CN107063820A

CN107063820A - 一种t2毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN107063820A
Application number: CN201710028007.8A
Authority: CN
Inventors: 张彦明
Original assignee: Beijing Meizheng Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Beijing Meizheng Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2017-01-16
Filing date: 2017-01-16
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明涉及一种T2毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途。该亲和纯化柱利用化学修饰的固相载体，然后用T2毒素的核酸适配体与载体进行共价偶联。然后装填亲和柱。该适配体亲和柱主要用于对于食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的T2毒素的纯化，以便于后期对样本中T2毒素的高效液相色谱（HPLC）检测和荧光检测。

Description

一种T2毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种T2毒素的适配体亲和柱及其制备方法和用途，属食品安全检测领域。

背景技术

毒素是由多种真菌，主要是三线镰刀菌产生的单端孢霉烯族化合物(trichothecenes，TS)之一。它广泛分布于自然界，是常见的污染田间作物和库存谷物的主要毒素，对人、畜危害较大。T-2毒素为白色针状结晶，在室温条件下相当稳定，放置6~7年或加热至100~120℃ 1小时毒性不减。T-2毒素带有酯基，用碱处理后水解成相应的醇。要使双键还原可用接触氢化。四氢钾铝或氢硼化钠可使环氧基还原成醇。

毒素主要作用于细胞分裂旺盛的组织器官，如胸腺、骨髓、肝、脾、淋巴结、生殖腺及胃肠粘膜等，抑制这些器官细胞蛋白质和DNA合成。此外，还发现该毒素可引起淋巴细胞中DNA单链的断裂。T-2毒素还可作用于氧化磷酸化的多个部位而引起线粒体呼吸抑制。1973年联合国粮农组织(FAQ)和世界卫生组织(WHO)在日内瓦召开的联席会议上，把这类毒素同黄曲霉素一样作为自然存在的最危险的食品污染源。我国国标GB 21693-2008规定，饲料中的T2毒素含量不能超过1000ug/kg。

目前T2毒素的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）等。

其中薄层层析法是最早使用也是最广泛使用的检测T2毒素的方法，其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作,且成本低,无需价格昂贵的仪器,。但是薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量,主观影响较大,灵敏度不高等,已远远不能满足现代检测要求。

酶联免疫吸附试验（ELISA ）检测方法检测特异、快速、灵敏度高、并且成本较低。成本低的特点,适用于基层机构大量样品的筛选和普查,可以大大节省时间和费用,因此越来越受到基层检验单位的欢迎。ELISA方法的主要问题是容易造成假阳性。因此主要用于基层的筛查检测。

高效液相色谱法( HPLC)具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点,是目前常用于食品中毒素检测的方法。但因其对样品中毒素纯度的要求较高,导致检测成本高、周期长,无法满足大批量样品快速筛选的需要,所以使用受到限制。今年来发展起来的免疫亲和柱-高效液相色谱（IAC-HPLC)）将免疫亲和纯化技术与高效液相色谱相结合。使HPLC的使用更加广泛。免疫亲和柱作为一种新的净化技术,在真菌毒素的分析检测中应用越来越广泛。它是将特异性抗体结合到活化的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时,其中的抗原与抗体结合,其他杂质则通过水溶液洗掉,再用有机溶剂将抗原即毒素洗脱下来,从而使样品中的毒素得以净化。

免疫亲和柱具有操作简单，特异性高的优点。但是由于抗体获得困难，免疫亲和柱通常比较昂贵。并且由于抗体本身是一种蛋白质，其活性受到周围环境的影响。保存不当或者操作不当很容易造成抗体失活从而影响免疫亲和柱的效率。

适配体是一段核酸序列，通常为DNA或者RNA序列。单链的核酸序列可以形成二级结构，从而能与靶点特异性结合。通过多次的富集和筛选，能够筛选到与靶点有高亲和力的特异性适配体。Herman等描述了核酸适配体的结合特异性，[Science 287,820-825].核酸适配体相对于抗体来说更稳定，不易受到环境的影响，并且核酸适配体可以化学合成，保证序列的准确性。[Song. Trends Analy. Chem 2008.27(2)]。

核酸适配体被应用于小分子的检测，在专利CN103808701 A中描述了一种基于赭曲霉毒素的核酸适配体荧光嵌合染料检测赭曲霉毒素的方法，利用赭曲霉毒素的核酸适配体与互补序列形成一个检测元件，利用嵌合染料作为报告分子检测样本中的赭曲霉毒素。在专利CN102735704A中，描绘了一种赭曲霉毒素的电化学传感器，利用赭曲霉毒素的适配体包被在裸金电极上，制备电化学传感器，用于检测赭曲霉毒素。在专利CN105372213A中，描述了一种利用赭曲霉毒素适配体检测方法，将赭曲霉毒素的适配体用上转发光材料标记，利用上转发光材料的荧光能量转移特性进行检测。

