CN104730172A - 一种中药中赭曲霉毒素a的净化新方法及检测技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以NHS活化的sephrose4FF为载体，赭曲霉毒素A特异性适体为配基制备的具有操作简单，偶联速度快，偶联效率高的适体亲和柱的制备方法。经系统考察后，该亲和柱在中药中适用性良好，能起到快速净化中药中赭曲霉毒素A的目的，且所建立的检测方法准确度好，灵敏度高，可用于中药中赭曲霉毒素A的快速筛查。此外，该适体亲和柱制备方法简便易行，生产成本较低，质量稳定可控，能满足中药中赭曲霉毒素A的快速检测，具有广阔的开发前景。

Description

一种中药中赭曲霉毒素A的净化新方法及检测技术

技术领域

本发明涉及一种中药中赭曲霉毒素A的净化新方法，特别是涉及适体亲和柱(AAC)的制备，AAC净化超高效液相荧光检测及液质联用检测中药中赭曲霉毒素A，其属于真菌毒素检测领域。 

背景技术

赭曲霉毒素A(ochratoxinA，OTA)是异香豆素联结L-苯丙氨酸的衍生物，由曲霉菌属和青霉菌属等产毒菌株产生的二级代谢产物，具有很强的肝肾毒性、神经毒性及免疫毒性等，故1993年国际癌症组织IARC已将其定义为2B类致癌物。OTA在全球污染范围较广，其广泛存在于各类食品及农作物中，且污染水平较高。近年来，一些诸如甘草、生姜、姜黄等中草药及其制品也被发现污染OTA，且污染状况不容小觑。但由于中药材种类繁多、基质复杂、加工和储藏尚存在不当之处加之OTA痕量(ppb)、pH敏感性等特点，实际检测困难重重。故目前除了欧盟(EU)对甘草和芳香植物做了相关的OTA限量规定外，其他国家尚处于摸索阶段，特别是我国相关组织对中药材OTA的限量还是空白。因而寻找一种简单、快速、准确、经济、特异性的前处理方法，消除中药基质干扰，对于研究中药中OTA的污染状况，制定中药中OTA的限量标准具有重要意义。 

适体(aptamer)是通过指数富集配基系统进化技术(SELEX)体外筛选得到的一类与目标分子高特异性结合的寡聚核苷酸片段。作为靶物质识别元件，与抗体相比aptamer具有多重优势，如其合成往往可通过体外化学合成，而抗体则需在一定的生理条件下，故aptamer受环境的影响较小，易于修饰，且制备更为经济，此外aptamer对结构类似物的识别能力更强，可达到nM级别，而抗体往往存在交叉反应。因此其作为一个优于抗体的新型识别配基，已在食品快速检验、环境检测、临床诊断和治疗以及毒理研究等领域展示了良好的应用前景。 

发明内容

本发明旨在提供一种制备方法简单、偶联速度快、偶联效率高、净化效果好可有效排除中药基质的干扰的AAC的制备方法，其优点在于以适体为特异性配基，NHS活化的sepharose4FF为载体，将这两者的优势联合起来，起到高效偶联，快速净化的目的，操作简单，价格低廉，能够应用于不同中药部位，消除不同中药成分的干扰，具有广阔的开发前景。 

技术解决方案 

本发明采用的技术方案是：优选、合成和末端修饰OTA适体序列，再在一定条件下混合 NHS活化的sephrose4FF，偶联上适体，制备出AAC；再以易污染真菌毒素的不同中药部位，不同次生代谢产物考察对柱效的影响；最后联合使用UPLC-FLR，UFLC-MS／MS等分析仪器建立AAC净化中药中OTA的检测方法。 

技术路线图见图1 

技术要点： 

(1)AAC的制备方法，按照下述步骤进行： 

a.OTA适体序列的筛选：查阅文献，合成相关适体DNA序列，考察不同序列的特异性，Apt-2对黄曲霉毒素B₁，B₂的吸附性较好，对黄曲霉毒素G₁，G₂及OTA也有一定的吸附，故特异性不强，因此优先OTA特异性序列为Apt-1(5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGG-AGCATCGGACA-3’)，选择合适的末端修饰方法-5’端C6间隔臂氨基修饰； 

