CN114288478A - 一种组织工程神经复合体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组织工程神经复合体及其制备方法和应用，属于生物医学材料领域。所述组织工程神经复合体包括神经导管、纤维支架和可注射剪切稀化生物材料，纤维支架和可注射剪切稀化生物材料填充在神经导管内；所述可注射剪切稀化生物材料（VEGF‑iSTB）由明胶、纳米硅酸盐SNPs、血管内皮生长因子和水制成。本发明利用VEGF‑iSTB缓释系统制成含VEGF‑iSTB的组织工程神经复合体，并将其移植到宿主皮下，从而构建得到预血管化组织工程神经复合体；之后将该预血管化组织工程神经复合体用于移植修复大鼠坐骨神经长距离缺损，可实现移植后与宿主血管系统发生融合，进而提高神经损伤修复效果。

Description

一种组织工程神经复合体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种组织工程神经复合体及其制备方法和应用。

背景技术

血管化是阻碍组织工程产品和技术临床应用的最大挑战之一。组织工程神经移植物的体内血管化程度与其周围神经修复效果密切相关。因此，针对组织工程神经移植物的研究，仅局限于生物材料、种子细胞、细胞因子及其他活性成分的研究远远不够，如何促进组织工程神经移植物早期血管化尤为重要。目前，在体外模拟复杂天然血管系统还面临巨大的挑战，生物材料和工程技术亟待进一步的研究，建立一种高效、易行的组织工程神经移植物预血管化方法对于组织工程神经移植物临床上治疗周围神经损伤的广泛应用意义重大。

目前，利用组织工程技术诱导血管生成的策略主要包括：①基于血管内皮细胞（或干细胞诱导分化来源的内皮细胞）体外构建血管网络，随后将血管化的工程化移植物移植入体内与宿主的血管发生吻合；②基于生长因子或细胞因子促进工程化移植物的血管化，已知的促进血管生成的因子有VEGF、bFGF、HGF等，另外如PDGF、TGF-β、Ang等可以间接促进血管内皮细胞的再生，加速血管化进程，这些因子在体内具有高度不稳定性，需要寻找合适的控释系统或通过基因转染种子细胞局部表达释放这些因子从而在体内发挥持久作用；③基于生物支架材料的血管化，分为天然生物衍生的血管化支架材料（如去细胞基质、壳聚糖、蚕丝丝蛋白等）和人工合成的血管化支架材料（如聚己内酯, 聚乙二醇等）。

利用血管内皮细胞（或干细胞诱导分化来源的内皮细胞）体外构建血管网络后再体内移植与宿主的血管网发生吻合的缺点在于要形成稳定、长期、有效的毛细血管网，还需要构成血管壁的其他细胞如周细胞、平滑肌细胞等。即便是可以利用多种细胞体外构建血管网络、但涉及的过程复杂，操作性、可控性较差，不利于后期标准化操作。基于生长因子或细胞因子的工程化移植物血管化缺点在于这些因子在体内具有高度不稳定性。生长因子一过性的体内大量释放并不能更有效的促进血管化的发生， 反而会因为局部短时间因子浓度过高导致形血管的形态异常和渗漏。基于生物支架材料的血管化局限性在于材料本身的促血管再生能力有限，需要结合生长因子或细胞来进一步提升生物材料的血管化能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织工程神经复合体及其制备方法及其应用，该复合体可应用于神经组织工程相关产品中。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种组织工程神经复合体，包括神经导管、纤维支架和可注射剪切稀化生物材料，所述纤维支架和可注射剪切稀化生物材料填充在神经导管内；

所述可注射剪切稀化生物材料由明胶、纳米硅酸盐、血管内皮生长因子和去离子水制成。

进一步地，所述可注射剪切稀化生物材料中明胶的浓度为2.0-5.0 wt.%，纳米硅酸盐的浓度为2.0-5.0 wt.%，血管内皮生长因子的浓度为0.1-10μg/mL。

