CN105400790A

CN105400790A - 一种定量检测黄曲霉毒素b1的方法

Info

Publication number: CN105400790A
Application number: CN201510703011.0A
Authority: CN
Inventors: 郑楠; 文芳; 李松励; 张养东; 赵圣国; 王加启
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2015-10-26
Filing date: 2015-10-26
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2035-10-26
Also published as: CN105400790B

Abstract

本发明公开了一种定量检测黄曲霉毒素B₁的方法，属于黄曲霉毒素B₁的定量检测领域。本发明首先公开了黄曲霉毒素B₁的适配体及其互补DNA序列。本发明进一步公开了一种定量检测黄曲霉毒素B₁的方法，包括以下步骤：(1)制备适配体生物传感器；(2)提取待测样品中的黄曲霉毒素B₁，得到样品提取液，加入到所述适配体生物传感器中，混匀，孵育；(3)分离上清液，加入过量蔗糖溶液进行反应；(4)用血糖仪进行定量检测。本发明适配体生物传感器结合血糖仪定量检测食品中黄曲霉毒素B₁的方法，操作简便，特异性好，灵敏度高，重复再现性好，为黄曲霉毒素B₁的定量检测提供了一种新方法。

Description

一种定量检测黄曲霉毒素B1的方法

技术领域

本发明涉及定量检测黄曲霉毒素B1的方法，尤其涉及一种适配体生物传感器结合血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，属于黄曲霉毒素B1的定量检测领域。

背景技术

霉菌毒素(mycotoxins)主要是指霉菌或真菌在其所污染的食品中产生的有毒代谢产物，它们可通过饲料或食品进入人和动物体内，引起人和动物的急性或慢性毒性，损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等。常见的霉菌毒素有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2、HT-2毒素、伏马菌素等。黄曲霉毒素B1(AFB1)被世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构认定为一级致癌物，开发高灵敏的黄曲霉毒素检测方法是国际关注的重点。

适配体与抗体的性质相似，但适配体特异性更强，对目标靶分子具有更高的亲和力，更容易获得，在体外可以大量快速的合成，制备方法也更为简单，可以针对不同种类的目标物进行筛选。血糖仪是一种测量血糖水平的电子仪器，由于其体积小，成本低，操作简单，能够得到准确的定量结果，已经得到广泛应用。然而，血糖仪只能检测葡萄糖这一种物质，并且检测范围是0.6～33mmol/l(10～600mg/dl)。

目前，黄曲霉毒素B1的很多检测方法存在所需试剂多，操作繁琐，检测周期长，重现性差，设备昂贵，前处理复杂等缺点，不利于进行现场检测。因此，开发一种便携式适配体生物传感器结合血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1这种非葡萄糖物质的方法，将具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种定量检测黄曲霉毒素B1的方法，该方法应用适配体生物传感器结合血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1，具有操作简便，检出限低，特异性好，重复再现性好等优点。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了黄曲霉毒素B1的适配体，其核苷酸序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。

所述适配体的互补DNA，其核苷酸序列为SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9或SEQIDNO.10所示。

本发明进一步公开了一种定量检测黄曲霉毒素B1的方法，包括以下步骤：(1)制备适配体生物传感器；(2)提取待测样品中的黄曲霉毒素B1，得到样品提取液，加入到所述适配体生物传感器中，混匀，孵育；(3)分离上清液，加入过量蔗糖溶液进行反应；(4)用血糖仪进行定量检测。

其中，步骤(1)所述适配体生物传感器按照以下方法制备：(a)活化蔗糖酶；(b)活化所述互补DNA；(c)将步骤(a)活化后的蔗糖酶与步骤(b)活化后的互补DNA分别洗涤，然后混匀，反应合成DNA-蔗糖酶聚合物；(d)将链霉亲和素修饰的磁球链接所述黄曲霉毒素B1的适配体；(e)将步骤(c)合成的DNA-蔗糖酶聚合物洗涤后固定在步骤(d)处理的磁球上，即得。

步骤(b)所述互补DNA的3’端进行巯基修饰；步骤(d)所述黄曲霉毒素B1适配体的3’端进行生物素修饰。

步骤(a)所述活化蔗糖酶是将蔗糖酶与sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate)反应；其中，所述反应的体系包括：300-500μl20mg/ml蔗糖酶，0.5-2mgsulfo-SMCC；所述反应的条件为：先涡旋震荡5min，然后在恒温混匀仪上室温反应1-3h；