OTA适体特异性图见图2 

b.AAC的制备：主要包括适体复性，洗涤，偶联，封闭，洗涤，装柱。考察载体不同活化方式(CNBr、Expoxy、NHS)，偶联pH值(6.0，7.0，8.0，9.0，10.0)，偶联时间(0，1，2，3，4，6h)对偶联效率的影响，得到最佳偶联方式及相关参数； 

偶联条件优化见图3 

c.最大吸附量考察：在最佳偶联条件下，制备6个不同批次的AAC和对照柱(未偶联适体)，确定最大吸附量，并与商业化的适体柱相比较。 

最大吸附量考察见图4 

(2)AAC适用性考察：以药用部位分类选择易被霉菌污染的中药材(种子果实类、根及根茎类、花类、叶及全草类、动物类)，综合考虑中药材中所含相关次生代谢产物(糖类、淀粉、黄酮类、生物碱类、苯丙素类等)，通过计算加样回收率方式考察这些中药材及所含成分对AAC柱效的影响，并考察AAC净化后对降低基质效应的影响。 

a.种子果实类：肉豆蔻，胡椒，小茴香，酸枣仁，胖大海，桃仁，陈皮，柏子仁，莲子，使君子，槟榔，生麦芽，决明子，薏苡仁，大枣，白扁豆，杏仁，枳棋子，木瓜，淡豆豉； 

b.根及根茎类：甘草，姜黄，生姜，远志，半夏，郁金，人参，西洋参，当归，葛根，黄芪，黄芩，白芍，天麻，麦冬，板蓝根，石斛，党参，延胡索，巴戟天； 

c.花类：红花，菊花，金银花，槐花，金莲花，辛夷； 

d.叶及全草类：淡竹叶，荷叶，桑叶，侧柏叶，银杏叶，薄荷，广藿香，芫荽，益母草，青蒿； 

e.动物类：龟板，蜈蚣，水蛭，全蝎，僵蚕，地龙，乌梢蛇，土鳖虫，鸡内金。 

(3)AAC实际应用性考察-基于AAC净化建立不同分析方法检测中药中OTA：考察不同影响 因素(稀释缓冲液类型，总离子强度，pH值，体积等)对柱效的影响，获得最佳净化参数，以AAC为净化方法，建立不同检测方法(HPLC-FLD，UPLC-FLR，UFLC-MS／MS)，并对比其他不同前处理方法(QuEChERS，MSPD，各种SPE小柱)在代表性中药中OTA的净化效果。 

该制备方法的优点在于：适体能够与复杂基质(中药)中痕量的OTA特异性结合，净化效果好，且精确性高、重复性好、无批次间差异、检测成本低；AAC制备过程简便易行，生产成本低，质量稳定可控，易于实现机械化操作，能够满足工业化生产需求。 

具体实施方式

通过以下实施例对本发明进一步说明。以下所列举的实施例不以任何方式构成限制。 

溶液配制：PBS：8g NaCl，1.2g Na₂HPO₄，0.2g KH₂PO₄，0.2g KCl溶解于1000mL水中(pH7.0)；BBS₁：10mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl，5mM MgCl₂(pH7.5)；BBS₂：12.5mMTris，150mM NaCl，6.25mM KCl，6.25mM MgCl₂；EBS：10mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl(pH7.5)。运用2M HCl和2M NaOH调节pH值。 

