CN102875730B - 拟除虫菊酯片段印迹聚合物制备方法 - Google Patents

Abstract

拟除虫菊酯片段印迹聚合物制备方法，属于农药残留检测技术领域。本发明利用片段印迹固相萃取技术，选择拟除虫菊酯的一个片段或者类似结构作为替代模板与功能单体、交联剂热引发聚合并洗去模板分子制备拟除虫菊酯片段印迹聚合物。制得的片段印迹聚合物可有效实现对拟除虫菊酯类物质的选择性富集。

Description

拟除虫菊酯片段印迹聚合物制备方法

技术领域

本发明属于农药残留检测技术领域，特别涉及一种适用于检测拟除虫菊酯农药残留的拟除虫菊酯片段印迹聚合物的制备方法。

背景技术

拟除虫菊酯 (synthetic pyrethroids)是改变天然除虫菊酯的化学结构衍生的合成酯类，是一类仿生合成的广谱杀虫剂，其杀虫毒力比老一代杀虫剂如有机磷、有机氯类提高 10～100倍。拟除虫菊酯的作用特点是使用浓度低且用量小，对人畜较安全，对环境的污染很小，缺点主要是对鱼毒性高，长期重复使用也会导致害虫产生抗药性。因此在CAC的有关条款中作了强制性规定，申明拟除虫菊酯类化合物在大多植物性食品中的残留限量不得超过2 mg kg-1，动物性制品中的残留限量不超过1 mg kg-1 。

目前对拟除虫菊酯类农药测定方法的研究较多集中在蔬菜、谷物、茶叶等方面，使用的方法主要为气相色谱法 (GC-ECD) [73-74]、气相色谱-质谱 (GC-MS) [75]和液相色谱-质谱(LC-MS) [76]等。其中GC- ECD应用最广泛，灵敏度最高，但对样品前处理的要求严格，目前常用的有机溶剂提取，液液分配，固相萃取柱净化等前处理方法，不能有效排除样品基质干扰，一些杂质也容易同时被提取，使分析结果常出现假阳性，影响结果的准确性。

传统的分子印迹技术在合成方面已经比较成熟，但是却面临一个无法避免的干扰——模板泄露：由于分子印迹聚合物兼具生物吸附材料的选择性和常规填料的理化稳定性，使得在制备最后的洗脱步骤中模板分子未完全除去，这样未经使用的吸附剂已经含有模板分子；或者在使用过程中吸附样品中的模板分子保留在吸附剂中没有最终洗脱下来，这对分子印迹技术在痕量分析中的应用有很大干扰。也有可能是模板分子自身有毒副作用，直接操作危害健康，或者难以得到，这些都限制了分子印迹聚合物的制备。

替代模板技术是指利用目标物质的一个结构片段作为替代模板合成的分子印迹聚合物，而合成的聚合物对该目标物质及其类似物质均具有识别性能的技术，这项技术首先可以有效解决模板泄露问题，由于合成的聚合物使用的替代模板并非最后需要测定的物质，这样即使开始使用时固相萃取柱填料中的模板未洗脱完全，后续的色谱分析也可以实现将泄漏的替代模板与目标化合物分开；其次，如果需要分析的对象是有毒有害的物质，用其直接做模板分子对实验人员身体健康可能造成威胁，通过选用毒副作用小的替代模板可以实现对操作人员的保护，符合环境友好的要求；再次，如果目标分子价格昂贵，选择一些价廉的结构相似物可以降低成本，更加经济实惠；第四，选用替代模板可以合成识别一类物质的聚合物，提高了工作效率。

发明内容

本发明目的在于提供一种适用于检测拟除虫菊酯农药残留的拟除虫菊酯片段印迹聚合物的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

拟除虫菊酯片段印迹聚合物制备方法（本体聚合法），其特征在于，包括如下步骤：

（1）将拟除虫菊酯类替代模板分子、功能单体、交联剂、引发剂和致孔剂混合；

（2）将上述物质混匀后，装入密闭容器中，通氮气，热引发聚合，得聚合物；

（3）将上述聚合物磨碎，用有机溶剂和酸混合液去除模板分子，处理后得拟除虫菊酯片段印迹聚合物。

步骤（1）中：所述的拟除虫菊酯类替代模板分子为二苯醚-联苯共晶或对氨基二苯醚，所述的功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、2-乙基氰基丙烯酸酯、2，3-环氧丙酯、2-甲基-2-丙烯酸-2，3-二羟基丙酯或二（2-甲基-2-丙烯酸）2-羟基-1，3-丙二醇酯，所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯、TDMA或亚甲基二丙烯酸酰胺，所述的引发剂为过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈，所述的致孔剂为乙腈、三氯甲烷、二氯甲烷或甲苯；步骤（3）中所述的有机溶剂为甲醇或乙腈，所述酸为乙酸。

步骤（1）中，所述的替代模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为：替代模板分子︰功能单体︰交联剂=1︰2～10︰20～60；步骤（2）中，所述的热引发聚合条件为50～90℃反应3～48个小时；步骤（3）中，所述的酸与有机溶剂的体积比为1︰5～20，所述处理为真空干燥。

拟除虫菊酯片段印迹聚合物制备方法（悬浮法），包括如下步骤：

（1）将含拟除虫菊酯类替代模板分子、功能单体、交联剂和引发剂的混合液加入悬浮剂和表面活性剂形成的溶液，热引发聚合，得聚合物微球；

（2）印迹聚合物微球用有机溶剂和酸混合液去除模板分子，处理后得拟除虫菊酯片段印迹聚合物微球。

步骤（1）中，所述的拟除虫菊酯类替代模板分子为二苯醚-联苯共晶或对氨基二苯醚，所述的功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、2-乙基氰基丙烯酸酯、2，3-环氧丙酯、2-甲基-2-丙烯酸-2，3-二羟基丙酯或二（2-甲基-2-丙烯酸）2-羟基-1，3-丙二醇酯，所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯、TDMA或亚甲基二丙烯酸酰胺；所述的引发剂为过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈，所述的悬浮剂（致孔剂）为水，所述的表面活性剂为聚乙烯醇；步骤（2）中，所述的有机溶剂为甲醇或乙腈，所述酸为乙酸。

步骤（1）中，所述的替代模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为：替代模板分子︰功能单体︰交联剂=1︰2～10︰20～60，所述的热引发聚合条件为50～90℃反应3～48个小时，所述热引发聚合反应产物用热水反复搅拌溶解、抽滤，洗去反应产物上粘连的聚乙烯醇，得到聚合物微球；步骤（2）中，将聚合物微球用有机溶剂和酸混合液去除模板分子、干燥得拟除虫菊酯片段印迹聚合物微球，所述的酸与有机溶剂的体积比为1︰4，所述处理为干燥。

拟除虫菊酯片段印迹聚合物制备方法，包括如下步骤：

（1）将拟除虫菊酯类替代模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶解于致孔剂（溶剂）中，热引发聚合，得聚合物微球；