更进一步地，所述可注射剪切稀化生物材料中明胶的浓度为2.0 wt.%，纳米硅酸盐的浓度为5.0 wt.%，血管内皮生长因子的浓度为0.1-10μg/mL。

更进一步地，所述可注射剪切稀化生物材料中明胶的浓度为2.0 wt.%，纳米硅酸盐的浓度为5.0 wt.%，血管内皮生长因子的浓度为1μg/mL。

进一步地，所述神经导管由生物可降解材料制成，所述生物可降解材料为丝素纤维单丝、壳聚糖、胶原、聚乳酸或聚羟基乙酸中的一种或几种。

进一步地，所述纤维支架为丝素纤维单丝。

上述组织工程神经复合体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将明胶溶液和纳米硅酸盐溶液混合，然后加入血管内皮生长因子，制得可注射剪切稀化生物材料；

步骤2，将步骤1的可注射剪切稀化生物材料导入填充有纤维支架的神经导管内，即可得到组织工程神经复合体。

上述组织工程神经复合体在制备预血管化组织工程神经复合体中的应用。

本发明利用VEGF-iSTB缓释系统制成含VEGF-iSTB的组织工程神经复合体，并将其移植到宿主皮下，从而构建得到含宿主源性血管网络、神经导管和内置纤维支架组成的预血管化组织工程神经复合体；之后将该预血管化组织工程神经复合体用于移植修复大鼠坐骨神经长距离缺损，可实现移植后与宿主血管系统发生融合 ，即刻通过吻合向组织和细胞提供营养，提高神经损伤局部微循环，改善损伤局部微环境，增加移植物的适应性，降低移植物的免疫排斥反应，进而提高神经损伤修复效果。

附图说明

图1为本发明的组织工程神经复合体构建及应用原理。

图2为不同组分iSTB的体外划痕实验结果。

图3为不同组分iSTB的体外二维成血管实验结果。

图4为不同组分iSTB体外缓释VEGF的结果。

图5为VEGF-iSTB组织工程神经复合体皮下移植后的成血管效果。其中：A为皮下预移植后不同时间点VEGF-iSTB组织工程神经复合体体式显微镜下大体观，B为VEGF-iSTB组织工程神经复合体经组织透明化处理后的大体观。

图6为VEGF-iSTB组织工程神经复合体皮下预移植后的成血管效果。其中：A为皮下预移植后4 d, 7 d, 14 d神经复合体中段横切面抗CD34免疫荧光化学染色；B为皮下预移植后4 d, 7 d, 14 d神经复合体中段横切面血管面积比统计。

图7为VEGF-iSTB组织工程神经复合体移植修复大鼠坐骨神经缺损后的血管再生效果评价。其中：A为MicroCT检测组织工程神经复合体皮下预移植4 d，7 d和未预移植的对照组VEGF-iSTB组织工程神经复合体移植修复大鼠坐骨神经缺损4 d, 7 d, 14 d后的血管再生效果；B为皮下预移植后4 d，7 d和未预移植的对照组VEGF-iSTB组织工程神经复合体移植修复大鼠坐骨神经缺损4 d, 7 d, 14 d后神经复合体中血管体积比统计。

图8为VEGF-iSTB组织工程神经复合体移植修复大鼠坐骨神经缺损后4 d , 14 d的神经断端（近、远端）施万细胞迁移距离统计。

图9 为VEGF-iSTB组织工程神经复合体皮下预移植后再生轴突长度和血管内皮细胞再生情况。其中：A为皮下预移植7 d, 14 d和未预移植的对照组VEGF-iSTB组织工程神经复合体移植修复大鼠坐骨神经缺损后14 d神经复合体纵切面抗NF200、CD34免疫荧光化学染色；B为皮下预移植7 d, 14 d和未预移植的对照组VEGF-iSTB组织工程神经复合体移植修复大鼠坐骨神经缺损后14 d神经复合体再生轴突长度统计。

