CN107144657A - 黄曲霉毒素b1适配体亲和毛细管整体柱的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备及应用，将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体通过戊二醛偶联接枝修饰于有机‑无机杂化的氨基毛细管整体柱，通过适配体与黄曲霉毒素B1特异性亲和作用，有机‑无机杂化整体柱高的柱渗透性和大的比表面积，可以高灵敏、高选择性地分离、富集复杂食品样品中痕量、超痕量黄曲霉毒素B1，与检测仪器联用可实现黄曲霉毒素B1简便、灵敏、快速检测。

Description

黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备及应用

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素B1的分离富集方法，具体涉及一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备方法及应用。

背景技术

黄曲霉毒素B1（AFB1）是主要由黄曲霉和寄生曲霉等产生的一种有毒代谢产物，已被国际癌症研究机构(IARC)定为一级致癌物。黄曲霉毒素B1广泛分布于各类农产品和食品中，其中最易受到污染的主要有花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品。鉴于AFB1的严重危害性，国内外相关组织对其制定了严格的限量标准。

目前黄曲霉毒素B1的检测方法主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法（LC-MS）、免疫分析法（IA）等。在众多的方法中，HPLC由于操作简单，准确可靠，重复性好，已成为实验室内黄曲霉毒素B1的主要检测方法。但是由于农产品和食品样品基体复杂，在采用HPLC检测黄曲霉毒素B1时，需要对提取液有一个分离纯化的过程。由于相对高的亲和力和特异性，免疫亲和柱在分离纯化和检测分析中得到了广泛的应用。然而，在亲和色谱中，免疫抗体存在一些明显的局限性，（1）抗体在固定相上的固定化仍然具有一定的挑战性，固定的抗体在空间上的取向难以保持一致，影响抗体的亲和力；（2）抗体易受外界条件的影响，在强亲和力的亲和色谱模式下，分离富集操作过程中经常需要改变溶液的pH、添加有机溶剂或变性剂等，剧烈的洗脱条件，可能会导致抗体失活，在很大程度上限制了方法的灵活应用；（3）抗体由于体积大，在固定相表面的覆盖率小，导致免疫亲和柱容量比较小；（4）抗体制备需要经过免疫动物实验或细胞实验、繁琐费时、成本高。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱，将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体通过戊二醛偶联接枝修饰于有机-无机杂化的氨基毛细管整体柱，用于待测样品中黄曲霉毒素B1的高选择性分离与富集。

本发明的技术方案如下：一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备方法，包括如下步骤：

（1）毛细管活化：用于制备整体柱的石英毛细管内径为530μm，外径为690μm。分别用1.0mol/L氢氧化钠溶液冲洗毛细管4h，去离子水冲洗30min，1.0mol/L盐酸溶液冲洗4h，然后再以去离子水洗至中性，在160℃下用氮气吹干。

（2）整体柱的原位合成：首先将10~30mg CTAB溶于150~350μL无水乙醇和50~150μL去离子水的混合溶液中。然后将100~200μL TEOS和50~100μL APTES快速加入上述混合溶液中。室温涡旋0.5~5min，然后放置在-5~5℃的水浴中超声0.5~5min后，将混合溶液灌入上述活化处理过的毛细管中。最后，毛细管两端以硅橡胶封口，放置于30~60℃烘箱中反应10~30h。

（3）整体柱的清洗：反应完成后，以甲醇和水充分清洗毛细管。

（4）戊二醛衍生：将含有5~20%戊二醛的磷酸缓冲溶液以5~20μL/min速率通入毛细管整体柱中，连续反应12h，然后用磷酸缓冲溶液冲洗掉残留的戊二醛。

（5）修饰适配体：将黄曲霉毒素B1适配体制成浓度为4~8nmol/L的磷酸缓冲溶液，注入毛细管整体柱中反应8~12h，重复三次，用磷酸缓冲溶液冲洗掉未反应的适配体。最后用3~8mg/ml氰基硼氢化钠冲洗整体柱6h，将制得的毛细管整体柱截取5 cm的长度用于之后的固相微萃取操作。

上述的毛细管整体柱在分离富集黄曲霉毒素B1中的应用。

一种基于上述的毛细管整体柱分离富集黄曲霉毒素B1的方法，它是基于黄曲霉毒素B1的毛细管整体柱选择性捕捉上样液中的黄曲霉毒素B1，实现黄曲霉毒素B1的分离富集；其步骤是：

（1）毛细管活化：用10~20 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液平衡亲和毛细管整体柱，将亲和毛细管整体柱活化；

