DE2716801A1

DE2716801A1 - Verfahren zur bestimmung des gehalts an gallensaeuren in einer probe unter verwendung markierter, konjugierter gallensaeurederivate und derivate zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2716801A1
Application number: DE19772716801
Authority: DE
Inventors: John Wayne Cole; Laurence Mark Cummins; Billy Joe Green; Harry Franklin Hixson
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1976-04-16
Filing date: 1977-04-15
Publication date: 1977-10-20
Also published as: DE2716801C3; FR2348494A1; DE2716801B2; FR2348494B1; JPS52128215A; BE853669A; JPS5851000B2

Description

27 1B8Ü

Dr.-lnfl. V/aüer Abitz Dr. Dice Γ. Μ ο rf Dipl.-ri'ys. !.1 'Jrilscliiuder 8 München Sb, Pienzenauerstr. 28

15. APRIL 1977 3301

ABBOTT LABORATORIES North Chicago, Illinois, V.St.A.

Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Gallensäuren in einer Probe unter Verwendung markierter, konjugierter Gallensäurederivate und Derivate zur Durchführung des Verfahrens

709842/1

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an spezifischen, immunoreaktiven, glycin-konjugierten Gallensäuren in einer Probe unter Verwendung markierter, konjugierter Gallensäurederivate.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, den Gehalt an einer spezifischen, glycin-konjugierten Gallensäure aus der Gruppe Cholylglycin, Chenodeoxycholylglycin, Deoxycholylglycin und Sulfolithocholylglycin in einer Probe zu bestimmen. Bei dem Verfahren werden die folgenden Stufen durchgeführt. Es wird ein Antiserum hergestellt, das für eine der glycin-konjugierten Gallensäuren spezifisch ist; die Serumprobe wird mit dem Antiserum und mit dem gleichen glycin-konjugierten GaIlensäure-tyraminderivat, das mit einem Markierungsmittel markiert ist, vermischt; das Probengemisch wird inkubiert, so daß die Antikörper des Antiserums an die glycin-konjugierte Gallensäure der Probe und an das markierte, glycin-konjugierte Gallensäurederivat gebunden werden; die gebundenen Antikörpermaterialien werden von den nichtgebundenen Materialien abgetrennt; und der Gehalt an markiertem Material in einer der abgetrennten Fraktionen wird bestimmt; durch Vergleich mit Standardproben kann die Menge an spezifischem Gallensäurekonjugat bestimmt werden.

Es ist allgemein bekannt, daß die Gesamtgallensäurekonzentration bei Patienten, die Leber- und Gallenkrankheiten haben, erhöht ist. Die primären Gallensäuren, Cholsäure und Chenodeoxycholsäure werden von der Leber als Glycin- oder Taurin-Konjugate abgeschieden und in der Gallenblase gespeichert. Obgleich einige von der Gallenblase in dem Blut absorbiert werden, wird die Hauptmenge mit der Galle durch den üblichen Gallengang in das Lumen des Duodenum abgeschieden, wo sie die Absorption von Cholesterin und die Verdauung und Absorption von Fettsäuren erleichtert. Die nichtverbrauchten, konkugierten Gallensäuren werden von den Blutbahnen bzw. -gefäßen

- 1 709842/1039

absorbiert, durchsetzen bzv;. durchströmen das Duodenum und werden über das Leberzuga^ssystem in die Leber geleitet. Diejenigen Gallensäuren, die nicht im Duodenum gewonnen werden, werden häufig durch die Einwirkung der Darmflora in sekundäre Gallensäuren umgewandelt. Diese werden ebenfalls im Blut absorbiert und über das Leberzugangssystem in die Leber zurückgeführt. Bei normalen Individuen werden die konguierten Gallensäuren aus dem Kreislauf durch die Leber entfernt und zu den konjugierten, primären Gallensäuren recyclisiert. Wenn die Hepatocyten durch Infektion oder Chemikalien beschädigt wurden, können sie die Gallensäuren nicht mehr auf übliche Weise recyclisieren. Die Menge der betroffenen Zellen ist durch quantitative Beziehungen zwischen den verschiedenen primären Gallensäurekonjugaten und ihren entsprechenden sekundären Konjugaten erkennbar.