实施例1：AAC的制备 

(1)制备步骤： 

a.适体复性：取2.7nmol的5’氨基修饰的适体溶解于400μL缓冲液中(200mM Na₂HPO₄5mM MgCl₂，pH8.0)，75℃下复性5min，室温放置30min； 

b.洗涤：取约200μL NHS-activated sephaorse4FF凝胶用1mL HCl(1mM，pH3.0)迅速反复洗涤5次； 

c.偶联：移去多余盐酸，迅速加入复性好的适体缓冲液，调节pH至8.0，室温摇床震摇反应3h； 

d.封闭：反应完成后，用3mLNa₂HPO₄(200mM，pH8.0)洗涤，加入1mLTris-HCl缓冲液(0.1M，pH8.0)室温反应2h封闭剩余活性位点； 

e.洗涤：用2mL Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH8.0，含0.5M NaCl)和2mL醋酸缓冲液(0.1M，pH4.0，含0.5M NaCl)先后交替洗涤5次； 

f.装柱：取1mL柱管，垫好筛板，将Binding buffer B(10mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl，5mM MgCl₂，pH7.5)悬浮的偶联胶装柱，至胶高度为0.5mL，用0.05％NaN₃／BB(w／v)缓冲液冰箱4℃保存。 

(2)最佳偶联条件：采用NHS活化活化的sepharose4FF在pH8.0下与适体反应3h为最佳偶联条件。 

(3)最大吸附量的考察：在最佳偶联条件下，上样250ng OTA标准品，测定对照组和实验组 的柱下液，淋洗液，洗脱液中OTA含量，考察最大吸附量为188.96±10.56ng。 

实施例2：AAC净化UPLC-FLR检测姜粉中OTA 

1.样品提取：准确称取姜粉20.0g(精确至0.1g)，加入60mL乙腈-水(60∶40，v／v)溶液，超声提取15min，用定量滤纸粗滤，取5mL滤液加45mL BBS₂(pH8.0)，混匀，玻璃纤维滤纸过滤，滤液备用。 

2.净化：取AAC柱用3mL BBS₁活化，将上述稀释后的滤液用移液器精密移取3mL(相当于0.1g样品)过柱，调节流速1drops／s。用1mL BBS₁清洗柱子，直至空气完全过柱。加入1mL纯甲醇，以1drops／s的流速洗脱，收集洗脱液。将洗脱液用氮气在45℃吹干，最后用甲醇-水(50∶50，v／v)定容至0.5mL，振荡混匀后，12000rpm下离心5min，取上清液供UPLC测定。 

3.色谱条件：Waters ACQUITYH-Class超高效液相色谱仪，荧光检测器(Waters，USA)；Waters Acquity UPLC HSS T3(50mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱；进样量：5μL；柱温：35℃；激发波长λex333nm，发射波长λem460nm；流动相：甲醇／0.5％乙酸水(65／35，v／v)；流速：0.2mL／min。 

4.液质确证条件：Prominence UFLC-20A超高效液相色谱仪(日本岛津公司)；AB SCIEX QTRAP5500质谱仪(美国AB应用生物系统公司)；Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(50mm×4.6mm，1.8μm)色谱柱；进样量：2μL；流动相：乙腈(含0.1％甲酸)／0.1甲酸水(70／30，v／v)；流速：0.3mL／min。离子源为ESI电喷雾离子源，正离子方式检测，m／z404.2→358.0和m／z404.2→239.1两对离子用来确证OTA，喷射电压为5.5kV，离子源温度550℃，雾化气，辅助气，气帘气为50，50，35psi，碰撞能量26／40eV，扫描方式为多反应监测(MRM)。 

(1)前处理条件的优化：考察了总离子强度(0.5-BB，1.0-BB，1.25-BB，1.5-BB，2.0-BB)，稀释缓冲液pH值(5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)，活化液(1，3，5mL)、上样液(3，6，9mL)、淋洗液(1，3，5mL)、洗脱液(0.5，1.0，1.5mL)用量的影响，获得姜粉中AAC的最佳净化方式为：取5mL滤液加45mL BBS₂(pH8.0)，混匀，玻璃纤维滤纸过滤，AAC用3mL BBS₁(pH7.5)活化，上样3mL，淋洗1mL BBS₁(pH7.5)，洗脱1mL纯甲醇。 

