CN103823064B - 一种呕吐毒素定量检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种呕吐毒素定量检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种呕吐毒素定量检测试剂盒机器使用方法，所述试剂盒包括：①磁分离试剂；②抗试剂；③酶标抗原试剂；④清洗液；⑤校准品、质控品；⑥底物溶液；⑦终止液；其中磁分离试剂为结合有抗异硫氰酸荧光素FITC-DON抗体的磁微粒混悬液；抗试剂为FITC标记的抗DON抗体溶液；酶标抗原试剂为偶联有生物酶的DON溶液；本发明的具有显著优点：本发明的呕吐毒素定量检测试剂盒操作简单、快速、灵敏准确；能够适用于日常大规模的食品或饲料中呕吐毒素的样品检测。

Description

一种呕吐毒素定量检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及生物监测领域，属于生物技术领域，特别是一种呕吐毒素定量检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
呕吐毒素（Vomitoxin），又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)，化学名称为3α，7α，1，5－三羟基草镰孢菌－9－烯－8－酮，属单端孢霉烯族化合物。，DON具有很高的细胞毒性及免疫抑制性，因此，对人类及动物的健康构成了威胁。
在20世纪90年代开始推广的磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种结合免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术建立的新型酶联免疫检测方法。磁微粒酶联免疫反应在近似液相下进行反应，免疫反应的表面积较ELISA法有更大的提高；另外磁微粒具有超顺磁性，在磁场下具有磁场响应性，更易于固液分离。该方法克服了普通酶联免疫分析（ELISA）分析精密度差、灵敏度差的缺点，反应快速、彻底，具有灵敏度高，特异性高，操作简便，检测用时少和不易受外界因素干扰的优点。
现在，还缺少能够快速、高效、高灵敏度检测呕吐毒素的试剂盒，因此想要迅速、高效的检测呕吐毒素依然很困难。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种呕吐毒素定量检测试剂盒及其制备、操作方法，采用该试剂盒进行呕吐毒素检测具有较高的灵敏度、特异性、操作简便和更短检测时间的优点。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种呕吐毒素定量检测试剂盒，其特征在于，包括：
①磁分离试剂；
②抗试剂；
③酶标抗原试剂；
④清洗液；
⑤校准品、质控品；
⑥底物溶液；
⑦终止液；
其中磁分离试剂为结合有抗异硫氰酸荧光素FITC-DON抗体的磁微粒混悬液；抗试剂为FITC标记的抗DON抗体溶液；酶标抗原试剂为偶联有生物酶的DON溶液。
一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①磁分离试剂的制备：
选用100mg具有顺磁性、表面带有羧基活性基团的磁分离微粒用0.1mol/L、pH4.5的2-（N-吗啉代）乙磺酸MES溶液10mL洗涤3次后，磁分离微粒用该溶液1mL重悬；之后加入50-250μl浓度为10mg/ml碳二亚胺EDC活化，25℃混匀2小时，加入2mg抗FITC抗体，37℃混合均匀2小时；之后加入1mL浓度为0.01mol/LPBS缓冲液于37°密闭静置1小时，所述PBS缓冲液为pH7.4的5%牛血清白蛋白BSA；最后用10mL0.5%BSA溶液的0.01mol/L磷酸缓冲溶液PBS缓冲液洗涤磁珠3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液；
②抗试剂的制备：
将DON单克隆抗体溶液与FITC共价连接；
③酶标抗原试剂的制备：
所述酶标抗原试剂的制备包括以下成分：DON-BSA偶联物以及酶标抗原试剂；
⑴DON-BSA偶联物的制备：
取20mgDON、1mol马来酸酐以及0.05--0.1mol的4-二甲氨基吡啶DMAP，溶于2ml甲苯，80℃搅拌12小时，蒸干溶剂，酸化，萃取，重结晶后得到DON半抗原；
将60mgDON半抗原溶于9.5mL0.01mol/L、pH5.0的PBS溶液中，加入12.5mgEDC，再加入1ml溶解了10mgDON半抗原的二甲基甲酰胺DMF溶液，25℃搅拌反应2小时，再加入6mgEDC，置于阴暗处搅拌反应12小时，用0.01mol/LPBS透析72小时，每8小时更换1次透析液，即得到DON-BSA偶联物；
⑵酶标抗原试剂制备：
a.将5mgDON-BSA抗原溶于0.01mol/LpH7.4的PBS溶液中，加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl溶液20μL，20℃放置30分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置3-5分钟；过柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
b.将碱性磷酸酶ALP溶于pH8.0的2mmol/LEDTA、20mmol/L三羟甲基氨基甲烷Tris-HCL溶液中，溶度5mg/mL，加入0.10mg/mL巯基活化试剂，室温放置40分钟，过柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
将a和b溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合，室温放置3小时，然后用凝胶层析柱分离纯化，收集第一峰和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保存在4℃，将上述连接物用酶反应物稀释液稀释到5ug/mL，使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存；