优选的，所述反应的体系包括：400μl20mg/ml蔗糖酶，1mgsulfo-SMCC；所述反应的条件为：先涡旋震荡5min，然后在恒温混匀仪上室温反应2h。

步骤(b)所述活化互补DNA是将所述互补DNA与TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphinehydrochloride)反应；其中，所述反应的体系包括：80-120μl100μM互补DNA，1-3μl0.1M缓冲液B，1-3μl30mMTCEP；所述反应的条件为：恒温混匀仪上室温反应0.5-2h；

优选的，所述反应的体系包括：100μl100μM所述互补DNA，2μl0.1M缓冲液B，2μl30mMTCEP；所述反应的条件为：恒温混匀仪上室温反应1h；所述缓冲液B包括：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，质量比为0.05％的吐温-20，pH＝7.3。

步骤(c)所述洗涤包括：将步骤(a)反应后的溶液离心，取上清液，加入到超滤管Amicon-100K，25℃、12000rcf离心10min，用缓冲液A洗涤；将步骤(b)反应后的溶液离心，取上清液，加入到超滤管Amicon-3K中，25℃、12000rcf离心10min，用缓冲液A洗涤；其中，所述缓冲液A包括：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，pH＝7.3；步骤(c)所述反应合成DNA-蔗糖酶聚合物的条件是恒温混匀仪上室温反应24-72h，优选为48h。

步骤(d)所述链接的体系包括：0.5-2ml1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球，40-80μl0.1mM所述黄曲霉毒素B1的适配体；所述链接的条件为：恒温混匀仪上室温反应0.5-2h；

优选的，步骤(d)所述链接的体系包括：1ml1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球，60μl0.1mM所述黄曲霉毒素B1的适配体；所述链接的条件为：恒温混匀仪上室温反应1h。

步骤(e)所述洗涤是将步骤(c)合成的DNA-蔗糖酶聚合物用超滤管Amicon-100K于25℃、12000rcf离心10min，用缓冲液A(所述缓冲液A包括：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，pH＝7.3)洗涤；步骤(e)所述固定是将洗涤后的DNA-蔗糖酶聚合物与步骤(d)处理的磁球混合，在恒温混匀仪上室温反应0.5-2h，优选为1h。

本发明定量检测黄曲霉毒素B1的方法中，步骤(2)将样品提取液加入适配体生物传感器中，使适配体生物传感器的终浓度为3mg/ml；所述孵育的条件为：25℃孵育30min；步骤(3)所述反应的条件为：25℃反应30min；所述分离上清液是将反应后的溶液用磁分离器分离，然后吸取上清液；步骤(4)所述定量检测是根据血糖仪的读数与黄曲霉毒素B1标准品的浓度作回归方程，将待测样品的血糖仪读数带入回归方程，计算待测样品中黄曲霉毒素B1的浓度；其中，所述待测样品包括食品。

本发明针对黄曲霉毒素B1分别合成了5条适配体序列及不同适配体序列相对应的互补DNA序列(适配体序列SEQIDNO.1，其对应的互补DNA核苷酸序列为SEQIDNO.6；适配体序列SEQIDNO.2，其对应的互补DNA核苷酸序列为SEQIDNO.7；依此类推。)；其中，SEQIDNO.5所示适配体序列与SEQIDNO.4所示序列的差异在于：SEQIDNO.5所示序列后多加12个A碱基。

本发明分别用不同的适配体序列及其互补DNA序列合成适配体生物传感器，比较不同适配体序列的血糖仪信号值。结果表明，当AFB1的浓度为25μM，SEQIDNO.1-4所示适配体序列所产生的血糖仪信号值分别为37mg/dl、35mg/dl、43mg/dl、53mg/dl；SEQIDNO.5所示适配体序列加了12个A碱基以后血糖仪的信号值为115mg/dl。可能是由于添加12个A碱基以后，适配体序列的3’端与磁球结合，增大了适配体与磁球之间的空间位置，适配体能更好的与AFB1分子结合，释放下来更多的蔗糖酶分子，血糖仪的信号值明显增加。因此，本发明黄曲霉毒素B1适配体的核苷酸序列优选为SEQIDNO.5所示，其互补DNA的核苷酸序列为SEQIDNO.10所示。