基于核酸适配体的检测方法很多，但是净化和纯化方法较少。在专利CN104399283中，描述了一种黄曲霉毒素B1的适配体亲和柱。该专利利用环氧基活化的琼脂糖微球，将黄曲霉毒素B1的适配体偶联，制备成亲和柱。实现黄曲霉毒素的分离。

发明内容

本发明的目的在于提供一种T2毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途。在本发明中，我们利用SELEX系统，从适配体文库中筛选出来一条高特异性、高亲和力的的新的T2毒素的DNA适配体。适配体修饰后与N-羟基琥珀酰亚胺活化的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到T2毒素的特异性载体。载体装柱后就形成了高亲和力的T2毒素适配体亲和柱。该亲和柱操作简便，纯化T2毒素毒素效率高。能耐受有机溶剂，并且可以重复使用。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的T2毒素。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。

本发明最大的优势就是利用了核酸适配体的特性，通过多轮的富集、洗涤、扩增等步骤，筛选出针对T2毒素的特异性适配体。通过序列测定得到适配体的序列。

核酸适配体相对于抗体来说，具有适应环境广泛，能够耐受高温、能耐受有机溶剂并且操作方便等优点。最主要的，适配体在制备过程中不需要经过动物体内的过程，而是通过化学合成来获得。因此，生产周期短，并且可以通过合成条件保证序列的准确性。

以核酸适配体为基础制备的亲和柱具有特异性好，T2毒素结合量大，纯化效率高的特点。

毒素适配体亲和柱及其制备方法说明如下：⑴载体活化：选择N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）修饰的琼脂糖载体sepharose4B，进行活化。取1gN-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖，加入用50ml 1mM的HCl，溶胀30min后，凝胶用100ml 1mM HCl洗涤6次，再用100ml超纯水洗涤。⑵将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液（0.1M的NaHCO3，0.8M NaCl，PH8.2）洗涤3次。加入20mol/L的氨基修饰的T2毒素适配体，室温偶联8小时。⑶将偶联好的T2毒素适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次。⑷封闭：将偶联好的T2毒素适配体-琼脂糖载体中加入100mmol/L的Tris.Cl PH8.0 ，室温反应2小时。⑸将封闭好的T2毒素适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次。⑹装柱：将T2毒素—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的T2毒素亲和柱。层析柱的结构如附图1所示。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：⑴本发明充分的利用了核酸适配体的优点，通过多轮的筛选和富集。得到了高特异性高亲和力的T2毒素核酸适配体。该适配体能够特异性的结合样本中的T2毒素，降低了抗体亲和柱经常遇到的交叉反应性。亲和柱效率大幅度提高。核酸适配体不受操作环境和有机溶剂的影响，尤其适合真菌毒素类的脂溶性物质的纯化。相比较，由于免疫亲和柱中的抗体不耐有机溶剂，有机溶剂常常会造成抗体的失活而使亲和柱效率降低。此外，由于有机溶剂导致抗体失活，因此免疫亲和柱通常为一次性使用。而核酸适配体亲和柱可以耐受有机溶剂，可以重复使用多次，大幅度降低了使用成本。⑵本发明使用的核酸适配体可以通过化学合成法获得，可以保证序列的正确性。大幅度降低了不同批次间的变异。而相对来说，不同批次的抗体来自于不同的小鼠或者兔子，导致抗体间质量变异较大，使亲和柱质量存在差别。⑶使用本发明纯化T2毒素操作简便，几步就可以得到纯度较高的T2毒素。更方便操作者使用。⑷使用本发明的产品得到的T2毒素纯度很高，后续不用再做别的纯化处理就可以直接用于高效液相色谱检测或者荧光检测。节省了操作者的时间和费用。

附图说明

图1：T2毒素适配体亲和柱结构组份示意图

A：进样口塞；B：活塞适配器；C：稳定箍；D：上筛板；E：柱体；F：载体填料；

G：下筛板；H：出样口堵头

图2：T2毒素适配体亲和柱外观结构图

G：下筛板；H：出样口堵头

图3：玉米样品中加入T2毒素标准品的液相色谱检测图

图4：饲料样品中加入T2毒素标准品的液相色谱检测图。

实施例1：利用氨基修饰的T2毒素适配体制备亲和柱

本发明制备T2毒素适配体亲和柱的一个优选的实施方案如下：

1.载体活化：

选择N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）修饰的琼脂糖载体sepharose4B，进行活化；取1gN-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖，加入用50ml 1mM的HCl，溶胀30min后，凝胶用100ml 1mM HCl洗涤6次，再用100ml超纯水洗涤；