Zahlreiche Methoden wurden zur Bestimmung der Gallensäure mit unterschiedlichem Erfolg verwendet. Eine der erfolgreichsten Methoden ist die Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (G-LC). Sie besitzt jedoch den Nachteil, daß relativ große Proben an Serum des Patienten, teure Vorrichtungen und eine beachtliche Vorbehandlung der Probe für die Isolierung der konjugierten Gallensäuren von den nichtkonjugierten Gallensäuren erforderlich sind. Die Proben-Vorbehandlung umfaßt die Isolierung, Verseifung und Derivatbildung und bewirkt, daß die G-LC-Verfahren nicht mehr unter den Rahmen der üblichen Laboratorien fallen.

Ein empfindlicher Radioimmunoassay (RIA) für !Conjugate der Cholsäure, einer primären Gallensäure, wurde zuerst von Simmonds et al in Radioimmunoassay of Conjugated Cholyl Bile Acids in Serum, Gastroenterology 65: 705-711 (1973), beschrieben. Diese Gruppe der Mayoklinik fand heraus, daß ihr RIA für Konjugate von Cholsäure spezifisch ist. Weitere klinische Untersuchungen an der Mayoklinik von Rochester,

709842/1039

Minnesota, werden von Korman et al in New England Journal of Medicine, 290: 1399 (1974), beschrieben. Diese Versuche zeigen erhöhte Cholatkonjugate in den Sera von Patienten mit chronischer Hepatitis, bei denen eine Leberfunktionstests normal sind, und bei Patienten mit anicterischer, viraler Hepatitis. Die klinische Verwendbarkeit dieses Tests wurde weiter bei 38 Patienten mit chronischer aktiver Hepatitis gezeigt, bei denen der RIA der Cholatkonjugate ein empfindlicherer Indikator für die Krankheit ist als die tradionellen Tests (Bromsulfathalien-Retention, Pro-Thrombin-Zeit, Serumbilirubin, Gesamtproteine, alkalische Phosphatase und Transaminase). Die Serumgehalte von Gallensäuren, angegeben als Cholatkonjugate, gehen Serumenzymerhohungen bei solchen Patienten voraus, die schließlich rezidivieren. Obgleich dieses Verfahren der Gruppe der Mayoklinik eine gute Spezifizität für Cholatkonjugate besitzt, ist es nicht möglich, mit diesem Verfahren zwischen den Glycin- und Taurincholatkonjugaten zu unterscheiden. G.M. Murphy et al, The Preparation and Properties of an Antiserura for the Radioimmunoassay of Serum Conjugated Cholic Acid, Clinica Chimica Acta, 54: 81-89 (1974), wiederholten die Arbeiten von Simmonds et al unter Verwendung eines anderen Verfahrens für das Heptenkuppeln und erhielten im wesentlichen die gleichen Ergebnisse.

Obgleich Gallensäuren, wie SuIfolithocholsäure, Cholsäure, Chenodeoxycholsäure, Deoxycholsäure, Lithocholsäure und ihre Konjugate,mit Aminosäuren, wie Glycin und Taurin, als tritierte (^H)-Formen hergestellt werden können, wie sie bei den oben beschriebenen Versuchen verwendet werden, sind sie als Tracers bzw. Indikatoren bei technisch durchzuführenden Inmunoassays unerwünscht, da sie (1) die Verwendung teurer ß-Zähler, die die meisten klinischen Laboratorien nicht besitzen, (2) die Verwendung von Scintillationsfluiden oder "Cocktails", (3) die Verwendung spezieller Zählampullen, in die die Tracer-Lösungen übertragen werden müssen, und (4)

- 3 7 098A 2/1039

2 7 1 6 B U I

die Beseitigung radioaktiver, organischer Lösungsmittelabfälle (verbrauchter "Cocktail") erfordern.

