CN108982859A - 一种测定人血清甘胆酸含量的试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定人血清甘胆酸含量的试剂，包括试剂1和试剂2，其中试剂1是由0.04%的胶乳微球‑BSA‑甘胆酸偶联物，并添加辅剂100mM,pH8.0的磷酸盐缓冲液，0.9%的氯化钠溶液，0.1%的BSA，0.1%的表面活性剂和稳定剂配制而成；试剂2是由1%的胶乳微球‑鼠抗甘胆酸单克隆抗体偶联物并添加辅剂100mM,pH8.0的磷酸盐缓冲液，0.9%的氯化钠溶液，0.1%的BSA，0.1%的表面活性剂和稳定剂配制而成。本发明将胶乳微球引入到试剂中，当试剂1和试剂2均存在有胶乳微球时，对试剂检测灵敏度的提高会更加显著。由于试剂1和试剂2均存在有胶乳微球，会相应的提高试剂的空白吸光度；因此试剂1和试剂2中的胶乳浓度需要进行精确控制。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测试剂，尤其是涉及一种应用胶乳免疫比浊技术测定人血清甘胆酸含量的试剂 。
背景技术
血清甘胆酸（Cholyglycine, CG，分子量465.6）属于胆汁酸的一种。胆汁酸包括一大类的胆烷酸，在胆汁中主要有胆酸(CA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、脱氧胆酸(DCA)，还有少量石胆酸(LCA)及微量熊脱氧胆酸(UDCA)，各种胆烷酸都可能和甘氨酸、牛磺酸结合成为结合形态，这是肝脏分泌到胆汁中的主要形式。各种胆汁酸，不论是游离态还是结合态，其分子内部都是既含亲水基团(羟基、羧基、磺酰基)，又含疏水基团(甲基及烃核)，故胆汁酸的立体构型具有亲水和疏水两个侧面，因而使胆汁酸表现出很强的界面活性。它能降低脂、水两相之间的表面张力，促进脂类形成混合微团，这对脂类物质的消化吸收以及维持胆汁中胆固醇的溶解都起重要作用。
血清甘胆酸在肝脏内合成，存储于胆囊内，在消化过程中由肠道吸收，绝大多数经门静脉被肝脏重新吸收，最终构成肝-胆-肠-静脉-肝的循环。当肝脏受到外部损坏或者疾病影响功能时，肝脏对血清甘胆酸的重吸收下降，会导致血清甘胆酸升高；当胆囊出现堵塞时，肝脏内的甘胆酸不能及时排泄到肠道内，导致返流入血液系统，也会引起血清甘胆酸升高；当肠道吸收功能受损时，也会影响血清甘胆酸的含量。因此，血清甘胆酸含量的高低能直接反馈肝胆系统的生理功能是否正常。
在临床上往往用血清甘胆酸的测定来判断孕妇是否患有胆汁淤积症。正常情况下，在妊娠后期，整个胎盘的增大会压迫各个内脏如心脏、肺、胃以及肝脏等器官，引起一系列的问题如下肢水肿、呼吸急促等。而对肝脏的压迫会影响肝脏胆汁的分泌，从而导致血清甘胆酸升高。因此，孕妇血清甘胆酸的参考值范围显著有别于正常人。同时，孕妇血清甘胆酸的测定能直接反馈肝脏内胆汁淤积的程度。胆汁淤积症常有家族史，具有一定的遗传特征，患有胆汁淤积症的孕妇自身情况较为良好，主要会出现皮肤瘙痒及轻度黄疸，但分娩之后症状迅速消失，但对胎儿有较大的影响，容易引起早产、低体重儿、胎儿宫内窘迫死亡及新生儿窒息等症状。因此及时准确的检测甘胆酸含量对孕妇特别是对胎儿的健康有及时的诊断意义。
目前临床对血清甘胆酸的诊断主要有放射免疫分析法、酶联免疫法、化学发光免疫分析法及均相酶免疫分析法等。
放射免疫分析法采用放射性元素标记甘胆酸，与样本中的甘胆酸竞争试剂中的抗体，通过分析与抗体发生反应的甘胆酸中反射性元素含量的高低来反馈样本中甘胆酸的试剂浓度。此法准确性较高，标记甘胆酸与正常甘胆酸对抗体的结合性能没有显著差异。但反射性元素的效期较短，后期废弃物难以处理，此方法现已逐步被市场淘汰。
酶联免疫法采用双抗体夹心的方法来检测甘胆酸，并通过酶联放大的效果来增大试剂灵敏度，具有灵敏度高的优点。但此方法反应时间较长，结果为半定量，不能满足市场上大规模筛查的需求。
化学发光免疫分析法原理与酶联免疫法类似，通过化学发光的方法取代酶联放大来增大试剂灵敏度。此法较酶联免疫灵敏度提高，准确性也相应提高，结果为定量结果，但目前为止，此法成本还是较高，市场推广有一定压力。
