CN104725505B - 一种高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

一种高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体及其制备方法，制备方法包括以下步骤：（1）呕吐毒素完全抗原合成；（2）呕吐毒素单克隆抗体的制备。步骤（2）中包括免疫程序、细胞融合、杂交瘤筛选及克隆化和抗体制备及纯化。本发明可以快速、灵敏、准确的检测呕吐毒素，克服了国产抗呕吐毒素单克隆抗体的亲和力低，大多以进口为主的问题。

Description

一种高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体及其制备方法，属于免疫检测技术领域。
背景技术
呕吐毒素的产毒菌主要是镰刀菌属(Fusarium)的菌侏，呕吐毒素主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等。呕吐毒素具有雌性激素作用，主要作用于生殖系统，可使家畜、家禽等产生雌性激素亢进症。食用含呕吐毒素的面粉制作的面食可以引起中枢神经系统的中毒，症状如恶心、发冷、头痛、神智抑郁和共济失调等。妊娠期的人和动物食用含呕吐毒素的食物易引起流产、死胎和畸胎，因此建立快速、灵敏、准确的呕吐毒素检测技术对人类健康具有重要意义。
目前，呕吐毒素的检测方法有化学发光法、液相色谱法、酶联免疫法、免疫胶体金法，其中，化学发光法，液相色谱法需要大型仪器和专业人员，而其他几种方法的核心是制备高亲和力的抗呕吐毒素单克隆抗体，而目前，国产抗呕吐毒素单克隆抗体的亲和力低，大多以进口为主。
本研究通过改进免疫原制备方法、融合方法、筛选方法，最终研制出一种高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体，及其单克隆抗体的制备方法，为快速、灵敏、准确的呕吐毒素检测产品的开发减少了成本。
发明内容
本发明提供了一种高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体及其制备方法，本发明为制备高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体提供了方法技术，为快速、灵敏、准确的呕吐毒素检测产品的开发减少了成本。
本发明是通过下述的技术方案来实现的：
高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体的制备方法
(1)呕吐毒素完全抗原合成
将呕吐毒素与N，N-羰二咪唑(CDI)分别按质量体积比为10:0.5-2(mg:mL)溶于吡啶中，于37℃衍生2-4h，得到呕吐毒素半抗原，将半抗原滴加到相当于吡啶2.5-4倍体积的0.01M PBS(3mL 0.01M PBS含20mg BSA)中，室温搅拌1h，用0.01mol/LPBS透析2天，得到呕吐毒素免疫抗原；
(2)高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体的制备
①免疫程序
将步骤(1)所得免疫抗原与501佐剂(山东绿都生物科技有限公司，货号LD003)按1:0.5-1.5的比例混合，对8-10周龄Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫，腿部肌肉注射，50μg/只，以后每隔两周免疫一次，免疫剂量、部位同上；5免后加强免疫，腹腔注射，不加佐剂，剂量加倍；
②细胞融合
将Balb/c小鼠体内的脾细胞与其腹腔内的骨髓瘤细胞按照20:0.5-1.5的比例混合，800rpm离心5-8min，弃去上清，于30S内加入1mL50％PEG(W/W)，静置1min，在第一个1min内缓慢加入1mL无血清的DMEM培养基(购自Gibico公司，货号H390)，在第二个1min内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第三个1min内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第四个1min内缓慢加入5mL无血清的DMEM培养基，在第五个1min内缓慢加入10mL无血清的DMEM培养基，800rpm离心10min，弃上清，用含20％小牛血清(购自Gibico公司，货号H1565)的完全培养基重悬细胞，细胞计数为3-6×105铺于含饲养细胞(2-6×104)的细胞培养板，置于CO2培养箱中。
③杂交瘤筛选及克隆化
待细胞长至孔底的1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，将阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，第6天，取细胞上清检测，最终选取高亲和力抗呕吐毒素的单克隆杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞冻存于液氮罐中，所述的杂交瘤细胞株W5于2014年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201474，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
④抗体制备及纯化
单克隆抗体的生产：采用动物体内腹水诱生法；
单克隆抗体的纯化：采用SPA柱(购自杭州纽龙生物科技有限公司)法对腹水进行纯化，即得本发明高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体。
通过本发明制备的高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体也在本发明的保护范围之内。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明可以快速、灵敏、准确的检测呕吐毒素，克服了国产抗呕吐毒素单克隆抗体的亲和力低，大多以进口为主的问题。