本发明适配体生物传感器结合血糖仪定量检测食品中黄曲霉毒素B1的原理包括，链霉亲和素包被的磁球与生物素修饰的适配体相结合，蔗糖酶和互补DNA相结合；将DNA-蔗糖酶聚合物通过互补DNA与适配体碱基互补配对的原则固定到磁球表面；当溶液中含有所需检测目标分子时，目标分子与适配体特异性结合，从而将DNA-蔗糖酶聚合物从磁球上释放到溶液中；用磁分离器分离溶液，释放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物能够高效水解蔗糖为葡萄糖，从而通过血糖仪进行定量检测。由于被释放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物的量能够通过葡萄糖的量来表示，并且蔗糖酶的量与样品中目标分子的量存在一定的比例关系。因此，血糖仪的读数能够被用来定量目标分子的浓度。

本发明适配体生物传感器4℃条件下能有效保存7天。

本发明对适配体生物传感器检测AFB1的过程中整个实验温度、生物传感器与目标分子的孵育时间进行了优化。结果表明，蔗糖酶的活性在25℃时实验效果更好；目标物和DNA-蔗糖酶固定的磁球孵育时间30分钟，固定在磁球上的DNA-蔗糖酶被释放的更完全。因此，本发明适配体生物传感器检测AFB1的过程中实验温度均为25℃，孵育时间为30min。

本发明运用适配体生物传感器结合血糖仪检测缓冲液中不同浓度的AFB1，结果表明随着AFB1浓度的增加，血糖仪的信号值也在逐步增加。当AFB1的浓度在2.5×10^–8M～4.0×10^-6M范围时，血糖仪的信号值有一个良好的线性关系。AFB1的最低检测限是5.9ng/ml。欧洲食品安全局规定了AFB1在食品中限量范围是0～12.0μg/kg。中国现行的GB2761-2011“食品中黄曲霉毒素的限量标准”和其他标准规定在婴幼儿谷类辅助食品中黄曲霉毒素B1的限量标准是0.5μg/kg，在玉米，花生及其制品中(花生油除外)黄曲霉毒素B1的限量是20μg/kg，在大米和食用油中限量是10μg/kg，在其他谷物、豆类、发酵食品中限量是5μg/kg。因此，本发明方法的检出限除婴幼儿辅助食品以外基本能满足检测要求。

重复实验结果表明，本发明适配体生物传感器检测黄曲霉毒素B1具有良好的重现性。特异性分析结果表明，AFB1适配体传感器除了AFB1之外不会与其他六种霉菌毒素(AFM₁、AFG₁、AFG₂、AFB₂、OTA和ZEA)特异性结合，说明本发明适配体传感器在AFB1的检测中具有良好的特异性。

本发明适配体生物传感器检测婴幼儿配方米粉中黄曲霉毒素B1，结果表明，AFB1的回收率在84.7％～118.7％，表明本发明适配体传感器可用于快速定量检测食品中的AFB1。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明开发了一种适配体生物传感器结合血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法。本发明适配体生物传感器通过其适配体特异性的识别黄曲霉毒素B1，释放生物传感器上结合的蔗糖酶分子到溶液中，蔗糖酶能够高效的水解蔗糖为葡萄糖，从而通过血糖仪进行定量检测。该方法具有操作简便，检出限低，特异性好，重复再现性好等优点，为食品中黄曲霉毒素B1的定量检测提供了一种新方法，具有良好的应用前景。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,MolCell.Probes8:91-98(1994))。

术语“适配体”意指一种经体外筛选技术得到的寡核苷酸序列(RNA或DNA)，与相应的配体有严格的识别能力和高度的亲和力，大小一般约6-40kDa。

附图说明

图1为基于适配体特异性识别目标分子的便携式生物传感器结合血糖仪检测AFB1的原理图；

图2为血糖仪检测缓冲液中AFB1以及血糖仪信号值与AFB1浓度的线性关系；

图3为血糖仪检测不同类型的霉菌毒素；其中，对照组：没有霉菌毒素；MIX1组：AFM₁、AFG₁、AFG₂、AFB₂、OTA和ZEA；MIX2组：AFM₁、AFG₁、AFG₂、AFB1、AFB₂、OTA和ZEA；

图4为血糖仪检测不同温度下缓冲液中蔗糖酶的活性；

图5为血糖仪检测不同孵育时间下缓冲液中的AFB1。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、材料与仪器

