CN103852436B - 一种高特异性dna水凝胶对铅离子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法，包括如下步骤：步骤一，将显色大分子包埋在对铅离子响应的高特异性DNA水凝胶结构中；步骤二，铅离子刺激水凝胶从而释放出包埋于其中的显色大分子；步骤三，根据不同浓度的含铅样品对水凝胶的瓦解程度不同的原理，从上清溶液中显色大分子的颜色深浅实现对铅离子的可视化检测。与现有技术相比，本发明的一种高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法灵敏度高、选择性好、检测结果可靠，且成分低廉，检测快速，具有广泛推广的可能性。
Description
技术领域
本发明属于可视化定量分析方法技术领域，尤其涉及一种高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法。
背景技术
水凝胶是一类亲水性的高分子聚合物，能够在水环境下发生溶胀，依靠物理交联或化学交联两种方式生成。凝胶结构能够响应多种环境参数，如温度、pH、离子强度和溶剂组成等，而发生改变，因而也被称作“智能水凝胶”。基于各种传统意义上的水凝胶构建的传感器在响应各种外界信号并发生性质改变后，通常还要结合一些复杂、精密的仪器对特征变化进行表征和记录，这样往往耗时费力，不适合普及。DNA交联水凝胶的出现，极大地扩展了水凝胶传感器的应用范围（1、Liu J，Liu H，Kang H，et.al.，Aptamer-incorporated hydrogels for visual detection，controlled drug release,and targeted cancer therapy[J].Anal Bioanal Chem(2012)402:187–194.）。
具有催化功能的DNA片段被称为脱氧核酶(DNAzyme或者Deoxyribozymes)。自从1994年Breaker小组第一次发现这种具有催化功能的DNA片段以来，DNAzyme多种催化功能已被证实，目前发现DNAzyme的催化反应包括磷酸化、RNA切割、光逆转、DNA连接以及核肽的连接反应。功能核酸分子功能的多样性充分体现出来。脱氧核酶其中一个重要的性质是往往依赖金属离子的存在（如Pb2+、Cu2+、UO2+等）。(Juewen Liu,Zehui Cao,and Yi Lu,Functional Nucleic Acid Sensors[J].Chem.Rev.(2009)109:1948–1998)。脱氧核酶在自由体系中会形成类似环型的二级结构，在金属离子的存在下，切割特定的识别位点，使RNA分子裂解。分析化学工作者利用这一性质，将脱氧核酶开发成能够检测金属离子的生物传感器。应用目的则相对专一，主要是检测和分析(Tian Lan,Kimberly Furuyab,Yi Lu,A highly selectivelead sensor based on a classic lead DNAzyme.Chem.Commun.(2010)46:3896–3898)。
传统方法利用大型仪器如电感耦合等离子体质谱（ICP-MS），原子吸收光谱仪（AAS）等实现对铅离子的检测，花费较大，且需要复杂的样品制备过程。
即时诊断是近年来日渐成熟的一项诊断技术。所谓即时诊断（Point of CareTest，POC Test），是指在病人身旁迅速获得检测结果。该技术方便、快捷，不依赖昂贵的实验仪器设备或者专业的技术人员，亦不需借助复杂的样品处理步骤，依靠简单的设备读出信号或者通过观测试纸上条纹、斑点等的颜色变化来反映检测结果。除应用于医院、诊所中迅速获取病人信息外，即时诊断使疫情早期预警、家庭保健防护、贫困地区医疗乃至食物、水、环境等的现场监测等成为可能。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术中检测铅离子的手段复杂、价格昂贵等问题，提供一种快速、灵敏的高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法。
本发明采用如下的技术方案：
一种高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法，包括如下步骤：
步骤一，将显色大分子包埋在对铅离子响应的高特异性DNA水凝胶结构中；
步骤二，铅离子刺激水凝胶从而释放出包埋于其中的显色大分子；
步骤三，根据不同浓度的含铅样品对水凝胶的瓦解程度不同的原理，从上清溶液中显色大分子的颜色深浅实现对铅离子的可视化检测；
步骤四，拍照分析或者利用微量紫外-可见光谱仪测定上清溶液吸收，从而定量测定样品中铅离子浓度。
