CN110885459B - 一种黄曲霉毒素b1刺激响应的双交联水凝胶的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶的制备方法，其是将两种带氨基的DNA单链SA和SB分别与透明质酸溶液混合后，组装形成两种模块结构，再与信号分子和适配体链混合，利用适配体链触发两种模块结构发生杂交链反应，形成单交联水凝胶；再利用聚乙烯亚胺与单交联水凝胶上剩余的羧基反应，以形成三维网状结构的双交联水凝胶。当环境中存在黄曲霉毒素B1时，其能将水凝胶中的适配体链竞争出来，导致水凝胶瓦解，从而可使包埋在水凝胶中的信号分子释放出来，以实现对黄曲霉毒素B1的定量检测。本发明原理简单，所得水凝胶化学稳定性好，有望在食品安全分析上得到广泛的应用。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶的制备方法及应用，其可用于黄曲霉毒素B1的检测。
背景技术
水凝胶是一类能够在水中溶胀并且具有高含水量的高分子聚合物材料。该材料通过高分子链之间的作用力（如分子间静电作用、氢键等作用力）或化学键形成三维网状结构。研究表明一些水凝胶能感知外界环境刺激，如pH值、温度、离子强度、压力、光、电、待测目标物等微小变化，导致水凝胶结构、能量状态等发生变化并产生一定的信号响应。基于高分子水凝胶对外界环境的敏感性，研究者们设计了许多功能化刺激响应型高分子水凝胶材料，构建了目标物刺激响应的传感器，实现了金属离子、生物大分子和细胞等物质分析检测。
透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种天然聚阴离子粘多糖，是由D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖重复构成的直链结构双糖，其亲水性良好，极易吸潮，具有良好的流动性与润滑性，同时具有高度的粘弹性与假塑性，在临床医学上得到了广泛应用。透明质酸分子结构中含有大量的伯、仲羟基，羧基，因此可以与其他单体通过物理或化学交联的形式形成具有网络结构的高分子聚合物材料，其中透明质酸水凝胶是最常见的透明质酸基高分子材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶的制备方法及应用，其可用于食品、环境中黄曲霉毒素B1的高灵敏检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
（1）按固液比1g:100mL的量将透明质酸溶解于超纯水中，然后对其进行超声处理，以除去溶液中悬浮的气泡，制得透明质酸溶液；
（2）取两份透明质酸溶液，在其中加入体积比为1:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），37 ℃下活化处理15 min后，分别加入带氨基的DNA单链SA和SB，孵育6~12 h后分别制得DNA单链含量均为100μM的SA溶液和SB溶液；
（3）将信号分子水溶液（其中信号分子的含量为1~20 nM）、适配体链水溶液（其中适配体链的含量为300μM）与SA溶液、SB溶液按体积比(1~3):(1~2):(3~5):(3~5)混合，在37℃下孵育4h进行杂交链反应，以形成三维网状的单交联水凝胶；
（4）将单交联水凝胶经二次活化后，加入所用透明质酸质量10%的聚乙烯亚胺混合均匀，制得水凝胶；
（5）将制得的水凝胶用水洗涤3次，去除未聚合的适配体链和聚乙烯亚胺以及多余的信号分子，制得所述黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶。
步骤（2）中DNA单链SA的序列为5 ́-NH2-TTTTGTGGGCCTAGCGA-3 ́，DNA单链SB的序列为5 ́-NH2-TTTACACGTGCCCAAC-3 ́；
步骤（3）中所用信号分子可为铂纳米颗粒、金纳米颗粒、脲酶等；所用适配体链的序列为5 ́-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3 ́。
步骤（5）洗涤处理的水凝胶用滤纸吸干游离的水分。
透明质酸的分子链上含有大量羧基，能与带氨基的DNA单链通过酰胺键相连，加入适配体链可触发透明质酸形成单交联水凝胶，而聚乙烯亚胺与透明质酸分子链上剩余的羧基反应，形成双交联水凝胶。
本发明所得双交联水凝胶可用于黄曲霉毒素B1的检测，其检测原理是将含有黄曲霉毒素B1的待检测物加入到所述双交联水凝胶中，利用黄曲霉毒素B1的刺激将水凝胶中的适配体竞争置换出来，使水凝胶瓦解，导致包埋在水凝胶中的信号分子释放出来，从而利用释放出的信号分子间接定量检测待检测物中黄曲霉毒素B1的含量。
本发明的显著优点在于：
本发明制备过程简单，无需先进的仪器，其所制得的双交联水凝胶性能稳定且可用于黄曲霉毒素B1的检测，该材料释放过程重现性良好、稳定，在样品检测、食品安全分析等具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备方法的原理示意图。
图2为本发明中三条DNA链的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图3为本发明中反映黄曲霉毒素B1含量与排出水量之间关系的标准曲线图。
具体实施方式
