CN104569382A

CN104569382A - 一种检测呕吐毒素的免疫亲和柱及其应用

Info

Publication number: CN104569382A
Application number: CN201310514174.5A
Authority: CN
Inventors: 冯才伟; 罗晓琴; 万宇平; 何方洋; 常平平; 冯才茂; 杨昌松; 徐念琴
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2013-10-26
Filing date: 2013-10-26
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2033-10-26
Also published as: CN104569382B

Abstract

本发明公开了一种检测呕吐毒素的免疫亲和柱及其应用。免疫亲和柱包括固相萃取柱空柱（1）、上筛板（2）、上盖（3）、下盖（4）、固相介质（5）、下筛板（6）；所述固相介质上偶联有呕吐毒素抗体。本发明还提供了一种应用上述呕吐毒素免疫亲和柱检测谷物及饲料中呕吐毒素残留的方法。本发明所提供的免疫亲和柱具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。

Description

一种检测呕吐毒素的免疫亲和柱及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测呕吐毒素的免疫亲和柱及其应用，具体涉及一种用于检测呕吐毒素的免疫亲和柱，其特别适用于谷物及成品饲料中呕吐毒素残留检测的样本前处理。

背景技术

呕吐毒素(vomitoxin)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，是单端孢菌素烯烃中的一种，它通常是由生长在谷类物品（如小麦、玉米、大麦和秣草）霉菌镰红菌素生成的。呕吐毒素的毒性效应包括：呕吐、不想进食、胃肠炎、腹泻、免疫抑制和血液病。

DON广泛存在于全球，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应。近年来发现DON可能与人类食管癌、IgA肾病有关，对人类及动物的健康构成威胁。人畜摄入了被DON污染的食物/饲料后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。研究表明，DON可能对免疫系统有影响，有明显胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遗传毒性，但无致癌、致突变作用。由于DON的危害严重，引起了各国的普遍重视。谷物及饲料中DON的含量有严格的限量标准。我国谷物、猪配合饲料、犊牛配合饲料、泌乳期动物配合饲料中DON的限量标准为1.0mg/kg，牛配合饲料、家禽配合饲料中DON的限量标准为5.0mg/kg。

传统的霉菌毒素提纯方法多采用有机溶剂萃取和化学吸附等方法，这些方法存在诸多不足之处：特异性不高，纯化效率低，纯化效果差；实验灵敏度和重复性差；操作过程烦琐、复杂、时间长，劳动强度大；使用有机溶剂容易造成环境污染，对操作人员伤害较大。而免疫亲和柱法能够较好地解决上面的不足，该方法采用特异性免疫反应为分离手段，大大提高了样品的纯度和纯化效率，保证了检测结果的可靠性和稳定性。我们设计的这种用免疫层析技术作为检测谷物及成品饲料中呕吐毒素的前处理方法，适合于批量样品，是理想的前处理手段，能够更好地满足我国谷物及成品饲料企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、前处理时间短的呕吐毒素免疫亲和柱。

本发明所提供的呕吐毒素免疫亲和柱，包括固相萃取柱空柱（1）、上筛板（2）、上盖（3）、下盖（4）、固相介质（5）、下筛板（6）；所述固相介质上偶联有呕吐毒素抗体。

所述呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物是由呕吐毒素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

所述呕吐毒素单克隆抗体是以呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由呕吐毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。

所述下筛板、下盖、固相介质、上筛板、上盖依次安装入固相萃取柱空柱上，在加入上盖之前，所述固相萃取柱已加入柱高为5/8～7/8保存液。

所述筛板为亲水材料，上盖和下盖为塑料材质。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述免疫亲和柱的方法，其包括步骤：

1）制备偶联有呕吐毒素抗体的固相介质。

2）将固相介质装入柱中，按亲和柱的组合、连接方式组装免疫亲和柱。

具体地说，步骤包括：

1）半抗原制备：将呕吐毒素与1,3-丙二胺反应得到呕吐毒素半抗原；

2）将呕吐毒素半抗原与载体蛋白偶联，得到呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物；

3）用呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到呕吐毒素单克隆杂交瘤细胞株；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5）称取CNBr-active-Sepharose-4B柱料1g，加1mM HCl溶液10ml溶胀，时间为30min，然后3000-8000rpm，离心2-10min分离柱料，用0.2M CB PH9.5缓冲液洗溶胀的基质3-5次，10ml每次，均为5000rpm，离心10min分离柱料；