其中，酶反应物稀释液配置方法：Tris12.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠1g，加纯化水至600mL，调整pH值至7.5；加吐温-201mL，BSA10g，加纯化水定容至1L；用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存；
④清洗液的制备：
取Tris12.54g、NaCl325.6g与吐温-205g先溶于900ml水中，再取0.2ml液体生物防腐剂Proclin-300溶于溶液中，最后将pH调整至7.4并定容至1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤既得清洗液浓缩液，使用时稀释20倍既得清洗液；
⑤校准品与质控品的制备：
将DON抗原称重后用标准品缓冲液溶解分装，校准品浓度分别为1ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、200ng/mL与1000ng/mL，质控品溶度为1ng/mL与100ng/mL，4℃保存；
其中，标准品缓冲液的配制：取Tris2.42g、NaCl2g，BSA2.5g,Proclin-3001ml溶解于1000ml纯化水，pH调整至7.4，用0.2μm过滤器过滤，4℃保存；
⑥底物溶液的制备：
取乙醇胺100g，NaCl2g，单磷酸酚酞4g，用纯化水配成1000ml，用37％盐酸调pH至8.4，用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存；
⑦终止液的制备
取NaCl1-2g,Na2CO310-15g,EDTA10-15g，用纯化水配制成1000ml,用0.2μm过滤器过滤，常温保存。
一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述选取的100mg具有顺磁性、表面带有羧基活性基团的磁分离微粒的直径为0.1-0.2um。
一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述FITC抗体为羊抗、鼠抗或兔抗。
一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述DON单克隆抗体为羊抗、鼠抗或兔抗。
一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述MES溶液的制备方法为：称取MES19.52g，Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取950mL纯化水溶解，调节pH至4.5；加纯化水定容到1L，采用孔径0.2μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述DON单克隆抗体溶液与FITC共价连接的连接方法为Marsshall法。
一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述柱子为SephadexG25柱子；所述凝胶层析柱为Superdex200凝胶层析柱。
一种呕吐毒素磁微粒分离酶联免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.备DON样本溶液：将食品或饲料样品粉碎成粉末，之后称取5g粉碎均匀的样品，加入25mL10%甲醇水溶液萃取，振荡10分钟后用定性滤纸过滤去沉渣，收集滤液，滤液即可直接用于检测；
b.样和免疫反应：在试管中加入50μL样品溶液，然后分别依次加入50μL酶标抗原试剂和50μL抗试剂，混匀后37℃温育20分钟；
c.加磁分离试剂：在试管中加入50μL混匀后的磁分离试剂，混匀后继续37℃温育10分钟；
d.清洗：试管放置在磁分离器上分离3分钟，倒去上清液，每管加入清洗液250μL，充分混匀后，将试管放置在磁分离器上分离3分钟，倒去上清液，重复洗涤过程2次；
e.加入底物溶液：每管加入200μL底物溶液至试管中，37℃混匀5分钟；
f.终止显色：每管加入200ul终止液，磁分离10分钟；
g.读值：在分光光度计上读取吸光度。
本发明的呕吐毒素定量检测试剂盒检测方法原理：本方法采用竞争性免疫检测原理，分别将异硫氰酸荧光素(FITC)抗体吸附在磁微粒表明形成磁分离试剂；将FITC与呕吐毒素DON抗体偶联形成抗试剂；将呕吐毒素DON与碱性磷酸酶ALP连接形成酶标抗原试剂。检测时样品中的DON抗原与酶标DON抗原竞争性结合FITC标记的DON抗试剂形成抗原抗体复合物，再加入磁分离试剂后，通过FITC的抗原抗体反应，将抗原抗体复合物结合到磁微粒表面。最后经洗涤，加入显色底物并检测。
本发明的有益之处在于：1.本发明的呕吐毒素定量检测试剂盒操作简单、快速、灵敏准确；2.能够适用于日常大规模的食品或饲料中呕吐毒素的样品检测。
附图说明
图1是本发明的两种检测方法测定小麦呕吐毒素含量结果线性关系图。
具体实施方式
实施例一：
本发明的呕吐毒素定量检测试剂盒制备方法，具体步骤如下：
一.磁分离试剂制备：
选用100mg具有超顺磁性，表面带有羧基（COOH-）活性基团的磁分离微粒（直径0.1μm）用0.1mol/L2-（N-吗啉代）乙磺酸MES，pH4.5溶液10mL洗涤3次，磁微粒用该溶液1mL重悬。之后加入50μL10mg/mlEDC活化，25℃混匀2小时，加入2mg抗FITC抗体（羊抗），37℃混合均匀2小时。之后加入等体积0.01mol/LPBS5%BSA(pH7.4)缓冲液于37°封闭1小时；最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/LPBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液。
所述MES溶液的制备方法为：
称取MES19.52g，Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取950mL纯化水溶解，调节pH至4.5；加纯化水定容到1L，采用孔径0.2μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
二.抗试剂的制备
将DON单克隆抗体溶液与异硫氰酸荧光素(FITC)按Marsshall法共价连接，所述DON抗体是单克隆抗体（羊抗）。
三.酶标抗原试剂制备：
⑴呕吐毒素-牛血清白蛋白（DON-BSA）偶联物的制备：