2.将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液（0.1M的NaHCO3，0.8M NaCl，PH8.2）洗涤3次。加入20mol/L的氨基修饰的T2毒素适配体，室温偶联8小时；

3.将偶联好的T2毒素适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次；

4.封闭：将偶联好的T2毒素适配体-琼脂糖载体中加入100mmol/L的Tris.Cl PH8.0 ，室温反应2小时；

5.将封闭好的T2毒素适配体-琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次；

6.装柱：将T2毒素—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的T2毒素亲和纯化柱。将交联后的T2毒素-琼脂糖凝胶用10毫升20mM PBS PH7.4重悬，然后装入空的亲和纯化柱柱体中

1)取空的柱体，加入下方筛板，加入1mlPBS，使其自然流干；

2)加下方出样口堵头，在柱体中加入1ml上述处理后的T2毒素适配体-琼脂糖凝胶载体，静止5分钟，使载体自然沉降；

3)加入上方筛板，按压筛板，使其到达载体上方；

4)加入活塞适配器，适配器有一个压紧作用，使上方筛板紧贴载体；

5)从下方将稳定箍套在柱体上，使其紧贴进样口；

6)拔掉出样口堵头，用注射器取5mlPBS，将注射器接在进样口上，缓慢的将PBS注入亲和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液体注入亲和柱；

7)套上出样口堵头，套上进样口塞，将制备好的T2毒素适配体亲和柱放入4℃保存

实施例2：利用生物素修饰的T2毒素适配体制备亲和柱

1.取1ml链霉亲和素（SA）修饰的琼脂糖凝胶sepharose4B，用10ml超纯水洗涤3次；

2.将（SA）修饰的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液（0.02M的PBS，0.8MNaCl，PH7.4）洗涤3次。加入20mol/L的生物素修饰的T2毒素适配体，室温偶联4小时；

4.装柱

将T2毒素—琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，可根据需要制备不同容量的T2毒素亲和纯化柱

1)取空的柱体，加入下方筛板，加入1mlPBS，使其自然流干；

3)加入上方筛板，按压筛板，使其到达载体上方；

4)加入活塞适配器，适配器一个压紧作用，使上方筛板紧贴载体；

5)从下方将稳定箍套在柱体上，使其紧贴进样口；

实施例3：利用T2毒素适配体亲和柱纯化和检测玉米样品中的T2毒素

本实施例利用正常的玉米样本定量加入T2毒素的标准品，然后用T2毒素适配体亲和柱进行纯化，纯化后用高效液相色谱检测。测定回收率。1.玉米样品处理：按照每克样品500ng的标准，在粉碎后的玉米样品中添加T2毒素标准品

1)提取

----20g±0.01g样品（固体样品需粉碎，并过2mm分样筛），5g氯化钠于三角瓶中，加入100mL的80%甲醇；

----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；

----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；

----取10mL滤液加入40mL去离子水稀释，混匀；

----用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；

----取25mL上样液过T2毒素适配体亲和柱净化；

稀释倍数：1

2)净化

----将T2毒素适配体亲和柱连接于10.0 ml一次性注射器下。准确移取相应的样品提取液注入一次性注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出；

---待液体排干，用10mL去离子水淋洗免疫亲和柱两次，流速2~3滴/秒；

----待液体排干后，更换新针筒，上样2mL洗脱液（2%乙酸甲醇溶液），用试管接洗脱液，流速1滴/秒，收集洗脱液并定容至2mL；

----洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于HPLC分析；

2.洗脱产物用高效液相色谱HPLC检测；

高效液相色谱检测结果见表1，色谱图见附图3：

从检测结果可以看出，在1g的粉碎后玉米样品中加入500ng的T2毒素，用本发明的适配体亲和柱可以回受到511.05ng。回收率为102.21% 。

实施例4：利用T2毒素适配体亲和柱纯化和检测饲料样品中的T2毒素

按照每克样品500ng的标准，在猪配合饲料样品中添加T2毒素标准品；

1.前处理

1)25g±0.01g样品（固体样品需粉碎，并过2mm分样筛）加入5g氯化钠与125mL提取液（70%甲醇-水溶液）混匀；

2)高速均质（≥10,000r/min）1min，或摇床（200r/min～300r/min）剧烈振荡20min，用快速定性滤纸过滤，收集滤液；

3)取10mL滤液加入20mL蒸馏水稀释（稀释后的液体pH值应保证在6~8之间，可用1M“NaOH”或“HCl”进行调节），再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；

