CN102952782A - 呕吐毒素杂交瘤、单克隆抗体及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了呕吐毒素杂交瘤、单克隆抗体及其制备方法及用途。以呕吐毒素与牛血清白蛋白偶联物为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，将小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0制备杂交瘤细胞，经间接ELISA筛选和有限稀释法获得单克隆抗体杂交瘤细胞株D-2-1CGMCC No.5161，将杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔内生产单克隆抗体，将该抗体应用于呕吐霉素间接竞争ELISA测定。本发明单克隆抗体可特异性检测呕吐毒素，灵敏度高，以此单克隆抗体制备的ELISA试剂盒检测呕吐毒素，成本低，无需大型仪器设备，操作简便，便于推广利用。

Description

呕吐毒素杂交瘤、单克隆抗体及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种杂交瘤、单克隆抗体及其制备与用途，具体涉及呕吐毒素杂交瘤、呕吐毒素单克隆抗体及其制备方法与用途。 

技术背景

呕吐毒素(化学结构式见图1)，化学上称作脱氧腐镰刀菌烯醇，属于霉菌的单端孢菌素族，具有很高的细胞毒性及免疫抑制性质，禾谷镰刀菌、拟枝镰刀菌，梨孢镰刀菌等镰刀菌株及头孢均属、漆班菌属、木霉菌等菌株都可产生该毒素，呕吐毒素对粮谷类的污染非常普遍。呕吐毒素可引起雏鸭、猪、猫、狗等动物严重的呕吐反应，严重者可造成死亡。急性中毒的动物主要表现为站立不稳、反应迟钝、竖毛、食欲下降、呕吐等，还可引起动物的拒食反应，其中猪对呕吐毒素最为敏感，呕吐毒素能引起猪食欲减退或废绝、呕吐、体重下降，流产、死胎和弱仔，抑制免疫机能和降低机体抵抗力。 

目前，呕吐毒素的检测方法有高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法等，仪器设备昂贵，技术水平要求较高，样品还需要进行纯化处理，不利于现场筛查。薄层色谱，样品前处理繁琐，实验过程复杂，所需时间长，准确性差，对实验人员危害较大，亦不利于现场筛查。 

酶联免疫分析技术，现在已经广泛应用于快速、微量检测药物残留，酶联免疫分析技术可定性定量检测微量残留有害物质，且对仪器要求低，成本低，操作快速简便，对样本前处理过程简单，对检测人员专业要求低，灵敏度较高，可适用于现场大量样本快速检测，实现酶联免疫检测技术的关键是合成抗体。 

发明内容

本发明提供针对现有技术的上述不足，提供了一种呕吐毒素杂交瘤、单克隆抗体及其制备方法与用途。 

一种呕吐毒素杂交瘤细胞株D-2-1CGMCC No.5161。 

一种呕吐毒素单克隆抗体是由杂交瘤细胞D-2-1CGMCC No.5161分泌的。 

一种呕吐毒素单克隆抗体的制备方法，其特征在于以呕吐毒素半抗原与牛血清白蛋白偶联物为免疫抗原，免疫Balb/C小鼠，将小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0制备杂交瘤细胞，经间接ELISA筛选和有限稀释法获得单克隆抗体杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。 

免疫抗原是由呕吐毒素与马来酸酐缩合反应，再与牛血清白蛋白偶联得到的。 

本发明的提供一种基于上述方法制备的抗原及其单克隆抗体用于检测呕吐毒素及其含量的ELISA测定方法。 

本发明所述的一种检测呕吐毒素及其含量的ELISA测定方法，样本中的呕吐毒素可以与包被抗原对抗体发生竞争反应，根据其吸光度的数值可以从标准曲线上推算出样品中呕吐毒素的含量，该方法的灵敏度可达到0.5μg/L。 

有益效果：本发明提供的单克隆抗体可特异性检测呕吐毒素，灵敏度较高，本发明单克隆抗体制备的ELISA试剂盒可以对食品中呕吐毒素进行快速检测，具有特异性高，灵敏度高，无需大型仪器设备，操作简便，便于推广应用的优点。 

附图说明：

图1呕吐毒素结构式。 

图2呕吐毒素半抗原合成路线图。 

图3呕吐毒素标准品竞争ELISA曲线。 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

实施例1  呕吐毒素完全抗原合成 

(1)呕吐毒素半抗原合成(合成技术路线见图2) 