Es besteht daher ein Bedarf an einem Test, der direkt mit einer Serumprobe durchgeführt werden kann und der Leber- bzw. Galle-Information über ein spezifisches, primäres Gallensäurekonjugat und sein entsprechendes sekundäres Gallensäurekonjugat ergibt und der direkt in einem analytischen Instrument ohne spezielle Lösungen oder Ampullen durchgeführt werden kann.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Untersuchung der Leberfunktion von Menschen und anderen warmblütigen Tieren und betrifft speziell ein Verfahren zur Bestimmung des Seruragehalts an spezifischen, glycin-konjugierten Gallensäuren als Indikation der Leberfunktion eines Lebewesens bzw. Säugetiers. Mit dem Verfahren kann der Gehalt in einer Probe einer spezifischen, immunoreaktiven, glycin-konjugierten, primären Gallensäure,entweder Cholylglycin (CG) oder Chenodeoxycholylglycin (CDG), bestimmt werden. Erfindungsgemäß kann der Gehalt an den entsprechenden immunoreaktiven, glycin-konjugierten sekundären Gallensäuren, Deoxycholylglycin (DG) oder Sulfolithocholylglycin (SLCG), gemessen werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die folgenden Stufen: Erzeugung eines Antiserums, das für eine der glycin-konjugierten Gallensäuren spezifisch ist; Vermischen einer Serumprobe mit dem Antiserum und dem gleichen, glycin-konjugierten Gallensäurederivat, zu dem ein Tyraminmolekülteil zugefügt wurde, der dann nach an sich bekannten Verfahren mit einem Markierungsmittel markiert oder bezeichnet werden kann. Solche Markierungsmittel sind z.B. physikalisch nachweisbare Substan-' zen, wie fluoreszierende Chemikalien, radioaktive Isotope, Enzyme u.a. Zur Bindung der Antikörper des Antiserums an die glycin-konjugierte Gallensäure der Probe und an das markierte, glycin-konjugierte Gallensäurederivat wird das Probenge-

709842/1039

27168Ü I

3301 ^

misch inkubiert. Dann werden die an die Antikörper gebundenen Materialien von den nichtgebundenen Materialien abgetrennt und der Gehalt an markierten Derivaten in einer der abgetrennten Fraktionen wird bestimmt, wodurch die Menge an spezifischem Gallensäurekonjugat in der Probe durch Vergleich mit Standardproben bestimmt werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Bestimmung des Gehalts an glycin-konjugierten Gallensäuren in irgendeiner Probe verwendet werden. Im folgenden wird es Jedoch insbesondere an einem Serumversuch erläutert.

Eine Hauptfunktion der Leber ist die Recyclisierung der Gallensäuren und Säurekonjugate. Eine Beeinträchtigung dieser Funktion ergibt ein geändertes Muster an Gallensäurekonjugat-Konzentrationen in dem Serum. Die quantitative Bestimmung der spezifischen Gallensäurekonjugate stellt eine Möglichkeit zur Bestimmung von Gallen- und Leberkrankheiten dar.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein direktes, empfindliches Verfahren zur Bestimmung und Messung des Gehalts an einer spezifischen, glycin-konjugierten Gallensäure im Serum als Indikation der Leberfunktion unter Verwendung von glycinkonjugierten Gallensäurederivaten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Bestimmung, ob die Leber erkrankt oder beschädigt ist, nützlich, und weiterhin ist es zur Bestimmung des Auftretens von Leber- und Gallenkrankheiten beim Menschen einschließlich viraler Hepatitis, hepatitischen Tumoren, Gallenstau, hepatitischer Zirrhose und Gallenatresia nützlich.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es wesentlich, daß ein hochspezifisches Antiserum für jede der zu prüfenden glycin-konjugierten Gallensäuren verwendet wird. Die Antisera, die für jede ihrer entsprechenden GaIlensäurekonjugate spezifisch sind, enthalten als Grundlage eine reine Gallen-

709842/1039

2 7 I 6 8 U I

3301 ^

säure. Die glycin-konjugierten Gallensäuren, die im Handel erhältlich sind, können je einzeln dünnschichttchromatographi sch unter Verwendung an sich bekannter Verfahren gereinigt werden.

