,25 ug/ml CG-Zusatz	% Ermittlung des zugestzten CG
	Blindprobe	0,02 ag/ml	9,25	100
Normal	A	0,80	9,3	92
	B	2,37	11,2	95
	C	6,97	15,43	92
	14	0.16	9.27	98
Hypo Ig G	20	0,21	9,58	101
	21	0.15	10,0	106
	22	1.33	10,03	94
	23	0,23	9.87	KM
	28	0.16	9.39	100
	29	0.17	9,65	102
	30	0,19	9.30	98
Hyper Ig G	16	0,26	9,36	98
	17	0,11	9.10	97
	18	0,08	8,08	86
	24	0,31	9,25	97
	27	0,13	8,61	92
	33	0,18	9,19	97
	34	0,83	9,47	97
	35	0,02	9,20	99
	36	3,42	12,59	99
X% Gewinnung	Nonna! = 93% HyperlgG = 96% Hypo Ig G = 10i%
	Hierzu 3	Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur immunologischen Bestimmung einer Gallensäure oder ihres Konjugats in einer unextrahierten Serumprobe, bei dem man

a) eine Serumprobe mit einem gegenüber der zu testenden speziellen Gallensäure spezifischen Antiserum und mit derselben, mit einem Indikator markierten Gallensäure vermischt,

b) das Gemisch von Stufe a) inkubiert, so daß sich jegliche Gallensäure des zu testenden Typs und die markierte Gallensäure mit den Antikörpern des Antiserums verbinden können,

c) die antikörpergebundenen Reaktanten von den ungebundenen abtrennt,

d) die markierte gebundene Fraktion von Stufe c) zur Bestimmung des relativen Anteils der Gallensäure in der Probe durch Vergleich mit Standardproben mißt,

dadurch gekennzeichnet, daß man

e) den Test in Gegenwart einer ausreichenden Konzentration eines Bindungshemmstoffs durchführt, der in der Lage ist, die Bindung der Gallensäuren durch in der Serprobe vorhandene Proteine zu hemmen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man.als Bindungshemmstoff 8-Anilino-1 -naphthalinsulfonsäure, Natriumbarbital und/oder mindestens ein Salicylat verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bindungshemmstoff Natriumsalicylat verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende oder zu bestimmende Gallensäure Cholsäure oder Sulfolithocholsäure ist

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende oder zu bestimmende Gallensäure Cholsäure und der Bindungshemmstoff mit Barbital gepufferte 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende oder zu bestimmende Gallensäure Sulfolithocholsäure und der Bindungshemmstoff Natriumsalicylat ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Cholsäure in Form des Glycinkonjugats vorliegt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfolithocholsäure in Form des Glycinkonjugats vorliegt.