Tris(2-carboxyethyl)phosphinehydrochloride(TCEP)、Invertase(蔗糖酶)、Tween-20(吐温-20)、Sucrose(蔗糖)，来自Sigma公司；Amicon-3K、Amicon-100K，来自Millipore公司；sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate(sulfo-SMCC)，来自Thermofisher公司；链霉亲和素修饰的磁球(直径1μm)、磁分离器，来自BangsLaboratories,Inc.公司；黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品，来自国家标准物质中心；血糖仪及试纸条，来自罗氏ACCU-CHEKAvia；超纯水，来自MilliporeAdvantageA10纯水系统；恒温混匀仪，来自爱本德Thermomixercomfort型号；基因漩涡混匀器，来自IKA品牌；落地高速冷冻离心机，来自HITACHICR22G111型号；移液枪；微型离心机；水浴氮吹仪；AFB1适配体和互补DNA，生工生物工程(上海)有限公司合成，(AFB1适配体和互补DNA的修饰：对AFB1适配体3’端进行生物素修饰，互补DNA的3’端进行巯基修饰，采用高效液相色谱法进行纯化)。

缓冲液A：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，pH＝7.3；

缓冲液B：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，pH＝7.3，0.05％(质量比)吐温-20。

2M蔗糖溶液用缓冲液A进行溶解，保存在4℃。

实施例1适配体生物传感器的合成以及结合血糖仪检测黄曲霉毒素B1

1、实验方法

1.1DNA-蔗糖酶聚合物的合成

1.1.1蔗糖酶分子的活化

取400μl20mg/ml蔗糖酶(bufferB)与1mgsulfo-SMCC混合，涡旋震荡5min，放置恒温混匀仪上，室温反应2h。

1.1.2DNA分子的活化

取100μl100μM互补DNA(thiol-DNA，3’-SH-A12-CAACCCGTGCACA-5’)，2μl0.1MbufferB，2μl30mMTCEP(超纯水)加入到1.5ml离心管中，涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应1h(其中，①互补DNA的处理：将合成的固体DNA(4℃，12000rcf，5min)离心，按要求加入345μl超纯水，轻微涡旋混匀，得到345μl100μM的DNA溶液；②TCEP的配制：TCEP分子量286.65，称量8.59mg，溶于1ml的超纯水，得到1ml30mMTCEP溶液)。

1.1.3DNA-蔗糖酶聚合物的合成

将蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反应溶液离心(25℃、12000rcf、5min)，吸取上清液，分别加入到超滤管中(蔗糖酶-SMCC用Amicon-100K；thiol-DNA用Amicon-3K)，离心(25℃、12000rcf、10min)，用bufferA洗涤8次；将8次离心洗涤后的thiol-DNA和蔗糖酶-SMCC分别从超滤管中吸出，转移到1.5ml的离心管中，涡旋混匀，室温放置恒温混匀仪上反应48h。

1.2DNA-蔗糖酶在磁球上的固定

1.2.1磁球和AFB1适配体的链接

取1ml1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球(MBs)放置磁分离器上至完全澄清，吸除上清液，用bufferB洗涤2次；取60μl0.1mMAFB1适配体(5′-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-A12-biotin-3′)(超纯水)加入到磁球溶液中，轻微涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应1h，用bufferB洗涤3次。

1.2.2DNA-蔗糖酶的洗涤

将48h反应后的DNA-蔗糖酶用超过滤器Amicon-100K(25℃、12000rcf、10min)离心，用bufferA洗涤8次。

1.2.3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定

将洗涤后的DNA-蔗糖酶溶液转移到磁球-aptamer溶液中，涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应1h，用bufferB洗涤3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖酶聚合物(Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成适配体生物传感器系统。将合成的Invertase-DNA-apt-MBs均匀分散在1mlbufferB中，每份取60μl用于下一步的检测。

1.3适配体生物传感器结合血糖仪检测缓冲液中的AFB1

取20μl不同浓度(0、0.25、2、6.25、12.5、25、50、100、200、400μM)的AFB1(bufferB)溶液加入到一份Invertase-DNA-apt-MBs溶液中(用磁分离器去除buffer)，轻微涡旋混匀，充分反应30min((MBs的浓度约3mg/ml)；将上述反应后的MBs溶液，用磁分离器分离，吸取10μl上清液，加入到5μl2MSucrose(bufferB)离心管中，涡旋混匀，室温(25℃)反应30min；取5μl反应后溶液用血糖仪检测。

