CN107807034A - 一种呕吐毒素核酸适配体亲和柱及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种呕吐毒素核酸适配体，具体为：5’‑GCCCGGATCGAGTTGATTTCAAGCGCATGAAGGCTA‑CCCCCCC‑NH2‑3’。本发明同时涉及一种呕吐毒素核酸适配体亲和柱，包括柱管以及填充在所述柱管底部的CNBr活化琼脂糖凝胶；所述3’端氨基修饰的呕吐毒素核酸适配体偶联于所述CNBr活化琼脂糖凝胶的表面。本发明还涉及一种呕吐毒素核酸适配体亲和柱的制备方法。本发明提供的亲和柱以呕吐毒素高亲和力和特异性的适配体为识别元件，将其连接在溴化氢活化的琼脂糖固相载体上，经过洗涤、封闭、装柱，制备成适配体亲和柱。农产品及其制品经所述配体亲和柱处理后用于后续检测，可以达到较好的富集净化呕吐毒素的效果，具有选择性高、稳定性好，降低检测假阳性，提高灵敏度的作用。
Description
技术领域
本发明涉及农产品及其制品中呕吐毒素检测的前处理领域，具体涉及以呕吐毒素核酸适配体为识别材料，将选择性高、稳定性好、易于合成的核酸适配体应用于固相萃取技术，制备成用于样品中呕吐毒素富集提纯净化的亲和柱。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，又名呕吐毒素，是镰刀菌属的禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、头孢菌属、漆班菌属、木霉属等菌株的代谢产物，主要污染小麦、玉米、大麦等，具有很强的毒性。2003年我国对小麦、玉米、稻谷中DON的污染情况调查显示，小麦、玉米DON污染较稻谷严重。我国在2005年颁布的粮食和食品中DON的限量标准，2011年颁布的国家食品安全标准—《食品中真菌毒素限量》中规定小麦、玉米中DON的最高限量为1000μg/kg。
真菌毒素的检测是一种痕量检测,一般仪器的灵敏度难以达到要求,加上受污染基质复杂,必须对基质中真菌毒素进行富集和净化才能用于检测。样品前处理是样品分析的第一步,也是整个样品分析过程中的关键步骤,直接影响分析的准确度和精密度。传统样品前处理技术普遍存在耗时、低效、有毒有机溶剂用量大、操作较繁琐等问题,为了解决上述问题,国内外众多研究人员开发了一系列新型的样品前处理技术。基于吸附萃取原理的固相萃取、磁分离、亲和色谱及微流控分离等样品前处理技术具有简单、高效、绿色等特点,其核心在于所选用的吸附材料。目前,净化方法主要有液液萃取和色谱柱净化等,但液液萃取法需大量有机溶剂,易造成环境污染和痕量毒素的回收率不高；色谱柱净化法由于具有消耗试剂少,操作简单成为毒素净化的主要方法。近年来，具有选择性高、稳定性好、制备简单等特点的分子印迹聚合物成为固相吸附材料的研究热点。但分子印迹材料的合成过程中不可避免地产生非特异性结合位点,且在生物样品(常以水溶液形式存在)分析中的应用受到较大限制。因此,水溶液样品适用性好、选择性更强的生物识别体系对于复杂生物样品中痕量、超痕量组分分析是较好的选择。免疫亲合柱(Immunoaffinitycolumn,IAC)净化是柱色谱中应用较多的一种,但该方法是一种基于抗原/抗体间相互作用的净化方法,易受样品基质、pH值、溶剂、盐浓度等的影响；IAC的价格比较昂贵,使得检测成本较高；且已有报道用于制备免疫亲和柱的抗体对真菌毒素及其代谢产物存在交叉反应,从而限制了该方法在毒素检测中的应用。高亲和力、高特异性的适配子作为一种结构稳定、易于合成和修饰、可反复使用的新型抗体替代材料,将其应用于真菌毒素的前处理,可有效避免使用大量有机试剂,排除其它物质干扰,可多次反复使用,成本较IAC低很多。
核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术经体外筛选得到的可以特异性地识别目标物的一段短的单链寡核苷酸序列。与抗体相比,适配体具有性质稳定、易化学合成、易化学修饰、分子量小和目标分子广泛等优点,目前在生物传感器、毛细管电泳、物质分离富集以及医疗诊断等领域得到了广泛应用选择性高、稳定性好、易于合成的核酸适配体在固相萃取技术中具有广阔的应用前景。适配体对目标毒素具有很高的亲和力,可显著提高萃取选择性,增强富集效率。因此,核酸适配体固相萃取技术在食品分析中具有很好的应用价值。近几年，关于赭曲霉毒素OTA适配体亲和柱的产品和应用较多，但对于呕吐毒素还未见相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种呕吐毒素核酸适配体。
