CN105784995A - Dna智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素b1的方法 - Google Patents
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Abstract
DNA智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素B1的方法,包括如下步骤:(1)将具有颜色指示作用的纳米粒子或者信号放大分子包埋在能够对黄曲霉毒素B1特异性响应的DNA智能水凝胶中;(2)黄曲霉毒素B1刺激DNA智能水凝胶,释放包埋其中的纳米粒子或信号放大分子;(3)通过裸眼观察具有颜色指示作用的纳米粒子在上清中的颜色深浅,实现黄曲霉毒素B1的半定量检测,和/或借助于信号放大分子催化过氧化氢产生氧气推动染料移动的芯片可以实现黄曲霉毒素B1的定量检测。与其他检测方法相比,该方法操作简单,价格低廉,无需大型仪器辅助测试,且灵敏度高、选择性好,具有广泛推广的可能性。
Description
技术领域
本发明属于可视化定量及半定量分析方法技术领域,具体涉及DNA智能水凝胶可视化定量及半定量检测黄曲霉毒素B1。
背景技术
水凝胶是一类以水为分散介质,具有网状交联结构的亲水性的高分子聚合物。水凝胶依靠物理交联或化学交联两种方式生成,具有一定的柔韧性,在水环境下可发生溶胀。根据凝胶生成方式的不同,凝胶结构能够响应多种环境参数(如温度、pH、离子强度和小分子等)而发生结构改变,因而也被成为“智能水凝胶”。DNA水凝胶,依靠DNA碱基互补配对杂交而形成网状结构,是一类新型的智能水凝胶。DNA水凝胶通常以对小分子或离子响应的核酸适体或脱氧核酶(DNAzyme)为交联剂形成凝胶体系,用以检测小分子、离子等(1.Zhu,Z.,Wu,C.;LiuH.et.al.,AnAptamerCross-LinkedHydrogelasaColorimetricPlatformforVisualDetection[J].Angew.Chem.2010,122,1070–1074.2.Kang,H.,Liu,H.,Zhang,X.et.al.,PhotoresponsiveDNA-Cross-LinkedHydrogelsforControllableReleaseandCancerTherapy[J].Langmuir2011,27(1),399–408.3.Liu,J.Oligonucleotide-functionalizedhydrogelsasstimuliresponsivematerialsandbiosensors[J].SoftMatter,2011,7,6757–6767)。DNA水凝胶极大的拓展了水凝胶传感器和核酸适体及脱氧核酶传感器的应用范围。
核酸适体(aptamer)是一类新型功能核酸分子,通常基于指数富集配体系统进化技术(SELEX)从随机寡核苷酸文库中体外筛选得到的”人工抗体”。核酸适体通常为短链DNA或RNA,与抗体相比,具有靶标分子广泛、与靶标高亲和力结合、无免疫源性、便于合成与定点修饰、批次间差异小等诸多优点,是潜在的抗体替代物,在生物化学分析检测领域具有广泛的应用(4.Liu,J.;Cao,Z.;Lu,Y.et.Al.,Functionalnucleicacidsensors.Chem.Rev.2009,109,1948-1998)。
黄曲霉毒素是一类由黄曲霉菌、寄生曲霉菌A产生的次生代谢产物,是严重威胁人类及动物健康最主要的一类真菌毒素(5.Geiser,D.M.;Dorner,J.W.;Horn,B.W.;Taylor,J.W.ThephylogeneticsofmycotoxinandsclerotiumproductioninAspergillusflavusandAspergillusoryzae[J].FungalGenet.Biol.2000,31,169-79.6.Horn,BruceW.;Moore,GeromyG.;Carbone,Ignazio.SexualreproductioninAspergillusflavus[J].Mycologia.2009,101,423-429)。