1.4特异性分析

为了评价所开发的适配体生物传感器的选择性，实验选择了一个对照组和6种霉菌毒素(AFM₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、OTAandZEA)以及MIX1组和MIX2组进行了检测，其中，MIX1组：AFM₁、AFG₁、AFG₂、AFB₂、OTA和ZEA；MIX2组：AFM₁、AFG₁、AFG₂、AFB1、AFB₂、OTA和ZEA；所有实验的霉菌毒素浓度为1ppm。检测步骤与上述缓冲液中AFB1的检测步骤相同。

1.5数据分析

实验数据采用Excel进行标准化处理，图表采用AdobeIllustratorCS5和Origin8.0进行作图分析。

2、实验结果

2.1适配体生物传感器检测原理

便携式生物传感器检测AFB1的原理如图1所示。

链霉亲和素包被的磁球与生物素修饰的适配体相结合，蔗糖酶和互补DNA相结合；将DNA-蔗糖酶聚合物通过互补DNA与适配体碱基互补配对的原则固定到磁球表面；当溶液中含有所需检测目标分子时，目标分子与适配体特异性结合，从而将DNA-蔗糖酶聚合物从磁球上释放到溶液中；用磁分离器分离溶液，释放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物能够高效水解蔗糖为葡萄糖，从而通过血糖仪进行定量检测。由于被释放到溶液中的DNA-蔗糖酶的量能够通过葡萄糖的量来表示，并且蔗糖酶的量与样品中目标分子的量存在一定的比例关系。因此，血糖仪的读数能够被用来定量目标分子的浓度。

2.2缓冲液中AFB1的检测

结果如图2所示，随着AFB1浓度的增加，血糖仪的信号值也在逐步增加。当AFB1的浓度在2.5×10^–8M～4.0×10^-6M范围时，血糖仪的信号值有一个良好的线性关系，线性回归方程为：y＝6.08x+1.8213，R²＝0.9958，其中x表示AFB1的浓度，y表示血糖仪示数的变化值，R是回归系数。最低检测限是5.9ng/ml。

欧洲食品安全局规定了黄曲霉毒素的最大限量值，AFB1在食品中限量范围是0～12.0μg/kg。中国现行的GB2761-2011“食品中黄曲霉毒素的限量标准”和其他标准规定在婴幼儿谷类辅助食品中黄曲霉毒素B1的限量标准是0.5μg/kg，在玉米，花生及其制品中(花生油除外)黄曲霉毒素B1的限量是20μg/kg，在大米和食用油中限量是10μg/kg，在其他谷物、豆类、发酵食品中限量是5μg/kg。因此，本发明方法的检出限除婴幼儿辅助食品以外基本能满足检测要求。

当黄曲霉毒素B1的浓度为25μM时进行3次平行重复实验，相对标准偏差在1.5％。结果表明，该方法具有良好的重现性。

此外，合成的适配体生物传感器被保存在4℃冰箱里7天，每天取出一等份用于检测实验，检测到血糖仪信号值与刚合成时的检测值没有显著差异。

2.3选择性分析

为了研究该传感器的选择性，选择了六种霉菌毒素(AFM₁、AFG₁、AFG₂、AFB₂、OTAandZEA)进行选择性实验，空白对照组(Control)不含有任何霉菌毒素，AFB1和其他霉菌毒素的浓度被设定在1ppm。结果如图3所示，空白对照组有一个较低的信号值(0.7mM)为本底值，除AFB1以外的六种单一的霉菌毒素的血糖仪检测值与空白对照组的血糖仪检测值没有明显差异，混合组1(MIX1)的血糖仪信号值略高于空白对照组信号值，但是差异不显著。AFB1和混合组2(MIX2)的血糖仪信号值明显高于空白对照组，混合组2(MIX2)的血糖仪信号值略低于AFB1组，可能由于混合毒素中某些毒素影响了AFB1与AFB1适配体的结合，导致释放的DNA-蔗糖酶的量减少，从而水解蔗糖为葡萄糖的量相应地减少，进而产生偏低的血糖仪信号值。结果表明，AFB1适配体传感器除了AFB1之外不会与其他六种霉菌毒素特异性结合。然而，其他的霉菌毒素的存在可能会干扰AFB1和适配体之间的结合反应，导致包含有AFB1的混合组2检测浓度偏低。结果表明，本发明适配体传感器在AFB1的检测中具有良好的特异性，不识别其他的霉菌毒素。

