CN104399283A - 黄曲霉毒素b1适配体亲和柱的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法，属于亲和层析和真菌毒素分析领域。采用环氧活化琼脂糖微球FF作为固相载体，与氨基修饰黄曲霉毒素B1适配体偶联后，封闭载体中多余活性位点，填入微型小柱制成。所制备的适配体亲和柱能与黄曲霉毒素B1特异性结合，其加标回收率在70~110之间，至少可以重复使用五次。

Description

黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法
技术领域
本发明涉及亲和层析及真菌毒素检测技术领域，具体涉及黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素B1均为黄曲霉菌、寄生曲霉菌产生的代谢物，具有致癌、致畸、致突变的作用，是迄今发现的最稳定的一种真菌毒素，一般食品加工条件都不易破坏，因此给消费者的饮食安全埋下了巨大的隐患。各国对食品中黄曲霉毒素残留量现状非常重视，制定了相应的限量标准，如我国规定大米、食用油中黄曲霉毒素允许量标准为( B1 + B2 + G1 + G2) 10 ng /g。
目前，黄曲霉毒素B1的分析方法中，常用的有高效液相色谱、毛细管电泳、液质联用等。这些仪器分析方法对样品纯度要求较高，需要经过一些前处理，传统的前处理技术有免疫亲和柱、多功能净化柱等，这些净化柱价格较贵，多为一次性的。建立高选择、快速有效的样品前处理技术已成为黄曲霉毒素B1检测分析中需要解决的重要问题。    
基于适配体亲和层析是一种新型高效样品前处理技术。它的原理是利用适配体对靶分子选择性吸附来实现对复杂样品中靶分子的提取和净化处理，这种吸附是可逆的。适配体的亲和层析结合常规仪器分析已成为真菌毒素分析的一个发展方向，但目前尚未见其适配体亲和柱的制备方法及其应用报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法，所研制的亲和柱是将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体与环氧活化的琼脂糖6FF偶联填充于固相萃取柱中，用于纯化含黄曲霉毒素B1的待测样品。
本发明的技术方案为：一种黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法，其步骤：1 活化：取60mg的环氧活化琼脂糖微球FF在2mL去离子水中悬浮溶胀成凝胶1小时。用60mL去离子水分三次洗涤凝胶，静置5min后，移除清洗液；2偶联：将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体溶于1mL20.0mmol/LpH10.0的磷酸盐缓冲液中。将步骤1中溶胀凝胶悬浮于含适配体的缓冲液中，在37℃的水浴中振摇16小时。反应完后，再用3mL去离子水洗涤未反应的适配体，静置5min后，移除清洗液；3 封闭：将步骤(2)中凝胶悬浮到2mL1mol/LpH8.0乙醇胺溶液中，在50℃的水浴中振摇4小时，反应完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0.1mol/LpH4.0乙酸缓冲液和3mL含0.5mol/LNaCl的pH8.3偶联缓冲液交替清洗，每次清洗2min，至少循环3次；4 装柱：将步骤3的悬浮凝胶液移入固相萃取小柱（内径5.0 mm，容积1.0mL），避免产生气泡，用5mL0.1mol/LpH8.0磷酸盐缓冲液平衡小柱。
其中步骤2中氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体为DNA合成公司商品化生产，黄曲霉毒素B1适配体的序列为：5’-TTT TTT GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA C-NH2-3’。
本发明黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的应用方法，按下述步骤进行：a上样：放掉柱内溶液，将提取的样品用0.1mol/LpH8.0磷酸盐缓冲液溶解或稀释，上样。上样时流速不超过1mL/min，避免样品流干。b淋洗：待样品过柱后，用3 mL二次水淋洗柱床、弃去。c洗脱：用3mL甲醇洗脱，在50℃下氮气吹干，用流动相定容待测。d再生：对于使用之后的凝胶，以2~3倍柱体积的含0.5mol/LNaCl的0.1mol/LpH8.3Tris-HCl和含0.5mol/LNaCl的0.1mol/pH4.5乙酸缓冲液交替冲洗2~3次。 
本发明的优点在于：本发明制备的适配体亲和柱能够与黄曲霉毒素B1特异性结合，一次净化能除去绝大部分干扰物。制备的适配体亲和柱最大结合容量约为80 ng黄曲霉毒素B1。采用的洗脱液为甲醇时，加标回收率在70~110%之间。制备的适配体亲和柱重复使用5次，回收率不低于70%。 
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备：
1 活化：取60mg的环氧活化琼脂糖微球FF在2mL去离子水中悬浮溶胀成凝胶1小时。用60mL去离子水分三次洗涤凝胶，静置5min后，移除清洗液；
2偶联：将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体溶于1mL20.0mmol/LpH10.0的磷酸盐缓冲液中。将步骤1中溶胀凝胶悬浮于含适配体的缓冲液中，在37℃的水浴中振摇16小时。反应完后，再用3mL去离子水洗涤未反应的适配体，静置5min后，移除清洗液；
3 封闭：将步骤2中凝胶悬浮到2mL1mol/LpH8.0乙醇胺溶液中，在50℃的水浴中振摇4小时，反应完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0.1mol/LpH4.0乙酸缓冲液和3mL含0.5mol/LNaCl的pH8.3偶联缓冲液交替清洗，每次清洗2min，至少循环3次；