Indikatoren, die mit γ-emittierenden Radioisotopen oder Enzymen oder fluoreszierenden Molekülen markiert sind,oder Elektronenspinresonanz (ESR)-Konjugate sind besser als die bekannten, mit Tritium behandelten Indikatoren, da sie direkt in einem analytischen Instrument ohne spezielle Lösungen oder Ampullen verwendet werden können. Gallensäure- oder Gallensäurekonjugat-Indikatoren von jeder dieser Klasse können auf folgende Weise hergestellt werden.

I. Gamma (γ)-emittierende Radioisotope ( j, J, Se)

Diese Radioisotope können eingearbeitet werden, indem man die folgenden Gallensäurederivate

BA-X oder BA-R-X

herstellt, worin

BA die Gallensäure oder ihr Konjugat, im allgemeinen Glycin oder Taurin, bedeutet,

R eine Abstands- oder Verbindungsgruppe, die eine aliphatische Aryl- oder arylaliphatische Verbindung enthält, bedeutet,

X eine Verbindung bedeutet, die mit einem γ-emittierenden Radioisotopen markiert werden kann; besonders bevorzugt sind Tyrosin, Tyramin, Histidin und Histamin. Zur Markierung mit dem Radioisotopen können auch Polymere oder Copolymere, die diese Gruppen enthalten, verwendet werden.

Für solche Gallensäure und Konjugate, die Sulfatgruppen enthalten, kann die Sulfatgruppe durch eine Selenosulfatgruppe,

die 'Se als Radioisotop enthält, ersetzt werden, entsprechend dem Verfahren, wie es von D.L.Klayman, Klayman und Günther,Editoren, Organic Selenium Compounds: Their Chemistry and Biology, Interscience, New York, 1973, S. 151, beschrie-

- 6 70984 2/1039

75 ben wird. Andere Reaktionen, die zur Einführung von Se in die Gallensäure-Tracer geeignet sind, werden in den Kapiteln III, IV und anderen Kapiteln dieser Publikation aufgeführt. Cholylglycyltyramin wird wie im folgenden beschrieben hergestellt und mit Jodine -125 nach einer Modifikation des Chloramin-T-Verfahrens von Greenwood et al (Greenwood, F.C, Hunter W.H. und Glover), J.S., Biochem. J., 8£, 114 (1963), markiert. Die Jodierung findet an dem Tyraminring statt. Die Verbindung, Cholylglycyl-Jodtyramin, ist immunologisch von dem Cholylglycin nicht unterscheidbar unter Verwendung von Kaninchen-Antiserum, hergestellt aus Rinderserum-Albuminkonjugat von Cholylglycin. Dieser Tracer bzw. Indikator besitzt die Form

BA-X

worin BA Cholylglycin und X Jodtyramin (J-125) bedeuten; oder

BA-R-X

worin BA Cholsäure, R Glycin und X Jodtyramin (1-125) bedeuten.

II. Fluoreszierend -markierte Gallensäuren

Diese können hergestellt werden, indem man fluoreszierende Moleküle an die Gallensäure oder ihr Konjugat bindet bzw. anbringt. Diese Verbindungen besitzen die Form

BA-F oder BA-R-F

BA die Gallensäure oder ihr Konjugat bedeutet, R eine Abstands- oder Verbindungsgruppe, wie oben

bei I definiert, bedeutet,

F ein fluoreszierendes Molekül, wie Fluorescein-

isocyanat, 4-Methyl-umbelliferon oder Naphthylamin, bedeutet,

709842/1039

3301 ^L

Cholylglycin wird mit Äthylend!amin unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimide unter Bildung von (I) Cholylglycyläthylamin umgesetzt. Dann wird (I) mit Fluoresceinisocyanat umgesetzt, wobei man

Cholylglycyl - N - C₀H₀ - N - C - N - Fluorescein H HOH

erhält.

