CN107262074A - 一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇适配体亲和柱及其制备方法和用途 - Google Patents

一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇适配体亲和柱及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇适配体亲和柱及其制备方法和用途。该亲和纯化柱利用化学修饰的固相载体，然后用脱氧雪腐镰刀菌烯醇的核酸适配体与载体进行共价偶联。然后装填亲和柱。该适配体亲和柱主要用于对于食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的纯化，以便于后期对样本中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的高效液相色谱（HPLC）检测和荧光检测。

Description

一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇适配体亲和柱及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇的适配体亲和柱及其制备方法和用途。属食品安全检测领域。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON) 又名呕吐毒素(vomitoxin,VT), 主要是由某些镰刀菌产生的次级代谢产物之一—一种单端孢霉烯族毒素。DON 是单端孢霉烯族毒素中最常见的一种, 研究表明DON虽然没有明显的致癌、致突变性, 但具有广泛的毒性, 特别是对免疫功能具有明显的影响, 根据DON 的剂量和暴露时间不同可引起免疫抑制或免疫刺激。动物采食带有霉菌毒素的饲料均可发生中毒, 猪对DON 的致吐作用最敏感, 经口最小呕吐量为0.1～0.2 mg/kg, 主要产毒菌是禾谷镰刀菌、雪腐镰刀菌等。DON是全世界饲料和粮食的污染霉菌毒素之一, 也是我国恶性肿瘤高发区居民粮食主要污染霉菌毒素之一。国家标准GB2761- 2005《食品中真菌毒素限量》中, 小麦及玉米中DON 的限量为1000μg/kg。2007 年3 月1 日实施的国家强制性标准GB20833- 2007 中猪配合饲料中DON 的允许量≤1mg/kg。
目前脱氧雪腐镰刀菌烯醇常用的检测方法有薄层层析法（TLC）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、气相色谱法（GC）和高效液相色谱法（HPLC）等。
薄层色谱测定法(thin layerchromatography, TLC)这是最早建立的一种检测方法, 具有简便、经济、对设备和检验人员要求不高等特点。是我国国家标准检测方法之一[7]。但由于TLC 法的精确度低, 操作过程复杂,分析结果的可重复性和再现性差, 该法目前仍是除北美和欧洲以外其他国家, 尤其是发展中国家检测食品和饲料中真菌毒素的常规方法。
酶联免疫吸附试验(ELISA)酶联免疫吸附试验又称之为免疫测定法, 是以免疫抗体为基础的免疫检测技术,是一类快速、灵敏且操作简单的分析方法, 在毒素和有毒化合物等小分子化合物的检测中应用已十分广泛, 目前已经有检测呕吐毒素的ELISA 方法和产品。但目前检测DON的ELISA方法 的主要缺点是由于存在所用抗体与DON 的乙酰化类似物的交叉反应致使其检出值偏高, 较易出现假阳性。另外,使用ELISA 方法难以在纯有机溶液剂中检测DON。
气相色谱法(gaschromatography GC)由于DON 分子中含有3 个羟基, 易形成稳定的氢键, 降低挥发性,因此在进行气相色谱分析前必须进行衍生化。将DON衍生 形成三甲基硅烷物。但是衍生试剂如七氟丁酸酐（HFBA ）价格昂贵, 且易挥发。GC 具有灵敏、高选择性、准确性和精确性等优点。另外, 用GC 还能实现对多 种真菌毒素的同时检测。但GC色谱中存在如下问题: 标准曲线线性关系不好、响应漂移、上一次进样样品的滞留和记忆效应、MS 检测时重复进样变异系数大以及存在基质干扰等问题。
高效液相色谱法( high performanceliquid chromatography, HPLC)高效液相色谱方法(HPLC) 高效液相色谱对样品的适用性广, 不受分析对象挥发性和热稳定性的限制, 因而弥补了气相色谱法的不足。是定量分析真菌毒素最常用的方法。
在使用高效液相色谱检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇时，需要先将脱氧雪腐镰刀菌烯醇样品进行净化处理。目前常用的净化处理方法就是固相萃取法，也叫柱层析法。是目前真菌毒素净化使用最广泛的方法。其中，免疫亲和柱方法的分析速度快, 灵敏度高,分离效率和回收率高, 不需要剧毒的真菌毒素标准物来标定, 安全可靠。因而成为最常用的方法。MacDonald SJ,等对免疫亲和柱净化处理脱氧雪腐镰刀菌烯醇样本，然后进行HPLC检测的方法进行了详细的描述。[MacDonald SJ J AOAC Int, 2005, 88(4): 1197～1204]。
核酸适配体被应用于小分子的检测，在专利CN105505940A中，描述了一种黄曲霉毒素B1的适配体DNA传感器。通过黄曲霉毒素B1的适配体，及多条互补探针序列制备DNA传感器，通过酶底物反应，实现黄曲霉毒素B1的检测。在毒素分离中，在专利CN104399283中，描述了一种黄曲霉毒素B1的适配体亲和柱。该专利利用环氧基活化的琼脂糖微球，将黄曲霉毒素B1的适配体偶联，制备成亲和柱。实现黄曲霉毒素的分离。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱及其制备方法和用途
在本发明中，我们利用SELEX系统，从适配体文库中筛选出来一条高特异性、高亲和力的的新的脱氧雪腐镰刀茵烯醇的DNA适配体。适配体修饰后与N-羟基琥珀酰亚胺活化的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到脱氧雪腐镰刀茵烯醇的特异性载体。载体装柱后就形成了高亲和力的脱氧雪腐镰刀茵烯醇毒素适配体亲和柱