实施例2适配体生物传感器的合成

1.1DNA-蔗糖酶聚合物的合成

1.1.1蔗糖酶分子的活化

取300μl20mg/ml蔗糖酶(bufferB)与0.5mgsulfo-SMCC混合，涡旋震荡5min，放置恒温混匀仪上，室温反应1h。

1.1.2DNA分子的活化

取80μl100μM互补DNA(thiol-DNA，3’-SH-A12-CAACCCGTGCACA-5’)，1μl0.1MbufferB，1μl30mMTCEP(超纯水)加入到1.5ml离心管中，涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应0.5h。

1.1.3DNA-蔗糖酶聚合物的合成

将蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反应溶液离心(25℃、12000rcf、5min)，吸取上清液，分别加入到超滤管中(蔗糖酶-SMCC用Amicon-100K；thiol-DNA用Amicon-3K)，离心(25℃、12000rcf、10min)，用bufferA洗涤8次；将8次离心洗涤后的thiol-DNA和蔗糖酶-SMCC分别从超滤管中吸出，转移到1.5ml的离心管中，涡旋混匀，室温放置恒温混匀仪上反应24h。

1.2DNA-蔗糖酶在磁球上的固定

1.2.1磁球和AFB1适配体的链接

取0.5ml1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球(MBs)放置磁分离器上至完全澄清，吸除上清液，用bufferB洗涤2次；取40μl0.1mMAFB1适配体(5′-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-A12-biotin-3′)(超纯水)加入到磁球溶液中，轻微涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应0.5h，用bufferB洗涤3次。

1.2.2DNA-蔗糖酶的洗涤

将反应后的DNA-蔗糖酶用超过滤器Amicon-100K(25℃、12000rcf、10min)离心，用bufferA洗涤8次。

1.2.3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定

将洗涤后的DNA-蔗糖酶溶液转移到磁球-aptamer溶液中，涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应0.5h，用bufferB洗涤3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖酶聚合物(Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成适配体生物传感器系统。

实施例3适配体生物传感器的合成

1.1DNA-蔗糖酶聚合物的合成

1.1.1蔗糖酶分子的活化

取500μl20mg/ml蔗糖酶(bufferB)与2mgsulfo-SMCC混合，涡旋震荡5min，放置恒温混匀仪上，室温反应3h。

1.1.2DNA分子的活化

取120μl100μM互补DNA(thiol-DNA，3’-SH-A12-CAACCCGTGCACA-5’)，3μl0.1MbufferB，3μl30mMTCEP(超纯水)加入到1.5ml离心管中，涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应2h。

1.1.3DNA-蔗糖酶聚合物的合成

将蔗糖酶-SMCC和thiol-DNA的反应溶液离心(25℃、12000rcf、5min)，吸取上清液，分别加入到超滤管中(蔗糖酶-SMCC用Amicon-100K；thiol-DNA用Amicon-3K)，离心(25℃、12000rcf、10min)，用bufferA洗涤8次；将8次离心洗涤后的thiol-DNA和蔗糖酶-SMCC分别从超滤管中吸出，转移到1.5ml的离心管中，涡旋混匀，室温放置恒温混匀仪上反应72h。

1.2DNA-蔗糖酶在磁球上的固定

1.2.1磁球和AFB1适配体的链接

取2ml1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球(MBs)放置磁分离器上至完全澄清，吸除上清液，用bufferB洗涤2次；取80μl0.1mMAFB1适配体(5′-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-A12-biotin-3′)(超纯水)加入到磁球溶液中，轻微涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应2h，用bufferB洗涤3次。

1.2.2DNA-蔗糖酶的洗涤

1.2.3DNA-蔗糖酶在磁球上的固定

将洗涤后的DNA-蔗糖酶溶液转移到磁球-aptamer溶液中，涡旋混匀，放置恒温混匀仪上，室温反应2h，用bufferB洗涤3-4次；得到DNA-磁球-蔗糖酶聚合物(Invertase-DNA-apt-MBs)，即合成适配体生物传感器系统。

实验例1适配体生物传感器反应条件的优化

1、实验方法

1.1反应温度的优化

对应用实施例1开发的适配体生物传感器检测AFB1的实验过程中整个实验温度进行优化。

因为固定DNA-蔗糖酶到磁球上是通过DNA分子杂交完成的，它们之间的亲和力跟温度有关，从而直接影响AFB1的检测。此外，蔗糖酶的活性与温度也有很大关系。本实验选择了两个最常用实验温度4℃和25℃，AFB1的浓度为12.5μM，孵育时间为30min，反应时间为0、1h、2h、3h、4h、5h。蔗糖酶水解蔗糖成葡萄糖，然后通过血糖仪定量检测。

