CN113663127A - 一种纳米复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种纳米复合水凝胶及其制备方法和应用，所述纳米复合水凝胶包括如下组分：天然高分子聚合物和天然交联剂形成的网状结构以及分布在所述网状结构中的纳米硅酸盐。本发明所述纳米复合水凝胶不仅具有生物兼容性好和细胞毒性低的优点，还由于纳米硅酸盐的引入使纳米复合水凝胶的机械性能得到提升，还兼具优异的矿化基质形成能力、优异的生物活性、显著的促进细胞增殖和分化和上调骨形成的能力，所述纳米复合水凝胶综合性能优异，在组织工程实际应用中具有很好的前景。

Description

一种纳米复合水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种纳米复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
纳米复合水凝胶是新兴的生物材料，可用于多种组织工程。由于其与天然组织的结构相似性，水凝胶能够模拟细胞外基质的某些物理和化学性质。天然衍生的高分子聚合物，明胶(gelatin)和壳聚糖(chitosan)，因其具有提供细胞结合的基序、生物降解性和与复杂生物功能分子结合的能力，被广泛用于组织工程。同时，由于明胶和壳聚糖具有较多的活性基团，能够与其他分子反应而聚合成胶。
CN102399370A公开了一种壳聚糖聚合物及其制备方法，其公开的壳聚糖聚合物是一种能够作为医学生物工程支架及携载活性生长因子的载体的壳聚糖聚合物，其公开的壳聚糖聚合物所用原材料包括：天然壳聚糖粉、明胶粉、京尼平溶液、甘油-2-磷酸二钠粉剂。其公开的制备方法具体包括合成前原材料的准备阶段和合成阶段；在壳聚糖聚合物的合成阶段中使天然壳聚糖分别与京尼平和甘油-2-磷酸二钠实现化学交链和离子交联，从而获得凝胶状的壳聚糖聚合物。其公开的制备方法操作过程简单，所用材料天然无毒，来源方便，并且所生产的壳聚糖聚合物稳定性好，可作为医学生物工程支架及携载活性生长因子的载体。但是其公开的壳聚糖聚合物矿化基质形成能力相对有限。
CN102942660A公开了一种天然生物交联的纳米复合三维凝胶支架及制备方法，其公开的纳米复合三维凝胶支架含有丙烯酰胺类单体M1、无机纳米粘土M2、生物高分子M3和生物交联剂京尼平M4，四者用量的质量百分比为：(55-90):(7-25):(3-20):(0-5)。其公开的制备方法是在水溶液中以M2作为M1的交联剂，M4作为M3的交联剂，采用原位自由基聚合和相分离冷冻干燥法制备生物相容性和力学性能优异的纳米复合三维凝胶支架。其公开的制备方法操作简便可控，无需大型设备，水相反应无毒无害，不污染环境。生物交联剂的引入提高了支架的机械强度，细胞可在支架内外部分生长和增殖，为组织再生提供良好的微环境。其公开的纳米复合三维凝胶支架可用于医用移植、药物释放和细胞培养。但是其公开的纳米复合三维凝胶支架含有丙烯酰胺类单体，虽然丙烯酰胺类单体聚合形成的聚合物网络生物安全性也非常高，但是残留的一些没有聚合的单体对生物具有一定的毒性。
因此，开发一种反应条件比较温和，并且具有优异的生物活性、矿化基质形成能力、显著的促细胞增殖和分化和上调骨形成的能力的天然聚合物水凝胶，在组织工程实际应用中至关重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米复合水凝胶及其制备方法和应用，所述纳米复合水凝胶具有优异的生物活性、矿化基质形成能力、显著的促细胞增殖和分化和上调骨形成的能力。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种纳米复合水凝胶，所述纳米复合水凝胶包括如下组分：天然高分子聚合物和天然交联剂形成的网状结构以及分布在所述网状结构中的纳米硅酸盐。