取20mgDON、1mol马来酸酐以及0.05mol的DMAP，溶于2ml甲苯，80℃搅拌12小时，蒸干溶剂，酸化，萃取，重结晶后得到DON半抗原。
将60mgDON半抗原溶于9.5ml0.01mol/L,pH5.0的PBS溶液中，加入12.5mgEDC,再加入1mLDMF溶解的10mgDON半抗原，25℃搅拌反应2小时，再加入6mgEDC,置于阴暗处搅拌反应12小时，用0.01mol/LPBS透析72小时，每8小时更换1次透析液，既得到DON-BSA偶联物。
⑵酶标抗原试剂制备：
a.将5mgDON-BSA抗原溶于0.01mol/LPBSPH7.4溶液中；加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL，20℃放置30分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置3-5分钟；通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
b.将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/LEDTA20mmol/LTris-HCLPH8.0溶液中，溶度5mg/mL，加入0.10mg/mLTraunt试剂室温放置40分钟，通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
将a和b溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合，室温放置3小时，然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化，收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保存在4℃。将上述连接物用酶反应物稀释液稀释到5μg/mL，使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。
其中，酶反应物稀释液配置方法：Tris12.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠1g，加纯化水至600mL，调整pH值至7.5。加吐温201mL，BSA10g，加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。
四.清洗液的制备：
取Tris12.54g、NaCl325.6g与吐温-205g先溶于900ml水中，再取0.2ml液体生物防腐剂Proclin-300溶于溶液中，最后将pH调整至7.4并定容至1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤既得清洗液浓缩液，使用时稀释20倍既得清洗液。
五.校准品与质控品的制备：
将DON抗原称重后用标准品缓冲液溶解分装，校准品浓度分别为1ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、200ng/mL与1000ng/mL，质控品溶度为1ng/mL与100ng/mL，4℃保存。
其中，标准品缓冲液的配制：取Tris2.42g、NaCl2g，BSA2.5g,Proclin-3001ml溶解于1000ml纯化水，pH调整至7.4，用0.2μm过滤器过滤，4℃保存。
六.底物溶液的制备：
取乙醇胺100g，NaCl2g，单磷酸酚酞4g，用纯化水配成1000mL，用37％盐酸调pH至8.4，用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。
七.终止液的制备
取NaCl1.0g,Na2CO310g,EDTA10g，用纯化水配制成1000mL,用0.2μm过滤器过滤，常温保存。
实施例二：
一.磁分离试剂制备：
选用100mg具有超顺磁性，表面带有羧基（COOH-）活性基团的磁分离微粒（直径0.2μm）用0.1mol/LMES，pH4.5溶液10mL洗涤3次，磁微粒用该溶液1mL重悬。之后加入75ul10mg/mlEDC活化，25℃混匀2小时，加入2mg抗FITC抗体（鼠抗），37℃混合均匀2小时。之后加入等体积0.01mol/LPBS5%BSA(pH7.4)缓冲液于37°封闭1小时；最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/LPBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液。
所述MES溶液的制备方法为：
称取MES19.52g，Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取950mL纯化水溶解，调节pH至4.5；加纯化水定容到1L，采用孔径0.2μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
二.抗试剂的制备
将DON单克隆抗体溶液与异硫氰酸荧光素(FITC)按Marsshall法共价连接，所述DON抗体是单克隆抗体（鼠抗）。
三.酶标抗原试剂制备：
⑴呕吐毒素-牛血清白蛋白（DON-BSA）偶联物的制备：
取20mgDON、1mol马来酸酐以及0.07mol的DMAP，溶于2ml甲苯，80℃搅拌12小时，蒸干溶剂，酸化，萃取，重结晶后得到DON半抗原。
将60mgDON半抗原溶于9.5ml0.01mol/L,pH5.0的PBS溶液中，加入12.5mgEDC,再加入1mLDMF溶解的10mgDON半抗原，25℃搅拌反应2小时，再加入6mgEDC,置于阴暗处搅拌反应12小时，用0.01mol/LPBS透析72小时，每8小时更换1次透析液，既得到DON-BSA偶联物。
⑵酶标抗原试剂制备：
a.将5mgDON-BSA抗原溶于0.01mol/LPBSPH7.4溶液中；加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL，20℃放置30分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置3-5分钟；通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