（2）上样：将待测样品溶液以10~100μL/min通入亲和毛细管整体柱内；

（3）清洗：待样品全部流经亲和毛细管整体柱后，用10~20 mmol/L Tris-HCl缓冲液将柱内残留和未被特异性捕获的黄曲霉毒素B1淋洗下来；

（4）洗脱：用含有40~60%甲醇的Tris-HCl 缓冲溶液将被亲和毛细管整体柱捕获的黄曲霉毒素B1洗脱。

本发明的黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱，将氨基修饰的黄曲霉毒素B1适配体通过戊二醛偶联接枝修饰于有机-无机杂化的氨基毛细管整体柱，通过适配体与黄曲霉毒素B1特异性亲和作用，有机-无机杂化整体柱高的柱渗透性和大的比表面积，可以高灵敏、高选择性地分离、富集复杂食品样品中痕量、超痕量黄曲霉毒素B1，与检测仪器联用可实现黄曲霉毒素B1简便、灵敏、快速检测。

附图说明

图1本发明实施例1适配体亲和毛细管整体柱的扫描电子显微镜图；

图2本发明实施例4整体柱净化后的色谱图。

具体实施方式

本发明在有机-无机杂化毛细管整体柱的表面修饰并结合黄曲霉毒素B1适配体，然后用这种毛细管整体柱去分离富集黄曲霉毒素B1。以下实施例仅作为本发明内容的进一步说明，其中的实验条件和设定参数不应视为本发明基本技术方案的局限。

实施例1 黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备

（1）毛细管活化：用于制备整体柱的石英毛细管内径为530μm，外径为690μm。分别用1.0mol/L氢氧化钠溶液冲洗毛细管4h，去离子水冲洗30min，1.0mol/L盐酸溶液冲洗4h，然后再以去离子水洗至中性，在160℃下用氮气吹干。

（2）整体柱的原位合成：首先将25mg CTAB溶于225μL无水乙醇和100μL去离子水的混合溶液中。然后将150μL TEOS和80μL APTES快速加入上述混合溶液中。室温涡旋30s，然后放置在0℃的冰水浴中超声30s后，将混合溶液灌入上述活化处理过的毛细管中。最后，毛细管两端以硅橡胶封口，放置于40℃烘箱中反应20h。

（3）整体柱的清洗：反应完成后，以甲醇和去离子水充分清洗毛细管，以除去未反应的硅烷试剂和模板剂CTAB。

（4）戊二醛衍生：配制含10%戊二醛的100mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 8.0），将该溶液以5μL/min的速率通入毛细管，连续反应12小时，然后用磷酸缓冲溶液冲洗掉残留的戊二醛。

（5）适配体修饰：将黄曲霉毒素B1适配体溶于100mmol/L磷酸缓冲溶液，配制成5nmol/L的适配体溶液，然后以5μL/min速率通入毛细管，在4℃下反应8h，重复三次，用磷酸缓冲溶液冲洗掉未反应的适配体。最后用5mg/mL氰基硼氢化钠溶液以5μL/min冲洗整体柱6h，将制得的整体柱截取5cm的长度用于之后的固相微萃取操作。

上述步骤中，黄曲霉毒素B1适配体的来源于实验室合成，其碱基序列为：

5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGTGCTATCATGCGCTCAATGGGAGACTTTAGCTG

CCCCCACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’，其中5'端通过C6间隔臂被-NH₂修饰。

实施例2

首先采用与实施例1相同的步骤进行毛细管活化处理。然后，将10mg CTAB溶于150μL无水乙醇和50μL去离子水的混合溶液中，然后将100μL TEOS和50 μL APTES快速加入上述混合溶液中。室温涡旋5min，然后放置在-5℃的冰水浴中超声5min后，将混合溶液灌入上述活化处理过的毛细管中。毛细管两端以硅橡胶封口，放置于30℃烘箱中反应10h。反应完成后，以甲醇和去离子水充分清洗毛细管。

配制含5%戊二醛的磷酸缓冲溶液，将该溶液以10μL/min的速率通入毛细管，连续反应。在适配体修饰过程中，将黄曲霉毒素B1适配体制成浓度为4nmol/L的磷酸缓冲溶液，然后以5μL/min速率通入毛细管，在4℃下反应12h，重复三次，用磷酸缓冲溶液冲洗掉未反应的适配体。最后用3mg/mL氰基硼氢化钠溶液以5μL/min冲洗整体柱6h，将制得的整体柱截取5cm的长度用于之后的固相微萃取操作。

实施例3

首先采用与实施例1相同的步骤进行毛细管活化处理。然后，将30mg CTAB溶于350μL无水乙醇和150μL去离子水的混合溶液中，然后将200μL TEOS和100 μL APTES快速加入上述混合溶液中。室温涡旋2min，然后放置在5℃的水浴中超声2min后，将混合溶液灌入上述活化处理过的毛细管中。毛细管两端以硅橡胶封口，放置于60℃烘箱中反应30h。反应完成后，以甲醇和去离子水充分清洗毛细管。

