DE2716801C3 - Sulfolithocholylglycyltyramin und dessen↑125↑J-Derivat und Verwendung zur Bestimmung von Sulfolithocholylglycin in einer Serumprobe - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Sulfoliihocholyiglycyltyramin und sein mit '-J markiertes Derivat. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der markierten Verbindung gemäß Anspruch ί zur Bestimmung des Gehalts an immunoreaktiver, glycin-konjugierter Sulfoiithocholsäure in einer Serumprobe unter Verwendung der markierten, mit Glycin konjugierten SuuuUihuchüisäure.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, den Gehalt an glycin-konjugierter Sulfoiithocholsäure aus einer Probe zu bestimmen. Bei dem Verfahren werden die folgenden Stufen durchgeführt. Es wird ein Antiserum hergestellt, das für die glycinkonjugierte Sulfoiithocholsäure spezifisch ist; die Serumprobe wird mit dem Antiserum und mit dem glycin-konjugierten Sulfolithocholsäure-tryaminderivat, das mit einem Markierangsmittel markiert ist, vermischt; das Probengemisch wird inkubiert, so daß die Antikörper des Antiserums an die glycin-konjugierte Sulfoiithocholsäure der Probe und an das markierte, gfycin-konjugierte Derivat gebunden werden; die gebundenen Antikörpermaterialien werden von den nichtgebundenen Materialien abgetrennt; und der Gehalt an markiertem Material in einer der abgetrennten Fraktionen wird bestimmt; durch Vergleich mit Standardproben kann die Menge an Sulfolithocholsäurekonjugat bestimmt werden.

Es ist allgemein bekannt, daß die Gesamtgallensäurekonzentration bei Patienten, die Leber- und Gallenkrankheiten haben, erhöht ist. Die primären Gallensäuren, Cholsäure und Chenodeoxycholsäure werden von der Leber als Glycin- oder Taurin-Konjugate abgeschieden und in der Gallenblase gespeichert. Obgleich einige von der Gallenblase in dem Blut absorbiert werden, wird die Hauptmenge mit der Galle durch den üblichen Gallengang in das Lumen des Duodenum abgeschieden, wo sie die Absorption von Cholesterin und die Verdauung und Absorption von Fettsäuren erleichtert. Die nichtverbrauchten, konjugierten Gallensäuren werden von den Blutbahnen bzw. -gefäßen absorbiert, durchsetzen bzw. durchströmen das Duodenum und werden über das Leberzugangssystem in die Leber geleitet. Diejenigen Gallensäuren, die nicht im Duodenum gewonnen werden, werden häufig durch die Einwirkung der Darmflora in sekundäre Gallensäuren umgewandelt. Diese werden ebenfalls im Blut absorbiert und über das Leber* zugangssystem in die Leber zurückgeführt. Bei normalen Individuen werden die konjugierten Gallensäuren aus dem Kreislauf durch die Leber entfernt und zu den konjugierten, primären Gallensäuren recyclisiert. Wenn die Hepatocyten durch Infektion oder Chemikalien beschädigt wurden, können sie die Gallensäuren nicht mehr auf übliche Weise recyclisieren. Die Menge der betroffenen Zellen ist durch quantitative Beziehungen zwischen den verschiedenen primären Gallensäurekonjugaten und ihren entsprechenden sekundären Konjugaten erkennbar.

Zahlreiche Methoden wurden zur Bestimmung der Gallensäure mit unterschiedlichem Erfolg verwendet. Eine der erfolgreichsten Methoden ist die Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (G-LC). Sie besitzt jedoch den Nachteil, daß relativ große Proben an Serum des Patienten, teure Vorrichtungen und eine beachtliche Vorbehandlung der Probe für die Isolierung der konjugierten Gallensäuren von den nichtkonjugierten Gallensäuren erforderlich sind. Die Proben-Vorbehandlung umfaßt die Isolierung, Verseifung und Derivatbildung und bewirkt, daß die G-LC-Verfahren nicht mehr in den Rahmen der üblichen Laboratorien fallen.