均相酶免疫分析法采用特定的酶来标记甘胆酸，并通过与特异的甘胆酸抗体结合来影响酶活性，当标记甘胆酸和正常甘胆酸一起与抗体反应时，正常甘胆酸的含量高低影响标记甘胆酸的整体酶活性，因此可以测定样本中正常甘胆酸的浓度。此法既有酶联免疫法灵敏度高的优点，也有生化试剂能够在全自动生化仪上快速高通量检测的优点。但是，由于目前的标记酶稳定性较差，不能满足临床使用的要求。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术所存在的缺陷，提供一种应用胶乳免疫比浊技术来测定人血清甘胆酸含量的试剂。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的测定人血清甘胆酸含量的试剂，包括试剂1和试剂2，其中：
试剂1是由0.04%的胶乳微球-BSA-甘胆酸偶联物，并添加辅剂100mM,pH8.0的磷酸盐缓冲液，0.9%的氯化钠溶液，0.1%的BSA，0.1%的表面活性剂和稳定剂配制而成；
试剂2是由1%的胶乳微球-鼠抗甘胆酸单克隆抗体偶联物并添加辅剂100mM,pH8.0的磷酸盐缓冲液，0.9%的氯化钠溶液，0.1%的BSA，0.1%的表面活性剂和稳定剂配制而成。
所述试剂1中胶乳微球-BSA-甘胆酸偶联物的制备方法如下：首先将甘胆酸活化，然后将活化的甘胆酸和BSA偶联，获得甘胆酸- BSA偶联物溶液备用；将粒径100 nm的羧基胶乳微球活化制得活化的胶乳微球溶液，在搅拌条件下，将其滴加到预先制得的甘胆酸-BSA偶联物溶液中，持续搅拌反应后进行封闭处理，超声重悬后，获得胶乳微粒-甘胆酸-BSA偶联物。
所述试剂2中胶乳微球-鼠抗甘胆酸单克隆抗体偶联物的制备方法如下：将粒径100 nm的羧基胶乳微球活化制得活化的胶乳微球溶液；将鼠抗甘胆酸单克隆抗体稀释至最终浓度0.5mg/mL的抗体溶液，然后将活化的胶乳微球溶液缓慢加入抗体溶液中，持续搅拌反应后进行封闭处理，超声重悬后，获得胶乳微粒-鼠抗甘胆酸单克隆抗体偶联物。
所述试剂1和试剂2中的表面活性剂为Triton X-100、Tween 20、Brij 35中的一种或者任两种组合。
所述试剂1和试剂2中所用的稳定剂为酪蛋白、明胶、小牛血清、甘露醇、蔗糖中的其中一种或者两种及两种以上组合。
本发明的优点为：
通过甘胆酸与BSA的偶联物在合适的缓冲基质下，与一定粒径的胶乳微球进行偶联（并添加多种辅助）来制作试剂1，由于甘胆酸为小分子物质，属于半抗原，不能直接免疫动物，只能与一个抗体发生免疫反应，所以游离的甘胆酸与抗体反应不能形成浊度反应；但甘胆酸与BSA偶联之后，每个BSA都可以和数个CG发生偶联，此偶联物可以有多个抗原位点，能与多个抗体进行免疫反应。
试剂2中的主要成分是鼠抗甘胆酸单克隆抗体和胶乳微球的偶联物，添加各种辅剂后制备成试剂2。
检测时，样本中的甘胆酸先和试剂1中的胶乳微球-BSA-甘胆酸偶联物进行竞争，然后再和试剂2中的鼠抗甘胆酸单克隆抗体和胶乳微球的偶联物进行反应。由于胶乳微球-BSA-甘胆酸偶联物与鼠抗甘胆酸单克隆抗体和胶乳微球的偶联物反应能够产生浊度反应，而游离甘胆酸与鼠抗甘胆酸单克隆抗体和胶乳微球的偶联物反应不能够产生免浊度反应。因此，样本中游离甘胆酸的含量与最终的浊度呈反比关系。根据相应的定标曲线我们就能检测出样品中甘胆酸的含量。
本发明将胶乳微球引入到反应中，当试剂1和试剂2均存在有胶乳微球时，对试剂检测灵敏度的提高会更加显著。由于试剂1和试剂2均存在有胶乳微球，因此本申请对试剂1和试剂2中的胶乳微球浓度进行了精确控制，保证试剂的空白吸光度符合相应生化仪的要求（OD＜2.5）。
本发明与放免、酶免等方法比较，具有极大的效率优势，借助于高速的全自动生化仪可以达到每小时2000个以上的检测样本数。与均相酶免疫法进行比较，在试剂稳定性上具有极大的优势，在加速条件下，其稳定性时间至少为均相酶免疫法试剂的2倍以上。
附图说明
图1是采用本发明试剂与现有放射免疫法和均相酶免疫法检测同一份样品的相关性图示。
具体实施方式
实施例1 按本发明方法配制测定人血清甘胆酸含量的试剂