该亲和柱操作简便，纯化脱氧雪腐镰刀茵烯醇毒素效率高。能耐受有机溶剂，并且可以重复使用。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的脱氧雪腐镰刀茵烯醇毒素。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。
具体操作如下：
本发明最大的优势就是利用了核酸适配体的特性，通过多轮的富集、洗涤、扩增等步骤，筛选出针对脱氧雪腐镰刀茵烯醇的特异性适配体。通过序列测定得到适配体的序列
核酸适配体相对于抗体来说，具有适应环境广泛，能够耐受高温、能耐受有机溶剂并且操作方便等优点。最主要的，适配体在制备过程中不需要经过动物体内的过程，而是通过化学合成来获得。因此，生产周期短，并且可以通过合成条件保证序列的准确性
以核酸适配体为基础制备的亲和柱具有特异性好，脱氧雪腐镰刀茵烯醇毒素结合量大，纯化效率高的特点。
脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱及其制备方法说明如下
1.选择N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）修饰的琼脂糖载体sepharose4B，进行活化
取1gN-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖，加入用50ml 1mM的HCl，溶胀30min后，凝胶用100ml 1mM HCl洗涤6次，再用100ml超纯水洗涤
2.将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液（0.1M的NaHCO3，0.8M NaCl，PH8.2）洗涤3次。加入20mol/L的氨基修饰的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体，室温偶联8小时
3.将偶联好的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次
4.封闭
将偶联好的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体-琼脂糖载体中加入100mmol/L的Tris.ClPH8.0 ，室温反应2小时
5.将封闭好的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次
6.装柱
将脱氧雪腐镰刀茵烯醇—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的脱氧雪腐镰刀茵烯醇亲和柱。层析柱的结构如附图1所示。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.本发明充分的利用了核酸适配体的优点，通过多轮的筛选和富集。得到了高特异性高亲和力的脱氧雪腐镰刀茵烯醇核酸适配体。该适配体能够特异性的结合样本中的脱氧雪腐镰刀茵烯醇，降低了抗体亲和柱经常遇到的交叉反应性。亲和柱效率大幅度提高
核酸适配体不受操作环境和有机溶剂的影响，尤其适合真菌毒素类的脂溶性物质的纯化。相比较，由于免疫亲和柱中的抗体不耐有机溶剂，有机溶剂常常会造成抗体的失活而使亲和柱效率降低
此外，由于有机溶剂导致抗体失活，因此免疫亲和柱通常为一次性使用。而核酸适配体亲和柱可以耐受有机溶剂，可以重复使用多次，大幅度降低了使用成本
2.本发明使用的核酸适配体可以通过化学合成法获得，可以保证序列的正确性。大幅度降低了不同批次间的变异。而相对来说，不同批次的抗体来自于不同的小鼠或者兔子，导致抗体间质量变异较大，使亲和柱质量存在差别
3.使用本发明纯化脱氧雪腐镰刀茵烯醇操作简便，几步就可以得到纯度较高的脱氧雪腐镰刀茵烯醇。更方便操作者使用
4.使用本发明的产品得到的脱氧雪腐镰刀茵烯醇纯度很高，后续不用再做别的纯化处理就可以直接用于高效液相色谱检测或者荧光检测。节省了操作者的时间和费用。
附图说明
图1：脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱结构组份示意图
A：进样口塞；B：活塞适配器；C：稳定箍；D：上筛板；E：柱体；F：载体填料； G：下筛板；H：出样口堵头
图2：脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱外观结构图
A：进样口塞；B：活塞适配器；C：稳定箍；D：上筛板；E：柱体；F：载体填料； G：下筛板；H：出样口堵头
图3：玉米样品中加入脱氧雪腐镰刀茵烯醇标准品的液相色谱检测图
图4：饲料样品中加入脱氧雪腐镰刀茵烯醇标准品的液相色谱检测图。
具体实施方式
实施例1：利用氨基修饰的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体制备亲和柱
本发明制备脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱的一个优选的实施方案如下：
1.载体活化
选择N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）修饰的琼脂糖载体sepharose4B，进行活化
取1gN-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖，加入用50ml 1mM的HCl，溶胀30min后，凝胶用100ml 1mM HCl洗涤6次，再用100ml超纯水洗涤
2.将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液（0.1M的NaHCO3，0.8M NaCl，PH8.2）洗涤3次。加入20mol/L的氨基修饰的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体，室温偶联8小时