优选地，所述显色大分子为金纳米粒子。优选地，所述金纳米粒子的粒径为13nm。优选地，所述金纳米粒子在水凝胶中浓度为30-300nM。
优选地，所述水凝胶中，各DNA链的终浓度为50μM-1mM。
优选地，所述水凝胶与含铅样品的体积比为1:4-6。
优选地，所述水凝胶与含铅样品的反应时间为30min-3hr。
所述水凝胶的制备方法为：将两条丙烯酰胺-DNA高聚链、一条脱氧核酶底物链、一条脱氧核酶酶链与显色大分子混合制得。比如，采用金纳米粒子时，制备的水凝胶中DNA链的浓度为120μM:120μM：60μM：120μM，金纳米粒子浓度为100nM。
由上述对本发明的描述可知，与现有技术相比，本发明的一种高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法灵敏度高、选择性好、检测结果可靠，且成分低廉，检测快速，具有广泛推广的可能性。
附图说明
图1为丙烯酸亚磷酰胺单体合成路线。
图2为不同浓度铅离子对水凝胶的响应情况及相应的上清样品紫外可见吸收与铅离子浓度的对应关系。DNA水凝胶解胶实验在HEPES缓冲液（25mM HEPES,300mMNaCl,pH7）中于30℃，150rpm反应2.5hr。相机拍照，收集反应上清液，在微量可见紫外光谱仪上测其吸收，并作出不同浓度响应柱状图。
图3为铅离子响应水凝胶对不同离子的响应情况对比。其中铅离子浓度为1μM，其它离子浓度为1mM，为铅离子浓度的1000倍。DNA水凝胶解胶实验在HEPES缓冲液（25mM HEPES,300mM NaCl,pH7）中于30℃，150rpm反应1hr。相机拍照，收集反应上清液，在微量可见-紫外光谱仪上测其吸收，并作出不同离子响应柱状图。
图4为实测含铅的海水样，用标准样(含0nM，10nM铅离子)与之对比，发现其浓度略大于10nM，这与用大型仪器（ICP-MS）测得的结果相符（其测得的结果为20nM）。DNA水凝胶解胶实验在HEPES缓冲液（25mM HEPES,300mM NaCl,pH7）中于30℃，150rpm反应2.5hr。相机拍照，收集反应上清液，在微量可见紫外光谱仪上测其吸收，并作出不同离子响应柱状图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明作进一步的描述。
一、丙烯酸亚磷酰胺单体的合成
丙烯酸亚磷酰胺单体的合成分为三个步骤：1）将6-氨基-1-己醇（1g，8.53mmol），三乙胺（2.36mL，17mmol）加入100mL二氯甲烷中冰浴，在无水无氧条件下逐滴加入甲基丙烯酰氯（2.67g，2.55mmol），之后整个体系在室温条件下搅拌反应2小时。2）将溶剂旋干，向产物中加入10mL乙醇和15%NaOH（4mL）将产物选择性水解成N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide。将N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide用乙酸乙酯在硅胶柱分离之后进行下一步反应。3）将纯化后的N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide（0.50g，2.70mmol）溶于10mL无水二氯甲烷中，在0℃条件下逐滴加入N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，0.98g，7.5mmol），再逐滴加入2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺（0.87ml，3.25mmol），在室温反应2小时。将溶剂旋干后，将产物用乙酸乙酯:石油醚:三乙胺40:60:3的洗脱液在硅胶柱上洗脱。得到的终产物为无色油状液体。终产物的核磁表征数据如下：1H NMR(CDCl3):δ5.92(br,1H),5.63(m,1H),5.27(m.1H),3.86-3.72(m,2H),3.66-3.49(m,4H),3.30-3.23(m,2H),2.61(t,2H),1.92(m,3H),1.58-1.50(m,4H)1.37-1.32(m,4H)1.17-1.13(m,12H).13C NMR(CDCl3):δ168.6,140.4,119.3,118.0,63.8,63.6,58.6,58.3,43.2,43.1,39.8,31.3,29.7,26.8,25.8,24.9,24.8,24.7,19.0.31P(CDCl3):δ148。
二、甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化