b.将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/LEDTA20mmol/LTris-HCLPH8.0溶液中，溶度5mg/mL，加入0.10mg/mLTraunt试剂室温放置40分钟，通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
将a和b溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合，室温放置3小时，然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化，收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保存在4℃。将上述连接物用酶反应物稀释液稀释到5μg/mL，使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。
其中，酶反应物稀释液配置方法：Tris12.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠1g，加纯化水至600mL，调整pH值至7.5。加吐温201mL，BSA10g，加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。
四.清洗液的制备：
取Tris12.54g、NaCl325.6g与吐温-205g先溶于900ml水中，再取0.2ml液体生物防腐剂Proclin-300溶于溶液中，最后将pH调整至7.4并定容至1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤既得清洗液浓缩液，使用时稀释20倍既得清洗液。
五.校准品与质控品的制备：
将DON抗原称重后用标准品缓冲液溶解分装，校准品浓度分别为1ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、200ng/mL与1000ng/mL，质控品溶度为1ng/mL与100ng/mL，4℃保存。
其中，标准品缓冲液的配制：取Tris2.42g、NaCl2g，BSA2.5g,Proclin-3001ml溶解于1000ml纯化水，pH调整至7.4，用0.2μm过滤器过滤，4℃保存。
六.底物溶液的制备：
取乙醇胺100g，NaCl2g，单磷酸酚酞4g，用纯化水配成1000mL，用37％盐酸调pH至8.4，用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。
七.终止液的制备
取NaCl2.0g,Na2CO315g,EDTA15g，用纯化水配制成1000ml,用0.2μm过滤器过滤，常温保存。
实施例三：
一.磁分离试剂制备：
选用100mg具有超顺磁性，表面带有羧基（COOH-）活性基团的磁分离微粒（直径0.1um）用0.1mol/LMES，pH4.5溶液10mL洗涤3次，磁微粒用该溶液1mL重悬。之后加入100ul10mg/mlEDC活化，25℃混匀2小时，加入2mg抗FITC抗体（兔抗），37℃混合均匀2小时。之后加入等体积0.01mol/LPBS5%BSA(pH7.4)缓冲液于37°封闭1小时；最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/LPBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液。
所述MES溶液的制备方法为：
称取MES19.52g，Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取950mL纯化水溶解，调节pH至4.5；加纯化水定容到1L，采用孔径0.2μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
二.抗试剂的制备
将DON单克隆抗体溶液与异硫氰酸荧光素(FITC)按Marsshall法共价连接，所述DON抗体是单克隆抗体（兔抗）。
三.酶标抗原试剂制备：
⑴呕吐毒素-牛血清白蛋白（DON-BSA）偶联物的制备：
取20mgDON、1mol马来酸酐以及0.1mol的DMAP，溶于2ml甲苯，80℃搅拌12小时，蒸干溶剂，酸化，萃取，重结晶后得到DON半抗原。
将60mgDON半抗原溶于9.5ml0.01mol/L,pH5.0的PBS溶液中，加入12.5mgEDC,再加入1mLDMF溶解的10mgDON半抗原，25℃搅拌反应2小时，再加入6mgEDC,置于阴暗处搅拌反应12小时，用0.01mol/LPBS透析72小时，每8小时更换1次透析液，既得到DON-BSA偶联物。
⑵酶标抗原试剂制备：
a.将5mgDON-BSA抗原溶于0.01mol/LPBSPH7.4溶液中；加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL，20℃放置30分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置3-5分钟；通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
b.将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/LEDTA20mmol/LTris-HCLPH8.0溶液中，溶度5mg/mL，加入0.10mg/mLTraunt试剂室温放置40分钟，通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
将a和b溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合，室温放置3小时，然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化，收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保存在4℃。将上述连接物用酶反应物稀释液稀释到5μg/mL，使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。