3.将偶联好的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次
4.封闭
将偶联好的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体-琼脂糖载体中加入100mmol/L的Tris.ClPH8.0 ，室温反应2小时
5.将封闭好的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次
6.将脱氧雪腐镰刀茵烯醇—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的脱氧雪腐镰刀茵烯醇亲和纯化柱
7.装柱
将交联后的脱氧雪腐镰刀茵烯醇-琼脂糖凝胶用10毫升20mM PBS PH7.4重悬，然后装入空的亲和纯化柱柱体中
1)取空的柱体，加入下方筛板，加入1mlPBS，使其自然流干
2)加下方出样口堵头，在柱体中加入1ml上述处理后的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体-琼脂糖凝胶载体，静止5分钟，使载体自然沉降
3)加入上方筛板，按压筛板，使其到达载体上方
4)加入活塞适配器，适配器有一个压紧作用，使上方筛板紧贴载体
5)从下方将稳定箍套在柱体上，使其紧贴进样口
6)拔掉出样口堵头，用注射器取5mlPBS，将注射器接在进样口上，缓慢的将PBS注入亲和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液体注入亲和柱
7)套上出样口堵头，套上进样口塞，将制备好的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱放入4℃保存。
实施例2：利用生物素修饰的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体制备亲和柱
本发明制备脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱的一个优选的实施方案如下：
1.取1ml链霉亲和素（SA）修饰的琼脂糖凝胶sepharose4B，用10ml超纯水洗涤3次
2.将（SA）修饰的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液（0.02M的PBS，0.8M NaCl，PH7.4）洗涤3次。加入20mol/L的生物素修饰的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体，室温偶联4小时
3.将偶联好的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次
4.装柱
将脱氧雪腐镰刀茵烯醇—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的脱氧雪腐镰刀茵烯醇亲和纯化柱
1)取空的柱体，加入下方筛板，加入1mlPBS，使其自然流干
2)加下方出样口堵头，在柱体中加入1ml上述处理后的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体-琼脂糖凝胶载体，静止5分钟，使载体自然沉降
3)加入上方筛板，按压筛板，使其到达载体上方
4)加入活塞适配器，适配器一个压紧作用，使上方筛板紧贴载体
5)从下方将稳定箍套在柱体上，使其紧贴进样口
6)拔掉出样口堵头，用注射器取5mlPBS，将注射器接在进样口上，缓慢的将PBS注入亲和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液体注入亲和柱
7)套上出样口堵头，套上进样口塞，将制备好的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱放入4℃保存。
实施例3：利用脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱纯化和检测玉米样品中的脱氧雪腐镰刀茵烯醇
本实施例利用正常的玉米样本定量加入脱氧雪腐镰刀茵烯醇的标准品，然后用脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱进行纯化，纯化后用高效液相色谱检测，测定回收率
1.玉米样品处理
1)将玉米样品粉碎；
2)按照每克样品1000ng的标准，在粉碎后的玉米样品中添加脱氧雪腐镰刀茵烯醇标准品；
3)称取25g样品，加入100mL的提取液；
4) 高速匀浆2min；
5)用快速定性滤纸过滤；
6)取1.5mL滤液，加入36mL稀释液，振荡混匀；
7)用微纤维滤纸过滤；
8)取全部滤液用于上样检测
2.取出脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱，打开进样口塞，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上
3.打开出样口塞，用10mmol/L PBS PH7.4洗涤亲和柱3次，每次10毫升，调节气孔操作架气泵压力，使液体以3滴/秒的流速流出
4.将样品加入亲和柱柱中，调节流量至1-2滴/秒。直至样品全部流出亲和柱
5.用蒸馏水洗涤纯化柱3次，每次5毫升
6.加入1ml甲醇，收集洗脱产物
7.洗脱产物用高效液相色谱HPLC检测
8.高效液相色谱检测结果
9.从检测结果可以看出，在1g的粉碎后玉米样品中加入1000ng的脱氧雪腐镰刀茵烯醇，用本发明的适配体亲和柱可以回受到956ng。回收率为95.6%。色谱图见附图3。
实施例4：利用脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱纯化和检测饲料样品中的脱氧雪腐镰刀茵烯醇
1.前处理
1)25g±0.01g样品（固体样品需粉碎，并过2mm分样筛）加入5g 氯化钠与125mL提取液（70%甲醇-水溶液）混匀；
2)高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液；
