CN105372421B - 基于智能水凝胶的禽流感病毒检测用荧光适配体传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器：选择对禽流感病毒H5N1具有高亲和力的DNA核酸适配体作为生物识别元件，设计与核酸适配体互补的单链DNA1和单链DNA2，丙烯酰胺基修饰的DNA链在引发剂的催化下能够聚合形成含有多条DNA支链的聚丙烯酰胺链，核酸适配体与单链DNA1之间的碱基互补配对发挥了交联剂的作用；当不存在目标物时，由于DNA链之间的杂交作用，凝胶处于收缩状态，量子点由于距离淬灭剂很近其荧光被淬灭；而当目标物存在时，适配体与目标物的结合导致DNA链之间的杂交被分解，使得凝胶溶胀，造成量子点与淬灭剂之间的距离增大，从而量子点荧光被恢复。

Description

基于智能水凝胶的禽流感病毒检测用荧光适配体传感器
技术领域
本发明涉及快速检测病毒的方法，尤其是涉及了一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器及其制备方法。
背景技术
禽流感是由A型流感病毒引起的禽类感染性疾病。禽流感病毒具有多形性，其中球形直径为80～120nm，有囊膜。依据其外膜血凝素H和神经氨酸酶蛋白N抗原性的不同，可分为16个H亚型和9个N亚型，其中感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N9等。高致病性禽流感病毒H5N1已经对全球公共卫生安全造成威胁，导致了巨大的经济损失。自从2003年，共有来自全球62个国家/地区的844人受到感染，其中449人因此死亡(WHO，截止2015年7月17日数据)。2014年底至2015年6月，美国中西部地区爆发了严重的H5亚型禽流感疫情，涉及21州，约4800万肉鸡受到感染(美国农业部，2014年12月19日-2015年6月17日数据)。因此，人们急需开发出快速、灵敏的检测方法，应用于禽流感病毒的现场检测中。
目前检测禽流感病毒的方法主要包括病毒分离法(金标)、ELISA等免疫法及其衍生法、PCR及其衍生法、基因法、以及微阵列法等。然而这些方法有的耗时太长、成本过高、有交叉反应，或要求昂贵的试剂仪器和实验条件。因此近年来许多学者们致力于研究和开发简捷快速的检测方法，如生物传感器法，其中已报道的有纳米磁珠放大的石英晶体微天平法、阻抗免疫法、基于纳米孔的酶反应安培传感法等。
水凝胶是一种具有交联结构的三维网状聚合物，性质柔软，能保持一定的形状。聚丙烯酰胺凝胶因其具有光学透明、易于修饰、制备简单等优点而被广泛用于制备智能响应水凝胶。另外，具有碱基互补配对原则的脱氧核糖核酸(DNA)序列非常适合在单链末端设计、修饰功能基团，并最终整合进入凝胶网络结构中，从而开发出多样的传感器。
作为抗体的替代品核酸适配体，拥有包括体积小、可连续合成、可控修饰、无毒、无免疫原性等在内的众多优点。因此以核酸适配体为基础的适配体传感器常被报道应用于可视化检测、分子识别、可控缓释以及分离等领域。特别地，将适配体作为设计和组成材料，与水凝胶整合，可个性化制备分子修饰的智能响应水凝胶，用于传感器开发。例如，Wang和Li将凝胶固定于QCM传感器表面，对禽流感病毒进行检测，但由于QCM易受环境因素的影响 而限制了其现场应用。
量子点作为一种新兴的荧光标记材料，相较于传统材料有许多优点，如较宽的激发光谱和较窄的发射光谱、多种量子点可被同一激发光源同时激发、较大的斯托克斯位移、较长的荧光寿命、较好的生物相容性等。例如，Liedl等已报道了在DNA聚合物凝胶中如何限制以及释放量子点。基于荧光量子点的淬灭法快速、简便、成本低、灵敏度高，将量子点渗入凝胶内部，不仅可以保护外界环境对其干扰，同时还可提供了在凝胶结构中充分发挥其光学特性的条件。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器及其制备方法和具体使用方法。本发明在总结现有技术问题的基础上，结合量子点的荧光淬灭法，提出并开发了一种基于智能响应水凝胶的适配体传感器，并利用功能化水凝胶对目标物的响应使其结构发生溶胀-收缩变化，引发量子点与淬灭剂之间的距离改变，从而导致荧光信号变化，以实现对禽流感病毒H5N1的简单、稳定、低成本、高专一性、无标记的快速筛查和现场检测。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器，其特征在于：
选择对禽流感病毒H5N1具有高亲和力的DNA核酸适配体作为生物识别元件，通过对其5’末端修饰丙烯酰胺基(Acrydite)，对其3’末端修饰修饰荧光淬灭基团IowaRQ，进行功能化修饰；针对性设计可与核酸适配体序列互补的单链DNA1和单链DNA2，并在单链DNA1的5’末端修饰丙烯酰胺基，在单链DNA2的5’末端修饰荧光量子点；丙烯酰胺基修饰的DNA链在引发剂的催化下能够聚合形成含有多条DNA支链的聚丙烯酰胺链；核酸适配体与单链DNA1之间的碱基互补配对发挥了交联剂的作用，使两种聚合物链相互连接，从而形成水凝胶；当不存在目标物时，由于DNA链之间的杂交作用，凝胶处于收缩状态，量子点由于距离淬灭剂很近其荧光被淬灭；而当目标物存在时，适配体与目标物的结合导致DNA链之间的杂交被分解，使得凝胶溶胀，造成量子点与淬灭剂之间的距离增大，从而量子点荧光被恢复。