（2）聚合物微球用有机溶剂和酸混合液去除模板分子，处理后得拟除虫菊酯片段印迹聚合物微球。

步骤（1）中，所述的拟除虫菊酯类替代模板分子为二苯醚-联苯共晶或对氨基二苯醚，所述的功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、2-乙基氰基丙烯酸酯、2，3-环氧丙酯、2-甲基-2-丙烯酸-2，3-二羟基丙酯或二（2-甲基-2-丙烯酸）2-羟基-1，3-丙二醇酯，所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯、TDMA或亚甲基二丙烯酸酰胺；所述的引发剂为过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈，所述的致孔剂为乙腈、三氯甲烷、二氯甲烷或甲苯；步骤（2）中，所述的有机溶剂为甲醇或乙腈，所述酸为乙酸。

步骤（1）中，所述的替代模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为：替代模板分子︰功能单体︰交联剂=1︰2～10︰20～60，所述的热引发聚合条件为50～90℃反应3～48个小时，将所述热引发聚合反应产物抽滤后得到聚合物微球；步骤（2）中，将聚合物微球用有机溶剂和酸混合液去除模板分子、干燥得拟除虫菊酯片段印迹聚合物微球，所述的酸与有机溶剂的体积比为1︰4，所述处理为干燥。

对于采用本体聚合法制备印迹聚合物：

成功制备印迹聚合物的时候必须满足以下两个前提：第一，要有交联剂支撑其的刚性网络结构，因为要保证制得的聚合物都能够与大量的交联剂并存；第二，替代模板与功能单体之间存在稳定的相互作用。

替代模板在结构上应该具备两个特点：一是本身结构有一定的刚性，以确保印迹空穴具有立体的空间结构；二是其空间构型具有一定的柔韧性，以确保亲和动力学平衡能够快速达到，但其本身不参与反应。

功能单体的选择受替代模板的结构和性质影响，既与模板分子有相互作用，又能在反应中与交联剂结合在合适的位置，使模板分子包埋其中，结构上必须具有双键结构。

交联剂通常是分子结构中含多个官能团的物质，它的架桥作用使多个线型分子相互键合交联成网络结构，能调节或促进印迹聚合物分子链间子键的形成。

溶剂直接决定聚合物的孔径分布和渗透性，并对模板分子和功能单体的相互作用亦有重要影响。溶剂的极性越低，对非共价合成法中模板分子与功能单体之间的相互作用干扰越小，则合成的聚合物具备更高的选择。

温度对聚合反应的影响是低温下模板分子与单体的热运动不剧烈，容易形成更加稳定、有序的聚合物，但是温度太低达不到引发剂的引发温度也不可行；溶剂的极性对非共价键的形成有较大影响，所以非共价方式一般在氯仿、甲苯、二氯甲烷等有机溶剂中进行，另外溶液浓度、引发剂、试剂的种类及用量也对生成的聚合物性状有影响。

对于采用片段印迹技术结合悬浮聚合和沉淀聚合两种方法合成拟除虫菊酯类物质片段印迹微球，直接制成微球不仅可以避免本体聚合因为研磨破坏印迹分子留下的空穴，而且球形结构比表面积较大，吸附能力会更理想。

悬浮聚合的制备过程是将溶有引发剂的功能单体在不溶的溶剂中被打散呈小珠并继续增长，通常选用高极性的有机溶剂或水做致孔剂。通过在含印迹分子、功能单体、交联剂的混合溶液中加入悬浮剂和表面活性剂而得到稳定的乳液液滴。这种方法反应温度易控制，聚合热容易扩散，生成的微球粒径一般也较大，分子量分布窄；聚合产物为固体珠状颗粒，易分离干燥。

沉淀聚合的制备过程是将参加反应的单体、交联剂及引发剂溶于致孔剂中，产生不易溶解的聚合物从溶剂中沉淀出来。该法的关键是在聚合物链增长到一定程度后从体系中沉析出来。这种方法不需在反应体系中加入任何表面活性剂或稳定剂，直接合成表面洁净的聚合物微球，省去了繁杂的后处理过程，且聚合物产率高，单分散性好，便于功能设计，也是一种理想的微球制备方法。

本发明利用新型片段印迹技术，使用三种方法合成了对据除虫菊酯类农药具有选择识别性的印迹聚合物，得出以下有益的结论：

1. 通过比较拟除虫菊酯类的分子结构、与功能单体相互作用后的紫外偏移和合成印迹聚合物的吸附能力选取二苯醚-联苯共晶作为替代模板；

2. 采取本体聚合方法，以二苯醚-联苯共晶为替代模板，4-vp为功能单体，EDMA 为交联剂，制备了对拟除虫菊酯类农药有选择性的片段印迹聚合物。通过优化聚合反应的条件：在70℃条件下，二苯醚-联苯共晶、4-vp和EDMA的用量比例为1:6:20；印迹聚合物对900 µg L-1毒死蜱、联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯混标的吸附量分别为389.2、474.4、467.3、407.5、458.7、447.4µg g-1，非印迹聚合物的吸附量分别为254.6、282.1、271.7、284.4、226.2、213.6 µg g-1，不仅可以看出印迹聚合物的吸附量显著高于非印迹聚合物，而且对拟除虫菊酯类的吸附量高于非拟除虫菊酯类的毒死蜱；将所得印迹聚合物填充固相萃取柱优化了固相萃取条件：以丙酮含量为10%的丙酮-水溶液作为上样溶剂，以丙酮含量为50%的丙酮-水溶液作为淋洗溶剂，以纯甲醇作为洗脱溶剂；分析蜂蜜样品中拟除虫菊酯类农药残留问题，所建立的方法的线性范围为0.002–0.2 µg mL−1，最低检测限为0.025 µg mL-1，测定了 0.05、0.1和0.2µg mL-1 三个水平的加标量回收率，对于联苯菊酯分别为98.7%，93.2%，91.6%，平行测定 6 次的相对标准偏差范围为 4.37%、3.65%和 6.17%；对蜂蜜样品的净化效果优于商品化的固相萃取柱，且成本大大降低，并且可重复使用，具有很好的应用前景。

3.利用悬浮聚合和沉淀聚合两种方法合成了对拟除虫菊酯类物质具有选择性吸附的印迹微球，通过比较吸附能力、形态特征确定了最佳反应的条件：沉淀聚合的方法，替代模板、功能单体、交联剂的比例为1:6:40，氯仿溶剂中在温度70℃条件下聚合10 h；进行吸附试验表明印迹微球对900 µg L-1甲氰菊酯、联苯菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、毒死蜱、五氯硝基苯混标的吸附量分别为632.3、518.24、575.69、558.05、537.81、385.03和352.57 µg g-1，而非印迹聚合物的吸附量分别为352.35、331.05、289.32、253.88、364.14、334.59和295.32 µg g-1；将所得印迹聚合物制得片段印迹固相萃取柱，并优化固相萃取条件，分析蜂蜜样品中拟除虫菊酯类农药，所建立的方法的线性范围为0.002–0.50 µg mL−1，最低检测限为0.011 µg mL-1，测定了 0.10、0.20和0.40 µg mL-1 三个水平的加标量回收率，对于联苯菊酯分别为96.1%，94.2%，95.6%，平行测定 6 次的相对标准偏差为 3.73%、5.16%和 4.04%。