3)取10mL滤液加入20mL蒸馏水稀释（稀释后的液体pH值应保证在6~8之间，可用1M“NaOH”或“HCl”进行调节），再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；
4)取15mL上样液过免疫亲和柱净化
2.净化
1)将亲和柱连接于10.0 ml一次性注射器下。按照前处理要求，准确移取相应体积的样品提取液注入一次性注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出；
2)待液体排干后，用蒸馏水或去离子水洗涤2次，每次10mL；
3)待液体排干后，上样1mL甲醇，流速1滴/秒，收集洗脱液并定容至1mL；
4)洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于HPLC分析
5)检测结果见下表
色谱图见附图4。
实施例5：脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱重复使用柱容量的变化
本实施例利用定量的脱氧雪腐镰刀茵烯醇的标准品，然后用脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱进行纯化。亲和柱上的脱氧雪腐镰刀茵烯醇用有机溶剂洗脱后，用高效液相色谱检测其浓度。亲和柱重新平衡后重复上样和洗脱，测定洗脱的脱氧雪腐镰刀茵烯醇浓度。主要目的是测试脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱的重复使用性
1.配制10ug/ml的脱氧雪腐镰刀茵烯醇标准品
2.取出脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱，打开进样口塞，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上
3.打开出样口塞，用10mmol/L PBS PH7.4洗涤亲和柱3次，每次10毫升，调节气孔操作架气泵压力，使液体以3滴/秒的流速流出
4.取100ul上述配制的脱氧雪腐镰刀茵烯醇标准品，总量1ug，加入亲和柱柱中，调节流量至1-2滴/秒。直至样品全部流出亲和柱
5.用蒸馏水洗涤纯化柱3次，每次5毫升
6.加入1ml甲醇，收集洗脱产物
7.洗脱产物用高效液相色谱HPLC检测
8.亲和柱用超纯水洗涤3次，每次10ml，然后用10mmol/L PBS PH7.4洗涤亲和柱3次，每次10毫升
9.再次上样100ul脱氧雪腐镰刀茵烯醇标准品，总量1ug
10. 按照上述操作洗涤及洗脱，洗脱产物用高效液相色谱检测其浓度
11. 再重复步骤8.9.10三次。检测洗脱产物的浓度
12. 计算总共5次的脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱纯化的回收率
高效液相色谱检测结果见表4：
从上述结果可以看出，脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱重复使用5次后，其结合能力没有明显的降低。
脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体序列
5’- tttaaaaccgcctccgggcacttccttaacgatcccccctaaattt -3

Claims (12)

1.一种脱氧雪腐镰刀茵烯醇的适配体亲和柱，其特征在于包含有载体和脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体。
2.根据权利要求1中所述的亲和柱，其特征在于适配体通过化学键偶联在载体上。
3.根据权利要求1中所述的亲和柱，其特征在于所述的适配体是核酸适配体，更具体的是寡聚脱氧核苷酸适配体。
4.根据权利要求3中所述的核酸适配体，其特征在于所述的适配体序列为序列1所描述的核酸序列。
5.根据权利要求1中所描述的适配体，其特征在于适配体是经过化学修饰的适配体。
6.根据权利要求5中所描述的适配体，其特征在于修饰方式包括但不限于氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰及生物素修饰。
7.根据权利要求1中所述的适配体亲和柱，其特征在于所述的载体是琼脂糖凝胶或者化学合成的固相载体。
8.根据权利要求5中所述的亲和柱，其特征在于所述的琼脂糖凝胶包含但不限于N-羟基琥珀酰亚胺活化的琼脂糖凝胶、溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶。
9.根据权利要求5中所描述的化学合成的固相载体载体，包括但不限于聚苯乙烯，多孔聚苯乙烯及交联多孔聚苯乙烯填料。
10.一种纯化脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体亲和柱制备方法，其特征在于
选择N-羟基琥珀酰亚胺活化后的载体，将载体干粉用1mmol/L的盐酸浸泡过夜进行活化
每克活化的载体加入30-200nmol的适配体，在0.1M NaHCO3，0.5M NaCl PH8.3的缓冲液中，室温偶联2小时，或者4℃偶联过夜
偶联产物用1M Tris.HCl PH 8.0 室温反应2小时
偶联好的载体-适配体，用20mM PH7.4的PBS洗涤
用含有0.01%硫柳汞的10mM PBS PH7.4 洗涤脱氧雪腐镰刀茵烯醇适配体-载体偶联产物，装柱，放于4℃保存。
11.一种脱氧雪腐镰刀茵烯醇的亲和柱，其用途在于对待检物中的脱氧雪腐镰刀茵烯醇的富集和纯化。
12.根据权利要求11所述的待检物，其特征在于待检物包含但不限于粮食、饲料、牛奶及乳制品、水产、血液、尿液和水。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107807034A (zh) * 2017-10-31 2018-03-16 北京农业质量标准与检测技术研究中心 一种呕吐毒素核酸适配体亲和柱及其制备方法与应用