净化优化见图5 

(2)色谱条件的建立：对比不同色谱柱(Waters Acquity UPLC BEH C₁₈(50mm×2.1mm，1.7μm)，Waters Acquity UPLC BEH C₁₈(100mm×2.1mm，1.7μm)，Waters Acquity UPLC HSS T3(50mm×2.1mm，1.8μm))，发现T3柱在OTA的分离性能，峰的响应，出峰时间上更具优势；对比HPLC-FLD检测法，UPLC-FLR具有更高的灵敏度，更短的分析时间(表1)。 

表1HPLC-FLD与UPLC-FLR对比 

注：HPLC-FLD进样量：100μL；UPLC-FLR进样量：5μL 

(3)不同前处理方法对比：选择了QuEChERS，基质辅助固相微萃取(MSPD)及不同吸附类型的SPE萃取小柱(C18，Oasis HLB，Oasis MAX，Mysep229，Pribofast290，TC-M160， SPE Ochratoxin A，OchraTest^TM免疫亲和柱)，其中免疫亲和柱的净化效果最好，准确度与AAC相当，但是相比AAC，净化时间长，且检测成本昂贵。Pribofast290处理后杂质不影响OTA的检测，但准确度不达标，其余前处理方法均未能有效除去干扰物，处理后的样品杂质峰多，干扰OTA的检出。 

典型样品图见图6 

(A：3ng／mL标品；B：IAC净化加标样品；C：AAC净化阴性样品；D：AAC净化加标样品) 

(4)重复性利用性对比：基质：姜粉，加标水平15μg／kg，AAC再生：5mL甲醇EBS(20／80，v／v)+5mL EBS+5mL BBS₁；5mL甲醇／水(80／20，v／v)+10mL水+20mL PBS。在姜粉样品中，AAC展示了更好的可重复利用性，在重复利用8次后，回收率仍大于70％。而1AC在使用4次后回收率就低于70％，且RSD增大，此外，IAC的再生需要更长的时间(12h)，而AAC只需几分钟。 

AAC与IAC重复利用性对比见图7 

(5)方法学考察： 

a.标准曲线的绘制：取不同浓度(0.5、1、2.5、5、10、25、50ng／mL)的OTA标准品溶液，分别进样，获得的色谱峰峰面积(A)对OTA的浓度(ng／mL)作回归曲线，OTA的线性回归方程为y=18367x+6221，变异系数(r²)为0.9999，线性范围为0.5-50ng／mL。 

b.检测限与定量限：根据信噪比S／N≥3和S／N≥10确定OTA的最低检测限和定量限分别为0.5和1.5μg／kg。 

c.精密度实验：取3.0ng／mL的OTA对照品溶液，在上述色谱条件下，分别在同一天内连续进样6次和在连续的6天进样测定，记录峰面积，结果分别见表2。OTA日内精密度(以RSD值表示)为1.37％，日间精密度为3.65％，表明仪器精密度良好。 

表2精密度实验结果 

e.稳定性实验：精密称取阴性姜粉20.0g，以15μg／kg的水平添加OTA对照品溶液，按上述方法制备供试品溶液，于配制后0、12、24、36、48、72h分别进样，记录峰面积并计算RSD值，结果见表3。OTA峰面积的RSD值小于7.0％，表明供试品溶液在72h内稳定。 

表3稳定性实验结果 

f.重复性实验：以15μg／kg的水平添加OTA对照品溶液，按上述供试品溶液制备方法平行制备样品共6份，分别进样测定，记录峰面积并计算含量，结果见表4。 

表4重复性实验结果 

g.加样回收率实验：精密称取姜粉20.0g，共9份，加入5、15、45μg／kg3个浓度水平的对照品溶液。按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，每个水平重复三次，计算平均回收率，结果见表5。OTA的加样回收率为81.40-98.36％，其RSD低于3.8％，表明该方法准确度好。 

表5加样回收率实验结果(n=3) 