一、配制试剂1
1、制备胶乳微球-BSA-甘胆酸偶联物
1）甘胆酸的活化
准确称取400mg 1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），溶于100mL MES缓冲液中（20mmol/L，pH=6.0），得到EDC溶液；准确称取200mg甘胆酸、400mg Sulfo-NHS，溶于100mLMES缓冲液中（20mmol/L，pH=6.0），得到甘胆酸溶液；在搅拌情况下，把EDC溶液缓慢加入到甘胆酸溶液中；加完之后持续搅拌反应30分钟，得到活化的甘胆酸溶液。
2）甘胆酸与BSA偶联
准确称取100mg BSA，溶于100mL MES缓冲液中（20mmol/L，pH=6.0），得到BSA溶液；在搅拌情况下，把活化的甘胆酸溶液缓慢加入到BSA溶液中；加完之后持续搅拌反应4小时，即可获得甘胆酸-BSA偶联物；经过柱层析、透析等方法去除游离的甘胆酸之后，可用于下一步偶联反应。
3）胶乳微球的活化
准确称取100mg 1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），溶于50mL MES缓冲液中（20mmol/L，pH=6.0），得EDC溶液；准确量取50mL胶乳微球溶液（羧基胶乳微球，粒径100nm，含量10%），溶于250mL MES缓冲液中（20mmol/L，pH=6.0），得到胶乳微球溶液；在搅拌情况下，把EDC溶液缓慢加入到胶乳微球溶液中；加完之后持续搅拌反应30分钟，得到活化的胶乳微球溶液。
4）甘胆酸- BSA偶联物与胶乳微球的偶联
把第2）步获得的甘胆酸-BSA偶联物用MES缓冲液（20mmol/L，pH=6.0）进行稀释，得到最终浓度为0.5mg/mL的甘胆酸-BSA偶联物溶液；在搅拌情况下，把第3）步活化的胶乳微球溶液缓慢加入到甘胆酸-BSA偶联物溶液中；加完之后持续搅拌反应4小时；再加入BSA溶液进行封闭处理1小时；然后离心去除多余的EDC、甘胆酸-BSA偶联物等，沉淀的胶乳微球加入磷酸盐缓冲液中（100mmol/L，pH=8.0），超声重悬，即获得胶乳微球-BSA-甘胆酸偶联物。
2、配制试剂1
在800mL去离子水中，添加32.22g 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）、1.36g磷酸二氢钾（KH2PO4）、9g氯化钠（NaCl），混匀溶解，调节pH为8.0，补足水到1L，此为磷酸盐缓冲液；用此磷酸盐缓冲液稀释第1步所得的胶乳微球-BSA-甘胆酸偶联物并使其最终浓度为0.04%，添加0.1%的BSA，0.1%的表面活性剂和稳定剂，即为试剂1。最终配制完成的试剂1中含有100mM，pH8.0的磷酸盐缓冲液，0.04%的胶乳微球-BSA-甘胆酸偶联物，0.9%的氯化钠，0.1%的BSA，0.1%的表面活性剂和稳定剂。
二、配制试剂2
1、制备胶乳微球-鼠抗甘胆酸单克隆抗体偶联物
1）胶乳微球的活化
准确称取100mg 1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），溶于50mL MES缓冲液中（20mmol/L，pH=6.0），得EDC溶液；准确量取50mL胶乳微球溶液（羧基胶乳微球，粒径100nm，含量10%），溶于250mL MES缓冲液中（20mmol/L，pH=6.0），得到胶乳微球溶液；在搅拌情况下，把EDC溶液缓慢加入到胶乳微球溶液中；加完之后持续搅拌反应30分钟，得到活化的胶乳微球溶液。
2）鼠抗甘胆酸单克隆抗体与胶乳微球的偶联
将鼠抗甘胆酸单克隆抗体用MES缓冲液（20mmol/L，pH=6.0）进行稀释，得到最终浓度为0.5mg/mL的抗体溶液。在搅拌情况下，把活化的胶乳微球溶液缓慢加入到抗体溶液中；加完之后持续搅拌反应4小时。再加入BSA溶液进行封闭处理1小时；然后离心去除多余的EDC、抗体等，沉淀的胶乳微球加入磷酸盐缓冲液中（100mmol/L，pH=8.0），超声重悬，即获得胶乳微球-鼠抗甘胆酸单克隆抗体偶联物。
2、试剂2的配制