CN109833648A (zh) * 2019-01-15 2019-06-04 北京农业质量标准与检测技术研究中心 呕吐毒素及其衍生物适配体亲和柱及其制备方法与应用
CN110923238A (zh) * 2019-11-26 2020-03-27 昆明理工大学 与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体、制备方法及应用
CN111296724A (zh) * 2020-03-03 2020-06-19 武汉轻工大学 纤维素碳化微球的应用以及饲料

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559686A (zh) * 2011-11-25 2012-07-11 国家纳米技术与工程研究院 脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体及其应用
CN103801110A (zh) * 2012-11-07 2014-05-21 江苏维赛科技生物发展有限公司 呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法
CN104117227A (zh) * 2013-04-28 2014-10-29 北京华安麦科生物技术有限公司 一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱及其制备方法和用途
CN104383718A (zh) * 2014-12-04 2015-03-04 江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所 卡那霉素适配体亲和柱的制备方法
CN104569382A (zh) * 2013-10-26 2015-04-29 北京勤邦生物技术有限公司 一种检测呕吐毒素的免疫亲和柱及其应用
CN104730172A (zh) * 2013-12-20 2015-06-24 中国医学科学院药用植物研究所 一种中药中赭曲霉毒素a的净化新方法及检测技术
CN106153784A (zh) * 2016-09-28 2016-11-23 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 大米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇与雪腐镰刀菌烯醇的免疫亲和净化‑高效液相色谱检测方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559686A (zh) * 2011-11-25 2012-07-11 国家纳米技术与工程研究院 脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体及其应用
CN103801110A (zh) * 2012-11-07 2014-05-21 江苏维赛科技生物发展有限公司 呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法
CN104117227A (zh) * 2013-04-28 2014-10-29 北京华安麦科生物技术有限公司 一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱及其制备方法和用途
CN104569382A (zh) * 2013-10-26 2015-04-29 北京勤邦生物技术有限公司 一种检测呕吐毒素的免疫亲和柱及其应用
CN104730172A (zh) * 2013-12-20 2015-06-24 中国医学科学院药用植物研究所 一种中药中赭曲霉毒素a的净化新方法及检测技术
CN104383718A (zh) * 2014-12-04 2015-03-04 江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所 卡那霉素适配体亲和柱的制备方法
CN106153784A (zh) * 2016-09-28 2016-11-23 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 大米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇与雪腐镰刀菌烯醇的免疫亲和净化‑高效液相色谱检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丁金凤等: "《基因分析和生物芯片技术》", 31 January 2004, 湖北科学技术出版社 *
邓舜洲等: "脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和层析柱的研制", 《食品工业科技》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107807034A (zh) * 2017-10-31 2018-03-16 北京农业质量标准与检测技术研究中心 一种呕吐毒素核酸适配体亲和柱及其制备方法与应用
CN109833648A (zh) * 2019-01-15 2019-06-04 北京农业质量标准与检测技术研究中心 呕吐毒素及其衍生物适配体亲和柱及其制备方法与应用
CN109833648B (zh) * 2019-01-15 2021-02-26 北京农业质量标准与检测技术研究中心 呕吐毒素及其衍生物适配体亲和柱及其制备方法与应用
CN110923238A (zh) * 2019-11-26 2020-03-27 昆明理工大学 与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体、制备方法及应用
CN111296724A (zh) * 2020-03-03 2020-06-19 武汉轻工大学 纤维素碳化微球的应用以及饲料

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