III. Spinn-markierte Gallensäuren

Diese können mit Elektronenspinnresonanzvorrichtungen verwendet werden und sind ähnlich wie die fluoreszierend-markierten Gallensäuren, ausgenommen, daß die Fluorescein-isocyanatgruppe durch eine N-Isocyanatverbindung ersetzt ist, worin N eine funktionelle Gruppe ist, die ein nichtgepaartes Elektron enthält, bevorzugt eine Nitroxidgruppe.

Beispiel 1 Tyraminderivat von Sulfolithocholylglycln

Diese Substanz wird als hellgelber Feststoff in Form des Pyridiniumsalzes von 3-Sulfolithocholylglycyltyramin erhalten. Man nimmt an, daß es ein Monohydrat mit einem Molekulargewicht von 730 ist. Es ist sehr löslich in Methanol und Äthanol, etwas löslich in Wasser und fast unlöslich in Äther oder Methylenchlorid. Aus ihrem derzeitigen Reinigungszustand schätzt man, daß sie etwa 9596 rein ist. Bei der Herstellung werden die folgenden Stufen durchgeführt:

(1) Das Diammoniumsalz von Glycolithocholsäure-3-sulfat wird gemäß dem Verfahren von Palmer und Bolt, J.Lipid Research, 12, 671-679 (1971), unter Verwendung des bekannten Glycolithocholsäure-natriumsalzes als Ausgangsmaterial hergestellt.

(2) Das Diammoniumsalz wird in das Dipyridiniumsalz überführt.

- 8 709842/10 39

3301 fa

(3) Die Kupplung von Tyramin erfolgt unter Verwendung, von Dicyclohexyl-carbodiimid (DCCI) in Pyridin.

(4) Der Dicyclohexylharnstoff und andere Nebenprodukte werden durch alternierende Behandlung mit Wasser,Methylenchlorid und Methanol entfernt.

Dieses Produkt zeigt die folgenden Werte:

Die DUnnschichtchromatographie (TLC) zeigt an, daß hauptsächlich eine neue Substanz und eine geringe Menge einer lipophyleren Verunreinigung gebildet wurden. Freies Tyramin iat abwesend.

Das NMR-Spektrum zeigt die Anwesenheit von Lithocholsäure, Tyramin und Pyridinringsystemen an wie auch eine Glycin-CH₂-Gruppe in etwa den erwarteten Verhältnissen.

Die Sulfatestergruppe wird durch das IR-Spektrum (KBr-Preßling), wo eine Absorption bei 1215 cm auftritt, und durch die elementare Schwefelanalyse festgestellt. Die Elementaranalyse ergibt die folgenden Ergebnisse:

Gefun- Berechn.Monohydrat Berechn.Dlhydrat d CHNOSHO CHOS2HO

	den	C₃₉H₅₇N₃O₇	S-H₂O C,
Schwefel	4,67	4,39
Kohlenstoff	62,6	64,1
Wasserstoff	8,30	8,14
Stickstoff	5,90	5,75
W M Π Q OM η *(Q^¹I? λ 7 fcXlpV**
4,29
62,6
8,21
5,63

Asche keine

Unter Verwendung ähnlicher Verfahren können Cholylglycintyramin, Lithocholsäure-tyramin und Deoxycholsäuretyraein hergestellt werden.

Ende der Beschreibung.