附图说明

图1-1为替代模板二苯醚-联苯共晶(a)、对氨基二苯醚（b）与单体4-vp作用紫外偏移图，其中1为替代模板，2为功能单体4-vp，3为1与2的混合溶液；

图1-2为片段印迹聚合物热重分析示意图；

图1-3为片段印迹聚合物的扫描电镜图（a,×160倍;b, ×1000倍）；

图1-4为片段印迹聚合物吸附等温线图；

图1-5为片段印迹聚合物在联苯菊酯溶液中的吸附速率图；

图1-6为片段印迹聚合物对菊酯类物质的选择性吸附图；

图1-7为固相萃取柱淋洗及洗脱溶剂的优化图；

图1-8为片段印迹聚合物固相萃取柱与商品化固相萃取柱的比较图，其中，1为五氯硝基苯，2为毒死蜱，3为联苯菊酯，4为甲氰菊酯，5为氯菊酯，6为氯氰菊酯，7为氰戊菊酯；

图2-1为不同功能单体合成的片段印记聚合物微球的吸附量图；

图2-2为不同方法制备的片段印迹聚合物微球扫描电镜形态，其中（a）悬浮聚合法，(b)沉淀聚合法；

图2-3为片段印迹聚合物微球产量随反应时间的变化图；

图2-4为聚合物微球在联苯菊酯溶液中吸附等温线；

图2-5为聚合物微球的吸附速率图；

图2-6为聚合物微球对拟除虫菊酯类物质和非拟除虫菊酯类物质的吸附图，其中：A-甲氰菊酯、B-联苯菊酯、C-氯菊酯、D-氯氰菊酯、E-氰戊菊酯、F-毒死蜱、G-五氯硝基苯；

图2-7为不同百分比溶剂淋洗及洗脱分布图。

具体实施方式

实施例1、拟除虫菊酯片段印迹聚合物制备方法（本体聚合法），量取 0.153 mL（0.5 mmol）替代模板二苯醚-联苯共晶，加入 0.324 mL（3 mmol）功能单体 4-vp，1.881 mL（10 mmol）交联剂EDMA和 24.3mg引发剂AIBN于试管中，加入 10mL 氯仿，震荡混匀，通氮气 10 min，在70 ℃油浴锅中反应24h，得淡黄色棒状固体产物（聚合物），碾磨，所得粉末过100-200目筛。

同时用同样比例和方法制取非印迹聚合物NIP（不加替代模板）。

称取制得的固体产物500 mg，置于ASE-200（Dionex, U.S.A.）的萃取池中（ASE萃取条件：压力：1500 psi；温度：100 ℃; 加热时间：5 min：溶剂冲洗时间： 5 min；溶剂：甲醇：乙酸= 4:1（V/V)；冲洗体积：60%；载气冲洗：90 s；循环次数：5），用体积比为 4:1 的甲醇-乙酸混合溶液提取出替代模板于接收瓶中，取出循环结束后萃取池中的白色聚合物，即为片段印迹聚合物（MIP），干燥到恒重后过筛取80- 120 µm放入干燥器中备用。

本实施例为片段印迹聚合物制备方案1，该方案中替代模板的选择，单因素实验，正交实验，聚合物表征，吸附实验，自制固相萃取柱的优化实验，方法的线性范围、检出限和精密度，方法的精密度和准确度内容及结果如下：

1、替代模板的选择

拟除虫菊酯类分子结构中都有共同的二苯醚或者联苯基团，选择二苯醚-联苯共晶和对氨基二苯醚作为替代模板，分别记为PT-1，PT-2，对两者进行优化选择。

（1）通过紫外最大吸收波长的偏移选择模板

用紫外分光光度计（岛津UV3600紫外—可见分光光度计）测定两个替代模板和单体4-vp（4-乙烯基吡啶）作用后最大吸收波长的偏移，见附图1-1。

比较图1-1之（a）、（b）发现，和对氨基二苯醚相比，二苯醚-联苯共晶与4-vp标准溶液相互作用后，在紫外最大吸光吸收波长处有更大的偏移，说明二苯醚-联苯共晶与4-vp有更大的相互作用。

（2） 通过吸附量选择模板

分别以二苯醚-联苯共晶和对氨基二苯醚为替代模板，4-vp（4-乙烯基吡啶）为单体，EDMA（乙二醇二甲基丙烯酸酯）为交联剂，AIBN（偶氮二异丁腈）为引发剂，氯仿为致孔剂，采用经典的印迹合成比例，即替代模板∶功能单体∶交联剂=1∶4∶20（摩尔比），氯仿5 mL，合成两个不同聚合物。以0.04 g L-1的甲醇∶水=1∶9 （V/V）的联苯菊酯溶液为吸附母液，静置吸附15 h后，通过紫外分光光度测出测定上清液浓度，进而计算出两个聚合物对联苯菊酯的吸附量，如表1-1所示。

表1-1 不同模板片段印迹聚合物的吸附量

替代模板	二苯醚-联苯共晶	对氨基二苯醚
			Q(mg g-1)	8.82	5.86

无论是比较替代模板与功能单体相互作用后的紫外偏移，还是比较两种不同模板片段印迹聚合物的吸附量，替代模板二苯醚-联苯共晶都具有更好的效果。因此，确定选用二苯醚-联苯共晶为替代模板，进行下一步的合成优化。

2、单因素实验

（1 ）致孔剂种类的影响

为了保证聚合物的特异识别的能力，模板分子与功能单体、交联剂之间的浓度应维持在一个合适的比例。经典的分子印迹聚合物合成比例是模板分子∶功能单体∶交联剂=1∶4∶20(摩尔比)，在实验中改变聚合溶剂，但维持上述比例不变。

分别用乙腈、三氯甲烷和甲苯分别作为聚合反应致孔剂，溶剂量为5mL，二苯醚-联苯共晶，4-vp，EDMA用量分别为0.25、1、5 mmol，在70℃温度下分别作聚合反应，以0.04 g L-1的甲醇∶水=1:9（V/V）的联苯菊酯溶液做吸附液，对聚合物进行吸附，所得各个聚合物吸附量如表1-2所示。

表1-2不同致孔剂合成的印迹聚合物的吸附量

致孔剂	正己烷	乙腈	三氯甲烷
				Q(mg g-1)	7.81	9.10	9.64

如表所示，用乙腈和正己烷作致孔剂时，所得聚合物比三氯甲烷做致孔剂时所得聚合物的吸附量低，故确定三氯甲烷做后面实验的致孔剂。

（2） 致孔剂用量的影响

聚合溶剂的用量决定了模板的浓度，在聚合反应中模板浓度提高，所生成的聚合物会有更多的特异性聚合位点，但当浓度过高时，合成的聚合物过于致密，不利于下一步研磨，为了保证聚合物的特异识别的能力，替代模板与功能单体、交联剂之间的浓度应维持在一个合适的比例。

以三氯甲烷做致孔剂，溶剂量为6 mL、5 mL、4 mL，二苯醚-联苯共晶，4-vp，EDMA用量分别为0.25、1、5 mmol（1:6:20），在70℃温度下分别作聚合反应，以0.04 g L-1的甲醇∶水=1∶9（V/V）的联苯菊酯溶液做吸附液，对聚合物进行吸附，所得各个聚合物吸附量如表1-3所示：