20-100mg呕吐毒素(购自上海安普科学仪器有限公司，货号CDFV-ALX-630-115-M001)，与1-3mol马来酸酐，催化量的DMAP，在2-5ml甲苯中，于室温80℃搅拌反应，8-20h后，蒸干溶剂，酸化，萃取，重结晶后得 到呕吐毒素半抗原。 

(2)呕吐毒素免疫抗原合成 

将呕吐毒素半抗原与牛血清白蛋白偶联得到免疫原。 

取60mg牛血清白蛋白溶于9.5ml PBS(0.01mol/L，pH5.0)溶液中，加入12.5mg EDC，加入1mlDMF溶解的10mg呕吐毒素半抗原，室温搅拌1h，再加6mg EDC，暗处搅拌反应并过夜，用0.01mol/LPBS透析3天，每天换3次透析液，得到呕吐毒素与牛血清白蛋白的免疫抗原。 

(3)呕吐毒素包被抗原合成 

将呕吐毒素半抗原与卵清蛋白偶联得到免疫原。 

取45mg卵清蛋白溶于5.5ml PBS(0.01mol/L，pH5.0)溶液中，加入12.5mgEDC，加入1mlDMF溶解的10mg呕吐毒素半抗原，室温搅拌1h，再加6mg EDC，暗处搅拌反应并过夜，用0.01mol/LPBS透析3天，每天换3次透析液，得到呕吐毒素与牛血清白蛋白的免疫抗原。 

实施例2  呕吐毒素单克隆抗体的制备 

将上述所得免疫抗原与弗氏佐剂(购自Sigma公司，货号F5881)按1∶3的比例混合，对8-10周龄Balb/c小鼠进行免疫，颈背部皮下多点注射，免疫剂量为150μg/只，两周后二免，采用弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司，货号F5506)，免疫剂量同上；28天后三免，采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量同上，31天后加强免，直接采用免疫原免疫。 

加强免疫后3天，取免疫Balb/c小鼠一只，眼眶采血后脱臼处死，在75％酒精中消毒后取脾脏，制备脾细胞悬液，转移到50ml离心管中，加RPMI1640至30ml，1500～2000rpm离心5min，弃上清，加RPMI1640至30ml，计数待用。 

取3瓶生长状态良好的(活细胞数＞95％)骨髓瘤细胞，将之完全吹下，转移到50ml离心管中，加RPMI1640至30ml，1500～2000rpm离心5min分钟，弃上清，加RPMI1640至30ml，计数待用。 

将脾细胞与骨髓瘤按照8∶1的比例混合，1500～2000rpm离心5min，将混合好的细胞离心，将沉淀细胞置于37℃水浴，加入1ml聚乙二醇(PEG)4000，搅拌2min，随后加入20ml无血清的PEG营养液，1000rpm离心10min，弃上清，用 20～50ml完全培养液重悬细胞，铺种于含饲养细胞96孔细胞培养板，置培养箱中。 

上清检测：待细胞长至孔底的1/2～1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，将阳性细胞采用有限稀释法进行亚克隆，10～14天后，再取细胞上清检测，最终得到呕吐毒素的单克隆杂交瘤细胞株，此细胞株命名为D-2-1，分类命名为呕吐毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，该细胞株已于2011年08月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.5161。 

单克隆抗体的腹水制备和纯化 

液体石蜡致敏Balb/c小鼠，6～8周，注射体积500μl/只。10天后可制备腹水，取100到150万细胞注射于老鼠腹腔，一周后采集腹水。采集到的腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20℃环境保存。 

实施例3  间接ELISA法建立 

(1)抗原抗体效价测定 

取呕吐毒素-卵清蛋白包被抗原以PBS(pH7.4，0.01mol/L)作1∶1000，1∶2000，1∶3000，1∶4000，1∶5000稀释，按照每孔100μl进行包被，37℃温育2h，倾去包被液，用PBST洗涤2次，每孔中加入200μl封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，备用。 

向板孔中加入呕吐毒素标准品溶液50μl/孔，随即加入以PBS(pH7.4，0.01mol/L)1∶4000稀释的羊抗鼠酶标二抗(购自北京吉比埃生物技术有限公司)50μl/孔，再加入以PBS(pH7.4，0.01mol/L)进行1∶3000，1∶6000，1∶12000，1∶24000，1∶48000，1∶96000稀释的呕吐毒素单克隆抗体50μl/孔，25℃反应30min，用PBST洗板3次，拍干。 