709842/1039

Claims

Abbott Laboratories 3301

Patentansprüche

ί, ΛJ Verfahren zur Messung des Gehaltes an einer spezifischen, glycin-konjuglerten Gallensäure aus der Gruppe Cholylglycin, Chenodeoxycholylglycin, Deoxycholylglycin und SuIf olithocholylglycin in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die folgenden Stufen durchführt:

(a) ein Antiserum schafft, das spezifisch für eine der glycin-konjugierten Gallensäuren ist,

(b) die Probe mit dem Antiserum und dem gleichen, glycin-konjugierten Gallensäure-tyraminderivat, das mit einem Markierungsmittel markiert ist, vermischt,

(c) das Gemisch der Stufe (b) so inkubiert, daß die Antikörper des Antiserums an die glycin-konjugierte Gallensäure der Probe und an das glycin-konjugierte, markierte Gallensäure-tyraminderivat gebunden werden,

(d) die gebundenen Antikörpermaterialien in eine abgetrennte Fraktion von den nichtgebundenen Materialien trennt und

(e) die Radioaktivität in einer der abgetrennten Fraktionen der Stufe (d) bestimmt, wodurch die Menge des spezifischen Gallensäurekonjugats durch Vergleich mit Standardproben bestimmt werden kann.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

12*5 daß das Markierungsmittel das radioaktive Isotop ^JS ist.
3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennte Fraktion, die gemessen wurde, die ist, die das radiomarkierte glycin-konjugierte Gallensäuretyraminderivat, gebunden an den Antikörper, enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennte, gemessene Fraktion die ist, die das

- 1 709842/1039

ORIGINAL INSPECTED

3301 ^

radiomarkierte, glycin-konjugierte Gallensäure-tyraminderivat, nichtgebunden an den Antikörper, enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antiserum spezifisch für Sulfolithocholylglycin ist und daß das markierte, glycin-konjugierte Gallensäure-tyraminderivat Sulfolithocholylglycyltyramin ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antiserum spezifisch für Chenodeoxycholylglycin ist und daß das markierte, glycin-konjugierte Gallensäure-tyraminderivat Chenodeoxycholylglycyltyramin ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antiserum spezifisch für Cholylglycin ist und daß das markierte, glycin-konjugierte Gallensäure-tyraminderivat Cholylglycyltyramin ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antiserum spezifisch für Deoxycholylglycin ist und daß das markierte, glycin-konjugierte Gallensäure-tyraminderivat Deoxycholylglycyltyramin ist.
9. Verfahren zur Bestimmung des Gehaltes an Sulfolithocholylglycin in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die folgenden Stufen durchführt:

(a) ein Antiserum schafft, das spezifisch für Sulfolithocholylglycin 1st,

(b) die Probe mit dem Antiserum und dem mit dem

125
Radioisotop "\J markierten Sulfolithocholylglycyltyramin vermischt,

(c) das Gemisch der Stufe (b) so inkubiert, daß die Antikörper des Antiserums an Sulfolithocholylglycin in der Probe und an das markierte Sulfolithocholylglycyltyramin gebunden werden,

709842/1039

3301 ^

(d) das gebundene Antikörpermaterial in eine getrennte Fraktion von den ungebundenen Materialien abtrennt, und

(e) die Radioaktivität in der abgetrennten Fraktion bestimmt, die das radiomarkierte Sulfolithocholylglycyltyrainin, das nicht an den Antikörper gebunden ist, enthält, und

(f) den nicht an den Antikörper gebundenen Prozentgehalt an Radioaktivität mit dem nichtgebundenen Prozentgehalt an Radioaktivität in Standardlösungen vergleicht.
10. Verbindlang aus der Gruppe Sulfolithocholylglycyltyrainin, Chenodeoxycholylglycyltyramin, Cholylglycyltyramin und Deoxycholylglycyltyramin.
11. Verbindung nach Anspruch 10, nämlich SuIfolithocholylglycyltyramin.
12. Verbindung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,

12*5
daß sie mit ^JZ markiert ist.

709842/1039