其中，酶反应物稀释液配置方法：Tris12.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠1g，加纯化水至600mL，调整pH值至7.5。加吐温201mL，BSA10g，加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。
四.清洗液的制备：
取Tris12.54g、NaCl325.6g与吐温-205g先溶于900ml水中，再取0.2ml液体生物防腐剂Proclin-300溶于溶液中，最后将pH调整至7.4并定容至1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤既得清洗液浓缩液，使用时稀释20倍既得清洗液。
五.校准品与质控品的制备：
将DON抗原称重后用标准品缓冲液溶解分装，校准品浓度分别为1ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、200ng/mL与1000ng/mL，质控品溶度为1ng/mL与100ng/mL，4℃保存。
其中，标准品缓冲液的配制：取Tris2.42g、NaCl2g，BSA2.5g,Proclin-3001ml溶解于1000ml纯化水，pH调整至7.4，用0.2μm过滤器过滤，4℃保存。
六.底物溶液的制备：
取乙醇胺100g，NaCl2g，单磷酸酚酞4g，用纯化水配成1000mL，用37％盐酸调pH至8.4，用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。
七.终止液的制备
取NaCl1.8g,Na2CO312g,EDTA12g，用纯化水配制成1000mL，用0.2μm过滤器过滤，常温保存。
实施例四：
一.磁分离试剂制备：
选用100mg具有超顺磁性，表面带有羧基（COOH-）活性基团的磁分离微粒（直径0.18um）用0.1mol/LMES，pH4.5溶液10mL洗涤3次，磁微粒用该溶液1mL重悬。之后加入150ul10mg/mlEDC活化，25℃混匀2小时，加入2mg抗FITC抗体（羊抗），37℃混合均匀2小时。之后加入等体积0.01mol/LPBS5%BSA(pH7.4)缓冲液于37°封闭1小时；最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/LPBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液。
所述MES溶液的制备方法为：
称取MES19.52g，Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取950mL纯化水溶解，调节pH至4.5；加纯化水定容到1L，采用孔径0.2μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
二.抗试剂的制备
将DON单克隆抗体溶液与异硫氰酸荧光素(FITC)按Marsshall法共价连接，所述DON抗体是单克隆抗体（羊抗）。
三.酶标抗原试剂制备：
⑴呕吐毒素-牛血清白蛋白（DON-BSA）偶联物的制备：
取20mgDON、1mol马来酸酐以及0.05mol的DMAP，溶于2ml甲苯，80℃搅拌12小时，蒸干溶剂，酸化，萃取，重结晶后得到DON半抗原。
将60mgDON半抗原溶于9.5ml0.01mol/L,pH5.0的PBS溶液中，加入12.5mgEDC,再加入1mLDMF溶解的10mgDON半抗原，25℃搅拌反应2小时，再加入6mgEDC,置于阴暗处搅拌反应12小时，用0.01mol/LPBS透析72小时，每8小时更换1次透析液，既得到DON-BSA偶联物。
⑵酶标抗原试剂制备：
a.将5mgDON-BSA抗原溶于0.01mol/LPBSPH7.4溶液中；加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL，20℃放置30分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置3-5分钟；通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
b.将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/LEDTA20mmol/LTris-HCLPH8.0溶液中，溶度5mg/mL，加入0.10mg/mLTraunt试剂室温放置40分钟，通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
将a和b溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合，室温放置3小时，然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化，收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保存在4℃。将上述连接物用酶反应物稀释液稀释到5μg/mL，使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。
其中，酶反应物稀释液配置方法：Tris12.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠1g，加纯化水至600mL，调整pH值至7.5。加吐温201mL，BSA10g，加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。
四.清洗液的制备：
取Tris12.54g、NaCl325.6g与吐温-205g先溶于900ml水中，再取0.2ml液体生物防腐剂Proclin-300溶于溶液中，最后将pH调整至7.4并定容至1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤既得清洗液浓缩液，使用时稀释20倍既得清洗液。
五.校准品与质控品的制备：
将DON抗原称重后用标准品缓冲液溶解分装，校准品浓度分别为1ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、200ng/mL与1000ng/mL，质控品溶度为1ng/mL与100ng/mL，4℃保存。