表1-3不同致孔剂用量合成的印迹聚合物的吸附量

致孔剂用量（mL）	4	5	6
				Q(mg g-1)	7.62	9.64	7.11

如表所示，三氯甲烷在用量为5 mL时所制备的聚合物的吸附量最大，故确定三氯甲烷的用量为5 mL。

3、正交试验

为了对二苯醚-联苯共晶片段印迹聚合物的聚合条件进一步优化，采用4因素3水平的正交实验。将合成聚合物去除模板后，吸附0.03 g L-1的甲醇∶水=1∶9 （V/V）的联苯菊酯溶液为吸附母液，静置吸附15h后，通过紫外分光光度测出测定上清液浓度，进而计算出各个条件下聚合物对联苯菊酯的吸附量。

（1）因素A，替代模板与功能单体的比例

A1 A2 A3

1:4 1:6 1:8

（2）因素B，替代模板与交联剂的比例

B1 B2 B3

1:20 1:30 1:40

（3）因素C，聚合温度

C1 C2 C3

60℃ 65℃ 70℃

（4）因素D，替代模板与引发剂比例

D1 D2 D3

1:1 1:1.5 1:2

正交实验见表1-4：

表1-4苯醚联苯共晶印迹聚合的正交实验表

由表可知，聚合反应的最佳聚合条件是实验4，即替代模板∶功能单体∶交联剂=1∶6∶20（摩尔比），聚合温度时间为70℃，引发剂用量为1.5%（实验4）。对比各因素的极差的大小可知R1最大，即影响聚合物合成的显著性因素是替代模板与功能单体的比例。这可能是因为当功能单体与替代模板在溶液中通过静电作用疏水相互作用、氢键等非共价相互作用时，替代模板与功能单体分子彼此间以结构互补的有序状态而排布起来，而聚合物对分析物的识别来源于制备过程中替代模板在其空间结构上形成的空穴，因而替代模板与功能单体的比例对于孔穴的规则排列有直接影响。若替代模板比例太大，形成的空穴就少，最终影响印迹聚合物的吸附性能；若替代模板比例太小，则过量的功能单体将部分替代模板包裹在微球内部难以洗脱，最终也会使印迹聚合物的吸附能力下降。

按照以上正交试验的优化结果，将制得的印迹聚合物进行碾磨洗脱后，测量聚合物对联苯菊酯的相对吸附量为：8.51 mg g-1。

4、聚合物的表征

（1） 热重差热分析

热重-差热分析（德国耐池公司STA-449C DCS-TG 联用综合热分析仪）在空气环境中进行，升温范围：50℃ 到 550℃，升温速度10℃ min-1，结果如图1-2所示。

由图分析表明：印迹聚合物在 276℃ 左右开始分解，说明其能保证在日常条件下分析，具有良好的热稳定性能。

（2） 电镜扫描

将合成的印迹聚合物经研磨过筛，通过电子扫描电镜（JSM-6490LV,日本）按×160， ×1000倍放大观察聚合物的表面形态和表面结构，见附图1-3。

从图1-3（a）、（b）中可以看到由于研磨引起的印迹聚合物的不规则颗粒状外貌，进一步放大1000倍，可以看到印迹聚合物立体感强，表面疏松，其多孔结构为后面的吸附提供了依据。

5、吸附试验

（1） 平衡吸附性能的测试

分别称取11份30 mg的印迹聚合物和非印迹聚合物吸附浓度范围为0.005- 0.08g L-1的联苯菊酯溶液，测定吸附后上清液的浓度计算出吸附量绘制吸附等温线，见附图1-4。

比较两曲线可知：首先同一浓度条件下，片段印迹聚合物的相对吸附量大于非印迹聚合物，这也证明了印迹聚合物中存在特异的识别结合位点，在吸附过程中，替代模板留下的印迹空穴及空穴上的结合位点使聚合物对分析物具有高度亲和力和特异识别性；其次聚合物的吸附量随着吸附联苯菊酯溶液浓度的增加也在增加，当联苯菊酯浓度为60 m g L-1时，吸附达到平衡，此时对于印迹聚合物相对吸附量Q=13.86 mg g-1。

（2 ）吸附速率的研究

图1-5测定的是聚合物随时间的增长吸附量的改变，即聚合物的吸附速率。

由图1-5可知，随吸附时间的延长，聚合物的吸附量逐渐增加，但7 h以后吸附基本没有变化，说明在7h的时候聚合物对联苯菊酯的吸附达到饱和，此时Q=7.09 mg g-1，因此后续静态吸附时间确定为7h。

（3 ）选择性研究

测定了两种聚合物对非拟除虫菊酯类农药毒死蜱和拟除虫菊酯类农药联苯菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯的选择性吸附，印迹聚合物和非印迹聚合物的相对吸附量分别记为Q1 和Q2，线性关系及吸附量见表1-5。

表1-5 不同物质的选择性吸附量

由图1-6可知，聚合物对拟除虫菊酯类农药的吸附量大于对非拟除虫菊酯类农药，并且印迹聚合物的吸附量高于非印迹聚合物。这是因为拟除虫菊酯类物质具有与替代模板类似的结构，而印迹聚合物中恰恰既存在能与拟除虫菊酯类结合的功能基团，又有与拟除虫菊酯类分子结构互补的特定立体孔穴，而非印迹聚合物中没有，这不仅表明了在聚合物合成过程中替代模板发挥了印迹效应，而且这种效应可以实现对一类物质的识别，并且还能排除结构不相似物质。

6、自制固相萃取柱的优化

（1）流速的选择

由于印迹聚合物的多孔形态特征，被分析物首先进入其表面识别位点，然后穿过孔道占据深层孔穴，要达到分析物分子的外扩散和内扩散平衡需要一定的时间。如果流速太快，分析物还没有进入孔穴就被冲走，在流速过快时甚至有可能出现穿漏现象，来不及达到动力学平衡。而流速过慢会导致分析时间过长，本实验最终控制流速约1mL min-1。

（2） 固相萃取溶剂的选择

将制备好的片段印迹聚合物柱预处理后，取0.04 g L-1的联苯菊酯溶液3.5 mL上样，分别用甲醇含量为0-100%的甲醇-水溶液3.5 mL洗脱，然后进行气相色谱（Agilent 7890，USA）分析（气相色谱条件：进样口温度：250℃；检测器（ECD）温度：310℃；色谱柱升温程序：初始60℃，保持1 mim，以30 ℃ min-1上升到150 ℃，再以6 ℃ mim-1上升到240 ℃，保持5 mim，最后以20 ℃ mim-1上升到270 ℃，保持9mim；进样口温度：250 ℃；载气：N2，24 mL min-1；进样量：1μL，无分流）。同样方法再分别以乙腈与水、乙醇与水、丙酮与水按上述比例及用量上样、洗脱，进行定量分析，绘制洗脱分布图见附图1-7。

据图1-7，对于乙腈-水来说，乙腈含量为60%时，能洗出80%固定相结合的联苯菊酯，乙腈含量为70%时，已经能将所结合的联苯菊酯完全洗出，为保证被结合待测组分完全洗出，且测试实际样品时需用纯溶液，故应选择乙腈含量为20%的乙腈-水溶液作为淋洗液，选择90%乙腈为洗脱溶剂。对于其他三种有机试剂，则可选丙酮含量为50%的丙酮-水、甲醇含量为40%的甲醇-水、乙醇含量为40%的乙醇-水可做淋洗溶液，而纯甲醇作为洗脱溶剂。综合考虑，以丙酮含量10%的丙酮-水溶液作为上样溶剂，以丙酮含量50%的丙酮-水溶液作为淋洗溶剂，以纯甲醇作为洗脱溶剂最佳，因为丙酮在这四种溶剂中洗脱能力最差，可选其作为上样溶剂；以丙酮-水作为淋洗溶剂时，可采用丙酮含量较高的溶剂，从而可以洗掉较多的与片段印迹聚合物非特异性结合的杂质；以纯甲醇作为洗脱溶剂，能够避免以乙腈洗脱能力太强而洗掉一些吸附力更强的杂质，三次平行测试联苯菊酯的平均回收率为101.37%。