图10为VEGF-iSTB组织工程神经复合体皮下移植后桥接修复大鼠坐骨神经后12周复合肌动作电位。

图11为透射电镜下观察组织工程神经复合体移植修复大鼠坐骨神经缺损12周后神经远端再生轴突再髓鞘化程度。

图12为VEGF-iSTB组织工程神经复合体皮下移植后桥接修复大鼠坐骨神经后腓肠肌和胫前肌湿重比统计。

具体实施方式

可注射剪切稀化生物材料（Injectable shear-thinning biomaterials, iSTB）是一种施加高于特定阈值的力以注入材料时，它会“变薄”并表现为半固体，使其易于流过导管。消除力后，材料立即变成具有显着内聚力的软固体，可防止其脱落或破裂。可注射剪切稀化生物材料具有通过微创疗法进行原位组织再生的巨大潜力。剪切变稀和自愈合水凝胶具有聚合物或聚合物之间的动态、可逆的相互作用，在包括药物递送，组织工程和三维生物打印各种生物医学领域中具有广泛的应用研究。

发明人前期研究通过改变明胶（Gelatin）和合成的纳米硅酸盐片状材料（synthetic silicate nanoplatelets, SNPs）的组分来合成iSTB，以控制其机械，流变学和生物活性特性。获得了可以满足不同临床需求，体外、体内生物相容性良好，材料溶胀性、孔隙率、降解率、注射力和剪切稀化性能可控的iSTB。明胶是通过胶原蛋白的部分水解获得的，由于变性，其抗原性相对低于胶原蛋白，生物相容性良好，是制备天然水凝胶的理想材料之一。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有显著的促血管生长作用，但本质上是不稳定的，损伤后局部炎症微环境加剧了这种不稳定性。为使VEGF稳定并持续在目标组织区域发挥生物学效应，本发明通过将iSTB作为缓释系统加载VEGF后增加其局部浓度并缓释释放。值得注意的是，iSTB中所含的SNPs组分可与VEGF之间存在强烈的相互作用，使其在植入部位长时间保留增强VEGF的功效，SNPs具有的高比表面积和荷电特性能促进血管生成分子的释放。与外源生物分子相比，SNPs可以保持与生长因子偶联物的稳定性、提高其生物利用度及其传递生长因子诱导血管生成的能力。在体外三维血管生成模型中，胶原水凝胶中加入载药纳米硅酸盐刺激内皮细胞侵袭。SNPs可以帮助一系列治疗性生物大分子持续释放，稳定并保留其活性形式，实现缓释释放，促进体外组织再生和伤口愈合。

如图1所示，本发明利用VEGF-iSTB缓释系统制成含VEGF-iSTB的组织工程神经复合体，并将进行移植到宿主皮下，从而构建得到含宿主源性血管网络、神经导管和内置纤维支架组成的预血管化组织工程神经复合体；之后将该预血管化组织工程神经复合体移植修复大鼠坐骨神经长距离缺损，预期达到移植后与宿主血管系统发生整合，即刻通过吻合向组织和细胞提供营养，提高神经损伤局部微循环，改善损伤局部微环境，增加移植物的适应性，降低移植物的免疫排斥反应，进而提高神经损伤修复效果。

具体包括以下几方面：

（1）体外VEGF-iSTB缓释系统的构建及效果评价

通过不同比例明胶和SNPs制备的iSTB与体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)开展生物相容性、细胞增殖和迁移实验，根据实验结果确定构建VEGF-iSTB缓释系统中明胶和SNPs最佳比例。构建含不同浓度VEGF的iSTB缓释系统。通过ELISA 实验体外检测VEGF-iSTB缓释系统中VEGF的负载能力及缓释效果。通过二维成血管实验检测该缓释系统体外释放VEGF的生物活性。

（2）体内验证VEGF-iSTB的缓释效果，建立预血管化组织工程神经复合体的优化条件

运用由壳聚糖神经导管、内置的蚕丝丝素纤维支架和含不同浓度VEGF的iSTB组成的VEGF-iSTB组织工程神经移植物预先移植到大鼠背部皮下，移植后不同时间点大体及组织学观察组织工程神经复合体的炎症免疫反应及预血管化情况。按照经济、高效、安全及便于临床转化的原则，选取含1μg/mL 的VEGF-iSTB填充于壳聚糖神经导管内，经皮下预移植7天体内构建预血管化程度良好的组织工程神经复合体。