在800mL去离子水中，添加32.22g 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）、1.36g磷酸二氢钾（KH2PO4）、9g氯化钠（NaCl），混匀溶解，调节pH为8.0，补足水到1L，此为磷酸盐缓冲液；用此磷酸盐缓冲液稀释第1步所得的胶乳微球-鼠抗甘胆酸单克隆抗体偶联物并使其最终浓度为1%，添加0.1%的BSA，0.1%的表面活性剂和稳定剂，即为试剂2。最终配制好的试剂2中含有100mM，pH8.0的磷酸盐缓冲液，1%的胶乳微球-鼠抗甘胆酸单克隆抗体偶联物， 0.9%的氯化钠，0.1%的BSA，0.1%的表面活性剂和稳定剂。
实施例2 检测方法及设备
本发明对甘胆酸的检测需要新鲜无溶血的血清或者血浆，对反应吸光度有干扰的样本如溶血或脂浊，可能会影响最终结果，建议重新采血。
本发明的试剂应用于各种型号的生化仪，如日立Hitachi7080/7600P、奥林巴斯Olympus AU400、贝克曼Beckman Coulter LX20/AU680/AU5800、东芝Toshiba 120FR、雅培Abbott C8000、西门子 SIEMENS ADVIA1800/ADVIA2400/Dimension RxL Max生化分析仪等。
具体的检测参数设定如下表所示，A1和A2的读点时间依据不同的仪器进行相应的设定：
实施例3 相关性比较
采用实施例1制得的试剂，与常规使用的放射免疫法和均相酶免疫法检测同一份样品，获得的相关性数据见下表1和图1：
从表1我们能够看出，本发明所测数据与放射免疫法所得结果接近，而均相酶免疫法所测结果在低值阶段与放射免疫法所得结果相关性较好，但高值阶段显著偏低，所以其线性要低于本发明及放射免疫法试剂。
图1比较直观的体现了三种试剂的比较关系：本发明所测数据与放射免疫法所得结果的趋势线接近直线，表明在0～60 mg/L内两者线性相当，准确性也相当；均相酶免疫法所测结果与放射免疫法所得结果的趋势线为曲线，在0～40 mg/L内接近直线，高于40 mg/L后显著弯曲。
Claims (5)
1.一种测定人血清甘胆酸含量的试剂，其特征在于：包括试剂1和试剂2，其中：
试剂1是由0.04%的胶乳微球-BSA-甘胆酸偶联物，并添加辅剂100mM,pH8.0的磷酸盐缓冲液，0.9%的氯化钠溶液，0.1%的BSA，0.1%的表面活性剂和稳定剂配制而成；
试剂2是由1%的胶乳微球-鼠抗甘胆酸单克隆抗体偶联物并添加辅剂100mM,pH8.0的磷酸盐缓冲液，0.9%的氯化钠溶液，0.1%的BSA，0.1%的表面活性剂和稳定剂配制而成。
2.根据权利要求1所述的测定人血清甘胆酸含量的试剂，其特征在于：所述试剂1中胶乳微球-BSA-甘胆酸偶联物的制备方法如下：首先将甘胆酸活化，然后将活化的甘胆酸和BSA偶联，获得甘胆酸- BSA偶联物溶液备用；将粒径100 nm的羧基胶乳微球活化制得活化的胶乳微球溶液，在搅拌条件下，将其滴加到预先制得的甘胆酸- BSA偶联物溶液中，持续搅拌反应后进行封闭处理，超声重悬后，获得胶乳微粒-甘胆酸- BSA偶联物。
3.根据权利要求1所述的测定人血清甘胆酸含量的试剂，其特征在于：所述试剂2中胶乳微球-鼠抗甘胆酸单克隆抗体偶联物的制备方法如下：将粒径100 nm的羧基胶乳微球活化制得活化的胶乳微球溶液；将鼠抗甘胆酸单克隆抗体稀释至最终浓度0.5mg/mL的抗体溶液，然后将活化的胶乳微球溶液缓慢加入抗体溶液中，持续搅拌反应后进行封闭处理，超声重悬后，获得胶乳微粒-鼠抗甘胆酸单克隆抗体偶联物。
4.根据权利要求1所述的测定人血清甘胆酸含量的试剂，其特征在于：所述试剂1和试剂2中的表面活性剂为Triton X-100、Tween 20、Brij 35中的一种或者任两种组合。
5.根据权利要求1所述的测定人血清甘胆酸含量的试剂，其特征在于：所述试剂1和试剂2中所用的稳定剂为酪蛋白、明胶、小牛血清、甘露醇、蔗糖中的其中一种或者两种及两种以上组合。
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