（3） 洗脱剂用量的确定

将制备好的片段印迹固相萃取柱经预处理后，取0.01g L-1的丙酮∶水=1:9（V/V）联苯菊酯溶液30 mL上样。用纯甲醇溶液洗脱，每使用0.1 mL甲醇测一次，当洗脱溶液加至第1.6 mL时，洗脱液中未检出联苯菊酯，故确定洗脱溶剂乙腈用量为1.5 mL。

（4） 最大柱容量的测定

将制备好的印迹聚合物100 mg填充固相萃取柱，经预处理后，依次取0.01g L-1的联苯菊酯溶液1mL上样，当上样到第65 mL后的流出液检测到有模板分子，计算出片段印迹固相萃取柱的最大柱容量是6.4 mg g-1。

（5） 与商品柱的比较

在选择性试验中，我们还在样品中添加五种拟除虫菊酯类农药和两种非拟除虫菊酯类农药的标准样，对比了商品化的NH2和C18柱的富集作用与自制片段印迹聚合物固相萃取柱的效果对比。

图1-8中可以看出经过相同的处理后，自制片段印迹固相萃取柱杂峰较少，以联苯菊酯为例，自制柱与C18 和 NH2柱的峰高分别为523.8, 239.2,511.2，自制柱响应更高，效果更理想。

（6） 重复使用次数

由于片段印迹聚合物上吸附的分析物可以经过物理萃取去除，因此可以反复使用降低检测成本。利用优化方案合成的印迹聚合物，填充固相萃取柱，经测试其萃取能力和性能在连续六次的使用中均保持稳定，因此自制片段印迹固相萃取柱具有良好的重复使用性。

（7） 耐溶剂性

商品化的固相萃取柱应用有一定的限制。例如：氯仿不能用于反相萃取柱中，甲醇不能用于硅胶萃取柱中。而本试验中片段印迹固相萃取柱对甲醇、乙醇、丙酮、乙腈都表现出良好的抵抗力，显示出良好的耐溶剂性能。

7 、方法的线性范围、检出限和精密度

配置五种拟除虫菊酯类和两种非拟除虫菊酯类农药0.02–2.0 µg mL−1的一系列标准溶液，用气相色谱测定结果见表1-6：

表1-6 方法的线性范围，检测限和精密度

8、方法的精密度和准确度

应用此法对蜂蜜样品进行加标回收分析实验，加标浓度分别为0.05 μg mL−1、0.10 μg mL−1、0.20 μg mL−1，结果如表 1-7。

表1-7 回收率和精密度试验结果（n=6）

上述实验中，二苯醚-联苯共晶印迹聚合物吸附性能的测试方法为：

（1） 标准溶液的配置

准确称取0.025g联苯菊酯，用甲醇溶解，然后定容于25 mL容量瓶中，得到1g L-1的联苯菊酯溶液。然后用甲醇∶水=1：9（V/V）的溶液逐级稀释配制浓度为0.005～0.05g L-1的一系列联苯菊酯标准溶液。

（2） 印迹聚合物吸附等温线的测试

称取十份0.025 g的印迹聚合物于离心管中，分别加入0.005～0.08 g L-1甲醇∶水=1：9（V/V）的联苯菊酯溶液5 mL，封口；振荡后静置15 h。用紫外分光光度计测其吸光度，并计算吸附后联苯菊酯的浓度。根据吸附前后溶液中联苯菊酯的浓度变化可计算聚合物对底物的结合量Q(mg g-1) ，平行测定3次取平均值。

Q=(C0-C1) (1000 m) -1 V 公式1

式中： Q—聚合物对联苯菊酯的吸附量, mg g-1

C0—联苯菊酯的原始浓度， g L-1

C1—吸附后溶液中联苯菊酯的浓度， g L-1

V—联苯菊酯标准溶液的体积，L

m—片段印迹聚合物的质量，g

非印迹聚合物的结合量用同样方法测定。

（3） 吸附速率的测试

取15份配制好的联苯菊酯溶液6 mL，加入0.025 g印迹聚合物后封口并对溶液分别编号。经过一定时间测定上清液的吸光度并换算成联苯菊酯的浓度。根据公式1计算出聚合物对底物的相对结合量Q(mg g-1)，平行测三次取平均值。

（4） 印迹聚合物选择性实验

准确称取0.015 g 印迹聚合物，加入毒死蜱、甲氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、联苯菊酯混标溶液10 mL，每种标样的浓度都为900 μg L-1，封口放置15 h。测定混标标准曲线后根据公式1计算聚合物对底物的结合量Q(mg g-1) ，平行测三次取平均值。

同样方法测非印迹聚合物对底物的结合量Q(mg g-1)。

二苯醚-联苯共晶固相萃取柱的制备及使用方法为：

准确称取100 mg二苯醚-联苯共晶片段印迹聚合物，干法填柱装入柱（内径6 mm）中，萃取柱上部可用双联球加压保持流速约1mL min-1。将装好的柱子保存备用。

将制备好的萃取柱依次用5 mL甲醇，5 mL水活化后，取联苯菊酯溶液上样，用2mL丙酮含量50%的丙酮水溶液淋洗后，用1.5 mL甲醇洗脱并收集洗脱液。

实施例2、拟除虫菊酯片段印迹聚合物微球制备方法（悬浮聚合法），量取1%的聚乙烯醇溶液100.0 mL加入到250.0 mL圆底烧瓶中，将二苯醚-联苯共晶2.0 mL、α-MAA 4.0 mL、DVB 20.0 mL、BPO 0.25 g一起加入到小烧杯中搅拌溶解，然后倒入滴液漏斗中慢慢滴加到烧瓶中，在反应温度80℃、机械搅拌条件下，反应四 h。将制得的产品用热水反复搅拌溶解，抽滤，洗去聚合物上粘连的聚乙烯醇，直至得到比较干爽的聚合物，将制得的聚合物晾干后，筛取360-200目（80μm-120μm）之间的产品备用。

称取制得的聚合物500 mg，置于ASE-200的萃取池中，用体积比为 4:1 的甲醇-乙酸混合溶液按上面步骤提取出替代模板于接收瓶中，待循环结束后取出萃取池中的聚合物即拟除虫菊酯片段印迹聚合物微球，干燥至恒重后放入干燥器备用。

实施例3、拟除虫菊酯片段印迹聚合物微球制备方法（沉淀聚合法），量取二苯醚-联苯共晶0.229 mL（0.75 mmol），α-MAA 0.381 mL(4.5 mmol)和EDMA 5.640 mL(30 mmol) 于250 mL圆底烧瓶中，然后加入AIBN 0.0633 g，三氯甲烷120 mL，搅拌使其完全溶解，放置于恒温油浴锅中，在温度70℃和磁力搅拌条件下反应8 h，反应结束后制得白色浑浊溶液，抽滤后得到白色粉末状聚合物，烘干后，筛取45μm-75μm之间的产品备用。