黄曲霉毒素是一组具有二呋喃环和氧杂萘邻酮(香豆素)相似基本结构的小分子,目前已发现20多种,常见的有六种,如黄曲霉毒素B1(AFB1)、B2(AFB2)、M1(AFM1)、M2(AFM2)、G1(AFG1)和G2(AFG2)。而在所有黄曲霉毒素中,黄曲霉毒素B1的毒性最强,存在量最大,稳定性最高,是目前公认的致癌性最强的真菌毒素。黄曲霉毒素B1广泛存在于土壤和动植物体内,如花生、玉米、小麦、稻谷和各种坚果,尤其是热带和亚热带等南方地区,高温高湿的环境更容易使得稻谷、花生等农作物受黄曲霉毒素B1的污染。而黄曲霉毒素B1作为一种有机小分子,化学性质稳定,普通的高温加热处理很难将其破坏,对人和动物的生命安全构成严重威胁。因而各国对于黄曲霉毒素B1在食品中的含量都有一定的限制标准(7.Selvaraj,J.N.;Zhou,L.;Wang,Y.Mycotoxindetection—Recenttrendsatgloballevel[J].JournalofIntegrativeAgriculture.2015,14,2265-2281),我国食品安全国家标准中同样对真菌毒素限量要求有比较严格的规定,如小麦粉、麦片及其他去壳谷物限量为5.0ppb,花生及其制品限量为20ppb,酱油、醋等(以粮食为主要原料)限量为5.0ppb。欧盟规定在花生、干果、麦片果汁和酒中黄曲霉毒素B1的最大量不得超过2.0ppb。因此,有效、快速、高灵敏度检测黄曲霉毒素B1具有非常重要的意义。
目前,常用的检测黄曲霉毒素B1的方法主要为化学分析法和免疫分析法。化学分析法主要包括薄层层析色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱与质谱联用法(LC-MS)等。TLC法作为检测黄曲霉毒素B1的经典方法,但其前处理繁琐复杂,检测灵敏度较低。而HPLC和LC-MS虽然作为检测黄曲霉毒素B1的标准方法,但是其需要复杂的前处理、昂贵的仪器及专业的操作人员,无法满足便携式实时定量检测黄曲霉毒素B1的要求(8.SaqerM.Herzallah.Determinationofaflatoxinsineggs,milk,meatandmeatproductsusingHPLCfluorescentandUVdetectors[J].FoodChemistry.2009,114,1141–1146.9.MohammadR.Khan,ZeidA.Alothman,AymanA.Ghfar.Analysisofaflatoxinsinnonalcoholicbeerusingliquid–liquidextractionandultraperformanceLC-MS/MS[J].J.Sep.Sci.2013,36,572–577)。而免疫分析法主要基于抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体发展起来的一系列免疫学检测方法。酶联免疫吸附法(ELISA)作为免疫检测法中最具代表性的一种检测方法,具有灵敏度高、安全性好、干扰小等优点,是目前检测黄曲霉毒素B1的常用方法。但是,该免疫分析方法中所使用到的黄曲霉毒素B1的抗体制备相对较困难,且试剂保存难寿命短,这些瓶颈都大大限制了这类检测方法的应用范围(10.NanjuA.Lee,ShuoWang.ARapidAflatoxinB1ELISA:DevelopmentandValidationwithReducedMatrixEffectsforPeanuts,Corn,Pistachio,andSoybeans[J]J.Agric.FoodChem.2004,52,2746-2755.11.Chan,D.,MacDonald,S.J.,Boughtflower,V.SimultaneousdeterminationofaflatoxinsandochratoxinAinfoodusingafullyautomatedimmunoaffinitycolumnclean-upandliquidchromatography–fluorescencedetection[J].J.Chromatogr.A,2004,1059,13-16.12.JinHwanDo;Dong-KugChoi.Aflatoxins:Detection,Toxicity,andBiosynthesis[J].BiotechnologyandBioprocessEngineering.2007,12,585-593.13.Piermarini,S.,Micheli,S.at.al.Electrochemicalimmunosensorarrayusinga96-wellscreen-printedmicroplateforaflatoxinB1detection[J].BiosensorsandBioelectronics.2007,22,1434–1440)。所以,发展一种便携、快速、灵敏检测黄曲霉毒素B1的检测方法迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于克服检测黄曲霉毒素B1的技术缺陷,提供一种便携、快速、灵敏检测黄曲霉毒素B1的方法。
本发明的具体技术方案如下:
DNA智能水凝胶可视化定量及半定量检测黄曲霉毒素B1,包括如下步骤:
步骤一,将具有颜色指示作用的纳米粒子和/或信号放大分子包埋在能够对黄曲霉毒素B1特异性响应的DNA智能水凝胶中;
步骤二:将待测样品和DNA智能水凝胶混合,黄曲霉毒素B1刺激DNA智能水凝胶,释放包埋其中的纳米粒子或信号放大分子;
步骤三:通过肉眼观察具有颜色指示作用的纳米粒子在上清中的颜色深浅,实现对黄曲霉毒素B1的半定量检测,和/或借助于信号放大分子催化过氧化氢产生氧气推动染料移动的芯片实现黄曲霉毒素B1的定量检测。
在本发明的一个优选实施方案中,所述的具有颜色指示作用的纳米粒子为金纳米粒子,粒径为13nm。
进一步优选的,所述水凝胶中包埋的金纳米颗粒浓度为30-60nM。
在本发明的一个优选实施方案中,所述的信号放大分子为铂纳米粒子,粒径为30nm。
进一步优选的,所述水凝胶中包埋的金纳米颗粒浓度为1-10nM。
进一步优选的,所述水凝胶中接枝到丙烯酰胺上的两种短链DNA与交联链DNA的浓度比为1:1:0.55。
进一步优选的,所述水凝胶中各DNA链的浓度为55-100μM。
进一步优选的,所述水凝胶与黄曲霉毒素B1的反应温度为20-30℃,反应时间为15-90min。
进一步优选的,所述水凝胶中接枝到丙烯酰胺上的两种短链DNA是通过末端修饰丙烯酰胺单体的DNA与丙烯酰胺在过硫酸铵和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺引发下聚合得到。
所述水凝胶的制备方法为:将两条丙烯酰胺-DNA与黄曲霉毒素B1核酸适体与具有颜色指示作用的纳米粒子或者信号放大分子混合制得。
由上述对本发明的描述可知,本发明发展了一种DNA智能水凝胶可视化定量及半定量检测黄曲霉毒素B1的检测方法。与现有分析检测方法相比,该方法具有灵敏度高、选择性好,且价格低廉,便携式快速检测等优点,具有广泛推广的可能性。
附图说明
图1为本发明的工作原理图。
图2为丙烯酸亚磷酰胺单体合成路线图。
图3为可视化半定量检测黄曲霉毒素B1,即不同浓度黄曲霉毒素B1对包埋金纳米粒子的水凝胶的响应情况。DNA水凝胶解胶实验是在Tris-HCl缓冲溶液(10mMTris,120mMNaCl,5mMKCl,20mMCaCl2,pH8.5)中于25℃,150rpm反应90min。解胶结束后,裸眼可观测上清颜色变化(A),也可以用UV-Vis检测上清的520nm处的吸收值,来半定量黄曲霉毒素B1(B)。
图4为不同浓度黄曲霉毒素B1对水凝胶的响应情况及染料上升距离与黄曲霉毒素B1浓度的对应关系。DNA水凝胶解胶实验是在Tris-HCl缓冲溶液(10mMTris,120mMNaCl,5mMKCl,20mMCaCl2,pH8.5)中于25℃,150rpm反应90min。解胶结束后,取解胶溶液上样到芯片中,铂纳米粒子催化过氧化氢产生氧气推动染料上升,读取染料上升距离进行分析。
图5为黄曲霉毒素B1对不同毒素分子的响应情况对比。其中,黄曲霉毒素类的浓度为100nM,其他毒素为1mM。DNA水凝胶解胶实验是在Tris-HCl缓冲溶液(10mMTris,120mMNaCl,5mMKCl,20mMCaCl2,pH8.5)中于25℃,150rpm反应90min。解胶结束后,取解胶溶液上样到芯片中,铂纳米粒子催化过氧化氢产生氧气推动染料上升,读取染料上升距离进行分析。