本发明还同时提供了基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：
一、制备单链DNA2-量子点耦合物；
将浓度为4～10μM的单链DNA2与浓度为0.5～1.2μM的量子点溶液混于容器(例如为一 小离心管)中，在室温搅拌条件下孵育25～35min(较佳为30min)，所述单链DNA2与量子点的摩尔比为：10:1～30:1；得单链DNA2-量子点耦合物；
备注说明：将制备所得的单链DNA2-量子点耦合物存于4℃备用；
二、制备单链DNA1-适配体聚合物水凝胶：
(1)配置质量浓度0.1～20％(质量％)的丙烯酰胺水溶液作为储备液；
(2)配置引发剂-催化剂混合溶液：首先将0.5mL去离子水通氮气(8～12min，例如为10min)，然后加入0.05g过硫酸铵和25μL四甲基乙二胺，接着连续通氮气(8～12min，例如为10min)，得引发剂-催化剂混合溶液，备用；
(3)制备适配体-丙烯酰胺聚合物作为溶液Ⅰ：将0.5～5μM的适配体溶液200μL通氮气(4～6min，例如为5min)，然后加入70～80μL(较佳为75μL)步骤(1)制备而得的储备液和100μL步骤(2)制备而得的引发剂-催化剂混合溶液(新鲜制备)，接着连续通氮气(8～12min，例如为10min)，得溶液Ⅰ，备用；
所述适配体为对禽流感病毒H5N1具有高亲和力的DNA核酸适配体；
(4)制备单链DNA1-丙烯酰胺聚合物作为溶液Ⅱ：将0.5～5μM的单链DNA1溶液200μL通氮气(4～6min，例如为5min)，然后加入70～80μL(较佳为75μL)步骤(1)制备而得的储备液和100μL步骤(2)制备而得的引发剂-催化剂混合溶液(新鲜制备)，接着连续通氮气(8～12min，例如为10min)，得溶液Ⅱ，备用；
(5)制备水凝胶：将步骤(3)所得的全部的溶液Ⅰ以及步骤(4)所得的全部的溶液Ⅱ混合，然后连续通氮气(8～12min，例如为10min)，接着将其置于36～38℃中保持10～12小时(较佳为37℃，过夜)以挥发掉部分水分；
所得物置于93～97℃变性9～11min(较佳为95℃变性10min)，然后自然降温至室温，得水凝胶。
在本发明中，室温一般是指15～25℃。
本发明的基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器包括单链DNA2-量子点耦合物、单链DNA1-适配体聚合物水凝胶。
作为本发明的基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器的制备方法的改进：
所述单链DNA2的序列为：5’-/5Biosg/CAA CAG GAC AAC-3’。
所述单链DNA1的序列为：5’-/5Acryd/ATC CAT GCA CAC-3’。
作为本发明的基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器的 制备方法的进一步改进：所述步骤一中，单链DNA2和量子点溶液的用量比为25:1；更佳为：单链DNA2的浓度为5μM、量子点溶液的浓度为1μM；所述步骤二中，丙烯酰胺水溶液的质量浓度为0.2％，适配体溶液的浓度为1μM，单链DNA1溶液的浓度为1μM。
本发明制备了单链DNA-适配体为基础的功能化水凝胶，并利用功能化水凝胶对目标物进行响应，使其结构发生溶胀-收缩变化，引发量子点与淬灭剂之间的距离改变，从而导致荧光信号变化，实现了对目标物的无标记定量快速检测。
本发明所述的适配体传感器将两条修饰过的单链DNA序列和一条对目标物具有高度专一性的适配体序列引入到聚丙烯酰胺凝胶骨架中，形成了一种功能化的智能响应聚合物水凝胶。在目标物的刺激作用下，其结构或功能发生相应的改变。
本发明所述的适配体传感器将荧光量子点-淬灭剂体系的荧光淬灭-恢复作用与聚合物水凝胶的收缩-溶胀作用整合在一个体系中，巧妙地实现了将水凝胶对目标物的快速响应信号，转化为可读取的荧光信号，并由荧光体系输出信号。
本发明所述的配备有纳米荧光量子点的目标响应水凝胶适配体传感器成功地应用于对禽流感病毒H5N1的简便、快速、稳定、低成本、高专一性的无标记检测，为现场快速筛查和检测禽流感病毒提供了新的思路和解决方案。
本发明所述的这种通用型的传感器方法可被借鉴，用于开发多样的检测生命健康、环境监控、食品安全、生物安全等领域的其他类型的被测对象，比如血细胞、细菌、小分子、蛋白质等。