其中，标准品缓冲液的配制：取Tris2.42g、NaCl2g，BSA2.5g,Proclin-3001ml溶解于1000ml纯化水，pH调整至7.4，用0.2μm过滤器过滤，4℃保存。
六.底物溶液的制备：
取乙醇胺100g，NaCl2g，单磷酸酚酞4g，用纯化水配成1000mL，用37％盐酸调pH至8.4，用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。
七.终止液的制备
取NaCl2.0g,Na2CO310g,EDTA10g，用纯化水配制成1000mL，用0.2μm过滤器过滤，常温保存。
实施例五：
一.磁分离试剂制备：
选用100mg具有超顺磁性，表面带有羧基（COOH-）活性基团的磁分离微粒（直径0.18um）用0.1mol/LMES，pH4.5溶液10mL洗涤3次，磁微粒用该溶液1mL重悬。之后加入200ul10mg/mlEDC活化，25℃混匀2小时，加入2mg抗FITC抗体（鼠抗），37℃混合均匀2小时。之后加入等体积0.01mol/LPBS5%BSA(pH7.4)缓冲液于37°封闭1小时；最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/LPBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液。
所述MES溶液的制备方法为：
称取MES19.52g，Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取950mL纯化水溶解，调节pH至4.5；加纯化水定容到1L，采用孔径0.2μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
二.抗试剂的制备
将DON单克隆抗体溶液与异硫氰酸荧光素(FITC)按Marsshall法共价连接，所述DON抗体是单克隆抗体（鼠抗）。
三.酶标抗原试剂制备：
⑴呕吐毒素-牛血清白蛋白（DON-BSA）偶联物的制备：
取20mgDON、1mol马来酸酐以及0.08mol的DMAP，溶于2ml甲苯，80℃搅拌12小时，蒸干溶剂，酸化，萃取，重结晶后得到DON半抗原。
将60mgDON半抗原溶于9.5ml0.01mol/L,pH5.0的PBS溶液中，加入12.5mgEDC,再加入1mLDMF溶解的10mgDON半抗原，25℃搅拌反应2小时，再加入6mgEDC,置于阴暗处搅拌反应12小时，用0.01mol/LPBS透析72小时，每8小时更换1次透析液，既得到DON-BSA偶联物。
⑵酶标抗原试剂制备：
a.将5mgDON-BSA抗原溶于0.01mol/LPBSPH7.4溶液中；加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL，20℃放置30分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置3-5分钟；通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
b.将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/LEDTA20mmol/LTris-HCLPH8.0溶液中，溶度5mg/mL，加入0.10mg/mLTraunt试剂室温放置40分钟，通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
将a和b溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合，室温放置3小时，然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化，收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保存在4℃。将上述连接物用酶反应物稀释液稀释到5μg/mL，使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。
其中，酶反应物稀释液配置方法：Tris12.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠1g，加纯化水至600mL，调整pH值至7.5。加吐温201mL，BSA10g，加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。
四.清洗液的制备：
取Tris12.54g、NaCl325.6g与吐温-205g先溶于900ml水中，再取0.2ml液体生物防腐剂Proclin-300溶于溶液中，最后将pH调整至7.4并定容至1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤既得清洗液浓缩液，使用时稀释20倍既得清洗液。
五.校准品与质控品的制备：
将DON抗原称重后用标准品缓冲液溶解分装，校准品浓度分别为1ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、200ng/mL与1000ng/mL，质控品溶度为1ng/mL与100ng/mL，4℃保存。
其中，标准品缓冲液的配制：取Tris2.42g、NaCl2g，BSA2.5g,Proclin-3001ml溶解于1000ml纯化水，pH调整至7.4，用0.2μm过滤器过滤，4℃保存。
六.底物溶液的制备：
取乙醇胺100g，NaCl2g，单磷酸酚酞4g，用纯化水配成1000mL，用37％盐酸调pH至8.4，用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。
七.终止液的制备
取NaCl1.5g,Na2CO310g,EDTA15g，用纯化水配制成1000mL，用0.2μm过滤器过滤，常温保存。
实施例六：
一.磁分离试剂制备：