加入显色底物反应25℃反应15min后，加入1～2mol/L的硫酸终止反应，用酶标仪以450/630nm双波长读取数据，以零标准品吸光度值约为1.5-2.0左右，0.5μg/L标准品抑制率约为15％-30％为参照，综合考虑抗原抗体稀释倍数等因素，最终测定抗原稀释倍数为1∶2000-3000，抗体稀释倍数为1∶12000-48000，具体测定结果见表1。 

表1  最佳抗原包被浓度和最佳抗体稀释浓度的测定结果 

(2)酶标二抗最佳工作浓度 

以上述确定的抗原包被浓度和呕吐毒素抗体浓度为参照，将羊抗鼠酶标二抗稀释三个浓度水平进行试验，分别为1000，3000，9000。 

取呕吐毒素-卵清蛋白包被原以PBS(pH7.4，0.01mol/L)作1∶2000，1∶3000稀释，按照每孔100μl进行包被，37℃温育2h，倾去包被液，用PBST洗涤2次，每次30s，拍干，每孔中加入200μl封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，备用； 

向板孔中加入呕吐毒素标准品溶液50μl/孔，随即加入以PBS(pH7.4，0.01mol/L)1∶1000，1∶3000，1∶9000进行稀释的羊抗鼠酶标二抗50μl/孔，再加入PBS(pH7.4，0.01mol/L)进行1∶12000，1∶24000，1∶48000稀释的呕吐毒素单克隆抗体50μl/孔，25℃反应30min，用PBST洗涤3次，拍干。 

加入显色底物反应25℃反应15min后，加入1～2mol/L的硫酸终止反应，用酶标仪以450/630nm双波长读取数据，以零标准品吸光度值约为1.5-2.0左右，0.5μg/L标准品抑制率约为15％-30％为参照，综合考虑抗原抗体稀释倍数等因素，确定结果见表2。 

表2  羊抗鼠酶标二抗工作浓度的确定 

结果说明：最佳羊抗鼠酶标二抗稀释倍数为1∶3000；最佳包被浓度为1∶2000，呕吐毒素单克隆抗体最佳稀释倍数为1∶24000-48000。 

(3)呕吐毒素间接竞争ELISA方法的建立 

从抗原、抗体、羊抗鼠酶标二抗的最适工作浓度、竞争反应时间、温度等方面确定了呕吐毒素ELISA方法的最佳反应条件，建立了呕吐毒素间接竞争ELISA方法。 

向酶标板微孔中加入稀释后的系列呕吐毒素标准品0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L各50μl/孔，随即加入羊抗鼠酶标二抗(pH7.4，0.01mol/L的PBS以1∶3000稀释)50μl/孔，再加入呕吐毒素单克隆抗体(pH7.4， 0.01mol/L的PBS以1∶36000稀释)50μl/孔，25℃反应30min，用PBST洗涤3次，拍干，加入显色底物，25℃反应15min，加入1～2mol/L的硫酸终止反应，用酶标仪以450/630nm双波长读取OD值，结果见表3和图3。 

表3  呕吐毒素标准品OD值的确定 

(4)单抗腹水的特异性测定 

选择呕吐毒素和常见的几种毒素(T2，黄曲霉毒素B1)，进行交叉反应试验，计算交叉反应率，结果见表4。 

交叉反应率(％)＝(引起50％抑制呕吐毒素的浓度/引起50％抑制的其他药物浓度)×100％ 

表4  单抗腹水的特异性测定结果 

药物名称	交叉反应率(％)
		呕吐毒素	100
T2	＜1
		黄曲霉毒素B1	＜1

Claims (5)

1.一种呕吐毒素杂交瘤细胞株D-2-1CGMCC No.5161。

2.一种呕吐毒素单克隆抗体是由杂交瘤细胞D-2-1CGMCC No.5161分泌的。

3.一种呕吐毒素单克隆抗体的制备方法，其特征在于以呕吐毒素半抗原与牛血清白蛋白偶联物为免疫抗原，免疫Balb/C小鼠，将小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0制备杂交瘤细胞，经间接ELISA筛选和有限稀释法获得单克隆抗体杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的呕吐毒素单克隆抗体的制备方法，其特征在于免疫抗原是由呕吐毒素与马来酸酐缩合反应，再与牛血清白蛋白偶联得到的。

5.如权利要求2所述的呕吐毒素单克隆抗体用于间接竞争ELISA检测呕吐毒素含量的应用。

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