本发明所述的适配体传感器由于低成本、便捷、稳定性好、易被修饰和固定化，具有开发成一次性便携式检测试纸条的应用潜力：将功能化水凝胶通过物理吸附或生化修饰后直接固定在合适的一次性固体基板上(如玻璃片)，批量制备出一次性便携式检测试纸条，可方便地直接用于现场快速检测。
本发明所述的方法中制备了三种不同单体浓度的敏感型水凝胶A、B和C，依据其孔径大小不同的特点，总结了目标响应水凝胶在此类检测应用中的尺寸依赖特性；针对孔径相对较大的水凝胶A和B，以及孔径相对较小的水凝胶C提出了两种不同的检测机理，分别是：若水凝胶结构性孔径尺寸相对目标物和信号报告分子足够大，那么它们可以自由通过孔径，使得适配体与目标物反应引发荧光信号改变，表现为目标物越多，被淬灭的量子点越少，荧光信号越强(水凝胶A和B)；若水凝胶结构性孔径尺寸足够小，阻碍了目标物和信号报告分子自由进入水凝胶内部，使得目标物只能先与处在水凝胶网状结构外层的适配体反应，使得外层凝胶发生溶胀，扩大了外层凝胶孔径，有利于信号报告分子和更多目标物的渗入，而 尺寸相对较小的信号报告分子渗透速率快于尺寸相对较大的目标物，从而与处在水凝胶网状结构内层的适配体优先反应并淬灭量子点荧光，表现为目标物越多，被淬灭的量子点越多，荧光信号越弱(水凝胶C)。
本发明所述的适配体传感器具有尺寸依赖特性，该特性为开发类似基于智能响应水凝胶的适配体传感器提供了新的思路，即针对目标物尺寸大小，量身设计与定制具有合适孔径大小和交联度的水凝胶，以达到高灵敏度检测。
本发明采用的技术方案主要包含：
(1)设计和合成了功能化的适配体和两条单链DNA(单链DNA1和单链DNA2)；(2)分别制备了具有多条单链DNA1支链的聚丙烯酰胺链和具有多条核酸适配体支链的聚丙烯酰胺链；(3)通过单链DNA1序列和部分核酸适配体序列之间的碱基互补配对原则使两种聚合物链相互连接，制备了功能化水凝胶；(4)通过调节单体丙烯酰胺的用量，分别制备了三种不同结构性孔径的功能化水凝胶；(5)制备了单链DNA2-量子点偶联物；(6)采用石英晶体微天平和荧光淬灭法对水凝胶结构中适配体对目标物的响应活性进行了确证；(7)采用纳米磁珠渗透法和扫描电子显微镜对水凝胶的微结构和形态特征进行了定性和半定量观察；(8)采用流变仪对不同水凝胶及其在结合目标物前后的流变特性变化进行了定量研究；(9)对核酸适配体的浓度、目标物与适配体的孵育时间，以及检测步骤进行了合理的优化；(10)将不同浓度的目标物(禽流感病毒H5N1)与荧光信号报告分子(单链DNA2-量子点偶联物)加入功能化水凝胶中反应，用一套便携式荧光光谱仪采集荧光信号，实现了基于智能响应水凝胶的荧光适配体传感器对禽流感病毒样本的快速检测；(11)对该传感器进行了专一性和储存稳定性的评价；(12)进一步探讨研究和详细论述了该智能响应水凝胶适配体传感器在目标物检测中的尺寸依赖特性，发现凝胶的孔径大小在本发明方法中起到了至关重要的作用。这种尺寸依赖性的凝胶检测特性也在本发明中阐明。
本发明所述的一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器，首先需要选择对禽流感病毒H5N1具有高亲和力的DNA核酸适配体作为生物识别元件，在其5’末端共价交联丙烯酰胺基(Acrydite)，在其3’末端共价交联荧光淬灭基团Iowa RQ，进行功能化修饰；针对性设计可与核酸适配体序列互补的单链DNA1和单链DNA2，并在单链DNA1的5’末端修饰丙烯酰胺基，在单链DNA2的5’末端修饰荧光量子点。在引发剂的催化下，修饰后的DNA核酸适配体能够聚合形成含有多条DNA支链的聚丙烯酰胺链。核酸适配体与单链DNA1之间的碱基互补配对发挥了交联剂的作用，使两种聚合物链相互连接，从而形成水凝胶。当不存在目标物时，由于DNA链之间的杂交作用，凝胶处于收缩状 态，量子点由于距离淬灭剂很近其荧光被淬灭；而当目标物存在时，适配体与目标物的结合导致DNA链之间的杂交被分解，使得凝胶溶胀，造成量子点与淬灭剂之间的距离增大，从而量子点荧光被恢复。
所述的一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器，将两条修饰过的单链DNA序列和一条对目标物具有高度专一性的适配体序列引入到聚丙烯酰胺凝胶骨架中，形成了一种功能化的智能响应聚合物水凝胶。在目标物的刺激作用下，其结构或功能发生相应的改变。
所述的一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器，将荧光量子点-淬灭剂体系的荧光淬灭-恢复作用与聚合物水凝胶的收缩-溶胀作用整合在一个体系中，巧妙地实现了将水凝胶对目标物的快速响应信号，转化为可读取的荧光信号，并由荧光体系输出信号。
所述的一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器，配备有纳米荧光量子点，成功地应用于不同浓度的禽流感病毒H5N1的简便、快速、稳定、低成本、高专一性的无标记检测。
本发明具有的有益效果是：