同时用同样比例和方法制取未加替代模板的非印迹聚合物微球（NIP）。

称取制得的白色粉末状聚合物500 mg，置于ASE-200的萃取池中，用体积比为 4:1 的甲醇-乙酸混合溶液按上面步骤提取出替代模板于接收瓶中，待循环结束后取出萃取池中的聚合物即拟除虫菊酯片段印迹聚合物微球（MIP），干燥至恒重后放入干燥器备用。

实施例2、3中片段印迹聚合物合成方法的优化，聚合产物电镜扫描图，反应时间的优化，正交实验，吸附测试，自制片段印迹固相萃取柱萃取条件的优化实验，方法的线性范围、检出限和精密度，方法的精密度和准确度以及蜂蜜样品的分析内容及结果如下：

1、合成方法的优化

（1）悬浮聚合条件的选择

悬浮聚合一般选用极性较强的溶剂，通常在水相中进行，功能单体被打散呈小珠并继续增长至高度交联的聚合物，生成的微球粒径一般也较大，因而交联剂的用量较大，且对其用量和操作条件的要求较高。

交联剂种类的选择

分别取三份100mL 1%的聚乙烯醇溶液与于三个250 mL圆底烧瓶中，依次加入二苯醚-联苯共晶2.0 mL、MAA（α-甲基丙烯酸） 4.0 mL、DVB（二乙烯苯） 20.0 mL或EDMA（乙二醇二甲基丙烯酸酯） 25.0 mL或TDMA（） 32.5 mL、BPO（过氧化苯甲酰） 0.25g，用滴液漏斗慢慢滴加到烧瓶中，80℃条件下机械搅拌反应4 h制得聚合物微球，将所得微球放入热水中搅拌并继续加热使聚乙烯醇溶于热水中，然后抽滤，重复三到五次直至完全除去聚乙烯醇。干燥、过筛取360-200目（45μm-75μm）见产物，测定三种交联剂的悬浮聚合产物的性质。

表2-1 悬浮聚合产物性状

交联剂 聚合产物性状
	TDMA 产物用水洗时分层，抽滤呈饼状，烘干产物较软粘连在一起
EDMA 产物用水洗时分层，抽滤呈饼状，产物能分散开
	DVB 产物用水洗时分层，产物微黄色，抽滤呈散开的沙粒状

分别称取0.025 g三种交联剂制得的聚合物加入离心管中，然后各自加入8.0 mL浓度为40 mg L-1的联苯菊酯溶液，震荡混匀，静态吸附15 h，离心取上清液，用紫外分光光度计测量吸附平衡后溶液吸光度，计算聚合物对联苯菊酯的相对吸附量Q(mg g-1)。

表2-2三种交联剂聚合产物的吸附量

交联剂种类	TDMA	EDMA	DVB
				吸附量（mg g-1）	4.65	7.82	8.13

可以看出选用DVB时得到的印迹聚合物外观形态较符合，吸附量也最大，所以选DVB作为交联剂进行进一步的优化。

交联剂用量的优化

此步骤采用单因素试验，固定其它条件，改变单体与交联剂的比例进行进一步优化。量取1%的聚乙烯醇溶液100.0 mL加入到250.0 mL圆底烧瓶中，将二苯醚-联苯共晶2.0 mL、MAA 4.0 mL、DVB（5.0 mL 、10.0 mL 、15.0 mL 、20.0mL、25.0 mL）、BPO 0.25g一起加入到小烧杯中搅拌溶解，然后倒入滴液漏斗中慢慢滴加到烧瓶中，在反应温度80℃、机械搅拌条件下，反应4 h。将制得的产品用热水反复搅拌溶解，抽滤，洗去聚合物上粘连的聚乙烯醇，直至得到比较干爽的聚合物，将制得的聚合物晾干后，筛取360-200目（45 μm-75 μm）之间的产品洗脱去除替代模板后，测定其对0.040 g L-1联苯菊酯的相对吸附量。

表2-3 三种单体与交联剂比例下聚合产物的吸附量

交联剂用量（mL）	5	10	15	20	25
						吸附量（mg g-1）	-	3.76	7.47	8.13	6.92

综合以上对悬浮聚合的优化条件：功能单体为MAA与交联剂DVB的摩尔比为3:4合成聚合物微球的吸附量最大。

搅拌速度的影响

参加聚合反应的单体在搅拌产生的剪切力作用被分散成小液滴。随着搅拌速度的提高，剪切作用增强，形成的液珠单滴越小，最终形成的聚合物微球粒径变小；同时会使分散的单体液滴运动速度加快，粒子间碰撞的几率升高，更容易成球。在本试验中对磁力搅拌制得聚合物经后续测定粒径分布，选取转速为125 r min-1。

（2）沉淀聚合条件的选择

沉淀聚合法使用的单体能溶于溶剂而生成的聚合物却不能，此法对溶剂的黏性要求高，黏性大小影响产物的粒径分布，通常选择黏性较小的溶剂。此法的关键是保证在聚合物链增长到一定程度后从体系中沉析出来。

溶剂种类的影响

以二苯醚-联苯共晶为替代模板，分别用乙腈、三氯甲烷和正己烷作为聚合反应溶剂，MAA为功能单体，EDMA为交联剂，AIBN为引发剂，在70℃温度下分别作聚合反应。将制得聚合物洗去模板后，称取相同质量，吸附浓度为0.040 g L-1甲醇∶水=1: 9（V/V）的联苯菊酯溶液，用紫外分光光度计测量吸附后溶液的吸光度，计算吸附后联苯菊酯浓度，算出吸附量，三种不同溶剂合成的聚合物吸附量如表2-4所示，

表2-4 致孔剂种类对微球吸附量的影响

溶剂种类	乙腈	三氯甲烷	正己烷
				吸附量（mg g-1）	1.26	10.3	8.18

由表中可以看出，以三氯甲烷合成的片段印迹聚合物吸附量最大，因此决定采用三氯甲烷作为后续实验的聚合溶剂。

溶剂用量的影响

聚合溶剂的用量决定了反应体系中模板的浓度，在反应中减少致孔剂用量，会提高模板浓度，有更多的特异性结合位点生成，但溶剂用量过少时，影响到聚合物的沉淀，为了保证聚合物的特异识别的能力，模板分子与功能单体、交联剂之间的浓度应维持在一个合适的比例。经典的分子印迹聚合物合成比例是模板分子：功能单体：交联剂=1:4:20 (摩尔比)。在实验中改变聚合溶剂用量，但维持上述比例不变，在溶剂用量为60 mL时所得产物颗粒粒度极其不均匀，局部呈致密块状；溶剂用量为80 mL时，所得产物疏松，颗粒粒度也相对均匀；溶剂用量为100 mL时的情况与80 mL的相比产量和微球粒度都没有太大的差别，所以聚合溶剂用量定为80 mL。