1.2孵育时间的优化

生物传感器与目标分子的孵育时间是非常重要的，直接关系到释放的DNA-蔗糖酶的量。因此，在AFB1存在的情况下，对DNA-蔗糖酶释放的动力学进行了研究。将含有AFB1的样品溶液与AFB1的适配体传感器进行混合，在不同浓度下(6.25、12.5、25、50、100、200、400μM的AFB1)，固定在磁球上的DNA-蔗糖酶在不同的时间里(15、30min)被磁性分离，然后与蔗糖溶液混合相同的时间(30min)，水解蔗糖成葡萄糖，通过血糖仪定量检测。

2、实验结果

2.1反应温度的优化

结果如图4所示，当与蔗糖溶液在25℃孵育时，血糖仪的信号值快速增加，基本成一个稳定的线性关系；当与蔗糖溶液在4℃孵育时，血糖仪的信号值在一个较低的水平，表明酶的活性很低，被水解的蔗糖的量较少。因此，从实验结果来看蔗糖酶的活性在25℃时实验效果更好。本发明确定整个实验温度均为25℃。

2.2孵育时间的优化

结果如图5所示，在每个浓度下，孵育30分钟的血糖仪检测值都明显高于孵育15分钟的检测值，说明孵育30分钟时，固定在磁球上的DNA-蔗糖酶被释放的更完全。为了保证实验中DNA-蔗糖酶更有效的释放，实验过程中选择将目标物和DNA-蔗糖酶固定的磁球孵育时间设定在30分钟。

实验例2适配体序列的筛选

本发明分别合成了以下适配体序列：

序列1：

5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGTGCTATCATGCGCTCAATGG

-biotin-3’；

序列2：

5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGTATCGTACGCCAAAGTCCCGTAAACACTACTTA-biotin-3’；

序列3：

5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGTCTAAATGACACCTTTTCAACC-biotin-3’；

序列4：

5′-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-biotin-3′；

序列5：

5′-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-AAAAAAAAAAAA-biotin-3′；

互补DNA序列：

互补序列1:5’-CCTCTGTGCTGCT-3’；

互补序列2:5’-CCTCTGTGCTGCT-3’；

互补序列3:5’-CCTCTGTGCTGCT-3’；

互补序列4:5’-ACACGTGCCCAAC-3’；

互补序列5:5’-ACACGTGCCCAAC-AAAAAAAAAAAA-3’。

适配体序列1的互补DNA序列对应互补序列1；适配体序列2的互补DNA序列对应互补序列2；依此类推，互补DNA的3’端进行巯基修饰。

分别按照实施例1相同的实验操作合成适配体生物传感器，用血糖仪检测含有25μM的AFB1的溶液，比较不同适配体序列的血糖仪信号值。

结果表明，适配体序列1-4没有添加12个A碱基，当AFB1的浓度为25μM，适配体1-4所产生的血糖仪信号值分别为37mg/dl、35mg/dl、43mg/dl、53mg/dl；序列5比序列4加了12个A碱基以后血糖仪的信号值为115mg/dl。可能是由于添加12个A碱基以后，适配体序列的3’端与磁球结合，增大了适配体与磁球之间的空间位置，适配体能更好的与AFB1分子结合，释放下来更多的蔗糖酶分子，血糖仪的信号值明显增加。所以，实验选择添加12个A碱基，来增强血糖仪的信号值。

实验例3实际样品的检测

将实施例1所开发的适配体生物传感器应用于婴幼儿配方米粉(宝贝营养配方米粉)中黄曲霉毒素B1的检测。

1、实验方法

1.1样品前处理

称取3份配方米粉，每份0.5g，分别添加500μl不同浓度(0ppb、15ppb、50ppb)的AFB1，再加入2.5ml的甲醇水(甲醇含量为70％)。将整个混合物进行涡旋震荡5min，然后离心(10000rcf、10min、4℃)。取上清液，进行氮吹浓缩至0.5ml，最后将残留物用2.5ml的甲醇水(甲醇5％)进行重新溶解后检测。

1.2数据分析

2、实验结果

为了验证实施例1所开发的适配体生物传感器在实际检测中的应用，选取从市场上购买的婴幼儿配方米粉进行加标实验。添加0ppbAFB1的作为本底值，不同浓度(50nM、160nM)(AFB1的分子量为312.27，因此15ppb、和50ppb也即是50nM和160nM)的AFB1标准溶液被加入到婴幼儿米粉中，按照上述的前处理方法进行处理和检测。结果如表1所示，AFB1的回收率在84.7％～118.7％。实验结果表明，该适配体传感器可用于快速定量检测食品中的AFB1。