本发明提供的3’端氨基修饰的呕吐毒素核酸适配体具体为：5’-GCCCGGATCGAGTTGATTTCAAGCGCATGAAGGCTA-CCCCCCC-NH2-3’。本发明通过大量研究获得呕吐毒素特异性核酸适配体，并在此基础上通过对3’端进行氨基修饰，将该适配体应用到亲和柱中，可以大幅度提高样品的回收率，避免样品损失。
本发明同时提供一种呕吐毒素核酸适配体亲和柱，其包括柱管以及填充在所述柱管底部的CNBr活化琼脂糖凝胶；上述3’端氨基修饰的呕吐毒素核酸适配体偶联于所述CNBr活化琼脂糖凝胶的表面。其结构可参考图1所示。3’端和5’端不同修饰方式的适配体亲和柱的回收率比较可参考图2所示。
为了实现良好的呕吐毒素富集效果，本发明对CNBr活化琼脂糖凝胶与3’端氨基修饰的呕吐毒素核酸适配体的最佳配比进行了优化，具体而言，当二者质量比为1000:0.1～2、优选为1000:1时，能够在确保呕吐毒素被充分富集的基础上提高样品的回收率。
为了使样品在亲和柱中洗脱时呕吐毒素被充分富集，本发明优选所述琼脂糖凝胶的填充体积与所述柱管体积之比为(0.4～0.6)：1。
所述亲和柱中，柱管的两端分别盖有上帽和下帽；所述琼脂糖凝胶通过上下各一块筛板固定在柱管底部。
本发明同时提供了一种呕吐毒素核酸适配体亲和柱的制备方法，该方法将CNBr活化琼脂糖与核酸适配体5’-GCCCGGATCGAGTTGATTTCAAGCGCATGAAGGCTA-CCCCCCC-NH2-3’以质量比为1000:0.1～2、优选为1000:1相偶联，充分洗涤后，装柱。
其中，所述核酸适配体在进行偶联前，先在含有Na2HPO4与MgCl2的缓冲液中(优选组成为200mM Na2HPO4 5mM MgCl2，pH8.0)复性。具体而言，可取1OD(约33μg/ml)的3’氨基修饰的呕吐毒素核酸适配体溶解于200μL缓冲液中(200mM Na2HPO4 5mM MgCl2，pH8.0)，95℃下复性5min，室温放置30min，即可。
所述CNBr活化琼脂糖在进行偶联前，应先用HCl活化后，再依次用HCl、蒸馏水以及含有Na2HPO4与MgCl2的缓冲液(优选组成为200mM Na2HPO4 5mM MgCl2，pH8.0)洗涤。具体而言，可取约60mg CNBr活化琼脂糖用2mL HCl(1mM，pH3.0)活化1h，用1mLHCl(1mM，pH3.0)反复洗涤6次，1ml蒸馏水洗涤2次和,1ml缓冲液(200mM Na2HPO4 5mM MgCl2，pH8.0)洗涤2次，即可。
本发明所述偶联方法具体为：室温下震摇反应过夜；所述偶联结束后，用Tris-HCl缓冲液封闭剩余活性位点。具体而言，可用将偶联后的产物用Na2HPO4(200mM，pH8.0)洗涤后，加入Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH 8.0)，28℃摇床震摇反应2h以封闭剩余活性位点
本发明所述充分洗涤优选为：用醋酸缓冲液和Tris-HCl缓冲液交替洗涤，以除去未偶联的适配体。具体而言，所述醋酸缓冲液优选为0.1M醋酸-醋酸钠，pH4.0，含0.5MNaCl；所述Tris-HCl缓冲液优选为0.1M，pH8.0，含0.5M NaCl。用二者先后交替洗涤5次以上，可充分去除未偶联的适配体。
将所述充分洗涤后的产物悬浮于结合缓冲液中，即可进行装柱。其中，所述结合缓冲液的组成优选为：10mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl，5mM MgCl2，pH7.5。
本发明同时保护所述呕吐毒素核酸适配体亲和柱在农产品及其制品中所含呕吐毒素净化富集中的应用。
所述农产品可包括水果、蔬菜、粮食及其加工后的食品。
所述亲和柱在实际应用时，将待测样品溶于适量的溶剂中，上样、洗脱后，收集即可。
作为本发明的优选方案，所述待测样品应以甲醇-水(70：30，v/v)为溶剂进行均质匀浆、过滤后，复溶于所述甲醇-水(70：30，v/v)溶剂中，再进行上样。待测样品中所含的呕吐毒素与亲和柱中的亲和配体充分结合，最后用甲醇洗脱回收，即实现呕吐毒素的富集净化。