选用100mg具有超顺磁性，表面带有羧基（COOH-）活性基团的磁分离微粒（直径介于0.18um）用0.1mol/LMES，pH4.5溶液10mL洗涤3次，磁微粒用该溶液1mL重悬。之后加入250ul10mg/mlEDC活化，25℃混匀2小时，加入2mg抗FITC抗体（兔抗），37℃混合均匀2小时。之后加入等体积0.01mol/LPBS5%BSA(pH7.4)缓冲液于37°封闭1小时；最后用10mL含0.5%BSA溶液的0.01mol/LPBS(pH7.4)缓冲液洗涤磁珠3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液。
所述MES溶液的制备方法为：
称取MES19.52g，Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取950mL纯化水溶解，调节pH至4.5；加纯化水定容到1L，采用孔径0.2μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
二.抗试剂的制备
将DON单克隆抗体溶液与异硫氰酸荧光素(FITC)按Marsshall法共价连接，所述DON抗体是单克隆抗体（兔抗）。
三.酶标抗原试剂制备：
⑴呕吐毒素-牛血清白蛋白（DON-BSA）偶联物的制备：
取20mgDON、1mol马来酸酐以及0.07mol的DMAP，溶于2ml甲苯，80℃搅拌12小时，蒸干溶剂，酸化，萃取，重结晶后得到DON半抗原。
将60mgDON半抗原溶于9.5ml0.01mol/L,pH5.0的PBS溶液中，加入12.5mgEDC,再加入1mLDMF溶解的10mgDON半抗原，25℃搅拌反应2小时，再加入6mgEDC,置于阴暗处搅拌反应12小时，用0.01mol/LPBS透析72小时，每8小时更换1次透析液，既得到DON-BSA偶联物。
⑵酶标抗原试剂制备：
a.将5mgDON-BSA抗原溶于0.01mol/LPBSPH7.4溶液中；加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)溶液20μL，20℃放置30分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置3-5分钟；通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
b.将碱性磷酸酶ALP溶于2mmol/LEDTA20mmol/LTris-HCLPH8.0溶液中，溶度5mg/mL，加入0.10mg/mLTraunt试剂室温放置40分钟，通过SephadexG25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
将a和b溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合，室温放置3小时，然后用Superdex200凝胶层析柱分离纯化，收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保存在4℃。将上述连接物用酶反应物稀释液稀释到5μg/mL，使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存。
其中，酶反应物稀释液配置方法：Tris12.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠1g，加纯化水至600mL，调整pH值至7.5。加吐温201mL，BSA10g，加纯化水定容至1L。用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。
四.清洗液的制备：
取Tris12.54g、NaCl325.6g与吐温-205g先溶于900ml水中，再取0.2ml液体生物防腐剂Proclin-300溶于溶液中，最后将pH调整至7.4并定容至1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤既得清洗液浓缩液，使用时稀释20倍既得清洗液。
五.校准品与质控品的制备：
将DON抗原称重后用标准品缓冲液溶解分装，校准品浓度分别为1ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、200ng/mL与1000ng/mL，质控品溶度为1ng/mL与100ng/mL，4℃保存。
其中，标准品缓冲液的配制：取Tris2.42g、NaCl2g，BSA2.5g,Proclin-3001ml溶解于1000ml纯化水，pH调整至7.4，用0.2μm过滤器过滤，4℃保存。
六.底物溶液的制备：
取乙醇胺100g，NaCl2g，单磷酸酚酞4g，用纯化水配成1000mL，用37％盐酸调pH至8.4，用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存。
七.终止液的制备
取NaCl1.5g,Na2CO315g,EDTA10g，用纯化水配制成1000mL，用0.2μm过滤器过滤，常温保存。
以本试剂实施例1为例制备出呕吐毒素定量检测试剂盒，并以此检测30例盲样食品标本，具体检测方法如下：
a.备DON样本溶液：将30例盲样食品标本粉碎成粉末，之后每个标本称取5g粉碎均匀的样品，加入25mL10%甲醇水溶液萃取，振荡10分钟后用定性滤纸过滤去沉渣，收集滤液，滤液即可直接用于检测；
b.样和免疫反应：在每个试管中加入50μL样品溶液，然后分别依次加入50μL酶标抗原试剂和50μL抗试剂，混匀后37℃温育20分钟；
c.加磁分离试剂：在每个试管中加入50μL混匀后的磁分离试剂，混匀后继续37℃温育10分钟；
d.清洗：试管放置在磁分离器上分离3分钟，倒去上清液，每管加入清洗液250μL，充分混匀后，将试管放置在磁分离器上分离3分钟，倒去上清液，重复洗涤过程2次；
e.加入底物溶液：每管加入200μL底物溶液至试管中，37℃混匀5分钟；
f.终止显色：每管加入200ul终止液，磁分离10分钟；
g.读值：在分光光度计上读取吸光度。
得到以下检测结果：
分析灵敏度：对20次零校准品的测定，取其2倍的平均偏差，其在标准曲线上对应的浓度即为分析灵敏度；本发明试剂盒分析灵敏度为0.1ng/mL。
精密性：批内精密度CV%≤10.0%；批间精密度CV%≤15.0%；
准确度：回收率为100-110%
测量范围：1-1000ng/mL。
线性范围：取本试剂实施例1，每点重复检测3次，得出本试剂盒标准曲线为：y=1.0024x-0.1223,线性相关R2=0.9999，本发明试剂盒线性范围为0.1-1000ng/mL（见图1）。又以本试剂盒与市售酶联免疫法试剂盒分别检测同一批30例标本，具体见表1，检测结果显示出了两者良好的相关性：