表1适配体传感器结合血糖仪检测婴幼儿米粉中的黄曲霉毒素B1

婴幼儿米粉样品稀释10倍后进行检测。

Claims

1.黄曲霉毒素B₁的适配体，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。

2.权利要求1所述适配体的互补DNA，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9或SEQIDNO.10所示。

3.一种定量检测黄曲霉毒素B₁的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备适配体生物传感器；(2)提取待测样品中的黄曲霉毒素B₁，得到样品提取液，加入到所述适配体生物传感器中，混匀，孵育；(3)分离上清液，加入过量蔗糖溶液进行反应；(4)用血糖仪进行定量检测。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述适配体生物传感器按照以下方法制备：

(a)活化蔗糖酶；(b)活化权利要求2所述互补DNA；(c)将步骤(a)活化后的蔗糖酶与步骤(b)活化后的互补DNA分别洗涤，然后混匀，反应合成DNA-蔗糖酶聚合物；(d)将链霉亲和素修饰的磁球链接权利要求1所述黄曲霉毒素B₁的适配体；(e)将步骤(c)合成的DNA-蔗糖酶聚合物洗涤后固定在步骤(d)处理的磁球上，即得。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(b)所述互补DNA的3’端进行巯基修饰；步骤(d)所述黄曲霉毒素B₁适配体的3’端进行生物素修饰。

6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(a)所述活化蔗糖酶是将蔗糖酶与sulfo-SMCC反应；

其中，所述反应的体系包括：300-500μl20mg/ml蔗糖酶，0.5-2mgsulfo-SMCC；所述反应的条件为：先涡旋震荡5min，然后在恒温混匀仪上室温反应1-3h；

7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(b)所述活化互补DNA是将权利要求2所述互补DNA与TCEP反应；

其中，所述反应的体系包括：80-120μl100μM权利要求2所述互补DNA，1-3μl0.1M缓冲液B，1-3μl30mMTCEP；所述反应的条件为：恒温混匀仪上室温反应0.5-2h；

优选的，所述反应的体系包括：100μl100μM权利要求2所述互补DNA，2μl0.1M缓冲液B，2μl30mMTCEP；所述反应的条件为：恒温混匀仪上室温反应1h；

所述缓冲液B包括：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，质量比为0.05％的吐温-20，pH＝7.3。

8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(c)所述洗涤包括：将步骤(a)反应后的溶液离心，取上清液，加入到超滤管Amicon-100K，25℃、12000rcf离心10min，用缓冲液A洗涤；

将步骤(b)反应后的溶液离心，取上清液，加入到超滤管Amicon-3K中，25℃、12000rcf离心10min，用缓冲液A洗涤；

其中，所述缓冲液A包括：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠，pH＝7.3；

步骤(c)所述反应合成DNA-蔗糖酶聚合物的条件是恒温混匀仪上室温反应24-72h，优选为48h。

9.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(d)所述链接的体系包括：0.5-2ml1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球，40-80μl0.1mM权利要求1所述黄曲霉毒素B₁的适配体；所述链接的条件为：恒温混匀仪上室温反应0.5-2h；

优选的，步骤(d)所述链接的体系包括：1ml1mg/ml链霉亲和素修饰的磁球，60μl0.1mM权利要求1所述黄曲霉毒素B₁的适配体；所述链接的条件为：恒温混匀仪上室温反应1h；

步骤(e)所述洗涤是将步骤(c)合成的DNA-蔗糖酶聚合物用超滤管Amicon-100K于25℃、12000rcf离心10min，用缓冲液A洗涤；

步骤(e)所述固定是将洗涤后的DNA-蔗糖酶聚合物与步骤(d)处理的磁球混合，在恒温混匀仪上室温反应0.5-2h，优选为1h。

10.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)将样品提取液加入适配体生物传感器中，使适配体生物传感器的终浓度为3mg/ml；所述孵育的条件为：25℃孵育30min；

步骤(3)所述反应的条件为：25℃反应30min；

步骤(4)所述定量检测是根据血糖仪的读数与黄曲霉毒素B₁标准品的浓度作回归方程，将待测样品的血糖仪读数带入回归方程，计算待测样品中黄曲霉毒素B₁的浓度；

所述待测样品包括食品。