图6为实际样品中黄曲霉毒素B1的检测,并与LC-MS标准方法比较。其中,选用的实际样品为啤酒样品,经超声除气及过膜除杂质后加黄曲霉毒素B1标准品,再经免疫亲和柱(IAC)进行富集。用富集得到的样品加入Tris-HCl缓冲溶液稀释后进行检测。DNA水凝胶解胶实验是在Tris-HCl缓冲溶液(10mMTris,120mMNaCl,5mMKCl,20mMCaCl2,pH8.5)中于25℃,150rpm反应90min。取解胶溶液上清,上样到气动芯片中,通过释放的铂纳米颗粒催化过氧化氢产生氧气推动染料上升,读取距离进行分析。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
一、丙烯酸亚磷酰胺单体的合成
丙烯酸亚磷酰胺单体的合成主要分为两个步骤:1)将2-甲基丙烯酸(440mg,5mmol)、6-氨基-1-己醇(585mg,5mmol)、N-羟基苯并三唑(HOBT,810mg,6mmol)和碳二亚胺(DCC,1356mg,6mmol)溶解在5mLN,N-二甲基甲酰胺中,氮气氛围下,搅拌反应过夜。用水/乙酸乙酯萃取后,保留有机相用无水硫酸钠干燥,而后用硅胶柱分离纯化得到第一步产物。2)取第一步产物(213mg,1.15mmol)溶解在2mL无水CH2Cl2中,冰浴条件下缓慢加入N,N’-二异丙基乙胺(DIPEA,0.55mL,3.22mmol)。稍后,逐滴滴加2-氰乙基二异丙基亚磷氯(0.28mL,1.15mmol),氮气保护和冰浴条件下避光反应3hr。旋转蒸发仪浓缩后用硅胶柱纯化得到丙烯酸亚磷酰胺单体。终产物的核磁表征数据如下:1HNMR(500MHz,CDCl3):5.83(s,1H),5.65(s,1H),5.29(s,1H),3.85-3.76(m,2H),3.65-3.55(m,4H),3.32-3.27(q,2H),2.65-2.62(t,2H),1.954(s,1H),1.61-1.53(m,4H),1.41-1.34(m,4H),1.18-1.16(m,12H).31P(CDCl3):δ147。质谱数据表征:ESI-MS(m/z)[1+H]+386.2,Found:386.4。
二、甲基丙烯基团修饰的DNA的合成与纯化
根据目标序列(具体合成序列见表1),以普通CPG作为固相载体,以DNA单体碱基为原料,在DNA合成仪上从3’端到5’端合成链A(P-SA)、链B(P-SB)及linker链。链A和链B在合成后,在5’端修饰丙烯酸亚磷酰胺单体。合成结束后,对所合成的DNA进行纯化。具体步骤如下:1)将上述CPG用氮气吹干,然后转移至2mL洁净的Eppendorf管中,加入0.5mL甲胺:氨水(v/v=1:1)混合液,在65℃条件下孵育30min,使DNA从CPG上切割下来。2)取1)中的上清至2mL洁净的Eppendorf管中,向其中加入1.25mL冰冻的无水乙醇及0.04mL3MNaCl,于-20℃冰箱中孵育30min,使得DNA沉淀析出。3)将酒精沉淀后的DNA于4℃,14000rpm的转速下离心10min,而后弃去上清得到DNA粗产物。4)将得到的粗产物溶解在0.1M醋酸三乙胺(TEAA)中,并用0.2μm滤膜过滤。5)将过滤膜的DNA溶液用反相高效液相色谱进行纯化,而后产品在真空中抽干浓缩。6)上述DNA溶于超纯水后使用凝胶色谱柱进行脱盐处理。根据紫外-可见分光光度计测定260nm处吸收值及相应消光系数对DNA进行定量。
表1所用DNA序列
名称 | 序列 |
P-SA | 5’-Acrydite-TTTTGTGGGCCTAGCGA-3’ |
P-SB | 5’-Acrydite-TTTACACGTGCCCAAC-3’ |
Linker | 5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’ |
三、金纳米粒子的制备
在250mL洁净的圆底烧瓶中,加入99mL和1mL1%氯金酸溶液,加热煮沸后加入100μL3%柠檬酸钠,回流反应30min即可得到2.5nM金纳米粒子。为了防止纳米粒子在高盐下团聚,合成得到的AuNPs用2μM巯基PEG(SH-PEG,MW5000)和0.01wt%Tween-20修饰。用超纯水离心重悬3次,浓缩到800nMAuNPs待用。
