CN109799337A - 一种快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法。所述方法包括如下步骤：S1：采用混合酸酐法将甘胆酸与卵清蛋白进行偶联，透析纯化后得到包被抗原；S2：将得到的包被抗原通过NHS/EDC法偶联到富含羟基的葡聚糖基质的CM5芯片上，并对未反应的活性位点进行封闭；S3：利用CM5芯片对甘胆酸进行检测。该方法直接利用甘胆酸偶联卵清蛋白形成检测受体，与甘胆酸小分子进行抗甘胆酸多克隆抗体竞争，通过在金膜上结合形成的竞争信号的差异来的对甘胆酸进行定量分析，可实现自动化，实时检测，更加直观反映甘胆酸含量水平，特异性高，灵敏度好，单个样检测时间在10 min内，具有快速、准确、可靠的优点。

Description

一种快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法。

背景技术

肝细胞受损并积累引起肝脏疾病，检测肝细胞受损程度并对肝功能进行实时评价，对于早期诊断、预防和治疗肝脏疾病具有重要意义。甘胆酸是胆汁酸的主要成分之一，由胆固醇与肝内的甘氨酸结合而成，其含量的测定对肝病诊断较具敏感性，是评价肝脏功能的一项很重要的指标。相关研究指出，胆汁酸经肾脏排泄很明显，并与肝胆疾病程度相关，因此检测尿液中的甘胆酸对临床有一定指导价值。

甘胆酸的常用检测方法主要是仪器方法，如薄层荧光法、高效液相色谱法，高效液相色谱法-串联质谱法以及超高效液相色谱质谱方法，这些方法需要大型仪器和复杂的样品前处理；另一方面是免疫法，主要包括放射免疫法、化学发光免疫法及免疫透射比浊法，但放射免疫法需要处理特异性的放射性元素，相关结果解读或者配套仪器也比较复杂，不适合家庭、个人及医院内。

因此，开发一种操作简单，适用范围广的检测甘胆酸的方法具有重要的研究意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中甘胆酸的检测方法需要大型仪器和复杂的样品前处理，操作复杂，不适合家庭、个人及医院的缺陷和不足，提供一种快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法。本发明提供的方法直接利用甘胆酸偶联卵清蛋白形成检测受体，与甘胆酸小分子进行抗甘胆酸多克隆抗体竞争，通过在金膜上结合形成的竞争信号的差异来的对甘胆酸进行定量分析，可实现自动化，实时检测，更加直观反映甘胆酸含量水平，特异性高，灵敏度好，IC50为71.6 ng/mL，线性范围为：6.3-817.2 ng/mL，单个样检测时间在10 min内，具有快速、准确、可靠的优点。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法，包括如下步骤：

S1：采用混合酸酐法将甘胆酸与卵清蛋白进行偶联，透析纯化后得到包被抗原；

S2：将得到的包被抗原通过NHS/EDC法偶联到富含羟基的葡聚糖基质的CM5芯片上，并对未反应的活性位点进行封闭；

S3：利用CM5芯片对甘胆酸进行检测。

本发明提供的方法直接利用甘胆酸偶联卵清蛋白形成检测受体，与甘胆酸小分子进行抗甘胆酸多克隆抗体竞争，通过在金膜上结合形成的竞争信号的差异来的对甘胆酸进行定量分析，可实现自动化，实时检测，更加直观反映甘胆酸含量水平，特异性高，灵敏度好，IC50为71.6 ng/mL，线性范围为：6.3-817.2 ng/mL，单个样检测时间在10 min内，具有快速、准确、可靠的优点。

优选地， S1中混合酸酐法的过程如下：甘胆酸和(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于水中，加入N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌过夜后加入到含有卵清蛋白的磷酸缓冲盐溶液，搅拌反应，透析纯化即得包被抗原。

更为优选地，所述甘胆酸和卵清蛋白的质量比为1:4~7。

更为优选地，所述甘胆酸和(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:0.5~1。

更为优选地，所述甘胆酸和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1~2。

更为优选地，所述搅拌的温度为4℃

具体地，S1中混合酸酐法的过程如下：称取10~40 mg甘胆酸和10~30 mg的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，溶于1~3 mL 去离子水，再加入20~40 mg N-羟基琥珀酰亚胺，4℃搅拌过夜，然后加入到含有70~120 mg卵清蛋白蛋白的磷酸缓冲盐溶液中，4℃搅拌反应12小时。反应后，反应液进行透析，4℃透析三天，每12小时换液。SDS-PAGE鉴定后进行冻干，放-20℃保存。