Ein empfindlicher Radioimmunoassa (RIA) für Konjugate der Cholsäure, einer primären Gallensäure, wurde zuerst von Sim monds et al inRadioimmunoassay of Conjugated Cholyl Bile Acids in Serum, Gästroenterolögy 65: 705—711 (1973), beschrieben. Diese Gruppe der Mayoklinik fand heraus, daß ihr RIA für Konjugate von Cholsäure spezifisch ist. Weitere klinische Untersuchungen an der Mayoklinik von Rochester, Minnesota, werden von Korman et al. in New England Journal of Medicine, 290: 1399 (1974), beschrieben. Diese Versuche zeigen erhöhte Cholatkonjugate in den Sera von Patienten mit chronischer Hepatitis, bei denen die Leberfunktionstests normal sind, und bei Patienten mit anicterischer, viraler Hepatitis. Die klinische Verwendbarkeit dieser Tests wurde weiter bei 38 Patienten mit chronischer aktiver Hepatitis gezeigt, bei denen der RIA der Cholatkonjugate ein empfindlicherer Indikator für die Krankheit ist als die traditionellen Tests (Bromsulfathalien-Retention, Pro-Thrombin-Zeit, Serumbilirubin, Gesamtproteine, alkalische Phosphatase und Transaminase). Die Serumgehalte von Gallensäuren, angegeben als Cholatkonjugate, gehen Scrumenzymerhöhungen bei solchen Patienten voraus, die schließlich rezidivieren. Obgleich dieses Verfahren der Gruppe der Mayoklinik eine gute Spezifizität für Cholatkonjugate besitzt, ist es nicht möglich, mit diesem Verfahren zwischen den Glycin- und Taurincholatkonjugaten zu unterscheiden. G. M. Murphy et al, The Preparation and Propertiesof an Antiserum for the Radioimmunoassay of Serum Conjugated Cholic Acid, Cünica Chimica Acta, 54: 81-89 (1974), wiederholten die Arbeiten von Simmonds et al unter Verwendung eines anderen Verfatirens für das Heptenkuppeln und erhielten im wesentlichen die gleichen Ergebnisse.

Obgleich Gallensäuren, wie Sulfoiithocholsäure, Cholsäure, Chenodeoxycholsäure, Deoxycholsäure, Lithocholsäure und ihre Konjugate, mit Aminosäuren, wie Glycin und Taurin, als tritierte ('H)-Formen hergestellt werden können, wie sie bei den oben beschriebenen Versuchen verwendet werden, sind sie als Tracers bzw. Indikatoren bei technisch durchzuführenden Immunoajsays unerwünscht, da sie (Π die Verwendung teurer /J-Zähler, die die meisten klinischen Laboratorien nicht besitzen, (2) die Verwendung von Scintillationsfluiden oder »Cocktails«, (3) die Verwendung spezieller Zählampullen, in die die Tracer-Lösungen übertragen werden müssen, und (4) die Beseitigung radioaktiver, organischer Lösungsmittelabfälle (verbrauchter »Cocktail«) erfordern.

Es besteht daher ein Bedarf an einem Test, der di-

rekt mit einer Seruraprobe durchgeführt werden kann und der Leber- bzw. Galle-Information über ein primäres Lithocholsäurekonjugat und sein entsprechendes sekundäres Konjugat ergibt und der direkt in einem analytischen Instrument ohne spezielle Lösungen oder Ampullen durchgeführt werden kann.

Die Erfindung betrifft die Untersuchung der Leberfunktion von Menschen und anderen warmblütigen Tieren und betrifft speziell ein Verfahren zur Bestimmung des Serumgehalts an glycin-konjugierter Sulfolithocholsäure als Indikation der Leberfunktion eines Lebewesens bzw. Säugetiere. Mit dem Verfahren kann der Gehalt in einer Probe von immunoreaktivem, glycin-konjugiertem Sulfolithocholylglycin (SLCG) gemessen werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die folgenden Stufen: Erzeugung eines Antiserums, das für Sulfolithocholsäure spezifisch ist; Vermischen einer Serumprobe mit dem Antiserum und dem gleichen, glycin-konjugierin Derivat, zu dem ein Tyraminmo- !ekültei! zugefügt wurde, der dann nach an. sich bekannten Verfahren mit einem Markierungsmittel markiert oder bezeichnet werden kann. Als Markierungsmittel wird ¹²⁵J verwendet. Zur Bindung der Antikörper des Antiserums an die glycin-konjugierte Sulfolithocholsäure der Probe und an das markierte, glycin-konjugierte Derivat wird aas Probengemisch inkubiert. Dann werden die an die Antikörper gebundenen Materialien von den nichtgebundenen Materialien abgetrennt, und der Gehalt an markiertem Derivat in den abgetrennten Fraktionen wird bestimmt, wodurch die Menge an Sulfolithocholsäurekonjugat in der Probe durch Verglekh mit tiandardproben bestimmt werden kann.