6）向溶胀好的柱料中加入抗体80mg，0.2M CB PH9.5缓冲液10ml，37℃，150rpm震荡反应1h。

7）离心分离柱料，用0.1M NaHCO₃PH8.3缓冲液洗柱料3-5次，10ml/次；

8）加0.1M乙醇胺，含0.5M NaCl PH8.0溶液10ml于已经结合偶联物的柱料中，4℃过夜或者37℃，150rpm，2h封闭未结合位点。

9）用洗脱液0.1M醋酸钠，0.5M NaCl PH4.0与0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl PH8.0交替洗涤3-5遍，最终用洗脱液0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl PH8.0缓冲液10ml复溶；

10）按1ml抗体结合凝胶溶液每支进行装柱，加20%的乙醇保存液，4-8℃，可保存一年以上。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述免疫亲和柱对谷物及成品饲料中呕吐毒素进行检测的方法，它包括步骤：

（1）样本前处理；

（2）样本过免疫亲和柱，提取、浓缩、纯化样本中的检测物；

（3）提取液进行分析检测。

本发明的呕吐毒素免疫亲和柱是以抗原抗体反应为基础，在柱体内部的载体上偶联有抗呕吐毒素的抗体，该抗体可与呕吐毒素产生特异性结合，通过淋洗除去无关杂质，再通过洗脱操作将目标物呕吐毒素洗脱，最终的洗脱液用于分析。

本发明的免疫亲和柱具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、前处理时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明免疫亲和柱对呕吐毒素进行前处理的方法简便、快速、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为免疫亲和柱剖面结构示意图。

图2为呕吐毒素半抗原合成图。

图3为呕吐毒素半抗原核磁共振氢谱图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1 呕吐毒素检测免疫亲和柱的制备

该免疫亲和柱的制备方法主要包括以下步骤：

1）制备偶联有呕吐毒素抗体的固相介质即CNBr-琼脂糖凝胶-4B-Ab

下面分步详细叙述：

1、呕吐毒素半抗原的制备

0.10g呕吐毒素在2mL二甲基亚砜（DMSO）中混合，60℃下缓慢滴加入0.1mL1,3-丙二胺和0.1mL吡啶在2mL DMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应12h，旋蒸除去溶剂和未反应的丙二胺，定量得到呕吐毒素的丙二胺单缩合物，合成路线如图2。

取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图3所示，1.1-3.5ppm之间增加的丙二胺片段烷基信号峰，说明半抗原合成成功。

2、免疫原的制备

取半抗原15.3mg用2ml水溶解；取戊二醛50ul逐滴加入到溶液（1）中．室温搅拌反应24h；取BSA50mg用4ml水溶解；将（1）缓慢加入到时（3）中，室温搅拌反应过夜；加入NaBH₄30mg还原；用0.02M的PBS透析三天，每天更换透析液三次，得到免疫原。

3、呕吐毒素单克隆抗体的制备

（1）动物免疫

将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

（2）细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

（3）细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

（4）单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20%（质量分数），碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2%（质量分数）；所述细胞培养基的pH为7.4。

4、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

5、免疫亲和柱的组装

称取CNBr-active-Sepharose-4B柱料1g，加1mM HCl溶液10ml溶胀，时间为30min，然后3000-8000rpm，离心2-10min分离柱料，用0.2M CB PH9.5缓冲液洗溶胀的基质3-5次，10ml每次，均为5000rpm，离心10min分离柱料；向溶胀好的柱料中加入抗体80mg，0.2M CB PH9.5缓冲液10ml，37℃，150rpm震荡反应1h。离心分离柱料，用0.1M NaHCO₃PH8.3缓冲液洗柱料3-5次，10ml/次；加0.1M乙醇胺，含0.5M NaCl PH8.0溶液10ml于已经结合偶联物的柱料中，4℃过夜或者37℃，150rpm，2h封闭未结合位点。用洗脱液0.1M醋酸钠，0.5M NaCl PH4.0与0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl PH8.0交替洗涤3-5遍，最终用洗脱液0.1M Tris-HCl，0.5M NaClPH8.0缓冲液10ml复溶；按1ml抗体结合凝胶溶液每支进行装柱，加20%的乙醇保存液，4-8℃，可保存一年以上。