优选地，S2中NHS/EDC法包括如下步骤：

S201：包被抗原在CM5芯片上的预富集；

S202：CM5芯片上的葡聚糖羧基的活化；

S203：卵清蛋白的氨基和检测基质的羧基偶联；

S204：利用乙醇胺封闭未反应的活性位点。

优选地，S201的具体过程为：将包被抗原溶于不同pH的醋酸钠缓冲液，以10 μL/min的流速流经CM5芯片，然后用NaOH溶液洗脱，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液冲洗回复基线。

更为优选地，S201中所述包被抗原的浓度为0.05 mg/mL。

更为优选地，S201中所述醋酸钠缓冲液的pH为4.0、4.5、5.0和5.5，每个pH的醋酸钠缓冲液流经CM5芯片的时间为2 min。

更为优选地，S201中所述NaOH溶液的浓度为50 mmol/L。

优选地，S202的具体过程为：EDC溶液和NHS溶液分别以10~30 μL/min的流速通过CM5芯片，以活化葡聚糖上的羟基。

更为优选地，S202中EDC溶液的浓度为100~400 mmol/L。

更为优选地，S202中所述NHS溶液的浓度为100~400 mmol/L。

更为优选地，S203的具体过程为：将包被抗原溶于pH为4.0的醋酸钠缓冲液中，以10 μL/min的流速通过芯片，实现卵清蛋白的氨基和检测基质的羧基偶联。

更为优选地，S204的具体过程为：利用1 mol/L的乙醇胺溶液对未反应的活性位点进行封闭。

优选地，S3步骤前还包括建立甘胆酸的表面等离子共振分析的标准曲线的步骤。

更为优选地，甘胆酸的表面等离子共振分析的标准曲线的建立过程为：确定多克隆抗体工作的浓度，然后建立甘胆酸标准曲线。

具体地，用 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液作为稀释液，配制不同稀释度的抗体工作浓度，以10~30 μL/min的流速通过S2得到的芯片，检测RU响应值，比较不同稀释度抗体工作浓度曲线，确定合适的抗体稀释度。

具体地，最佳抗体稀释度通过如下方法得到：以抗体稀释的量为横坐标，RU响应值为纵坐标，作图，取在接近平和的斜线上的反应浓度为最适宜的抗体结合包被抗原的浓度。

甘胆酸检测具体按照以下步骤：配制不同浓度的甘胆酸标准溶液（0，1，10，100，500，1000，10000，100000 ng/mL），加入等量的抗体工作液（最佳稀释度），将混合溶液振荡摇匀1 min，室温孵育30 min，然后再注入芯片的流路中，流速为10~30 μL/min，时间为3min，随后注入甘氨酸-盐酸（pH=1~3）的再生溶液对结合的抗体进行洗脱，直至基线回复且平衡。

具体的，甘胆酸标准曲线通过如下过程建立：以甘胆酸浓度为横坐标，RU响应值为纵坐标，得到甘胆酸标准曲线。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的方法直接利用甘胆酸偶联卵清蛋白形成检测受体，与甘胆酸小分子进行抗甘胆酸多克隆抗体竞争，通过在金膜上结合形成的竞争信号的差异来的对甘胆酸进行定量分析，可实现自动化，实时检测，更加直观反映甘胆酸含量水平，特异性高，灵敏度好，IC50为71.6 ng/mL，线性范围为：6.3-817.2 ng/mL，单个样检测时间在10 min内，具有快速、准确、可靠的优点。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的包被抗原OVA-GCA在CM5芯片上的偶联；

图2是本发明实施例1提供的抗体稀释度-响应值曲线；

图3是本发明实施例1提供的甘胆酸标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法，如图1，如下步骤。

（1）甘胆酸包被抗原的偶联

称取20 mg甘胆酸和17 mg的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，溶于2 mL去离子水，再加入34 mg N-羟基琥珀酰亚胺，4℃搅拌过夜，然后加入到含有100 mg卵清蛋白蛋白的磷酸缓冲盐溶液中，4℃搅拌反应12小时。反应后，反应液进行透析，4℃透析三天，每12小时换液。

（2）包被抗原在芯片上的偶联

1.OVA-GCA在CM5芯片上的预富集。将0.05 mg/mL的OVA-GCA溶于不同pH（4.0/4.5/5.0/5.5）的醋酸钠缓冲液，在CM5芯片上进行预富集，每个梯度流速是10 μL/min，时间是2 min，随后用50 m mol/L NaOH对OVA-GCA进行洗脱，最后用4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液冲洗系统回复基线。

2.葡聚糖羧基的活化。根据步骤1所得的条件进行正式的偶联，在室温下，200mmol/L的EDC溶液和200 mmol/L的NHS溶液分别以10 μL/min的流速通过CM5芯片，以活化葡聚糖上的羟基，