附图说明
图1为呕吐毒素完全抗原合成工艺图；
图2为呕吐毒素ELISA的竞争曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体的制备方法
(1)呕吐毒素完全抗原合成
将呕吐毒素和N，N-羰二咪唑(CDI)分别按质量体积比为10:1(mg:mL)溶于吡啶中，于37℃衍生3h，得到呕吐毒素半抗原，将半抗原滴加到相当于吡啶3倍体积的0.01M PBS(3mL 0.01M PBS含20mg BSA)中，室温搅拌1h，用0.01mol/LPBS透析2天，得到呕吐毒素免疫抗原，呕吐毒素完全抗原合成工艺如图1所示；
(2)呕吐毒素单克隆抗体的制备
①免疫程序
将步骤(1)所得免疫抗原与501佐剂(山东绿都生物科技有限公司，货号LD003)按1:1的比例混合，对8-10周龄Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫，腿部肌肉注射，50μg/只，以后每隔两周免疫一次，免疫剂量、部位同上；5免后加强免疫，腹腔注射，不加佐剂，剂量加倍；
②细胞融合
将Balb/c小鼠体内的脾细胞与其腹腔内的骨髓瘤细胞按照20:1的比例混合，800rpm离心5min，弃去上清，每只小鼠加入1mL 50％PEG(W/W)，于30S内加入，静置1min，在第一个1min内缓慢加入1mL无血清的DMEM培养基(购自Gibico公司，货号H390)，在第二个1min内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第三个1min内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第四个1min内缓慢加入5mL无血清的DMEM培养基，在第五个1min内缓慢加入10mL无血清的DMEM培养基，800rpm离心10min，弃上清，用含20％小牛血清(购自Gibico公司，货号H1565)的完全培养基重悬细胞，细胞计数为3-6×105铺于含饲养细胞(2-6×104)的细胞培养板，置于CO2培养箱中。
③杂交瘤筛选及克隆化
待细胞长至孔底的1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，将阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，第6天，取细胞上清检测，最终选取高亲和力抗呕吐毒素的单克隆杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞冻存于液氮罐中，所述的杂交瘤细胞株W5于2014年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201474。
④抗体制备及纯化
单克隆抗体的生产：采用动物体内腹水诱生法。向Balb/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司，货号F5881)，0.5mL/只，10天后待小鼠肚子稍稍变大，向腹腔内注射杂交瘤细胞，100万个细胞/只，7天后开始取腹水。
单克隆抗体的纯化：先将收集的腹水以4000rpm的速度离心，弃沉淀，将上清上SPA柱，按照柱子说明书操作，1mL SPA琼脂糖凝胶FF预装柱用5-10个柱床体积的蒸馏水洗去保存液；用结合缓冲液平衡5-10个柱床体积；
将5mL兔多抗血清用结合缓冲液稀释到50mL，0.45μm滤膜过滤上样；
用结合缓冲液再洗5-10个柱床体积；用洗脱缓冲液洗脱抗体，收集洗脱峰，并用中和缓冲液调节其pH至中性；每次使用后用3-5个柱床体积的0.1M NaOH溶液(pH 3.0)再生清洗。纯化好的抗体分装于-20度保存。
试验例1抗呕吐毒素单克隆抗体的亚型及亲和常数测定
抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定：采用抗体亚类测定试剂盒(购自ThermoScientific公司)进行测定，亚型为IgG1。
抗体亲和常数测定：OD490值为纵坐标作图，以各曲线上部趋于平坦段的OD值为100％，查出其OD值为50％点的McAb浓度[Ab]，这样每份被检样品针对抗原可得[Ab]、[Ab]t、[Ab`]t三个值，代入公式计算抗体亲和常数：
Ka＝(n-1)/2(n[ab]-[ab]t)
其中，[Ab]为抗原浓度为[Ag]时A＝1/2Amax对应的抗体浓度；[Ab]t表示抗原浓度为[Ag]t时A＝1/2Amax对应的抗体浓度；[Ag]、[Ag]t：表示抗原浓度；n为抗原[Ag]与[Ag]t间的稀释倍数，亲和常数为2×1011。
试验例2呕吐毒素单克隆抗体的亲和力测定
经考马斯亮蓝法测定包被抗原的浓度为5.2mg/mL，纯化单抗的浓度为6.7mg/mL，通过正交实验，ELISA曲线的最佳抗原稀释度为1:60000，最佳抗体稀释度为1:160000，呕吐毒素标准品的浓度为：0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L。
呕吐毒素单克隆抗体应用于ELISA的竞争曲线如图2所示。

Claims (4)

1.高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体的制备方法，其特征在于，
所述制备方法中采用的单克隆杂交瘤细胞株是保藏编号为CCTCC NO：C201474的杂交瘤细胞株W5。
2.通过如权利要求1所述的方法制备的高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体在检测呕吐毒素中的应用。
4.一株杂交瘤细胞株W5，其特征在于，所述杂交瘤细胞株W5保藏编号为CCTCC NO：C201474，保藏日期为2014年6月5日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
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