本发明所述纳米复合水凝胶是由天然高分子聚合物和天然交联剂形成的网状结构以及分布在所述网状结构中的纳米硅酸盐形成。天然高分子聚合物具有生物兼容性好、可降解性、与复杂生物功能分子结合的能力和促进细胞粘附等优点；天然交联剂具有更高的生物兼容性和更低的细胞毒性；纳米硅酸盐的引入赋予了水凝胶多种功能。因其独特的晶体结构和带电荷的表面以及其降解产物为能够较快被身体吸收的镁离子、原硅酸以及锂离子，所以纳米硅酸盐同时可以提升水凝胶的机械性能、矿化基质形成的能力、以及促进细胞增殖、分化和上调骨形成的能力；三者相互配合，使所得纳米复合水凝胶综合性能优异，能很好地应用于组织工程中。
优选地，所述天然高分子聚合物包括壳聚糖和明胶的组合。
优选地，所述天然交联剂包括京尼平。
优选地，所述天然高分子聚合物在纳米复合水凝胶的质量百分数为0.5％-19％，例如1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％等。
优选地，所述壳聚糖在纳米复合水凝胶的质量百分数为0.5％-4％，例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％等。
优选地，所述明胶在纳米复合水凝胶的质量百分数为5％-15％，例如6％、8％、10％、12％、14％等。
优选地，所述纳米硅酸盐在纳米复合水凝胶的质量百分数为0.1％-2％，例如0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％等，优选0.5％-1％。
优选地，所述天然交联剂在纳米复合水凝胶的质量百分数为0.01％-0.03％，例如0.012％、0.014％、0.016％、0.018％、0.02％、0.022％、0.024％、0.026％、0.028％等。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的纳米复合水凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将天然高分子聚合物配制成溶液，再将天然高分子聚合物溶液与天然交联剂、纳米硅酸盐混合，静置，得到所述纳米复合水凝胶。
优选地，所述天然高分子聚合物溶液的制备方法包括：将明胶与壳聚糖溶液混合，溶解，得到所述天然高分子聚合物溶液。
优选地，所述溶解的温度为50-70℃，例如52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃等。
优选地，所述天然高分子聚合物溶液的制备方法还包括：在所述溶解之后补充去离子水，得到与所述壳聚糖溶液体积相同的天然高分子聚合物溶液。
优选地，所述壳聚糖溶液的溶剂包括去离子水和乙酸的组合。
优选地，所述壳聚糖溶液的制备方法包括：将壳聚糖溶解于去离子水和乙酸中，溶解过程中补充去离子水，保持溶液体积与初始去离子水体积相同，得到所述壳聚糖溶液。
优选地，所述壳聚糖溶解的温度为50-70℃，例如52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃等。
优选地，所述静置的温度为35-45℃，例如36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃等。
优选地，所述静置的时间为30-40小时，例如31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时等。
作为优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将壳聚糖在50-70℃下溶解于去离子水和乙酸中，溶解过程中补充去离子水，保持溶液体积与初始去离子水体积相同，得到所述壳聚糖溶液；
(2)将明胶在50-70℃下溶于步骤(1)所述壳聚糖溶液中，补充去离子水，得到与壳聚糖溶液体积相同的天然高分子聚合物溶液；
(3)将纳米硅酸盐溶于步骤(2)所述天然高分子聚合物溶液中；