（3）预血管化组织工程神经复合体桥接修复大鼠坐骨神经缺损后血管形成的效果评价

利用最优VEGF浓度的VEGF-iSTB组织工程神经复合体修复大鼠坐骨神经10 mm缺损，术后通过MICROFIL®血管造影剂灌注、组织透明化、micro-CT扫描结合免疫组化染色等影像学、组织形态学手段评价组织工程神经复合体的血管生成效果，确定体内构建预血管化组织工程神经复合体最佳的体内预血管化时间。

（4）预血管化组织工程神经复合体桥接修复大鼠坐骨神经缺损的效果评价

利用优化后的预血管化组织工程神经复合体修复大鼠坐骨神经10 mm缺损，选取未经体内预血管化的组织工程神经移植物修复大鼠坐骨神经缺损为阴性对照，自体神经修复组为阳性对照。术后通过组织形态学观察比较各组之间损伤神经纤维再生速度。术后3个月观察小动物行为学、电生理学、组织形态学及形态计量学方法综合评价该预血管化组织工程神经复合体修复周围神经缺损的效果。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。

本发明所述的神经导管为本领域技术人员常用的组织工程神经移植物，优选表面多孔的壳聚糖导管，如 50-90%、孔径 50-300 mm 的具有多孔结构、抗拉强度高的神经导管，管状本体内径为 0.5-8 mm、壁厚 0.1-3 mm，可参照专利申请CN102343114A组织工程神经移植物及其用途或专利申请CN103041450A用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法中所述的方法制得；或者优选纳米纤维蚕丝丝素蛋白导管，可参照专利申请CN101664346A静电纺丝制备的人工神经移植物及其制备方法和专用装置或专利申请CN103041450A用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法所述的方法制得；或者优选使用表面多孔的壳聚糖导管外壳或纳米纤维蚕丝丝素蛋白导管外壳，导管内部充填入丝素蛋白纤维的复合型神经导管，丝素蛋白纤维的制备可参照专利申请CN101664346A静电纺丝制备的人工神经移植物及其制备方法和专用装置或专利申请CN103041450A用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法所述的方法制得，优选每个导管中含有120 根丝素蛋白单丝。

实施例1

1、VEGF-iSTB缓释系统的构建

分别用Milli-Q水制备18% w/v明胶溶液(type A, G1890, Sigma, CA, USA)和10% w/v SNPs 溶液(Laponite XLG, BYK Additives Ltd, TX, USA)；再制备不同比例明胶和SNPs的复合水凝胶iSTB。

通过不同比例明胶和SNPs制备的iSTB与体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人皮肤成纤维细胞 (HDF)开展生物相容性、成血管效应、细胞迁移实验，根据实验结果确定构建VEGF-iSTB缓释系统中明胶和SNPs最佳比例。

为了测试VEGF-iSTB缓释系统的对血管内皮细胞的成血管效应，利用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在不同的VEGF-iSTB缓释水凝胶包被的孔板内培养，不同时间点拍照记录，再用ImageJ分析获得细胞划痕愈合、二维成管率和分叉数等相关参数。

如图2所示，不同组分 iSTB的体外划痕实验证明G2.0%-SNP5.0%的水凝胶能够更好地促进成纤维细胞迁移。

如图3所示，不同组分 iSTB的体外二维成血管实验证明G2.0%-SNP5.0%的水凝胶能够更好地促进成血管内皮细胞体外成管。

2、VEGF-iSTB负载能力及缓释效果评价

将1 μg/mL的VEGF与iSTB混合即得VEGF-iSTB缓释水凝胶。

通过ELISA 实验体外检测VEGF-iSTB缓释系统中VEGF的负载能力及缓释效果。实验过程为：

VEGF-iSTB负载能力通过37℃下将不同浓度梯度VEGF-iSTB置于含1 mg/mL BSA的5mL PBS中孵育90 min，采用ELISA法测定反应液中VEGF的浓度，并由以下公式计算获得（负载的VEGF=（反应前VEGF的浓度−反应后VEGF浓度）×体积）；VEGF-iSTB缓释效果通过37℃下将含100 ng/mL VEGF的iSTB置于含1mg/mL BSA的5mL PBS中孵育，PBS每24小时更换一次，并在-20℃下保存，直至测定，采用ELISA法连续7天测定PBS中VEGF的浓度。