4 装柱：将步骤3的悬浮凝胶液移入固相萃取小柱（内径5.0 mm，容积1.0mL），避免产生气泡，用5mL0.1mol/LpH8.0磷酸盐缓冲液平衡小柱。
其中步骤2中氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体为DNA合成公司商品化生产。
本发明所述黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的性能评价方法：
实施例1所制备的亲和柱最大结合容量的测定：分别用10mL20.0ng/mL（200ng）过黄曲霉毒素B1亲和柱。上样液每毫升收集一管，用HPLC-MS/MS测定每管中黄曲霉毒素B1含量。根据下式计算：最大结合容量（即被吸附的黄曲霉毒素B1总量）等于上样总量减去洗下的黄曲霉毒素B1总量。结果发现，1~5mL上样液只测出黄曲霉毒素B1，到5mL开始无吸附。因此，偶联1.9 nmol/L黄曲霉毒素B1适配体的亲和柱最大结合容量约为80 ng。
实施例1所制备的亲和柱加标回收率和重复性测定：分别上样20mL的0.5ng/mL、1.0 ng/mL、2.0ng/mL三种不同浓度的黄曲霉毒素B1，每种浓度作三组平行。收集洗涤液后用HPLC-MS/MS测定回收率。结果见表1，经测定回收率均达到90%以上，相对标准偏差少于10%。
表1制备的黄曲霉毒素B1亲和柱加标回收率和重复性
实施例1所制备的亲和柱重复使用次数的确定：制备亲和柱，分别重复上样、洗涤、洗脱、再生操作，重复试验，收集洗涤液后用HPLC-MS/MS测定回收率。结果显示，五次上样20mL的1.0 ng/mL黄曲霉毒素B1标准溶液过同一亲和柱的回收率依次为90.3%、87.4%、85.2%，84.5%、80.2%。
HPLC-MS/MS评价方法的建立：
液相条件: Agilent 1290 UHPLC；色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18 (2.1 mm×100mm,1.8μm), 柱温40℃；流速为0.3 mL/min；流动相A: 0.1% 甲酸水溶液（包含10 mmol/L甲酸铵）；B:甲醇；梯度洗脱条件：梯度洗脱：0~ 5m in, 10% B线性变化至90% B; 5~ 5.1m in, 90% B线性变化至10% B; 5.1~ 6m in,  维持10% B。质谱条件: Ag ilent 6460 QQQ; ESI ( + ), 毛细管电压4000V, MRM 检测,黄曲霉毒素B1母离子/子离子及碰撞能量（*定量离子）： 313>284.4*（24）；313>240.6(36)。
取50.0 μg/L黄曲霉毒素B1标准溶液配制成系列浓度（0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L），进10.0μL，HLPC-MS/MS分析。以浓度对其线性拟合，线性方程为Y=2257.5X-214.8(X，μg/L；R 2=0.9951)。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一种黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法，其步骤：（1） 活化：取60mg的环氧活化琼脂糖微球FF在2mL去离子水中悬浮溶胀成凝胶1小时，用60mL去离子水分三次洗涤凝胶，静置5min后，移除清洗液；（2） 偶联：将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体溶于1mL20.0mmol/LpH10.0的磷酸盐缓冲液中，将步骤（1）中溶胀凝胶悬浮于含适配体的缓冲液中，在37℃的水浴中振摇16小时，反应完后，再用3mL去离子水洗涤未反应的适配体，静置5min后，移除清洗液；（3）封闭：将步骤(2)中凝胶悬浮到2mL1mol/LpH8.0乙醇胺溶液中，在50℃的水浴中振摇4小时，反应完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0.1mol/LpH4.0乙酸缓冲液和3mL含0.5mol/LNaCl的pH8.3偶联缓冲液交替清洗，每次清洗2min，至少循环3次；（4）装柱：将步骤（3）的悬浮凝胶液移入固相萃取小柱，避免产生气泡，用5mL0.1mol/LpH8.0磷酸盐缓冲液平衡小柱。
2.根据权利要求1所述黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法，其特征在于：其中步骤（2）中氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体为DNA合成公司商品化生产，黄曲霉毒素B1适配体的序列为：5’- NH2-TTT TTT GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA C -3’。
3.根据权利要求1所述黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的制备方法，其特征在于：本发明黄曲霉毒素B1适配体亲和柱的应用方法，按下述步骤进行：（a）上样：放掉柱内溶液，将提取的样品用0.1mol/LpH8.0磷酸盐缓冲液溶解或稀释，上样，上样时流速不超过1mL/min，避免样品流干；( b）淋洗：待样品过柱后，用3 mL去离子水淋洗柱床、弃去；（c）洗脱：用3mL甲醇洗脱，在50℃下氮气吹干，用流动相定容待测；（d）再生：对于使用之后的凝胶，以2~3倍柱体积的含0.5mol/LNaCl的0.1mol/LpH8.3Tris-HCl和含0.5mol/LNaCl的0.1mol/pH4.5乙酸缓冲液交替冲洗2~3次。
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