以普通CPG作为固相载体，以DNA单体碱基为原料，在DNA合成仪上由3′端向5′端合成链A、链B及linker核酸适体，最后在两条链A和B的5′端修饰上前节中合成的丙烯酸亚磷酰胺单体。具体合成的序列见表1。合成结束后，将上述CPG转移至2ml洁净灭菌的Eppendorf管中，加入0.5mL甲胺：氨水=1:1的溶液，在65℃下氨解30min，使DNA从CPG上切割下来。氨解完毕后提取上清，并用少量超纯水清洗CPG，合并上清。向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl，于-20℃冰箱进行酒精沉淀30min。酒精沉淀完毕后，在14000rpm的转速下离心10min，弃上清。将得到的粗产物溶解在0.1mol/L的醋酸三乙胺（TEAA）中，使用反相高效液相色谱仪进行纯化。将通过反相-HPLC纯化后的产品进行真空干燥，溶于超纯水后使用凝胶过滤柱进行脱盐处理。使用紫外-可见分光光度计测定260nm处核酸的吸光度，根据DNA的消光系数计算出其相应的物质的量和浓度值。定量后真空浓缩。
三、水凝胶的制备
将链A和链B分别溶解在超纯水中配制成高浓度DNA储存液。分别配制10%的过硫酸铵和5%的TEMED，即0.05g过硫酸铵溶解至0.5ml超纯水和25μl TEMED溶解于0.5ml超纯水。将DNA与终浓度为4%的丙烯酰胺配成混合液，放入真空干燥器中抽真空除气10min。加入终浓度为0.14%的新鲜配制的引发剂（过硫酸铵）和0.07%加速剂（TEMED），混匀后将反应体系置于真空干燥器中，30℃条件下抽真空反应15min，得到链A和链B的线状高分子聚合产物PS-A、PS-B。将PS-A与PS-B按照1:1混合后，加入反应缓冲液（25mM HEPES,300mM NaCl,pH7），之后加入金纳米颗粒，再加入脱氧核酶底物链及酶链，保证终浓度PS-A:PS-B:脱氧核酶底物链:脱氧核酶酶链浓度比为1:1:0.5:1。重复振荡、加热步骤，直至得到均匀包裹有金纳米颗粒的三维交联水凝胶。上述反应在干浴器中进行，加热步骤在65℃保持5min，最后自然冷却至室温。
四、DNA水凝胶可视化定量检测步骤
使用前用超纯水将水凝胶清洗3次，并除去残留的缓冲液。检测时，上层加入不同样品，将离心管转移至摇床上，于30℃，150rpm的转速下进行充分反应。最终拍照记录，并用微量紫外可见吸收光谱仪测上清吸收。
表一具体实施方式中所用DNA序列
上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
Claims (8)
1.一种高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤一，将显色大分子包埋在对铅离子响应的高特异性DNA水凝胶结构中；
步骤二，铅离子刺激水凝胶从而释放出包埋于其中的显色大分子；
步骤三，根据不同浓度的含铅样品对水凝胶的瓦解程度不同的原理，从上清溶液中显色大分子的颜色深浅实现对铅离子的可视化检测；
所述水凝胶的制备方法为：将两条丙烯酰胺-DNA高聚链、一条脱氧核酶底物链、一条脱氧核酶酶链与显色大分子混合制得。
2.如权利要求1所述的一种高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法，其特征在于：还包括步骤四，拍照分析或者利用微量紫外-可见光谱仪测定上清溶液吸收，从而定量测定样品中铅离子浓度。
3.如权利要求1所述的一种高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法，其特征在于：所述显色大分子为金纳米粒子。
4.如权利要求3所述的一种高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法，其特征在于：所述金纳米粒子的粒径为13nm。
5.如权利要求3所述的一种高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法，其特征在于：所述金纳米粒子在水凝胶中浓度为30-300nM。
6.如权利要求1所述的一种高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法，其特征在于：所述水凝胶中，各DNA链的终浓度为50μM-1mM。
7.如权利要求1所述的一种高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法，其特征在于：所述水凝胶与含铅样品的体积比为1:4-6。
8.如权利要求1所述的一种高特异性DNA水凝胶对铅离子的检测方法，其特征在于：所述水凝胶与含铅样品的反应时间为30min-3hr。
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