功能单体的选择

以二苯醚-联苯共晶为替代模板，分别以4-vp，MAA，MA，MMA，AA为功能单体，EDMA为交联剂，AIBN为引发剂，三氯甲烷为致孔剂，在相同反应条件下，合成五种片段印迹聚合物微球。洗去模板后，分别称取相同质量的聚合物，吸附同体积同浓度的联苯菊酯标准液，用紫外分光光度计分别测量吸附后各溶液的吸光度，根据标准曲线算出各个聚合物对联苯菊酯的吸附量。

如图2-1所示，从图中可以明显看到，以MAA为单体合成的片段印迹聚合物对联苯菊酯的吸附量最大，因此决定采用MAA为功能单体，进行接下来的合成实验。

温度的影响

一般认为，温度越低，生成聚合物的识别性能越好，但是温度过低，无法达到引发剂AIBN的热分解温度，聚合反应不能发生。而随着聚合反应温度的升高，引发、聚合和成核速度逐渐加快，相互碰撞几率增大，聚合体系的粘度降低，聚合物颗粒的平均粒径将增大。所以若要得到合适粒径而又识别性好的聚合物就必须控制好聚合反应的温度。不同温度下生成所需粒径微球（45μm-75μm）占产物总数的质量分数如下：

表2-5 不同温度下的粒径分布

聚合温度	65℃	70℃	75℃	80℃
					含量（%）	28.7℃	45.6	35.3	23.8

试验中在温度为70℃时45μm-75μm间产物产量最高，后续实验采用70℃条件下合成。

2、沉淀聚合与悬浮聚合产物电镜扫描图

通过扫描电镜用来研究聚合物的表面结构和形态特征，将两种方法制备的片段印迹微球扫描电镜分别按按×50和×100倍观察。

如图2-2（a）、（b），由微球的电镜图，可以看出悬浮聚合法合成的聚合物大小不均且微球表面有粘连现象，这可能是残留的不易洗掉的分散剂等杂质，而沉淀聚合合成的聚合物大小一致，分散均匀，合成产物形态理想，这也从一方面说明了吸附性能测试中沉淀微球具有更好的吸附性能的原因。因此后续实验选择沉淀聚合作为合成方法。

3、反应时间的优化

确定沉淀聚合的试验方法后，称量反应不同时间后所生成聚合物微球的质量，绘制其与反应时间的关系于图2-3。

由图2-3可知当反应进行前4 h聚合物产量迅速增加，接下来6 h增速放缓，达到10 h候后聚合物质量不在发生变化，即反应 10 h后，聚合物反应基本完成，所以本次试验的反应时间定为10 h。

4、正交实验

为了对二苯醚-联苯共晶片段印迹聚合物的聚合条件进一步优化，采用4因素3水平的正交实验，将所得印迹微球去除模板后吸附0.03 g L-1的甲醇:水=1:9 （V/V）的联苯菊酯溶液为吸附母液。正交实验见表2-6：

表2-6正交试验设计

将各实验条件下所得聚合物吸附量最大的条件确定为聚合反应的最佳条件—替代模板：功能单体：交联剂=1:6:40（摩尔比），聚合温度时间为 70℃。对比各因素的极差的大小可知影响聚合物性能的显著性因素是替代模板与功能单体的比例。洗脱替代模板的印迹微球对联苯菊酯的单位吸附量为：17.79 mg g-1，吸附效果优于优化前且比本体聚合的相对吸附量大。

5、吸附测试

（1） 吸附能力的研究

测定印迹微球对不同浓度的联苯菊酯溶液的吸附量，即吸附等温线。准确称取0.010 g除去替代模板的聚合物，分别加入8mL浓度范围为0.001-0.12g L-1的联苯菊酯溶液中，震荡后静置吸附15 h后，用气相色谱仪分别检测其峰面积，根据公式1计算聚合物对底物结合量Q (mg g-1) ，同样方法测非印迹聚合物的相对吸附量，结合等温线见图2-4。

比较两曲线可知，随着被吸附溶液浓度的增加，片段印迹微球和非印迹微球的吸附量均增加并在100 mg L-1时达到平衡；在同一浓度条件下，印迹微球的相对吸附量大于非印迹微球，分别对应的平衡吸附量为32.4 mg g-1和11.9 mg g-1，这说明在合成过程中，替代模板在印迹聚合物中留下的印迹空穴及空穴上的活性结合位点决定了印迹微球对分析物有特异识别性和高度亲和力。

（2） 吸附速率的研究

聚合物的吸附量随时间的变化趋势，即吸附速率，是吸附动力学的一项重要研究内容，如图2-5，聚合物的吸附量随时间的延长逐渐增加，在9 h的时候聚合物对联苯菊酯的相对吸附量基本不变，即聚合物的吸附在9 h达到平衡。

（3） 选择性研究

实验测定了印迹聚合物和非印迹聚合物对菊酯类物质（A-联苯菊酯、B-甲氰菊酯、C-氯菊酯、D-氯氰菊酯、E-氰戊菊酯）和非菊酯类物质（F-毒死蜱、G-五氯硝基苯）的选择性吸附，结果如图2-6：

印迹微球对甲氰菊酯、联苯菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、毒死蜱、五氯硝基苯的吸附量分别为632.3、518.24、575.69、558.05、537.81、385.03和352.57mg Kg-1，而非印迹聚合物的吸附量分别为352.35、331.05、289.32、253.88、364.14、334.59和295.32mg Kg-1，印迹微球的吸附量大于非印迹微球，菊酯类物质吸附量比对非菊酯类物质的吸附量要大很多，而非印迹聚合物对菊酯类和非菊酯类物质的吸附量相差不大，结果表明合成的印迹聚合物对菊酯类物质有较好选择性，而非印迹聚合物没有。这是因为印迹聚合物中既有与拟除虫菊酯类分子结构互补的特定形状的立体孔穴，又存在与拟除虫菊酯类相结合的功能基团，而在非印迹聚合物中则没有，因此非印迹聚合物对菊酯类物质不显示特异选择性。

6、自制片段印迹固相萃取柱萃取条件的优化

（1） 样品上柱溶液的确定

在固相萃取中，在保证样品溶解的前提下，尽可能采用弱溶剂溶解样品，使组分在萃取柱上有较强保留，用较小体积溶剂便可将组分洗脱，也可减少杂质洗出。若样品溶剂强度过高或体积过大，则可能会造成穿漏，使回收率降低。

考虑到本实验的目的是测定食品样品，而联苯菊酯在水中的溶解性较差，因此采用含有一定比例的有机溶剂和水的混合溶剂作为联苯菊酯的上柱溶剂，实验采用丙酮∶水=1:9（V/V）作为上柱溶剂。

（2）淋洗及洗脱溶剂的选择

淋洗溶剂一般略强于或等于样品溶剂，在保证待测组分不被洗掉的前提下，洗去不需要的组分或杂质，以便于随后的色谱分离测定。洗脱溶剂选择时保证用最小体积的溶剂将待测组分洗下来，并可避免溶剂太强洗出不必要的干扰组分。

对于二苯醚-联苯共晶片段印迹聚合物制备的固相萃取柱，准确量取3.0 mL浓度为0.030 g L-1的联苯菊酯溶液上样，分别测定了有机溶剂含量为10~100%的甲醇-水、乙腈-水、丙酮-水以及乙醇-水的淋洗/洗脱情况，每种溶剂的淋洗用量为3.0 mL，用紫外可见光度计测定洗脱液的吸光度，根据标准曲线，求出对应浓度，计算回收率，绘制淋洗/洗脱分布图，如图2-7所示。