1、本发明实现了对禽流感病毒H5N1的简便、快速、稳定、低成本、高专一性的无标记检测，为现场快速筛查和检测禽流感病毒提供了新的思路和解决方案。其中，
简便：本发明所述的传感器，其检测步骤和操作只需将目标物溶液与荧光信号报告分子溶液一起加入到已制备好的功能化水凝胶中，反应30分钟后便可读取数据，分析结果，实现了一步检测；
快速：本发明所述的检测方法从加样到输出结果只需约30分钟；
稳定：本发明所述的传感器在4摄氏度冰箱中保存3个月后，对同一样本检测的输出信号没有显著性变化，其性能稳定可靠，保存性好；
低成本：本发明所述的检测方法所需要的大部分生化试剂价格较低，其单次检测所需的试剂用量较少，水凝胶只需80微升；
高专一性：本发明所述的传感器所采用的适配体对目标物具有高度专一性，较少受到类似目标物的干扰；
无标记：本发明所述的传感器由于不涉及目标物与标记分子的连结而省去了标记环节，直接由目标物的加入触发传感器的信号变化，其中的量子点不是标记分子，仅是荧光信号报告分子；
适合现场检测：本发明所述的传感器配备有一套由便携式光源、检测器以及手提电脑组成的荧光检测系统，检测所占用的空间小，有较好的便携性，操作只需一步即可完成检测，检测总耗时较短，检测成本较低，检测信号稳定，保存性好，非常适合现场快速检测。
2、本发明所述的这种通用型的传感器方法可以被借鉴，用于开发检测生命健康、环境监控、食品安全、生物安全等领域的其他类型的被测对象，比如血细胞、细菌、小分子、蛋白质等。
3、本发明所述的配备有纳米荧光量子点的基于目标响应水凝胶的适配体传感器，具有同时检测多种目标物的潜力：将多种荧光量子点同时整合进水凝胶中，与多种专一性的适配体形成配对。在同一激发光源作用下，不同的量子点会分别显示不同的荧光最大发射波段，从而指示多种被测对象的存在，并定量给出其浓度。
4、本发明所述的适配体传感器由于低成本、便捷、稳定性好、易被修饰和固定化，具有开发成一次性便携式检测试纸条的应用潜力：将功能化水凝胶通过物理吸附或生化修饰后直接固定在合适的一次性固体基板上(如玻璃片)，批量制备出一次性便携式检测试纸条，可方便地直接用于现场快速检测。
5、本发明所述的适配体传感器具有尺寸依赖特性，该特性为设计开发基于智能响应水凝胶的适配体传感器提供了新的思路，即针对目标物尺寸大小，量身设计与定制具有合适孔径大小和交联度的水凝胶，以达到高灵敏度检测。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为图1是本发明智能响应水凝胶荧光适配体传感器快速检测禽流感病毒H5N1的原理示意图。
图2是本发明智能响应水凝胶荧光适配体传感器对浓度范围2-4到26凝集单位(HAU)的禽流感病毒检测结果图，其中(a)为量子点最大发射波长626nm时各浓度样本和对照样本所对应的荧光发射光谱图，(b)为各荧光强度对各浓度的线性回归曲线；(a)中从上至下依次为样本26、24、22、20、2-2、2-4、0以及溶剂TBE所对应的荧光图谱；图中均值和误差棒(标准误差)均是基于三次重复实验的结果。
图3是本发明(a)三种不同孔径的智能响应水凝胶荧光适配体传感器对不同浓度的禽流感病毒(20、22、24和26HAU)检测的结果图，以及(b)两种基于水凝胶尺寸依赖特性的检测机理的探讨。对于水凝胶A和B遵循的检测机理如(b)左图所示，对于水凝胶C遵循的检测机理如(b)右图所示；图中均值和误差棒(标准误差)均是基于三次重复实验的结果。
图4是本发明(a)采用两种不同直径的磁珠分别模拟病毒颗粒和荧光信号报告分子耦合物自然渗透并下沉穿过功能化水凝胶的过程，以及(b)采用一种与荧光信号报告分子耦合物尺寸相当的磁珠分别在有和无病毒颗粒存在时，在水凝胶中的自然渗透并下沉扩散的情况。
图5是本发明三种不同孔径的智能响应水凝胶的透射电镜SEM观察图。
图5中，
水凝胶A对应的3张图，从左至右标尺刻度依次为：10μm、4μm、500nm；
水凝胶B对应的2张图，从左至右标尺刻度依次为：5μm、1μm；
水凝胶C对应的4张图，从左至右标尺刻度依次为：5μm、5μm、3μm、1μm；
图6是本发明三种不同孔径的智能响应水凝胶本身的粘度比较，以及各自在对目标物病毒进行响应后的粘度变化情况；图中均值和误差棒(标准误差)均是基于三次重复实验的结果。
图7是本发明适配体传感器在检测过程中，(a)对检测步骤调整优化结果图，(b)对核酸适配体浓度优化结果图，以及(c)对孵育时间的优化结果图。结果表明同时添加信号报告分子试剂和被测物溶液到水凝胶中，适配体浓度为1μM，以及孵育时间为30分钟时，传感器响应得到较高的灵敏度；图中均值和误差棒(标准误差)均是基于三次重复实验的结果。
图8是本发明适配体传感器的性能评价结果图，其中(a)采用6种其他禽流感病毒(H5N2、H5N3、H1N1、H2N2、H4N8和H7N2)对此针对H5N1的适配体传感器的专一性评价试验结果图，(b)为通过比较该传感器在4摄氏度冰箱中储存3个月后对同一样品的检测结果，评价其储存稳定性的试验结果图。图中均值和误差棒(标准误差)均是基于三次重复实验的结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图，对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