3.OVA-GCA蛋白氨基的偶联。在步骤2的基础上，随后加入0.05 mg/mL的OVA-GCA溶于pH4.0的醋酸钠缓冲液中，以10 μL/min的流速通过芯片，实现蛋白质的氨基和检测基质的羧基偶联，

4.乙醇胺的封闭。在步骤3的基础上，用1 mol/L 的乙醇胺溶液对未反应的活性位点进行封闭。

（3）确定甘胆酸的表面等离子共振分析的标准曲线

1.配制标准溶液：将1 mg的甘胆酸溶于1 mL的PBS中做贮存液（1 mg/mL）使用。然后用4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液按照一定的稀释度将其配成0，1，10，100，500，1000，10000，100000 ng/mL的甘胆酸的标准溶液，避光保存，每次使用前用混匀器摇匀3 min。

2.抗体工作浓度（AbWS）的确定：用 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液作为稀释液，配制不同稀释度的抗体工作浓度，以10 μL/min的流速通过包有OVA-GCA蛋白的芯片检测RU响应值。比较不同稀释度抗体工作浓度曲线如图2，选择响应值在150 RU附近的浓度作为工作浓度，150RU附近作为起始浓度，该浓度下OVA-GCA和抗体结合具有足够的响应范围待后续检测以及灵敏度较好，且抗体用量经济，所以这里选择的抗体稀释度为1:100。

3.竞争表面等离子共振分析法的建立：往试管中加入100 μL抗体工作浓度溶液，再加入100 μL不同浓度的甘胆酸标准溶液（0，1，10，100，500，1000，10000，100000 ng/mL），将混合溶液振荡摇匀3 min，室温静置30 min，然后注入工作流路中，流速30 μL/min，时间是3min，随后注入甘氨酸-盐酸缓冲液，pH=1.5，对OVA-GCA和抗体的结合进行洗脱，流速是30 μL/min，时间是2 min。

4.绘制表面等离子共振免疫分析标准曲线：使用origin 8.5软件，以RU/RU₀响应值为纵坐标，甘胆酸标准溶液浓度为横坐标，拟合四参数曲线，得到甘胆酸的表面等离子共振分析方法的标准曲线，可以得到该方法的半抑制浓度（IC50）为71.6 ng/mL，规定抑制率在20%-80%之间为线性范围，可得线性范围为6.3-817.2 ng/mL，拟合方程为，y= -1.16+(40.72/(1+(x/71.6)^0.57)，R²=0.9882，如图3。

实施例2

本实施例提供一种快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法，包括如下步骤。

（1）甘胆酸包被抗原的偶联

称取10 mg甘胆酸和10 mg的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，溶于1 mL去离子水，再加入20 mg N-羟基琥珀酰亚胺，4℃搅拌过夜，然后加入到含有70mg卵清蛋白蛋白的磷酸缓冲盐溶液中，4℃搅拌反应12小时。反应后，反应液进行透析，4℃透析三天，每12小时换液。

（2）包被抗原在芯片上的偶联

1.OVA-GCA在CM5芯片上的预富集。将0.05 mg/mL的OVA-GCA溶于不同pH（4.0/4.5/5.0/5.5）的醋酸钠缓冲液，在CM5芯片上进行预富集，每个梯度流速是10 μL/min，时间是2 min，随后用50 mmol/L NaOH对OVA-GCA进行洗脱，最后用4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液冲洗系统回复基线。

2.葡聚糖羧基的活化。根据步骤1所得的条件进行正式的偶联，在室温下，100mmol/L的EDC溶液和100 mmol/L的NHS溶液分别以10 μL/min的流速通过CM5芯片，以活化葡聚糖上的羟基，

3.OVA-GCA蛋白氨基的偶联。在步骤2的基础上，随后加入0.05 mg/mL的OVA-GCA溶于pH4.0的醋酸钠缓冲液中，以10 μL/min的流速通过芯片，实现蛋白质的氨基和检测基质的羧基偶联，

4.乙醇胺的封闭。在步骤3的基础上，用1 mol/L 的乙醇胺溶液对未反应的活性位点进行封闭。

实施例3

本实施例提供一种快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法，包括如下步骤。

（1）甘胆酸包被抗原的偶联

称取40 mg甘胆酸和30 mg的(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，溶于3 mL去离子水，再加入40 mg N-羟基琥珀酰亚胺，4℃搅拌过夜，然后加入到含有120 mg卵清蛋白蛋白的磷酸缓冲盐溶液中，4℃搅拌反应12小时。反应后，反应液进行透析，4℃透析三天，每12小时换液。