实施例2 样品中呕吐毒素残留的检测

1、样品的前处理

用均质器均质样品；称取2.0±0.05g样品至50ml聚苯乙烯离心管中，加入16ml去离子水，用涡旋仪涡旋5min，或者摇床震荡20min，3000g以上，室温（20-25℃-77/68℉）离心5min；用定性滤纸过滤所有上清液待用；

2、样品过柱操作步骤

将免疫亲和柱连接于10ml的注射器下，将亲和柱产品使用转接头进行连接；准确吸取8ml（相当于1g样品）待测液加入到注射器中，使用注射器控制待测液流速为2秒每滴通过亲和柱；用5ml去离子水淋洗亲和柱1次，使用注射器控制流速为0.5-1秒每滴，待液体通过后，排干亲和柱内的液体；准确吸取1ml甲醇，进行洗脱操作，使用注射器控制流速为2-3秒每滴，收集全部洗脱液，于50-60℃（122-140℉）水浴氮气流下吹干，用1ml流动相进行复溶，用于分析。

实施例3 样品检测实例

1、阴性样本空白测定：基质总类包括（谷物、成品饲料）。

取以上各种基质（玉米、豆粕、麦麸、酒糟、配合料、浓缩料）的空白样本，通过呕吐毒素免疫亲和柱进行净化再进行仪器检测得出以下结果(见表1)，每个样本重复测定三次。

表1各种空白样本检测结果

结果表明：各种基质检出空白值，远远小于国家要求检测限量1μg/kg，说明该亲和柱能适用于各种基质的样本检测，不同样本基质不会对检测造成空白干扰。

2、准确度及精密度测定：在不同种类以上空白样本中，添加呕吐毒素浓度为1μg/g，通过呕吐毒素免疫亲和柱进行净化再进行仪器检测得出以下结果(见表2)，每个添加重复测定三次。

表2各种基质准确度及精密度检测结果

结果表明：各种基质下回收率均在90%-108%，各种样本三次重复测定变异系数均小于5%，说明该亲和柱适用于各种基质样本呕吐毒素检测。

Claims

1.一种检测呕吐毒素的免疫亲和柱，包括固相萃取柱空柱（1）、上筛板（2）、上盖（3）、下盖（4）、固相介质（5）、下筛板（6），其特征在于所述固相介质上偶联有呕吐毒素抗体。

2.如权利要求1所述的免疫亲和柱，其特征在于所述筛板为亲水材料，上盖和下盖为塑料材质。

3.如权利要求1-2任一项所述的免疫亲和柱，其特征在于所述下筛板、下盖、固相介质、上筛板、上盖依次安装入固相萃取柱空柱上，在加入上盖之前，所述固相萃取柱已加入柱高为5/8～7/8保存液。

4.如权利要求1所述的免疫亲和柱，其特征在于所述呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物由呕吐毒素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

5.如权利要求1或4任一项所述的免疫亲和柱，其特征在于所述呕吐毒素半抗原是由呕吐毒素与1,3-丙二胺反应得到，其分子结构式为：

6.如权利要求1所述的免疫亲和柱，其特征在于所述呕吐毒素单克隆抗体是以呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。

7.一种制备权利要求1-6任一项所述免疫亲和柱的方法，其包括步骤：

1）制备偶联有呕吐毒素抗体的固相介质；

8.一种检测谷物及成品饲料中呕吐毒素进行检测的方法，其包括步骤：

1）样本前处理；

2）样本过免疫亲和柱，提取、浓缩、纯化样本中的检测物；

3）提取液进行分析检测。