四、铂纳米粒子的制备
具体合成步骤如下:在900μL超纯水中加入10μL100mMH2PtCl6,80℃反应加热20min后,加入100μL0.4M抗坏血酸,80℃反应30min,即可得到4.5nMPtNPs。在14000rpm的转速下离心10min浓缩弃去910μL上清将PtNPs浓缩至50nM。
五、聚丙烯酰胺-DNA的制备
将链A和链B分别溶解在超纯水中配制高浓度DNA储存液。分别配制4wt%的丙烯酰胺,10wt%APS(过硫酸铵)和5%(v/v)TEMED(N,N,N’,N’四甲基乙二胺)。聚合的操作步骤如下:500μM修饰了丙烯酰胺的链A和链B分别与4wt%丙烯酰胺混合后,37℃抽真空10min除去空气,而后加入1.4%新鲜配置的10wt%APS和2.8%新鲜配制的5%(v/v)TEMED。稍后在真空干燥器中,37℃真空反应15min和12min,得到聚丙烯酰胺-DNA高分子产物(P-SA、P-SB)。得到的P-SA及P-SB用100KD的超滤离心管纯化。纯化后的聚丙烯酰胺-DNA利用260nm处吸收值对于接枝上的DNA进行定量。将P-SA与P-SB按照1:1浓度混合,加入反应缓冲溶液(10mMTris,120mMNaCl,5mMKCl,20mMCaCl2,pH8.5),最后加入铂纳米颗粒,65℃孵育5min,重复两次。而后加入交联剂linker链,确保终浓度P-SA:P-SB:linker=1:1:0.55。65℃孵育5min,重复两次确保铂纳米被均匀的包埋在水凝胶中。最后将水凝胶自然冷却至室温。
六、DNA智能水凝胶可视化半定量检测黄曲霉毒素B1
取制备好的包埋金纳米粒子的DNA水凝胶,使用前用缓冲溶液(10mMTris,120mMNaCl,5mMKCl,20mMCaCl2,pH8.5)清洗水凝胶3次,并用滤纸将管壁擦拭干净。DNA水凝胶解胶实验是在Tris-HCl缓冲溶液(10mMTris,120mMNaCl,5mMKCl,20mMCaCl2,pH8.5)中于25℃,150rpm反应90min。解胶结束后,裸眼可观测上清颜色变化(结果见图3A),也可以用UV-Vis检测上清的520nm处的吸收值,来半定量黄曲霉毒素B1(结果见图3B)。
七、DNA智能水凝胶可视化定量检测黄曲霉毒素B1
使用前用缓冲溶液(10mMTris,120mMNaCl,5mMKCl,20mMCaCl2,pH8.5)清洗水凝胶3次,并用滤纸将管壁擦拭干净。DNA水凝胶解胶实验是在Tris-HCl缓冲溶液(10mMTris,120mMNaCl,5mMKCl,20mMCaCl2,pH8.5)中于25℃,150rpm反应90min。取解胶溶液上清,上样到气动芯片中,通过释放的铂纳米颗粒催化过氧化氢产生氧气推动染料上升,来读取距离进行分析。(结果见图4)
八、
图5为黄曲霉毒素B1对不同毒素分子的响应情况对比。其中,黄曲霉毒素类的浓度为100nM,其他毒素为1mM。DNA水凝胶解胶实验是在Tris-HCl缓冲溶液(10mMTris,120mMNaCl,5mMKCl,20mMCaCl2,pH8.5)中于25℃,150rpm反应90min。解胶结束后,取解胶溶液上样到芯片中,铂纳米粒子催化过氧化氢产生氧气推动染料上升,读取染料上升距离进行分析。
九、免疫亲和柱处理实际样品
将啤酒样品超声1hr除去气体,过膜除去固体杂质,然后在10mL样品中分别加入不同浓度的黄曲霉毒素B1标准品。而后分别将加标样品加入到免疫亲和柱中,打开抽气阀,使得样品以1-2mL/min的速度流出直至完全流干。用10mL磷酸缓冲溶液淋洗后,再用同等体积的去离子水淋洗2次。最后,依次用0.5mL和1.0mL甲醇将黄曲霉毒素B1洗脱下来,最终得到扣除基底浓缩的黄曲霉毒素B1样品。
用富集得到的样品加入Tris-HCl缓冲溶液稀释后进行检测。DNA水凝胶解胶实验是在Tris-HCl缓冲溶液(10mMTris,120mMNaCl,5mMKCl,20mMCaCl2,pH8.5)中于25℃,150rpm反应90min。取解胶溶液上清,上样到气动芯片中,通过释放的铂纳米颗粒催化过氧化氢产生氧气推动染料上升,读取距离进行分析。结果见图6。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例而已,故不能依此限定本发明实施的范围,即依本发明专利范围及说明书内容进行非实质性的改动,均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