据图，以乙腈-水为例，乙腈含量为50%时，能洗出约62.73%与固定相结合的联苯菊酯，乙腈含量为70%时，已经能将所结合的联苯菊酯完全洗出，为保证被结合待测组分完全洗出，且测试实际样品时需用纯溶液做气相分析，故应选择已经含量为15%的乙腈-水溶液作为淋洗液，选择纯乙腈为洗脱溶剂。对于其他三种有机试剂，则分别可选20%的丙酮-水、10%的甲醇-水、10%的乙醇-水作为淋洗液，以纯甲醇或者乙腈作为洗脱溶剂，而即使用100%的丙酮或者100%的乙醇都不能将联苯菊酯完全洗脱下来。综合考虑，以20%的丙酮-水作为淋洗液，以纯甲醇作为洗脱液最佳，因为以丙酮-水作为淋洗液时，可采用有机溶剂含量较高的溶剂，这样可以洗掉较多的与片段印迹聚合物非特异性结合的杂质；而以纯甲醇作为洗脱液，回收率高且便于随后的气相测试，并且且能够避免以乙腈洗脱能力太强而洗掉一些吸附力更强的杂质。

（3） 最大柱容量

将制备好的片段印迹聚合物固相萃取柱活化后，先取60 mg L-1的联苯菊酯的丙酮∶水=1:9（V/V）溶液3.0 mL上样，然后分析过柱后的溶液，观察是无滴漏现象，继续上样，累计上样30 mL，然后用0.030 g L-1的联苯菊酯溶液3.0 mL上样，继续检测分析，累计上样18.0 mL，最后用用0.010 g L-1联苯菊酯溶液1mL上样，在累计加入到17mL时，在溶液检测到有模板分子漏出，由此，可以计算出最大柱容量为25 mg g-1。

（4 ）洗脱剂用量的选择

将制备好的片段印迹聚合物柱预处理后，取10 mg L-1的丙酮∶水=1:9（V/V）联苯菊酯溶液30 mL上样。用纯甲醇溶液洗脱，每使用0.1 mL甲醇测一次，当洗脱溶液加至第1.8 mL时，洗脱液中为检出联苯菊酯，故确定洗脱溶剂乙腈用量为1.7 mL。

7、方法的线性范围、检出限和精密度

配置五种农药的0.02–2.0 µg mL−1一系列标准溶液，用气相色谱测定，结果如表2-7。

表2-7 方法的线性范围，检测限和精密度

8、方法的精密度和准确度

利用此方法对蜂蜜样品进行加标回收分析实验，加标浓度分别为0.10 μg mL−1、 0.20 μg mL−1、0.40 μg mL−1，结果如表2-8。

表2-8 回收率和精密度试验结果（n=6）

9、蜂蜜样品的分析

将优化后的片段印迹固相萃取条件用于蜂蜜样品的分析。分别称取两种蜂蜜样品（Ⅰ、Ⅱ）10 g加入10 mL水在4000 rpm离心10min，吸取上清液调节 pH 至4.45（蛋白质的等电点），离心除去可能存在的少量蛋白，再加入PSA除糖，再次离心，取10 mL上清液通过固相萃取柱富集，将洗脱液进GC-ECD分析，分析结果中到样品Ⅱ含氯氰菊酯9.6 µg L-1。

上述实验中，片段印迹聚合物微球的性能测试方法为：

（1） 片段印迹微球吸附性能测试

称取 10 mg 印迹微球 12 份，分别加入浓度为 0.01～0.12 g L-1一系列甲醇∶水=1:9 (V/V）的联苯菊酯溶液8.0 mL，振荡后静态吸附15 h后测定吸附前后底液中联苯菊酯的浓度变化，计算聚合物对底物的结合量 Q ( mg g-1 ) ，平行 3 次取平均值。同样用公式1测定非印迹微球的相对吸附量。

（2） 吸附速率的测试

准确称取25.0 mg二苯醚-联苯共晶片段印迹微球，分别加入到14份盛有8.0mL联苯菊酯溶液的离心管中，依次编号为1-14号，震荡后密封。前10号溶液每小时测一个，11至14号溶液2、4、4、4小时测一个。用紫外分光光度计测量其吸附后上清液的吸光度，根据公式1计算聚合物的相对吸附量Q(mg g-1) ，平行3次取平均值。

（3） 印迹微球选择性实验

准确称取10.0 mg除去替代模板的印迹聚合物，加入五氯硝基苯、毒死蜱、联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯混标溶液10mL，混标的浓度都为0.9 mg L-1，震荡后放置15 h。用气相色谱仪测量其峰面积，计算聚合物对底物的相对吸附量 Q(mg g-1) ，平行3次取平均值。

同样方法测非印迹聚合物的相对结合量Q(mg g-1)。

片段印迹聚合物微球固相萃取性能测试方法为：

（1） 固相萃取柱的制备

准确称取100 mg二苯醚-联苯共晶片段印迹聚合物，用湿法上柱装入柱中，用双联球加压控制流速。将制备好的固相萃取柱用甲醇活化，然后在用少量水洗掉甲醇，量取联苯菊酯溶液上样，用1.0 mL 20%的丙酮-水的淋洗，保持流速约1 mL min-1，然后用1.7 mL甲醇洗脱，用气相色谱测量洗脱液中联苯菊酯含量，并计算其回收率。

（2） 实际样品的测定

分别称取两种蜂蜜样品（Ⅰ、Ⅱ）10 g加入10 mL水在4000 rpm离心10 min，吸取上清液调节 pH 至4.45（蛋白质的等电点），离心除去可能存在的少量蛋白，再加入PSA除糖，再次离心，取10 mL上清液通过固相萃取柱富集，将洗脱液进GC-ECD分析。

Claims (2)

1.拟除虫菊酯片段印迹聚合物制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将含拟除虫菊酯类替代模板分子、功能单体、交联剂和引发剂的混合液加入悬浮剂和表面活性剂形成的溶液，热引发聚合，得聚合物微球；所述的拟除虫菊酯类替代模板分子为二苯醚-联苯共晶或对氨基二苯醚，所述的功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶、2-乙基氰基丙烯酸酯、2-甲基-2-丙烯酸-2，3-二羟基丙酯或二（2-甲基-2-丙烯酸）2-羟基-1，3-丙二醇酯，所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯或TDMA；所述的引发剂为过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈，所述的悬浮剂为水，所述的表面活性剂为聚乙烯醇；

（2）聚合物微球用有机溶剂和酸混合液去除模板分子，处理后得拟除虫菊酯片段印迹聚合物微球；所述的有机溶剂为甲醇或乙腈，所述酸为乙酸。

2.如权利要求1所述的拟除虫菊酯片段印迹聚合物制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的替代模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为：替代模板分子︰功能单体︰交联剂=1︰2～10︰20～60，所述的热引发聚合条件为50～90℃反应3～48个小时，所述热引发聚合反应产物用热水反复搅拌溶解、抽滤，洗去反应产物上粘连的聚乙烯醇，得到聚合物微球；步骤（2）中，将聚合物微球用有机溶剂和酸混合液去除模板分子、干燥得拟除虫菊酯片段印迹聚合物微球，所述的酸与有机溶剂的体积比为1︰4，所述处理为干燥。