如图4所示，经ELISA法体外检测不同组分 iSTB缓释VEGF的程度发现iSTB（Gelatin2.0%-SNP5.0%）体外缓释VEGF的效果最佳。

实施例2

预血管化组织工程神经复合体的构建

运用由壳聚糖神经导管、内置的蚕丝丝素纤维支架和含不同浓度VEGF的iSTB组成的VEGF-iSTB组织工程神经移植物预先移植到大鼠背部皮下，移植后不同时间点大体及组织学观察组织工程神经复合体的炎症免疫反应及预血管化情况。

将VEGF-iSTB通过注射器注入神经导管内，完全填充腔内空间。将含1 μg/mL VEGF的iSTB组成的组织工程神经移植物预先移植到大鼠背部皮下，移植后4天、7天、14天取材体式显微镜下直接观察和免疫组化染色（CD34）观察组织工程神经复合体的预血管化情况。

如图5所示，VEGF 浓度大于1 μg/mL的iSTB组织工程神经复合体，体内预移植时间大于7天，组织工程神经复合体表面血管生长与对照组相比较好。

如图6所示，VEGF 浓度大于1 μg/mL的iSTB组织工程神经复合体，体内预移植时间大于7天，组织工程神经复合体表面及内部血管生长较好。

实施例3

1、预血管化组织工程神经复合体桥体内血管形成的效果评价

建立大鼠坐骨神经缺损模型，腹腔注射麻醉后，常规备皮，延臀浅肌和股二头肌间隙痕迹切开皮肤及皮下组织，延肌间隙钝性分离暴露坐骨神经，实验组、自体组和支架组的大鼠于股骨中段位置切除约10mm坐骨神经。将预血管化组织工程神经复合体桥接修复大鼠坐骨神经 10 mm 缺损，设立未体内预血管化的组织工程神经移植物修复大鼠坐骨神经缺损为阴性对照组。分别显微缝线将组织工程神经复合体与神经外膜缝合，恢复各组神经于肌间隙中的位置，依次缝合各层组织，缝合皮肤。利用体内不同预血管化时间构建的组织工程神经复合体修复大鼠坐骨神经10 mm缺损，术后4 天、7天、14天通过MICROFIL®血管造影剂灌注、组织透明化、micro-CT扫描比较各组之间评价组织工程神经复合体血管生成效果。

如图7所示，VEGF 浓度为1 μg/mL的iSTB组织工程神经复合体，皮下移植时间大于7天，桥接修复大鼠坐骨神经10 mm缺损后与对照组相比血管生长较好，且预移植7天和14天无差别。

2、神经生长速度及施万细胞迁移能力检测

利用体内不同预血管化时间构建的组织工程神经复合体修复大鼠坐骨神经10 mm缺损，各组大鼠分别于术后4天、7天、14天取神经桥接段，固定后于冰冻切片机上以 OCT 包埋后切片。桥接段纵切后，行 NF-200、S100及 CD34 免疫荧光双标化学染色,分析系统分别测量再生神经纤维生长长度及成髓鞘的施万细迁移情况，比较各组差异。

如图8所示，VEGF 浓度为1 μg/mL的iSTB组织工程神经复合体，皮下移植时间大于7天，桥接修复大鼠坐骨神经10 mm缺损后与对照组相比再生神经纤维生长较好，且预移植7天和14天无差别。

如图9所示，VEGF 浓度为1 μg/mL的iSTB组织工程神经复合体，皮下移植时间大于7天，桥接修复大鼠坐骨神经10 mm缺损后与对照组相比施万细胞迁移能力较好，且预移植7天和14天无差别。