如图1所示，本发明所述的一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器，首先合理地选择了对禽流感病毒H5N1具有高亲和力的DNA核酸适配体作为生物识别元件，通过对其5’末端修饰丙烯酰胺基(Acrydite)，对其3’末端修饰修饰荧光淬灭基团Iowa RQ，进行功能化修饰；其次，针对性设计可与核酸适配体互补的单链DNA1和单链DNA2，并在单链DNA1的5’末端修饰丙烯酰胺基，在单链DNA2的5’末端修饰荧光量子点。丙烯酰胺基修饰的DNA在引发剂的催化下能够聚合形成含有多条DNA支链的聚丙烯酰胺链。核酸适配体与单链DNA1链之间的碱基互补配对发挥了交联剂的作用，使两种聚合物链相互连接，从而形成水凝胶。当不存在目标物时，由于DNA链之间的杂交作 用，凝胶处于收缩状态，量子点由于距离淬灭剂很近其荧光被淬灭；而当目标物存在时，适配体与目标物的结合导致处于杂交状态的两段DNA序列相互分解，使得凝胶溶胀，造成量子点与淬灭剂之间的距离增大，从而量子点荧光恢复，实现了对目标物进行无标记的定量检测。
实施例1、一种基于智能响应水凝胶的快速检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器的制备方法，具体如下：
一、制备单链DNA2-量子点耦合物
将单链DNA2(80μL，5μM)与量子点溶液(16μL，1μM)混于一小离心管中，在室温搅拌条件下孵育30min，保存于4℃备用。
所述单链DNA2的序列为：5’-/5Biosg/CAA CAG GAC AAC-3’。
所述量子点溶液的配方为：硒化镉/硫化锌CdSe/ZnS核壳型半导体荧光量子点，溶剂为硼酸盐缓冲液(0.05M，pH 7.4)，最大发射波长为626nm。
二、制备单链DNA1-适配体聚合物水凝胶：
(1)、配置0.2％(质量％)的丙烯酰胺水溶液作为储备液；
(2)、配置引发剂-催化剂混合溶液：首先将0.5mL去离子水通氮气10min，然后加入0.05g过硫酸铵和25μL四甲基乙二胺溶液，接着连续通氮气10min，备用；
备注说明：通氮气的作用是去除溶液中溶解的氧，以下同；
(3)、制备适配体-丙烯酰胺聚合物作为溶液Ⅰ：将适配体溶液(200μL，1μM)通氮气5min，然后加入75μL步骤(1)制备而得的储备液和100μL的新鲜制备的步骤(2)的引发剂-催化剂混合溶液，接着连续通氮气10min，备用；
所述适配体为对禽流感病毒H5N1具有高亲和力的DNA核酸适配体，其具体为：5’-/5Acryd/GTG TGC ATG GAT AGC ACG TAA CGG TGT AGT AGA TAC GTG CGG GTA GGA AGAAAG GGA AAT AGT TGT CCT GTT G/3IAbRQSp/-3’，参考文献Wang etal.J.Virol.Methods,2013,189,362-369。
(4)、制备单链DNA1-丙烯酰胺聚合物作为溶液Ⅱ：将单链DNA1溶液(200μL，1μM)通氮气5min，然后加入75μL的步骤(1)所得的储备液和100μL的新鲜制备的步骤(2)中的引发剂-催化剂混合溶液，接着连续通氮气10min，备用；
所述单链DNA1的序列为：5’-/5Acryd/ATC CAT GCA CAC-3’。
(5)制备水凝胶：将步骤(3)所得的全部的溶液Ⅰ以及步骤(4)所得的全部的溶液Ⅱ混合，然后连续通氮气10min，接着将其置于37℃过夜(约12小时)以挥发掉部分水分， 得到初始的水凝胶；取其中部分的初始的水凝胶(80μL)置于95℃变性10min，立即取出，置于室温30min(自然降温至室温)，备用。
(6)此法制备得到的水凝胶记为水凝胶A。参照同样的方法，按照单体丙烯酰胺用量1：10：100(A：B：C)的比例，制备另外两种水凝胶B和C。
即，将上述步骤(1)中的0.2％(质量％)改成2％(质量％)；其余等同，从而获得水凝胶B；
同理，上述步骤(1)中的0.2％(质量％)改成20％(质量％)；其余等同，从而获得水凝胶C。
对上述3种水凝胶(水凝胶A、水凝胶B、水凝胶C)的各项性能检测如下：
一、依据常规的荧光法进行检测：