(4)将天然交联剂加入步骤(3)所得溶液中，混匀；
(5)将步骤(4)所得溶液在35-45℃的温度下静置30-40小时，得到所述纳米复合水凝胶。
第三方面，本发明提供一种第一方面所述的纳米复合水凝胶在组织工程中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所述纳米复合水凝胶不仅具有生物兼容性好和细胞毒性低的优点，还由于纳米硅酸盐的引入使纳米复合水凝胶的机械性能得到提升，还兼具优异的矿化基质形成能力、优异的生物活性、显著的促进细胞增殖和分化和上调骨形成的能力，所述纳米复合水凝胶综合性能优异，可用于组织工程。本发明所述纳米复合水凝胶的模量在3.85kPa以上，平衡含水量在94.54％以上，3天生物相容性在0.60OD以上，7天生物相容性在0.79OD以上，3天ALP活性在1.09U/mg-prot以上，7天ALP活性在1.47U/mg-prot以上。
附图说明
图1是实施例1所述纳米复合水凝胶的结构示意图；
图2是实施例2所述纳米复合水凝胶3天时的荧光染色图；
图3是实施例2所述纳米复合水凝胶7天时的荧光染色图；
图4是实施例1所述纳米复合水凝胶3天时的荧光染色图；
图5是实施例1所述纳米复合水凝胶7天时的荧光染色图；
图6是实施例3所述纳米复合水凝胶3天时的荧光染色图；
图7是实施例3所述纳米复合水凝胶7天时的荧光染色图；
图8是实施例4所述纳米复合水凝胶3天时的荧光染色图；
图9是实施例4所述纳米复合水凝胶7天时的荧光染色图；
图10是实施例1、3和4所述纳米复合水凝胶Mg2+的释放浓度随时间的变化图；
图11是实施例1、3和4所述纳米复合水凝胶Si4+的释放浓度随时间的变化图；
其中，1-京尼平；2-纳米硅酸盐；3-壳聚糖；4-明胶。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种纳米复合水凝胶，具体结构示意图如图1所示，所述纳米复合水凝胶包括壳聚糖3、明胶4、纳米硅酸盐2、京尼平1和去离子水。
所述壳聚糖购于sigma-aldrich，牌号为448869，在纳米复合水凝胶的质量百分数为4％；
所述明胶购于sigma-aldrich，牌号为V900863，在纳米复合水凝胶的质量百分数为10％；
所述纳米硅酸盐购于BYK，牌号为53320-86-8，在纳米复合水凝胶的质量百分数为0.5％；
所述京尼平购于麦克林，牌号为G810337，在纳米复合水凝胶的质量百分数为0.02％。
上述纳米复合水凝胶的制备方法包括如下步骤：
(1)将壳聚糖在60℃下溶解于去离子水，加入1％乙酸，溶解过程中补充去离子水，保持溶液体积与初始去离子水体积相同，得到所述壳聚糖溶液；
(2)将明胶在60℃下溶于步骤(1)所述壳聚糖溶液中，补充去离子水，得到与壳聚糖溶液体积相同的天然高分子聚合物溶液；
(3)将纳米硅酸盐溶于步骤(2)所述天然高分子聚合物溶液中；
(4)将天然交联剂加入步骤(3)所得溶液中，混匀；
(5)将步骤(4)所得溶液在37℃的温度下静置36小时，得到所述纳米复合水凝胶。
实施例2-4
实施例2-4与实施例1的区别在于纳米硅酸盐在纳米复合水凝胶中的质量百分数分别为0％、1％和2％，其余均与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供一种纳米复合水凝胶，所述纳米复合水凝胶包括壳聚糖、明胶、纳米硅酸盐、京尼平和去离子水。
所述壳聚糖购于sigma-aldrich，牌号为448869，在纳米复合水凝胶的质量百分数为2％；
所述明胶购于sigma-aldrich，牌号为V900863，在纳米复合水凝胶的质量百分数为5％；
所述纳米硅酸盐购于BYK，牌号为53320-86-8，在纳米复合水凝胶的质量百分数为1％；
所述京尼平购于麦克林，牌号为G810337，在纳米复合水凝胶的质量百分数为0.03％。
上述纳米复合水凝胶的制备方法包括如下步骤：