(6)样品测定及确证：运用上述建立的方法测定了25批姜粉样品，测定结果见表6。在25批姜粉样品中，4批样品为阳性，污染水平在1.51-4.31μg／kg之间；8批样品低于定量限。所有阳性样品的污染量均未超过欧盟对生姜中OTA的限量标准(15μg/kg)。由于中药的成分复杂，测定阳性结果容易出现假阳性，因此采用UFLC-ESI-MS／MS法对上述阳性样品进行定性确证。经确证所有样品未出现假阳性结果，图8为4号姜粉阳性样品的UPLC-FLR及UFLC-MS／MS确认图。 

表625批姜粉样品测定结果 

^*＜LOQ为低于定量限；^**ND为未检测到 

4号姜粉阳性样品的UPLC-FLR及UFLC-MS／MS确认图见图8 

实施例3：AAC净化UFLC-MS／MS检测中药中OTA 

1.样品提取：准确称取药材粉末2.0g(精确至0.1g)，加入8mL乙腈-水(60∶40，v／v)溶液，2400rpm下涡旋辅助提取2min，静置30min，4000rpm下离心10min，取3mL滤液用BBS₂稀释至30mL，混匀，并用盐酸调节pH至7.5，玻璃纤维滤纸过滤，滤液备用。 

2.净化：取AAC柱用3mL BBS₁活化，将上述稀释后的滤液用移液器精密移取2mL(相当于50mg样品)过柱，调节流速1drops／s。用1mL BBS₁清洗柱子，直至空气完全过柱。加入1mL纯甲醇，以1drops／s的流速洗脱，收集洗脱液。将洗脱液用氮气在45℃吹干，加入内标工作液(100ng／mL)5μL，最后用甲醇-水(50∶50，v／v)定容至0.5mL，振荡混匀后，12000rpm下离心15min，取上清液供UFLC-MS／MS测定。 

3.液质条件：Prominence UFLC-20A超高效液相色谱仪(日本岛津公司)；AB SCIEX QTRAP5500质谱仪(美国AB应用生物系统公司)；液相条件：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(50mm×4.6mm，1.8μm)色谱柱；柱温：25℃；进样量：2μL；流动相：乙腈(含0.1％甲酸)／0.1甲酸水(70／30，v／v)；流速：0.3mL／min。质谱条件：离子源为ESI电喷雾离子源；正离子方式检测；m／z404.2→239.1，404.2→358.0分别为OTA定量和定性离子对，扫描方式为多反应监测(MRM)；子离子扫描：信息关联采集(IDA)，动态背景扣除(DBS)；增强型子离子扫描(EPI)：扫描范围100-500Da，扫描速度10000Da／s，CE和CES为30和10eV，具体参数见表7。 

表7OTA及内标丁螺环酮质谱参数 

(1)前处理条件的优化：考察了缓冲液类型(纯水，Tris，PBS)(均内含5mM MgCl₂)，上样pH值(4.5，5.5，6.5，7.5，8.5)，对柱效的影响，获得中药中AAC的最佳净化方式：取3mL滤液用BBS₂稀释至30mL，混匀，并用盐酸调节pH至7.5，玻璃纤维滤纸过滤，AAC用3mL BBS₁(pH7.5)活化，上样2mL，淋洗1mL BBS₁(pH7.5)，洗脱1mL纯甲醇。 

优化过程图见图9 

(2)65种易污染中药材适用性的考察：分别取阴性样品-种子果实类(20种)，根及根茎类(20种)，花类(6种)，叶及全草类(10种)，动物类(9种)，以20μg／kg的水平添加OTA对照品溶液，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，探讨AAC适用性，实验结果见表8，AAC在基质相对较为简单的种子果实类药材中适用性良好，这类中药材在种植和储藏的时候较易受到霉菌的污染，从而产生真菌毒素，在65种不同中药材中的总体适用性良好(72.3％)，故具有良好的开发价值。 

表8AAC柱净化65种中药中OTA的适用性(n=3) 

*在此回收率范围内未有中药 

(3)65种易污染中药材经AAC净化后的基质效应的评价：分别取上述65种阴性中药材，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，用空白样品净化液配制2ng／mL OTA溶液(内含IS1ng／mL)，探讨AAC净化后基质评价，实验结果见表9，中药成分复杂，基质效应明显， 未经净化直接进样，大部分中药材在m／z404.2／358.0通道中OTA出峰处出现干扰峰，经AAC净化后，干扰明显降低，基质效应符合检测标准(70-120％)，RSD＜10％。 