配制含20%戊二醛的磷酸缓冲溶液，将该溶液以20μL/min的速率通入毛细管，连续反应。在适配体修饰过程中，将黄曲霉毒素B1适配体制成浓度为8nmol/L的磷酸缓冲溶液，然后以5μL/min速率通入毛细管，在4℃下反应10h，重复三次，用磷酸缓冲溶液冲洗掉未反应的适配体。最后用8mg/mL氰基硼氢化钠溶液以5μL/min冲洗整体柱6h，将制得的整体柱截取5cm的长度用于之后的固相微萃取操作。

实施例4 黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的应用

（1）活化：用100μL 10mmol/L Tris-HCl平衡实施例1制备得到的亲和整体柱，将亲和整体柱活化。

（2）上样：将500 μL样品溶液以10 μL/min的速率通入整体柱内。

（3）清洗：待样品全部流经亲和柱后用50μL 10mmol/L Tris-HCl（pH=7.5）缓冲液将柱内残留和未被特异性捕获的黄曲霉毒素B1淋洗下来；

（4）洗脱：以20 μL/min的速率，用含有40%甲醇的Tris-HCl溶液，将被亲和柱捕获的黄曲霉毒素B1洗脱。

（5）上机检测：采用高效液相色谱柱后衍生荧光检测洗脱液中的黄曲霉毒素B1。色谱柱为C18反相色谱柱，检测所采用的激发波长和发射波长分别为365 nm和440 nm。小麦加标样品色谱分离图如附图2所示，其中横坐标是保留时间，纵坐标是荧光强度。提取液加标量5μg/L浓度水平时，回收率为83.1~92.3%。

实施例5

采用与实施例4相同的步骤，对待测样品中的黄曲霉毒素B1进行分离与富集，其不同点在于：其中采用20mmol/L 的Tris-HCl缓冲液，上样速率为100 μL/min，并用含60%甲醇的Tris-HCl溶液进行洗脱处理。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型。

Claims (6)

1.一种黄曲霉毒素B1适配体亲和毛细管整体柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）毛细管活化：分别用1.0mol/L氢氧化钠溶液冲洗毛细管4h，去离子水冲洗30min，1.0mol/L盐酸溶液冲洗4h，然后再以去离子水洗至中性，在160℃下用氮气吹干；

（2）整体柱的原位合成：首先将10~30mg CTAB溶于150~350μL无水乙醇和50~150μL去离子水的混合溶液中；然后将100~200μL TEOS和50~100μL APTES快速加入上述混合溶液中，室温涡旋0.5~5min，然后放置在-5~5℃的水浴中超声0.5~5min后，将混合溶液灌入上述活化处理过的毛细管中；最后，毛细管两端以硅橡胶封口，放置于30~60℃烘箱中反应10~30h；

（3）整体柱的清洗：反应完成后，以甲醇和水充分清洗毛细管；

（4）戊二醛衍生：将含有5~20%戊二醛的磷酸缓冲溶液以5~20μL/min速率通入毛细管整体柱中，连续反应12h，然后用磷酸缓冲溶液冲洗掉残留的戊二醛；

（5）修饰适配体：将黄曲霉毒素B1适配体制成浓度为4~8nmol/L的磷酸缓冲溶液，注入毛细管整体柱中反应8~12h，重复三次，用磷酸缓冲溶液冲洗掉未反应的适配体；最后用3~8mg/ml氰基硼氢化钠冲洗整体柱6h，将制得的毛细管整体柱截取5 cm的长度用于之后的固相微萃取操作。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，用于制备整体柱的石英毛细管内径为530μm，外径为690μm。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，将25mg CTAB溶于225μL无水乙醇和100μL去离子水的混合溶液中，然后将150μL TEOS和80μL APTES快速加入上述混合溶液中。

4.一种权利要求1-3任一项所述方法制备得到的毛细管整体柱。

5.一种权利要求4所述毛细管整体柱在分离富集黄曲霉毒素B1中的应用。

6.根据权利要求5所述的毛细管整体柱的应用方法，其特征在于，步骤如下：

（1）毛细管活化：用10~20 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液平衡亲和毛细管整体柱，将亲和毛细管整体柱活化；

（2）上样：将待测样品溶液以10~100μL/min通入亲和毛细管整体柱内；

（3）清洗：待样品全部流经亲和毛细管整体柱后，用10~20 mmol/L Tris-HCl缓冲液将柱内残留和未被特异性捕获的黄曲霉毒素B1淋洗下来；

（4）洗脱：用含有40~60%甲醇的Tris-HCl 缓冲溶液将被亲和毛细管整体柱捕获的黄曲霉毒素B1洗脱。