如图1所示，一种黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶的制备方法包括以下步骤：
（1）按固液比1 g:100 mL的量将透明质酸溶解于超纯水中，然后对其进行超声处理，以除去溶液中悬浮的气泡，制得透明质酸溶液；
（2）取两份透明质酸溶液，在其中加入体积比为1:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），37 ℃下活化处理15 min后，分别加入带氨基的DNA单链SA和SB，孵育6~12 h后分别制得DNA单链含量均为100μM的SA溶液和SB溶液；
（3）将信号分子水溶液（其中信号分子的含量为1~20 nM）、适配体链水溶液（其中适配体链的含量为300μM）与SA溶液、SB溶液按体积比(1~3):(1~2):(3~5):(3~5)混合，在37℃下孵育4h进行杂交链反应，以形成三维网状的单交联水凝胶；
（4）将单交联水凝胶经二次活化后，加入所用透明质酸质量10%的聚乙烯亚胺混合均匀，制得水凝胶；
（5）将制得的水凝胶用水洗涤3次，去除未聚合的适配体链和聚乙烯亚胺以及多余的信号分子，制得所述黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶。
步骤（2）中DNA单链SA的序列为5 ́-NH2-TTTTGTGGGCCTAGCGA-3 ́，DNA单链SB的序列为5 ́-NH2-TTTACACGTGCCCAAC-3 ́；
步骤（3）中所用信号分子可为铂纳米颗粒、金纳米颗粒、脲酶等；所用适配体链的序列为5 ́-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3 ́。
步骤（5）洗涤处理的水凝胶用滤纸吸干游离的水分。
本发明所得双交联水凝胶可用于黄曲霉毒素B1的检测，其检测原理是将含有黄曲霉毒素B1的待检测物加入到所述双交联水凝胶中，利用黄曲霉毒素B1的刺激将水凝胶中的适配体竞争置换出来，使水凝胶瓦解，导致包埋在水凝胶中的信号分子释放出来，从而通过检测释放出的信号分子间接定量检测待检测物中黄曲霉毒素B1的含量。
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
实验例1
一种黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶的制备方法，其包括如下步骤：
（1）将0.003 g透明质酸溶解于300 μL超纯水中，然后通过漩涡混匀器将透明质酸完全溶解后，再对其进行超声处理，以去除溶液中悬浮的气泡，制得透明质酸溶液；
（2）取两份制备好的透明质酸溶液，往其中加入EDC（50 μL，28.8 mg）和NHS（50 μL，5.8 mg），在37 ℃下活化15 min后，分别在两份溶液中加入带氨基的DNA单链SA和SB，37℃下孵育12 h，制得DNA单链含量均为100μM的SA溶液和SB溶液；
（3）取3 μL溶液SA、3 μL溶液SB、2 μL铂纳米颗粒(6.2 nM)和1 μL适配体链（300 μM）混合于200 μL离心管中，在37 ℃下孵育4 h，触发适配体链和SA、SB发生杂交链反应，以形成三维网状的单交联水凝胶；
（4）将水凝胶加入1 μL EDC（96mg/mL）和1 μL NHS（19mg/mL）中，在37 ℃下活化15min后，加入所含透明质酸质量10%的聚乙烯亚胺混合均匀，在37 ℃下孵育12 h，制得双交联水凝胶；
（5）将制得的水凝胶用超纯水洗涤3次，去除未聚合的适配体链和聚乙烯亚胺以及多余的信息分子后，用滤纸对其表面进行水份吸干，即可制得黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶。
为了直观表征DNA单链SA、DNA单链SB以及适配体的结合，选用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行验证实验。所有DNA序列的终浓度设定为1.0 μM。反应溶液与100×Super Green和loading buffer充分混合后，于室温下避光反应15 min，然后将上述溶液加入到制备好的凝胶电泳系统中。电泳所用的电解液为0.5×Tris-Borate-EDTA(TBE)缓冲液，施加电压80 V，时间 2.5 h。待电泳完成后，将凝胶转移到凝胶成像仪中进行拍照处理。图2为三条DNA链的聚丙烯酰胺凝胶电泳，从F泳道可以看出三条链成功杂交。
实验例2
一种黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶的制备方法，其包括如下步骤：
（1）将0.003 g透明质酸溶解于300 μL超纯水中，然后通过漩涡混匀器将透明质酸完全溶解后，再对其进行超声处理，以去除溶液中悬浮的气泡，制得透明质酸溶液；
（2）取制备好的两份透明质酸溶液，往其中加入EDC（50 μL，28.8 mg）和NHS（50 μL，5.8 mg），在37 ℃下活化15 min后，分别在两份溶液中加入带氨基的DNA单链SA和SB，37℃下孵育12 h，制得DNA单链含量均为100μM的SA溶液和SB溶液；
（3）取3 μL溶液SA、3 μL溶液SB、2 μL铂纳米颗粒(6.2 nM)和1 μL适配体链（300 μM）混合于200 μL离心管中，在37 ℃下孵育4 h，触发适配体链和SA、SB发生杂交链反应，以形成三维网状的单交联水凝胶；