Bei dem erfindungsgemäßen Ve. rahren ist es wesentlich, daß ein hochspezifisches Antiserum für die zu prüfende glycin-konjugierte Sulfolithocholsäure verwendet wird. Das Antiserum, das für das Sulfolithocholsäurekonjugat spezifisch ist, enthält als Grundlage reine Sulfolithocholsäure. Die glycin-konjugierte Sulfolithocholsäure, die im Handel erhältlich ist, kann dünnschichtchromatographisch unter Verwendung an sich bekannter Verfahren gereinigt werden.

Indikatoren, die mit /-emittierenden Radioisotopen oder Enzymen oder fluoreszierenden Molekülen markiert sind, oder Elektronenspinnresonanz(ESR)-Konjugate sind besser als die bekannten, mit Tritium behandelten Indikatoren, da sie direkt in einem analytischen Instrument ohne spezielle Lösungen oder Ampullen verwendet werden können. Gallensäure- oder Galleiisäurekonjugat-Indikatoren von jeder dieser Klasse können auf folgende Weise hergestellt werden.

Beispie!
Tyraminderivat von Sulfolithocholylglycin

Diese Substanz wird als hellgelber Feststoff in Form des Pyridiniumsalzes von 3-Sulfolithocholylglycyltyramin erhalten. Man nimmt an, daß es ein Monohydrat mit einem Molekulargewicht von 730 ist. Es ist sehr löslich in Methanol und Äthanol, etwas löslich in Wasser und fast unlöslich in Äther oder Methylenchlorid. Aus ihrem derzeitigen Reinigungszustand schätzt man, daß sie etwa 95% rein ist. Bei der Herstellung werden die folgenden Stufen durchgeführt:
('.) Das Diammoniumsalz von Glycolithocholsäure-3-sulfat wird gemäß dem Verfahren von Palmer und Bolt, J. Lipid Research, 12, 671-67S) (1971), unter Verwendung des bekannten Glycolithocholsäure-natriumsalzes als Ausgangsmaterial hergestellt.

(2) Das DiammoniumsaSz wird in das Dipyridiniumsalz überführt.

(3) Die Kupplung von Tyramin erfolgt unter Verwendung von Dicyclohexyl-carbodiimid (DCCI) in Pyridin.

(4) Der Dicyclohexylharnstoff und andere Nebenprodukte werde.i durch alternierende Behandlung mit Wasser, Methylenchlorid und Methanol entfernt.

Dieses Produkt zeigt die folgenden Werte:

Die Dünnschichtchromatographie (TLC) zeigt an, daß hauptsächlich eine neue Substanz und eine geringe Menge einer Iipophyleren Verunreinigung gebildet wurden. Freies Tyramin ist abwesend.

Das NMR-Spektrum zeigt die Anwesenheit von Lithocholsäure, Tyramin und Pyridinringsysternen an wie auch eine Glycin -CH₂-Gruppe in etwa den erwarteten Verhältnissen.

Die Suifatestergruppe wird durch das IR-Spektrum (KBr-Preßling), wo eine Absorption bei 1215 cm"' auftritt, und durch die elementare Schwefelanalyse festgestellt. Die Elementaranalyse ergibt die folgenden Ergebnisse:

	Ge	Hctcchn.	Mono-	Berechn.	Dihydrat
	funden	h>drat		C„H„N	,O7S 2H2O
		C39H57N	,O7S H2O
Schwefel	4.67	4,39		4,29
Kohlenstoff	62,6	64.'.		62,6
i() Wasserstoff	8,30	8.14		8,2!
Stickstoff	5,90	5.75		5,6.1
Asche	keine	-		-

Claims (2)

Patentansprüche;

1. Suifoüthocholyglycyltyramin und sein mit ³M markiertes Derivat.

2. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 zur Bestimmung des Gehaltes an Sulfolithocholylglycin in einer Serumprobe.