Claims (10)
1.DNA智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素B1的方法,包括如下步骤:
步骤一,将具有颜色指示作用的纳米粒子和/或信号放大分子包埋在能够对黄曲霉毒素B1特异性响应的DNA智能水凝胶中;
步骤二:将待测样品和DNA智能水凝胶混合,黄曲霉毒素B1刺激DNA智能水凝胶,释放包埋其中的纳米粒子或信号放大分子;
步骤三:通过裸眼观察具有颜色指示作用的纳米粒子在上清中的颜色深浅,实现对黄曲霉毒素B1的半定量检测,和/或借助于信号放大分子催化过氧化氢产生氧气推动染料移动的芯片实现黄曲霉毒素B1的定量检测。
2.如权利要求1所述的DNA智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于DNA智能水凝胶所用的序列为:
P-SA5’-Acrydite-TTTTGTGGGCCTAGCGA-3’
P-SB5’-Acrydite-TTTACACGTGCCCAAC-3’
Linker5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。
3.如权利要求2所述的DNA智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于:所述水凝胶中,接枝到丙烯酰胺上的两种短链DNAP-SA和P-SB与交联链DNA的浓度比为1:1:0.55。
4.如权利要求1所述的DNA智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于:所述DNA智能水凝胶中,各DNA链的浓度为55-100μM。
5.如权利要求1所述的DNA智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于:所述的具有颜色指示作用的纳米粒子为金纳米粒子,其在水凝胶中的包埋量为30-60nM。
6.如权利要求1所述的DNA智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于:所述的信号放大分子为铂纳米粒子,其在水凝胶中的包埋量为1-10nM。
7.如权利要求1所述的DNA智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于:所述水凝胶与含黄曲霉毒素B1样品的体积比为1:4-6。
8.如权利要求1所述的DNA智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于:所述DNA智能水凝胶与黄曲霉毒素B1的反应温度为20-30℃,反应时间为15-90min。
9.如权利要求1所述的DNA智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于:所述水凝胶中,接枝到丙烯酰胺上的两种短链DNA是通过末端修饰丙烯酰胺单体的DNA通过过硫酸铵和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺引发聚合得到。
10.如权利要求1所述的DNA智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于水凝胶的制备方法为:将两条丙烯酰胺-DNA与黄曲霉毒素B1核酸适体与具有颜色指示作用的纳米粒子或者信号放大分子混合制得。
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CN201610103017.9A CN105784995A (zh) | 2016-02-25 | 2016-02-25 | Dna智能水凝胶可视化定量和/或半定量检测黄曲霉毒素b1的方法 |
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