表965种易污染中药基质效应考察(n=3) 

(4)方法学考察： 

a.标准曲线的绘制：取不同浓度(0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0ng／mL)的OTA标准品溶液(均内含IS1ng／mL)，按上述色谱条件分别进样，以各种对照品与内标峰面积的比值对对照品的浓度(ng／mL)作线性回归，权重因子为1／X²，得到相应的回归方程为y=29724x+339，变异系数(r²)为0.9987，线性范围为0.2-20ng／mL。 

b.检测限与定量限：根据信噪比S／N≥3和S／N≥10确定莲子、党参、龟板代表基质中OTA的最低检测限和定量限分别为0.5-0.8和1.5-2.5μg／kg。 

c.精密度实验：取洁净EP管，加入三个不同浓度的OTA标准溶液，同时制备随行曲线，按样品制备方法制备。每天配制一批及一条随行曲线，连续做3天，共3批，每批每个浓度平行做6份样品，记录OTA以及内标的色谱峰面积，代入线性方程算出相应浓度，计算日内和日间精密度和仪器的进样的准确度。低、中、高三个浓度的日内和日间精密度均＜9％，三个浓度的准确度在79.90-102.81％之间。结果见表10。 

表10UFLC-MS／MS测定中药中OTA的精密度和准确度结果(n=6) 

e.稳定性实验：精密称取阴性莲子，党参，龟板代表性中药粉末2.0g，以4、20、100μg／kg的水平添加OTA对照品溶液，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，于配制后0、4、8、12、24h分别进样，记录峰面积并计算各个时间点测定的含量，考察样品在进样板上放置的稳定性，结果见表11。样品各个时间含量的RSD值小于9.0％，表明供试品溶液在24h内稳定。 

表11样品稳定性实验结果(n=3) 

f.重复性实验：精密称取阴性莲子粉末2.0g，以20μg／kg的水平添加OTA对照品溶液，按上述供试品溶液制备方法平行制备样品共6份，分别进样测定，记录峰面积并计算含量，考察方法的重复性，由表12可知，方法的重复性良好。 

表12重复性实验结果 

g.加样回收率实验：精密称取阴性莲子，党参，龟板代表性中药粉末2.0g，共27份，加入3个浓度水平的对照品溶液分别为4、20、100μg／kg。按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，每个水平重复三次，计算平均回收率，结果见表13。OTA的加样回收率为80.26-96.64％，其RSD低于6.0％，表明该方法准确度好。 

表13加样回收率实验结果(n=3) 

典型样品UFLC-MS／MS图见图10 

(a：1ng/mL内标丁螺环酮；b：2ng/mLOTA；c：莲子阴性样品图；d：莲子加标样品图；c：党参阴性样品图；d：党参加标样品图；c：龟板阴性样品图；d：龟板加标样品图) 

(5)样品测定及确证：应用上述建立的方法测定了25批中药样品，测定结果见表14。在25批中药样品中，2批样品为阳性，污染水平在2.61-3.41μg／kg之间；6批样品低于定量限。所有阳性样品的污染量均未超过5μg/kg。图11为生姜22号阳性样品的UFLC-MS／MS色谱图。 

表1425批中药样品UFLC-MS／MS的测定结果 

^*ND为未检测到；^**＜LOQ为低于定量限 

22号阳性样品UFLC-MS／MS图见图11 

附图说明：

图1为本发明技术路线图 

图2为OTA适体DNA序列特异性考察图 

图3为适体亲和柱制备条件的优化图 

图4为适体亲和柱最大吸附量考察图 

图5为适体亲和柱净化姜粉中OTA条件的优化图 

图6为适体亲和柱及免疫亲和柱净化-UPLC-FLR检测姜粉中OTA图 

图7为适体亲和柱及免疫亲和柱重复利用性对比图 

图8为4号姜粉阳性样品的UPLC-FLR及UFLC-MS／MS确认图 

图9为适体亲和柱净化中药中OTA条件的优化图 

图10为典型样品UFLC-MS／MS图 

图11为22号阳性样品UFLC-MS／MS图 。

Claims (2)