3、神经电生理学检测

各组大鼠于术后12 w，室温条件下对两组大鼠进行电生理学检测。用复合麻醉剂对大鼠进行腹腔注射麻醉后，术区常规消毒、备皮。暴露出术侧坐骨神经 (含桥接段)，用玻璃分针分离桥接段两端的神经，按照Suzuki的方法记录复合肌动作电位(compound muscleaction potentials， CMAPs)。将记录电极插入肌腹，干扰电极置于腿部皮肤，依次将刺激电极置于桥接段两段的近、远侧神经干，刺激神经，分两通道记录CMAPs。非手术侧，同法刺激相应部位神经干，记录正常CMAPs，并进行统计分析，比较各组差异。

如图10所示，VEGF 浓度为1 μg/mL的iSTB组织工程神经复合体，皮下移植时间大于7天，桥接修复大鼠坐骨神经后神经电生理功能恢复优于对照组。

4、再生神经形态学观察

组织工程神经复合体移植修复大鼠坐骨神经10 mm缺损术后12周，动物灌注固定后，术侧再生神经远侧段切取神经，修切成 1.5 mm×1 mm×1 mm 大小，健侧神经在对应位置取材。将神经标本依次置于预冷的 2.5%戊二醛和 1%锇酸固定，固定好的样品经醋酸铀块染，梯度乙醇脱水， Epon812 环氧树脂包埋后做半薄切片定位，超薄切片，进行常规枸橼酸铅复染，透射电镜下观察，比较各组差异。

如图11所示，VEGF 浓度为1 μg/mL的iSTB，皮下移植时间大于7天，桥接修复大鼠坐骨神经后再生神经髓鞘厚度髓鞘板层数目恢复优于对照组。

5、靶肌大体及形态学观察

组织工程神经复合体移植修复大鼠坐骨神经10 mm缺损术后12周对各组大鼠进行灌注取材，分别取下双侧的胫前肌和腓肠肌，分析天平称重，计算所有实验大鼠的术侧肌肉与健侧肌肉的比值，分别比较两组大鼠的胫前肌湿重比和腓肠肌湿重比。

如图12所示，VEGF 浓度为1 μg/mL的iSTB，皮下移植时间大于7天，组织工程神经复合体桥接修复大鼠坐骨神经后靶肌湿重恢复优于对照组，且预移植7天和14天无差别。

Claims (9)

1.一种组织工程神经复合体，其特征在于：包括神经导管、纤维支架和可注射剪切稀化生物材料，所述纤维支架和可注射剪切稀化生物材料填充在神经导管内；

所述可注射剪切稀化生物材料由明胶、纳米硅酸盐、血管内皮生长因子和去离子水制成。

2.根据权利要求1所述的组织工程神经复合体，其特征在于：所述可注射剪切稀化生物材料中明胶的浓度为2.0-5.0 wt.%，纳米硅酸盐的浓度为2.0-5.0 wt.%，血管内皮生长因子的浓度为0.1-10μg/mL。

3.根据权利要求2所述的组织工程神经复合体，其特征在于：所述可注射剪切稀化生物材料中明胶的浓度为2.0 wt.%，纳米硅酸盐的浓度为5.0 wt.%，血管内皮生长因子的浓度为0.1-10μg/mL。

4.根据权利要求3所述的组织工程神经复合体，其特征在于：所述可注射剪切稀化生物材料中明胶的浓度为2.0 wt.%，纳米硅酸盐的浓度为5.0 wt.%，血管内皮生长因子的浓度为1μg/mL。

5.根据权利要求1所述的组织工程神经复合体，其特征在于：所述神经导管由生物可降解材料制成，所述生物可降解材料为丝素蛋白、壳聚糖、胶原、聚乳酸或聚羟基乙酸中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的组织工程神经复合体，其特征在于：所述纤维支架为脱丝胶后的丝素纤维单丝。

7.权利要求1所述的组织工程神经复合体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，将明胶溶液和纳米硅酸盐溶液混合，然后加入血管内皮生长因子，制得可注射剪切稀化生物材料；

步骤2，将步骤1的可注射剪切稀化生物材料导入填充有纤维支架的神经导管内，即可得到组织工程神经复合体。

8.权利要求1所述的组织工程神经复合体在制备预血管化的组织工程神经复合体中的应用。

9.一种预血管化的组织工程神经复合体，其特征在于：由权利要求1所述的组织工程神经复合体制得。

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