如图3所示，利用三种制备得到的不同单体浓度的水凝胶，对不同浓度(20、22、24和26HAU)的禽流感病毒H5N1进行检测，发现水凝胶C对病毒浓度变化的响应趋势与水凝胶A和B正好相反，结果如图3(a)所示。因此，本发明大胆提出和详细探讨了两种基于水凝胶尺寸依赖特性的检测机理，分别是：若水凝胶结构性孔径尺寸相对目标物和信号报告分子足够大，那么它们可以自由通过孔径，使得适配体与目标物反应引发荧光信号改变，表现为目标物越多，被淬灭的量子点越少，荧光信号越强(水凝胶A和B)；若水凝胶结构性孔径尺寸足够小，阻碍了目标物和信号报告分子自由进入水凝胶内部，使得目标物只能先与处在水凝胶网状结构外层的适配体反应，使得外层凝胶发生溶胀，扩大了外层凝胶孔径，有利于信号报告分子和更多目标物的渗入，而尺寸相对较小的信号报告分子渗透速率快于尺寸相对较大的目标物，从而与处在水凝胶网状结构内层的适配体优先反应并淬灭量子点荧光，表现为目标物越多，被淬灭的量子点越多，荧光信号越弱(水凝胶C)。对于水凝胶A和B遵循的检测机理如图3(b)左图所示，对于水凝胶C遵循的检测机理如图3(b)右图所示。
二、如图4所示，将20μL的两种不同直径的磁珠(一个直径为150nm左右，另一个为20nm左右)，分别轻缓地加入到位于小试管底部的100μL水凝胶上部，静止于桌面上，分别对应模拟病毒颗粒和荧光信号报告分子耦合物自然渗透、下沉穿过功能化水凝胶的过程，不同时间点(0、30、60分钟)的观察结果如图4(a)所示。
根据图4(a)的结果，我们得知：直径为20nm左右和150nm左右的颗粒物在三种水凝胶中的穿行速度不同，在水凝胶A中最快，在水凝胶B中其次且与A中的所用时间很接近，在水凝胶C中最慢。这个实验定性地说明了不同单体浓度的水凝胶的孔径尺寸不同，水凝胶A最大，水凝胶B其次且与A很接近，水凝胶C最小。
另外，将与荧光信号报告分子耦合物尺寸相当的磁珠(～20nm)轻缓地加入到位于小试管底部的100μL水凝胶上部，静止于桌面上，分别在有、无目标病毒颗粒(10μL的H5N1病毒溶液，64HAU)存在时，观察其在水凝胶中的自然渗透、下沉扩散情况，不同时间点(0、30、60、240分钟)的观察图如图4(b)所示。
根据图4(b)的结果，我们得知：直径为20nm左右的颗粒物在三种目标病毒加入前后的水凝胶中的穿行速度不同，在目标病毒加入后的水凝胶中的速度略快于目标病毒加入前的水凝胶。这个实验定性地说明了目标病毒的加入导致了水凝胶结构的溶胀变化，从而增大了各水凝胶的孔径大小。
三、依据常规的扫描电子显微镜法进行观察：
扫描电子显微镜SEM用于观测水凝胶的微结构和孔径大小。为了制备SEM样本，首先将足量的水凝胶置于液氮中迅速冷冻2min，然后在-54℃负压16Pa的条件下冷冻干燥96h，接着将样本转移到液氮中1min，立刻敲成碎片，收集于样品架上进行喷金处理，最后进行SEM观察。
根据图5，我们得知：水凝胶A和B的孔径大小约为300-400nm，其中水凝胶B的孔径略小于A，水凝胶C的孔径大小在100nm以内，最小的可至几个纳米。SEM所观测到的结果与上文(一)相符。
四、依据常规的粘度测定法进行检测：
如图6所示，采用动态流变仪对三种不同孔径的智能响应水凝胶的粘度，以及各自在对目标物病毒进行响应后的粘度变化情况进行了检测和比较，其结果如图6所示。检测时，直接将足量的样本置于检测平台上，在初始高度1000μm、步进剪切力0-300/s、压力30psi的条件下，在室温进行粘度测定。
根据图6，我们可以定量得到水凝胶A、B和C的粘度以及在目标病毒加入后它们的粘度变化(均减小)，此结论与上文(二)结果相符，与(一)中的假设推理也相符。
从图3(a)中三条回归曲线的灵敏度判断，采用水凝胶C当作传感器部件最灵敏，A其次，B最不灵敏，而水凝胶A和C的灵敏度相差不大。但是，水凝胶C本身的粘度很大，在实际操作中显得有点不方便，因此从综合来看，采用水凝胶A当做传感器部件为最佳方案。
实施例2、利用上述基于智能响应水凝胶的荧光适配体传感器进行的不同浓度的禽流感病毒H5N1进行快速检测法：
本发明所述的适配体传感器配套使用的一个便携式荧光光谱检测系统(参考自美国专利US 2008/0135490 A1)，其组成包括：
(1)一个可检测波长360到900nm的USB2000光学检测器；
(2)一个可发射380nm激发光的便携式光源；
(3)一根可传导紫外-可见反射/散射光的光纤及探头；
(4)一个自制可装比色皿的黑箱；
(5)以及一套可读取检测数据和显示检测结果的软件和手提电脑。
其使用方法具体如下(以水凝胶A为例)：
如图2所示，本发明所述的一种基于智能响应水凝胶的荧光适配体传感器，可对不同浓度的禽流感病毒H5N1进行快速检测。
其中检测步骤为：将20μL不同浓度的目标物禽流感病毒H5N1(0、2-4、2-2、20、22、24和26HAU)加入到80μL的水凝胶中，同时加入10μL的单链DNA2-量子点耦合物溶液，室温孵育30min后即可进行荧光测量。以TBE缓冲溶液代替目标物进行同步实验作为负对照。检测得到的荧光光谱图，如图2(a)所示，将最大发射波长(626nm)下的各荧光强度对各浓度作图得到线性回归曲线(y＝21.7x+798.3，R2＝0.94)，如图2(b)所示。根据3倍信噪比可计算得到该适配体传感器的检测限为0.2HAU。
采用类似的方法，水凝胶B和C对不同浓度禽流感病毒的检测实验结果如图3(a)所示。