由于呕吐毒素具有较强的毒性作用，并且广泛发生在多种农产品及其制品中，因此，在农产品产地准出和市场准入以及流通过程中，需要经济、可靠的分析和前处理方法。本发明针对目前呕吐毒素免疫亲和柱稳定性差、价格昂贵等缺点，利用高亲和力和特异性适配体序列，将适配子作为一种分子识别元件,应用到毒素的分离、净化中，开发可以商品化的适配体亲和柱,来替代价格相对昂贵的免疫亲和柱。适配体亲和柱不仅可以用于大型仪器如HPLC的检测，而且适用于快速检测中样品的净化富集，可以减少毒素检测前处理成本,对其在农产品安全全程监控中发挥作用有重要的现实意义。
附图说明
图1为实施例1提供的适配体亲和柱示意图；其中，1、上帽；2、柱管；3、上筛板；4、表面偶联3’氨基修饰的呕吐毒素核酸适配体的CNBr活化琼脂糖凝胶；5、下筛板；6、下帽；a、CNBr活化琼脂糖凝胶；b、3’氨基修饰的呕吐毒素核酸适配体；c、被3’氨基修饰的呕吐毒素核酸适配体捕捉的呕吐毒素；
图2为3’端和5’端不同修饰方式的适配体亲和柱的回收率比较；
图3为经过呕吐毒素核酸适配体亲和柱净化的小麦样品HPLC色谱峰。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种呕吐毒素核酸适配体亲和柱，如图1所示：包括柱管2以及填充在所述柱管底部的表面偶联3’氨基修饰的呕吐毒素核酸适配体的CNBr活化琼脂糖凝胶4；
所述3’氨基修饰的呕吐毒素核酸适配体b与所述CNBr活化琼脂糖凝胶a的质量比为1:1000所述核酸适配体具体为：5’-GCCCGGATCGAGTTGATTTCAAGCGCATGAAGGCTA-CCCCCCC-NH2-3’；在实际应用时，所述核酸适配体b可捕捉呕吐毒素c；
所述CNBr活化琼脂糖凝胶的填充体积与所述柱管体积之比为0.5：1；
所述柱管的两端分别盖有上帽1和下帽6；所述琼脂糖凝胶通过上筛板3和下筛板5固定在柱管底部。
实施例2
本实施例提供了实施例1所述呕吐毒素核酸适配体亲和柱的制备方法，具体为：
a.适配体复性：取1OD的3’氨基修饰的DON适配体溶解于200μL缓冲液中(200mMNa2HPO4 5mM MgCl2，pH8.0)，95℃下复性5min，室温放置30min；
b.洗涤：取约60mg CNBr活化琼脂糖用2mL HCl(1mM，pH3.0)活化1h，用1mL HCl(1mM，pH3.0)反复洗涤6次，1ml蒸馏水洗涤2次和,1ml缓冲液(200mM Na2HPO4 5mM MgCl2，pH8.0)洗涤2次；
c.偶联：移去多余盐酸，迅速加入复性好的适配体缓冲液，室温(30度)摇床震摇反应，过夜；
d.封闭：反应完成后，用3mL Na2HPO4(200mM，pH8.0)洗涤，加入1mL Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH 8.0)，28度摇床震摇反应2h封闭剩余活性位点；
e.洗涤：用2mL醋酸缓冲液(0.1M醋酸-醋酸钠，pH4.0，含0.5M NaCl)和2mL Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH8.0，含0.5M NaCl)先后交替洗涤5次(除去未偶联的适配体)；
f.装柱：取1mL柱管，垫好筛板，将Binding buffer B(10mM Tris，120mM NaCl，5mMKCl，5mM MgCl2，pH7.5)悬浮的偶联胶装柱，至胶高度为0.5mL，冰箱4℃保存。
实施例3
本实施例提供了实施例1所述呕吐毒素核酸适配体亲和柱的应用方法，具体为：
(1)小麦样品预处理：将小麦样品粉碎；分别按照每克样品0.2、0.5、1.0μg的标准，在粉碎后的小麦样品中添加呕吐毒素标准品；称取5克样品，加入25mL甲醇-水(70：30，v/v)，置于均质匀浆机上11000rpm高速匀浆3min；用0.45μm针筒式滤膜过滤；取5mL滤液，40℃氮吹至近干，加入0.5mL甲醇-水(70:30，v/v)复溶，并用Binding buffer定容至5mL；取上述复溶液用于上样净化，检测；