表1
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①磁分离试剂的制备：
选用100mg具有顺磁性、表面带有羧基活性基团的磁分离微粒用0.1mol/L、pH4.5的2-（N-吗啉代）乙磺酸MES溶液10mL洗涤3次后，磁分离微粒用该溶液1mL重悬；之后加入50-250μl浓度为10mg/ml碳二亚胺EDC活化，25℃混匀2小时，加入2mg抗FITC抗体，37°C混合均匀2小时；之后加入1mL浓度为0.01mol/LPBS缓冲液于37°C密闭静置1小时，所述PBS缓冲液为pH7.4的含有5%牛血清白蛋白BSA的PBS缓冲液；最后用10mL含有0.5%BSA的0.01mol/LPBS缓冲液洗涤磁分离微粒3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液；
②抗试剂的制备：
将DON单克隆抗体溶液与FITC共价连接；
③酶标抗原试剂的制备：
所述酶标抗原试剂的制备包括以下成分的制备：DON-BSA偶联物以及酶标抗原试剂；
（1）DON-BSA偶联物的制备：
取20mgDON、1mol马来酸酐以及0.05-0.1mol的4-二甲氨基吡啶DMAP，溶于2ml甲苯，80°C搅拌12小时，蒸干溶剂，酸化，萃取，重结晶后得到DON半抗原；
将60mg牛血清白蛋白溶于9.5mL0.01mol/L、pH5.0的PBS溶液中，加入12.5mgEDC，再加入1ml溶解了10mgDON半抗原的二甲基甲酰胺DMF溶液，25°C搅拌反应2小时，再加入6mgEDC，置于阴暗处搅拌反应12小时，用0.01mol/LPBS透析72小时，每8小时更换1次透析液，即得到DON-BSA偶联物；
⑵酶标抗原试剂制备：
a.将5mgDON-BSA偶联物溶于0.01mol/LpH7.4的PBS溶液中，加入0.1mol/mL活化剂2-Iminothiolane·HCl溶液20μL，20℃放置30分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置3-5分钟；过柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
b.将碱性磷酸酶ALP溶于pH8.0的2mmol/LEDTA、20mmol/LTris-HCl溶液中，浓度5mg/mL，加入0.10mg/mL巯基活化试剂，室温放置40分钟，过柱子除去活化剂，收集蛋白峰；
将步骤a和步骤b获得的蛋白按照抗原与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合，室温放置3小时，然后用凝胶层析柱分离纯化，收集第一峰和第二峰，除去未连接的游离抗原和碱性磷酸酶，将产物保存在4℃，将上述产物用酶反应物稀释液稀释到5μg/mL，使用0.2μm过滤器过滤后4℃保存；
其中，酶反应物稀释液配置方法：Tris12.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠1g，加纯化水至600mL，调整pH值至7.5；加吐温-201mL，BSA10g，加纯化水定容至1L；用0.2μm过滤器过滤，于4℃保存；
④清洗液的制备：
取Tris12.54g、NaCl325.6g与吐温-205g先溶于900ml水中，再取0.2ml液体生物防腐剂Proclin-300溶于溶液中，最后将pH调整至7.4并定容至1000ml，完全溶解后用0.2μm滤器过滤即得清洗液浓缩液，使用时稀释20倍即得清洗液；
⑤校准品与质控品的制备：
将DON抗原称重后用标准品缓冲液溶解分装，校准品浓度分别为1ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、200ng/mL与1000ng/mL，质控品溶度为1ng/mL与100ng/mL，4°C保存；
其中，标准品缓冲液的配制：取Tris2.42g、NaCl2g，BSA2.5g,Proclin-3001ml溶解于1000ml纯化水，pH调整至7.4，用0.2μm过滤器过滤，4°C保存；
⑥底物溶液的制备：
取乙醇胺100g，NaCl2g，单磷酸酚酞4g，用纯化水配成1000ml，用37％盐酸调pH至8.4，用
0.2μm过滤器过滤，于4℃保存；
⑦终止液的制备
取NaCl1-2g,Na2CO310-15g,EDTA10-15g，用纯化水配制成1000ml,用0.2μm过滤器过滤，常温保存。
2.根据权利要求1所述的呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述选取的100mg具有顺磁性、表面带有羧基活性基团的磁分离微粒的直径为0.1-0.2μm。
3.根据权利要求2所述的呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述抗FITC抗体为羊抗、鼠抗或兔抗。
4.根据权利要求2所述的呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，DON单克隆抗体为羊抗、鼠抗或兔抗。
5.根据权利要求2所述的呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述MES溶液的制备方法为：称取MES19.52g，Tris1.56g,NaCl4.24g于1L烧杯中,量取950mL纯化水溶解，调节pH至4.5；加纯化水定容到1L，采用孔径0.2μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
6.根据权利要求2所述的呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述DON单克隆抗体溶液与FITC共价连接的连接方法为Marsshall法。
7.根据权利要求2所述的呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述柱子为SephadexG25柱子；所述凝胶层析柱为Superdex200凝胶层析柱。
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