（2）包被抗原在芯片上的偶联

1.OVA-GCA在CM5芯片上的预富集。将0.05 mg/mL的OVA-GCA溶于不同pH（4.0/4.5/5.0/5.5）的醋酸钠缓冲液，在CM5芯片上进行预富集，每个梯度流速是10 μL/min，时间是2 min，随后用50 mmol/L NaOH对OVA-GCA进行洗脱，最后用4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液冲洗系统回复基线。

2.葡聚糖羧基的活化。根据步骤1所得的条件进行正式的偶联，在室温下，400mmol/L的EDC溶液和400 mmol/L的NHS溶液分别以30 μL/min的流速通过CM5芯片，以活化葡聚糖上的羟基，

3.OVA-GCA蛋白氨基的偶联。在步骤2的基础上，随后加入0.05 mg/mL的OVA-GCA溶于pH4.0的醋酸钠缓冲液中，以10 μL/min的流速通过芯片，实现蛋白质的氨基和检测基质的羧基偶联，

4.乙醇胺的封闭。在步骤3的基础上，用1 mol/L 的乙醇胺溶液对未反应的活性位点进行封闭。

应用例1

本应用例以实施例1中制备的CM5芯片为例对含甘胆酸的样品尿液进行加标回收，具体测试结果如下。

1.先将从医院取来的清晨尿以5000 rpm离心10 min，取上清。用PBS缓冲液将尿液稀释10倍后，混匀，检测待用。

2.取100 μL的原尿液，往试管中加入100 μL抗体工作浓度溶液，将混合溶液振荡摇匀3 min，室温静置30 min，然后注入工作流路中，流速30 μL/min，时间是3 min，随后注入甘氨酸-盐酸缓冲液，pH=1.5，对OVA-GCA和抗体的结合进行洗脱，流速是30 μL/min，时间是2 min，得到响应值。

3.使用origin 8.5软件，对照已建立的标准曲线得到甘胆酸浓度。

表1加样回收尿液中的甘胆酸

测定结果如表1。从测定结果可知，本发明提供的方法可对甘胆酸进行定量分析，实现自动化，实时检测，更加直观反映甘胆酸含量水平，特异性高，灵敏度好，具有快速、准确、可靠的优点。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：采用混合酸酐法将甘胆酸与卵清蛋白进行偶联，透析纯化后得到包被抗原；

S2：将得到的包被抗原通过NHS/EDC法偶联到富含羟基的葡聚糖基质的CM5芯片上，并对未反应的活性位点进行封闭；

S3：利用CM5芯片对甘胆酸进行检测。

2.根据权利要求1所述快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法，其特征在于，S1中混合酸酐法的过程如下：甘胆酸和(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于水中，加入N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌过夜后加入到含有卵清蛋白的磷酸缓冲盐溶液，搅拌反应，透析纯化即得包被抗原。

3.根据权利要求2所述快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法，其特征在于，所述甘胆酸和卵清蛋白的质量比为1:4~7；所述甘胆酸和(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:0.5~1；所述甘胆酸和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1~2。

4.根据权利要求1所述快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法，其特征在于，所述搅拌的温度为4℃。

5.根据权利要求1所述快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法，其特征在于，S2中NHS/EDC法包括如下步骤：

S201：包被抗原在CM5芯片上的预富集；

S202：CM5芯片上的葡聚糖羧基的活化；

S203：卵清蛋白的氨基和检测基质的羧基偶联；

S204：利用乙醇胺封闭未反应的活性位点。

6.根据权利要求1所述快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法，其特征在于，

S201的具体过程为：将包被抗原溶于不同pH的醋酸钠缓冲液，以10 μL/min的流速流经CM5芯片，然后用NaOH溶液洗脱，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液冲洗回复基线；

S202的具体过程为：EDC溶液和NHS溶液分别以10~30 μL/min的流速通过CM5芯片，以活化葡聚糖上的羟基；

S203的具体过程为：将包被抗原溶于pH为4.0的醋酸钠缓冲液中，以10 μL/min的流速通过芯片，实现卵清蛋白的氨基和检测基质的羧基偶联；

S204的具体过程为：利用1 mol/L的乙醇胺溶液对未反应的活性位点进行封闭。

7.根据权利要求6所述快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法，其特征在于，S201中所述包被抗原的浓度为0.05 mg/mL；所述醋酸钠缓冲液的pH为4.0、4.5、5.0和5.5，每个pH的醋酸钠缓冲液流经CM5芯片的时间为2 min；所述NaOH溶液的浓度为50 mmol/L。

8.根据权利要求6所述快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法，其特征在于，S202中EDC溶液的浓度为100~400 mmol/L；所述NHS溶液的浓度为100~400 mmol/L。

9.根据权利要求1所述快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法，其特征在于，S3步骤前还包括建立甘胆酸的表面等离子共振分析的标准曲线的步骤。