(2)亲和柱预处理：取出呕吐毒素适配体亲和柱，打开进样口塞(即上帽)，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上；打开出样口塞(即下帽)，用5mL Bindingbuffer平衡亲和柱，调节气孔操作架气泵压力，使液体以3滴/秒的流速流出；
(3)上样：将上述复溶液加入亲和柱中调节流量1-2滴/秒，直至样品全部流出亲和柱；
(4)洗脱：用1mL Binding buffer洗涤亲和柱；
(5)收集：加入1mL甲醇，收集洗脱产物；
(6)检测：洗脱产物用高效液相色谱-荧光检测器检测。
通过用高效液相色谱-紫外检测器或者高效液相色谱串联质谱进行定量，并计算加标回收率。
以回收率为指标，以市售小麦为实际样本加标后对制得的适配体亲和柱的回收率进行评估，回收样品的色谱图如图3所示，加标回收结果如表1所示。经计算，市售小麦的加标回收率均在100％附近(109.32±7.94％)，符合要求。
表1：加标回收率
| 呕吐毒素加标浓度/mg.kg-1 | 测定浓度/mg.kg-1 | 加标回收率/％ |
| 0.20 | 0.22 | 110.20 |
| 0.50 | 0.56 | 110.67 |
| 1.00 | 1.07 | 107.09 |
可见，本发明提供呕吐毒素核酸适配体亲和柱的适用于快速检测和大型仪器设备样品的净化富集，可以减少毒素检测前处理成本，对其在农产品安全全程监控中发挥作用有重要的现实意义。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种呕吐毒素核酸适配体，其特征在于，具体为：5’-GCCCGGATCGAGTTGATTTCAAGCGCATGAAGGCTA-CCCCCCC-NH2-3’。
2.一种呕吐毒素核酸适配体亲和柱，其特征在于，包括柱管以及填充在所述柱管底部的CNBr活化琼脂糖凝胶；3’端氨基修饰的呕吐毒素核酸适配体偶联于所述CNBr活化琼脂糖凝胶的表面；
所述3’端氨基修饰的呕吐毒素核酸适配体具体为：5’-GCCCGGATCGAGTTGATTTCAAGCGCATGAAGGCTA-CCCCCCC-NH2-3’。
3.根据权利要求2所述的适配体亲和柱，其特征在于，所述CNBr活化琼脂糖凝胶与3’端氨基修饰的呕吐毒素核酸适配体的质量比1000:0.1～2，优选为1000:1。
4.根据权利要求2所述的适配体亲和柱，其特征在于，所述CNBr活化琼脂糖凝胶的填充体积与所述柱管体积之比为(0.4～0.6)：1。
5.根据权利要求2所述的适配体亲和柱，其特征在于，所述柱管的两端分别盖有上帽和下帽；所述琼脂糖凝胶通过上下各一块筛板固定在柱管底部。
6.一种呕吐毒素核酸适配体亲和柱的制备方法，其特征在于，将CNBr活化琼脂糖与核酸适配体5’-GCCCGGATCGAGTTGATTTCAAGCGCATGAAGGCTA-CCCCCCC-NH2-3’以质量比为1000:0.1～2、优选为1000:1相偶联，充分洗涤后，装柱。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述核酸适配体在进行偶联前，先在含有Na2HPO4与MgCl2的缓冲液中复性；
和/或，所述CNBr活化琼脂糖在进行偶联前，先用HCl活化后，再依次用HCl、蒸馏水以及含有Na2HPO4与MgCl2的缓冲液洗涤。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述偶联具体为：室温下震摇反应过夜；所述偶联结束后，用Tris-HCl缓冲液封闭剩余活性位点。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述充分洗涤具体为：用醋酸缓冲液和Tris-HCl缓冲液交替洗涤；
和/或，将所述充分洗涤后的产物悬浮于结合缓冲液中进行状柱；所述结合缓冲液的组成优选为：10mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl，5mM MgCl2，pH7.5。
10.权利要求2～5任意一项所述呕吐毒素核酸适配体亲和柱或权利要求6～9任意一项所述方法制备而成的呕吐毒素核酸适配体亲和柱在富集净化农产品及其制品中所含的呕吐毒素中的应用。
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