1.一种赭曲霉毒素A(OTA)适体亲和柱的制备方法及其检测技术，其特征在于：

(1)以NHS活化的sepharose4FF为载体，OTA适体特异性DNA配基为吸附剂制备适体亲和柱；

(2)以适体亲和柱为净化方法，UPLC-FLR为检测技术建立姜粉中OTA检测方法；

(3)以适体亲和柱为净化方法，UFLC-MS／MS为检测技术建立中药中OTA检测方法。

2.根据权利要求1OTA适体亲和柱的制备方法及检测技术，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)OTA适体亲和柱的制备步骤：

a.OTA适体序列的筛选：合成相关适体DNA序列，考察不同序列对黄曲霉毒素B₁，B₂，G₁，G₂及OTA的特异性，优先了OTA特异性序列；

b.适体亲和柱的制备：其步骤主要包括适体复性，洗涤，偶联，封闭，洗涤，装柱；载体活化方式包括CNBr、Expoxy和NHS，偶联pH值6.0-10.0，偶联时间0-6h；

c.最大吸附量：在最优偶联条件下，制备不同批次适体亲和柱，其最大吸附量高达188.96±10.56ng；

(2)适体亲和柱净化-UPLC-FLR检测姜粉中OTA：

a.样品提取与净化：称取姜粉20.0g，加入60mL乙腈-水(60∶40，v／v)溶液，超声提取15min，定量滤纸粗滤，取5mL滤液加45mL BBS₂(0.5-2.0倍的BBS₁)(pH5.0-9.0)，混匀，玻璃纤维滤纸过滤，取AAC柱用1-5mL BBS1活化，将稀释后的滤液移取3-9mL过柱，用1-5mL BBS₁淋洗，直至空气完全过柱，加入0.5-1.5mL纯甲醇洗脱，将洗脱液用氮气在45℃吹干，最后用甲醇-水(50∶50，v／v)定容至0.5mL，振荡混匀后，12000rpm下离心5min，取上清液供UPLC测定；

b.不同前处理方法及检测技术的对比：对比了QuEChERS，基质辅助固相微萃取(MSPD)及不同吸附类型的SPE萃取小柱(C18，Oasis HLB，Oasis MAX，Mysep229，Pribofast290，TC-M160，SPE OchratoxinA，OchraTestTM免疫亲和柱)，能达到检测目的只有免疫亲和柱和适体亲和柱；对比了HPLC-FLD和UPLC-FLR两种检测技术，后者在灵敏度，分析时间在更具优势；

c.重复利用性对比：适体亲和柱可达到8次(回收率70-110％)，免疫亲和柱4次(回收率70-110％)；

(3)适体亲和柱净化-UFLC-MS／MS检测中药中OTA：

a.样品提取与净化：取药材粉末2.0g，加入8mL乙腈-水(60∶40，v／v)，2400rpm下涡旋提取2min，静置30min，4000rpm下离心10min，取3mL滤液用BBS₂稀释至30mL，混匀，调节pH至4.5-8.5，玻璃纤维滤纸过滤，取AAC柱用3mL BBS₁活化，将稀释后的滤液取2mL过柱，用1mL BBS₁淋洗，加入1mL纯甲醇洗脱，洗脱液用氮气在45℃吹干，加入内标工作液(100ng／mL)5μL，最后用甲醇-水(50∶50，v／v)定容至0.5mL，振荡混匀后，12000rpm下离心15min，取上清液供UFLC-MS／MS测定；

b.65种易污染中药材适用性的考察：以20μg／kg的添加水平，考察适体亲和柱在种子果实类(20种)，根及根茎类(20种)，花类(6种)，叶及全草类(10种)，动物类(9种)(详见说明书)中的适用性。