(1)将壳聚糖在50℃下溶解于去离子水，加入1％乙酸，溶解过程中补充去离子水，保持溶液体积与初始去离子水体积相同，得到所述壳聚糖溶液；
(2)将明胶在70℃下溶于步骤(1)所述壳聚糖溶液中，补充去离子水，得到与壳聚糖溶液体积相同的天然高分子聚合物溶液；
(3)将纳米硅酸盐溶于步骤(2)所述天然高分子聚合物溶液中；
(4)将天然交联剂加入步骤(3)所得溶液中，混匀；
(5)将步骤(4)所得溶液在35℃的温度下静置30小时，得到所述纳米复合水凝胶。
实施例6
本实施例提供一种纳米复合水凝胶，所述纳米复合水凝胶包括壳聚糖、明胶、纳米硅酸盐、京尼平和去离子水。
所述壳聚糖购于sigma-aldrich，牌号为448869，在纳米复合水凝胶的质量百分数为1％；
所述明胶购于sigma-aldrich，牌号为V900863，在纳米复合水凝胶的质量百分数为15％；
所述纳米硅酸盐购于BYK，牌号为53320-86-8，在纳米复合水凝胶的质量百分数为0.1％；
所述京尼平购于麦克林，牌号为G810337，在纳米复合水凝胶的质量百分数为0.01％。
上述纳米复合水凝胶的制备方法包括如下步骤：
(1)将壳聚糖在70℃下溶解于去离子水，加入1％乙酸，溶解过程中补充去离子水，保持溶液体积与初始去离子水体积相同，得到所述壳聚糖溶液；
(2)将明胶在50℃下溶于步骤(1)所述壳聚糖溶液中，补充去离子水，得到与壳聚糖溶液体积相同的天然高分子聚合物溶液；
(3)将纳米硅酸盐溶于步骤(2)所述天然高分子聚合物溶液中；
(4)将天然交联剂加入步骤(3)所得溶液中，混匀；
(5)将步骤(4)所得溶液在45℃的温度下静置40小时，得到所述纳米复合水凝胶。
性能测试
将实施例1-4进行如下测试：
(1)机械性能测试：采用台式机械测试仪(AG-IS)评价了水凝胶的力学性能。将直径为8mm、厚度为6mm的圆柱形水凝胶以5mm/min的应变速率压缩，压缩模量由5-10％应变对应的线性区域的应力-应变曲线斜率计算得到。极限应力为水凝胶破裂前的最大应力。每组6个样本。
(2)平衡含水量(Equilibrium water content，EWC)测定：水凝胶在PBS中吸水溶胀平衡24h，然后冻干16h，得到干凝胶。EWC(平均含水量)的计算公式为:EWC＝(Mw-Md)/Mw，其中Mw和Md分别为水凝胶的湿重和水凝胶的干重。
(3)生物相容性分析：采用CellTiter 96liquid One Solution CellProliferation Assay(MTS)，按照试剂盒的说明定量测定MC3T3的细胞活力。分别在培养3d和7d后，取出培养基，用新鲜培养基(200μL,10％MTS)孵育细胞1小时。用酶标仪在490nm处,记录吸光度。
(4)ALP活性的测定：采用碱性磷酸酶活性(ALP)检测MC3T3的成骨分化。培养3、7d后，每孔去除培养基，PBS洗涤2次，Triton X-100(200μL，1.0％，v/v)裂解。将裂解液离心，上清液用碱性磷酸酶测定试剂盒进行碱性磷酸酶活性分析。最终的ALP活性相对于从同一样品中获得的总蛋白含量归一化。使用BCA测定每个样品细胞裂解液的总蛋白浓度。
离子释放分析：将制备好的材料，分别浸泡在PBS(8mL)中。到达指定的时间点(1、3、5、7、14、21天)，吸取出液体，测定镁离子的浓度水平和硅离子释放，建立离子释放和时间之间的关系。
测试结果汇总于表1和图2-11中。
表1
Figure BDA0003219789810000101
分析表1数据可知，本发明所述纳米复合水凝胶的模量在3.85kPa以上，平衡含水量在94.54％以上，3天生物相容性在0.60OD以上，7天生物相容性在0.79OD以上，3天ALP活性在1.09U/mg-prot以上，7天ALP活性在1.47U/mg-prot以上，本发明所述纳米复合水凝胶具有一定的力学强度、良好的生物活性、优异的矿化基质形成能力、显著的促细胞增殖和分化和上调骨形成的能力。