对比实验1、如图7(a)所示，本发明对该适配体传感器在禽流感病毒中的检测步骤进行了对比和优化调整，具体是参照同样的检测参数，比较了同时添加信号报告分子试剂和被测物溶液到水凝胶中的试验，以及先添加被测物溶液到水凝胶中进行孵育，然后再添加信号报告分子试剂到反应溶液中进行再次孵育的试验。即，具体为：将20μL不同浓度的目标病毒溶液(0、1、4和16HAU)加入到80μL的水凝胶中。在一份样品中同时加入10μL的单链DNA2-量子点耦合物溶液，室温孵育30min后进行荧光测量；对于另一份样品，先让病毒和水凝胶室温孵育30min后，再加入10μL的单链DNA2-量子点耦合物溶液，然后在室温孵育30min后进行荧光测量，检测得到最大发射波长(626nm)下的荧光光谱图，和各荧光强度对各浓度作图得到线性回归曲线。
其结果如图7(a)所示，结果表明同时添加信号报告分子试剂和被测物溶液到水凝胶中，传感器响应得到更高的斜率(即灵敏度)，其性能更好。
对比试验2、如图7(b)所示，本发明优化了该传感器的核酸适配体浓度。即，具体为：采用不同浓度的核酸适配体(0.5、1、2.5和5μM)制备得到几种水凝胶，将20μL不同浓度的目标病毒溶液(0、1、4和16HAU)加入到80μL的各水凝胶中，同时加入10μL的单链DNA2-量子点耦合物溶液，室温孵育30min后进行荧光测量，检测得到最大发射波长(626nm) 下的荧光光谱图，作图可得和各荧光强度对各浓度的线性回归曲线。
其结果如图7(b)所示，结果表明适配体浓度为1μM时，传感器的斜率更大，表明其灵敏度更好。
对比试验3、如图7(c)所示，本发明对该传感器与目标物的孵育时间进行了优化。即，具体为：将20μL的目标病毒溶液(16HAU)加入到80μL的各水凝胶中，同时加入10μL的单链DNA2-量子点耦合物溶液，在室温分别孵育不同的时间(0、15、30和45min)后进行荧光测量，检测得到最大发射波长(626nm)下的荧光强度。
其结果如图7(c)所示，结果表明孵育时间为45分钟时的结果和30分钟时的结果没有显著性差异(p>0.05)。而与15分钟时的结果有显著性差异(p<0.05)。因此该传感器选择30分钟作为孵育时间。
对比试验4、如图8(a)所示，本发明对该适配体传感器的专一性进行了评价，具体内容如下：将20μL的目标病毒溶液(16HAU)和其他6种其他禽流感病毒(H5N2、H5N3、H1N1、H2N2、H4N8和H7N2)分别加入到80μL的各水凝胶中，同时各加入10μL的单链DNA2-量子点耦合物溶液，在室温分别孵育不同的时间30min后进行荧光测量，检测得到最大发射波长(626nm)下的荧光强度。
如图8(a)所示，专一性试验结果是本发明所述的适配体传感器对目标病毒具有很好的响应，值为约950，而对其他几种非目标病毒的响应均在控制线或以下。因此，此针对H5N1的适配体传感器具有高度专一性，其他6种非目标性禽流感病毒(H5N2、H5N3、H1N1、H2N2、H4N8和H7N2)对其没有显著性影响。
对比试验5、如图8(b)所示，本发明对该适配体传感器的储存稳定性进行了评价，具体内容如下：将刚制备好的水凝胶分两部分，取一部分(80μL)与20μL的目标病毒溶液(32HAU)混合，同时各加入10μL的单链DNA2-量子点耦合物溶液，在室温分别孵育不同的时间30min后进行荧光测量，检测得到最大发射波长(626nm)下的荧光强度。将另一部分储存于4摄氏度冰箱中3个月。然后进行同样的检测实验，得到相应的荧光强度。
如图8(b)所示，储存稳定性试验结果表明，该传感器在4摄氏度冰箱中储存3个月后对同一样品的响应没有显著性下降，其性能稳定，保存性好。
对比试验6、为了证明本发明所述的适配体与单链DNA1和单链DNA2之间的互补配对能力，仅仅改变部分单链DNA1的序列(具体如下)，将其与适配体序列进行配对分析(OligoAnalyzer 3.1，Integrated DNA Technologies,Inc.)，所得的结果如下：
在DNA1链5’末端修改三个碱基，序列为：5’-/5Acryd/GGG CAT GCA CAC-3’，即得到DNA1-Ⅰ。它与适配体配对形成二聚体的最小ΔG1-Ⅰ为-6.44kcal/mole(千卡/摩尔)；
在DNA1链中部修改三个碱基，序列为5’-/5Acryd/ATC GGG GCA CAC-3’：，即得到DNA1-Ⅱ。它与适配体配对形成二聚体的最小ΔG1-Ⅱ为-9.73kcal/mole；
在DNA1链3’末端修改三个碱基，序列为：5’-/5Acryd/ATC CAT GCA GGG-3’，即得到DNA1-Ⅲ。它与适配体配对形成二聚体的最小ΔG1-Ⅲ为-6.62kcal/mole；
而DNA1和适配体互补配对的形成二聚体的最小ΔG1为-21.23kcal/mole。