4)取15mL上样液过T2毒素适配体亲和柱净化；

2.净化

1)将T2毒素适配体亲和柱连接于10.0ml一次性注射器下。按照前处理要求，准确移取相应体积的样品提取液注入一次性注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出；

2)待液体排干后，用蒸馏水或去离子水洗涤2次，每次10mL；

3)待液体排干后，上样1mL甲醇，流速1滴/秒，收集洗脱液并定容至1mL；

4)洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于HPLC分析；

5)检测结果见表2：

色谱图见附图4。

实施例5：T2毒素适配体亲和柱重复使用柱容量的变化

本实施例利用定量的T2毒素的标准品，然后用T2毒素适配体亲和柱进行纯化。亲和柱上的T2毒素用有机溶剂洗脱后，用高效液相色谱检测其浓度。亲和柱重新平衡后重复上样和洗脱，测定洗脱的T2毒素浓度。主要目的是测试T2毒素适配体亲和柱的重复使用性

1.配制10ug/ml的T2毒素标准品；

2.取出T2毒素适配体亲和柱，打开进样口塞，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上；

3.打开出样口塞，用10mmol/L PBS PH7.4洗涤亲和柱3次，每次10毫升，调节气孔操作架气泵压力，使液体以3滴/秒的流速流出；

4.取100ul上述配制的T2毒素标准品，总量1ug，加入亲和柱柱中，调节流量至1-2滴/秒。直至样品全部流出亲和柱；

5.用蒸馏水洗涤纯化柱3次，每次5毫升；

6.加入1ml甲醇，收集洗脱产物；

7.洗脱产物用高效液相色谱HPLC检测；

8.亲和柱用超纯水洗涤3次，每次10ml，然后用10mmol/L PBS PH7.4洗涤亲和柱3次，每次10毫升；

9.再次上样100ulT2毒素标准品，总量1ug；

10. 按照上述操作洗涤及洗脱，洗脱产物用高效液相色谱检测其浓度；

11. 再重复步骤8.9.10三次。检测洗脱产物的浓度；

12. 计算总共5次的T2毒素适配体亲和柱纯化的回收率；

高效液相色谱检测结果见表4：

从上述结果可以看出，T2毒素适配体亲和柱重复使用5次后，其结合能力没有明显的降低。

T2毒素适配体序列

5’-TTTTTTCAGATGCACGACTTCGAGTCTTCACCTCTCGCATGTGTAAACACGCGATGCTTGATATACAGGATCAAGCTTCTGAGCTG -3

Claims

1.一种T2毒素的适配体亲和柱，其特征在于包含有载体和T2毒素适配体。

2.根据权利要求1中所述的亲和柱，其特征在于适配体通过化学键偶联在载体上。

3.根据权利要求1中所述的亲和柱，其特征在于所述的适配体是核酸适配体，更具体的是寡聚脱氧核苷酸适配体。

4.根据权利要求3中所述的核酸适配体，其特征在于所述的适配体序列为序列1所描述的核酸序列。

5.根据权利要求1中所描述的适配体，其特征在于适配体是经过化学修饰的适配体。

6.根据权利要求5中所描述的适配体，其特征在于修饰方式包括但不限于氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰及生物素修饰。

7.根据权利要求1中所述的适配体亲和柱，其特征在于所述的载体是琼脂糖凝胶或者化学合成的固相载体。

8.根据权利要求5中所述的亲和柱，其特征在于所述的琼脂糖凝胶包含但不限于N-羟基琥珀酰亚胺活化的琼脂糖凝胶、溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶。

9.根据权利要求5中所描述的化学合成的固相载体，包括但不限于聚苯乙烯，多孔聚苯乙烯及交联多孔聚苯乙烯填料。

10.一种纯化T2毒素亲和柱制备方法，其特征在于：选择N-羟基琥珀酰亚胺活化后的载体，将载体干粉用1mmol/L的盐酸浸泡过夜进行活化；每克活化的载体加入30-200nmol的T2毒素适配体，在0.1M NaHCO₃，0.5M NaCl PH8.3的缓冲液中，室温偶联2小时，或者4℃偶联过夜；偶联产物用1M Tris.HCl PH 8.0 室温反应2小时；偶联好的载体-适配体，用20mMPH7.4的PBS洗涤；用含有0.01%硫柳汞的10mM PBS PH7.4 洗涤T2毒素适配体-载体偶联产物，装柱，放于4℃保存。

11.一种T2毒素的亲和柱，其用途在于对待检物中的T2毒素的富集和纯化。

12.根据权利要求11所述的待检物，其特征在于待检物包含但不限于粮食、饲料、牛奶及乳制品、水产、血液、尿液和水。