分析实施例1-4可知，随着纳米硅酸盐含量的上升，所述纳米复合水凝胶的生物相容性和ALP活性均有所提升，纳米硅酸盐在所述纳米复合水凝胶中的质量百分数在0.5％-1％范围内综合性能更优异。
分析图4和图5可知，本发明所述纳米复合水凝胶，证明了材料具有良好的生物相容性，并且纳米硅酸盐具有促进细胞增殖的能力，图2和图3、图6和图7、图8和图9呈现出相似的变化规律。
分析图10和图11可知，本发明所述纳米复合水凝胶硅离子和镁离子的释放浓度随着时间的延长逐渐增加，且随着纳米硅酸盐含量的上升，浓度逐渐上升，结合ALP的活性，证明了释放出的离子具有促进成骨分化的能力。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米复合水凝胶，其特征在于，所述纳米复合水凝胶包括如下组分：天然高分子聚合物和天然交联剂形成的网状结构以及分布在所述网状结构中的纳米硅酸盐。
2.根据权利要求1所述的纳米复合水凝胶，其特征在于，所述天然高分子聚合物包括壳聚糖和明胶的组合。
3.根据权利要求1或2所述的纳米复合水凝胶，其特征在于，所述天然交联剂包括京尼平。
4.根据权利要求2或3所述的纳米复合水凝胶，其特征在于，所述天然高分子聚合物在纳米复合水凝胶的质量百分数为0.5％-19％；
优选地，所述壳聚糖在纳米复合水凝胶的质量百分数为0.5％-4％；
优选地，所述明胶在纳米复合水凝胶的质量百分数为5％-15％；
优选地，所述纳米硅酸盐在纳米复合水凝胶的质量百分数为0.1％-2％；
优选地，所述天然交联剂在纳米复合水凝胶的质量百分数为0.01％-0.03％。
5.一种根据权利要求1-4任一项所述的纳米复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将天然高分子聚合物配制成溶液，再将天然高分子聚合物溶液与天然交联剂、纳米硅酸盐混合，静置，得到所述纳米复合水凝胶。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述天然高分子聚合物溶液的制备方法包括：将明胶与壳聚糖溶液混合，溶解，得到所述天然高分子聚合物溶液；
优选地，所述溶解的温度为50-70℃；
优选地，所述天然高分子聚合物溶液的制备方法还包括：在所述溶解之后补充去离子水，得到与所述壳聚糖溶液体积相同的天然高分子聚合物溶液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液的溶剂包括去离子水和乙酸的组合；
优选地，所述壳聚糖溶液的制备方法包括：将壳聚糖溶解于去离子水和乙酸中，溶解过程中补充去离子水，保持溶液体积与初始去离子水体积相同，得到所述壳聚糖溶液；
优选地，所述壳聚糖溶解的温度为50-70℃。
8.根据权利要求5-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述静置的温度为35-45℃；
优选地，所述静置的时间为30-40小时。
9.根据权利要求5-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将壳聚糖在50-70℃下溶解于去离子水和乙酸中，溶解过程中补充去离子水，保持溶液体积与初始去离子水体积相同，得到所述壳聚糖溶液；
(2)将明胶在50-70℃下溶于步骤(1)所述壳聚糖溶液中，补充去离子水，得到与壳聚糖溶液体积相同的天然高分子聚合物溶液；
(3)将纳米硅酸盐溶于步骤(2)所述天然高分子聚合物溶液中；
(4)将天然交联剂加入步骤(3)所得溶液中，混匀；
(5)将步骤(4)所得溶液在35-45℃的温度下静置30-40小时，得到所述纳米复合水凝胶。
10.一种根据权利要求1-4任一项所述的纳米复合水凝胶在组织工程中的应用。
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