一般而言，在DNA二聚体的形成中，若ΔG为负值，则该结构可以自发形成；为正值，则不可自发形成。ΔG绝对值越大，结构越稳定；ΔG绝对值越小，结构越不稳定。尽管其他三条修改后的单链DNA1所得的ΔG1-Ⅰ、ΔG1-Ⅱ和ΔG1-Ⅲ都是负值，但其绝对值均远小于所设计的单链DNA1对应的ΔG1的绝对值。因此，该结果表明，修改后的三条链中任何一条与适配体形成二聚体时，其结构均远没有所设计的单链DNA1与适配体之间形成的二聚体结构稳定。
类似地，仅仅改变部分单链DNA2的序列(具体如下)，将其与适配体序列进行配对分析(OligoAnalyzer 3.1，Integrated DNA Technologies,Inc.)，所得的结果如下：
在DNA2链5’末端修改三个碱基，序列为：5’-/5Biosg/GGG CAG GAC AAC-3’，即得到DNA2-Ⅰ。它与适配体配对形成二聚体的最小ΔG2-Ⅰ为-5.24kcal/mole；
在DNA2链中部修改三个碱基，序列为5’-/5Biosg/CAA CAC CCC AAC-3’，即得到DNA2-Ⅱ。它与适配体配对形成二聚体的最小ΔG2-Ⅱ为-7.71kcal/mole；
在DNA2链3’末端修改三个碱基，序列为：5’-/5Biosg/CAA CAG GAC GGG-3’，即得到DNA2-Ⅲ。它与适配体配对形成二聚体的最小ΔG2-Ⅲ为-5.24kcal/mole；
而DNA2和适配体互补配对的形成二聚体的最小ΔG2为-20.02kcal/mole。
同样地，尽管其他三条修改后的单链DNA2所得的ΔG2-Ⅰ、ΔG2-Ⅱ和ΔG2-Ⅲ都是负值，但其绝对值均远小于所设计的单链DNA2对应的ΔG2的绝对值。因此，该结果表明，修改后的三条链中任何一条与适配体形成二聚体时，其结构均远没有所设计的单链DNA2与适配体之间形成的二聚体结构稳定。
上述具体实施方式仅用于解释说明本发明，而非对本发明进行限制。尽管参照具体实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都在本发明技术方案的精神和范围内，均应落入本发明的权利要求和保护范围之内。

Claims (1)

1.基于智能响应水凝胶的检测禽流感病毒H5N1的荧光适配体传感器的制备方法，依次进行以下步骤：
一、制备单链DNA2-量子点耦合物
将80μL浓度为5μM的单链DNA2与16μL浓度为1μM量子点溶液混于一小离心管中，在室温搅拌条件下孵育30min，保存于4℃备用；
所述单链DNA2的序列为：5’-/5Biosg/CAA CAG GAC AAC-3’；
所述量子点溶液的配方为：硒化镉/硫化锌CdSe/ZnS核壳型半导体荧光量子点，溶剂为0.05M、pH 7.4的硼酸盐缓冲液，最大发射波长为626nm；
二、制备单链DNA1-适配体聚合物水凝胶：
(1)配置质量％为20％的丙烯酰胺水溶液作为储备液；
(2)配置引发剂-催化剂混合溶液：首先将0.5mL去离子水通氮气10min，然后加入0.05g过硫酸铵和25μL四甲基乙二胺，接着连续通氮气10min，备用；
通氮气的作用是去除溶液中溶解的氧，以下同；
(3)制备适配体-丙烯酰胺聚合物作为溶液Ⅰ：将200μL浓度为1μM的适配体溶液通氮气5min，然后加入75μL步骤(1)制备而得的储备液和100μL的新鲜制备的步骤(2)的引发剂-催化剂混合溶液，接着连续通氮气10min，备用；
所述适配体为对禽流感病毒H5N1具有高亲和力的DNA核酸适配体，其具体为：5’-/5Acryd/GTG TGC ATG GAT AGC ACG TAA CGG TGT AGT AGA TAC GTG CGG GTA GGA AGAAAG GGA AAT AGT TGT CCT GTT G/3IAbRQSp/-3’；
(4)制备单链DNA1-丙烯酰胺聚合物作为溶液Ⅱ：将200μL浓度为1μM的单链DNA1溶液通氮气5min，然后加入75μL的步骤(1)所得的储备液和100μL的新鲜制备的步骤(2)中的引发剂-催化剂混合溶液，接着连续通氮气10min，备用；
所述单链DNA1的序列为：5’-/5Acryd/ATC CAT GCA CAC-3’；
(5)制备水凝胶：将步骤(3)所得的全部的溶液Ⅰ以及步骤(4)所得的全部的溶液Ⅱ混合，然后连续通氮气10min，接着将其置于37℃过夜以挥发掉部分水分，得到初始的水凝胶；取80μL初始的水凝胶置于95℃变性10min，立即取出，置于室温30min以自然降温至室温，备用；
该水凝胶结构性孔径尺寸足够小，阻碍了目标物H5N1和信号报告分子单链DNA2-量子点耦合物自由进入水凝胶内部，使得目标物H5N1只能先与处在水凝胶网状结构外层的适配体反应，使得外层凝胶发生溶胀，扩大了外层凝胶孔径，有利于信号报告分子单链DNA2-量子点耦合物和更多目标物H5N1的渗入，而尺寸相对较小的信号报告分子单链DNA2-量子点耦合物渗透速率快于尺寸相对较大的目标物H5N1，从而与处在水凝胶网状结构内层的适配体优先反应并淬灭量子点荧光，表现为目标物H5N1越多，被淬灭的量子点越多，荧光信号越弱。
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