（4）将水凝胶加入1 μL EDC（96 mg/mL）和1 μL NHS（19 mg/mL）中，在37 ℃下活化15 min后，加入所含透明质酸质量10%的聚乙烯亚胺混合均匀，在37 ℃下孵育4 h，制得双交联水凝胶；
（5）将制得的水凝胶用超纯水洗涤3次，去除未聚合的适配体链和聚乙烯亚胺以及多余的信息分子后，用滤纸对其表面进行水份吸干，即可制得黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶。
样品测试
将50 μL不同浓度的（1、2.5、5、7.5、10、15、20μM）黄曲霉毒素B1标准溶液加入到实施例1制得的双交联水凝胶（即HA-DNA-PEI水凝胶）中，通过漩涡混匀器将二者充分混匀，然后放置在室温中孵育。此时，黄曲霉毒素B1与水凝胶产生竞争反应，即水凝胶中的适配体链与黄曲霉毒素B1发生反应，导致HA-DNA-PEI水凝胶结构瓦解，释放信号分子。孵育完成后，使用移液枪将上清液移取出来，转移到排水装置内瓶中（排水装置由一个含有1mL H2O2的5mL敞口内瓶、一个装水的10mL密闭外瓶以及一个从外瓶底部通向外部的导管组成），利用上清液中含有的铂纳米颗粒催化H2O2(催化时间为30min)产生O2，以使排水装置内压力增大，从而使外瓶中的水分排除，通过对排出水量的测定，即可计算获得黄曲霉毒素B1的含量。结果如图3所示，其所得线性方程为Y=113.34x+142.56 (R2 =0.9959)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的等效变化，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶的制备及应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 1
<400> 1
ttttgtgggc ctagcga 17
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 2
<400> 2
tttacacgtg cccaac 16
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 3
<400> 3
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50
Claims (7)
1.一种黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）按固液比1g:100mL的量将透明质酸溶解于超纯水中，经超声处理制得透明质酸溶液；
（2）将两份透明质酸溶液活化后，分别加入带氨基的DNA单链SA和SB，经孵育后分别制得SA溶液和SB溶液；
（3）将信号分子水溶液、适配体链水溶液与SA溶液和SB溶液混合进行杂交链反应，以形成三维网状的单交联水凝胶；
（4）将单交联水凝胶经二次活化后，加入聚乙烯亚胺混合均匀，制得水凝胶；
（5）将制得的水凝胶洗涤去除未聚合的适配体链和聚乙烯亚胺以及多余的信号分子，制得所述黄曲霉毒素B1刺激响应的双交联水凝胶；
其中，DNA单链SA的序列为5 ́-NH2-TTTTGTGGGCCTAGCGA-3 ́，DNA单链SB的序列为5 ́-NH2-TTTACACGTGCCCAAC-3；
步骤（4）中所用聚乙烯亚胺的质量为透明质酸用量的10%。
2. 根据权利要求1所述的双交联水凝胶的制备方法，其特征在于：所述活化是加入体积比为1:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，在37 ℃下处理15 min。
3.根据权利要求1所述的双交联水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（2）所得SA溶液、SB溶液中带氨基的DNA单链SA、SB的含量均为100μM。
4. 根据权利要求1所述的双交联水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中孵育时间为6~12 h。
5. 根据权利要求1所述的双交联水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所用信号分子包括铂纳米颗粒、金纳米颗粒或脲酶；所用适配体链的序列为5 ́-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3 ́。
6. 根据权利要求1所述的双交联水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（3）中信号分子水溶液、适配体链水溶液与SA溶液、SB溶液的体积比为(1~3):(1~2):(3~5):(3~5)；所述信号分子水溶液中信号分子的含量为1~20 nM；所述适配体链水溶液中适配体链的含量为300μM。
7. 根据权利要求1所述的双交联水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述杂交链反应是在37 ℃下反应4h。
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