CN101443459A

CN101443459A - 用于在分析检测方法中校正样品基体效应的样品对照

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Publication number: CN101443459A
Application number: CNA200780017404XA
Authority: CN
Inventors: K·A·施密特; G·W·吕卡森; S·内尔肯
Original assignee: Koninklijke Philips Electronics NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2006-05-16
Filing date: 2007-05-08
Publication date: 2009-05-27
Also published as: US20090162888A1; CN101443461A; WO2007135591A1; BRPI0711844A2; EP2019870A1; JP2009537816A; RU2008149512A

Abstract

本发明描述了适于确定样品基体对标记检测的效应的方法和系统，以便当在分析检测技术中使用所述标记时允许校正这些样品基体效应。该方法对于在一次性分子诊断盒中的应用是特别有利的。

Description

用于在分析检测方法中校正样品基体效应的样品对照

本发明涉及对标记检测发生样品基体效应的确定方法以及根据所述方法的设备操作，所述方法使得在包括应用该标记或类似标记的分析技术中这些样品基体效应得以校正。

尽管在医疗诊断学、病理学、毒理学、流行病学、生物战、环境取样、法医学和诸如比较蛋白质组学和基因表达研究的许多其它领域中具有广泛的潜在应用，生物分子诸如蛋白质、肽、寡核苷酸、核酸、脂质、多糖、激素、神经递质、代谢物等的灵敏准确检测——定性或定量——已经证明是一个令人困惑的目标。

涉及DNA检测的具体例子是例如在医疗诊断学中诸如传染原如病原菌和病毒的检测、先天性和获得性遗传病的诊断等等，在法医试验中作为犯罪调查的一部分、在亲子关系纠纷中、在全基因组测序中等等。

尽管纯化的生物分析物样品的鉴定和/或定量有时可以基于分析物本身的物理化学性质进行，但是能够鉴定和/或定量非纯化样品中的分析物的大多数检测方法利用了“探针”，其是具有强亲和性的已知分子，并对于该分析物还优选具有高度特异性。在分析物是蛋白质或肽的情况下，这些确定被称为配体-结合确定(例如，免疫确定)。DNA的检测通常利用特异于靶DNA的核苷酸序列的杂交。

在这些基于探针的检测确定中，分析物特异性的探针(或分析物)或直接或间接用可追踪的物质标记。通过探针结合分析物的可追踪物质(下文称为“标记”)的检测是试验样品中分析物含量的指示。取决于所采用标记的性质，标记的检测可利用各种不同的技术加以保证。

一种生物技术分析技术是拉曼光谱确定法。在拉曼光谱确定法中，由样品中的分子进行的光的非弹性散射(称为拉曼散射)被检测。所得到的拉曼光谱是样品中光吸收分子的化学组成和结构上的特征，而拉曼散射的强度取决于这些分子的浓度。

当分子被吸附在粗糙的金属表面例如金、银、铜和某些其它金属的纳米颗粒之上时发射谱得以增强若干个数量级——可达10¹⁴倍——这一观测结果已经产生了高度灵敏的表面增强光谱术(例如，表面增强荧光术(SEF)和表面增强(共振)拉曼光谱术(SE(R)RS))

在表面增强拉曼共振光谱术(SERRS)中，利用了连接于分析物的“SERRS-活性”物质或染料(当进行适当照射时能够产生SERRS谱)，并在染料的共振频率下操作。

在应用表面增强光谱术中的关键步骤是粗糙金属表面的可再现性产生以及待检测的标记有效吸附/结合在该金属表面上。当粗糙金属表面由胶体金属纳米颗粒组成时，最佳的信号增强在它们以可控的方式聚集时得以实现。通过例如用还原剂诸如柠檬酸盐还原金属盐(例如，硝酸银)，制备未聚集的胶体，以形成稳定的微晶悬液。然后，该胶体悬液在使用之前即刻进行聚集。理想地，聚集的胶体在样品中原位形成，而SE(R)RS谱在之后不久获得，以便防止沉淀。

已经观察到，在应用要求在样品内进行检测的标记的任何检测技术中，样品基体效应可影响分析结果。样品基体效应在复杂的介质诸如其中干扰物质的性质和量通常未知并且不容易控制的生物、矿物和环境样品中特别严重，但由于可影响检测的不同方面的盐和/或其它成分的存在，样品基体效应在通过(半)纯化技术得到的样品中也可以是有关系的。在生物样品中，样品基体效应可以由过量的体液成分例如脂血症、胆红素血症、血红蛋白血症、溶血、脂质、蛋白质、血红蛋白、免疫球蛋白、激素、药物、抗原、变应原、毒素、肿瘤标记、可溶性细胞分子以及核酸造成。在DNA提取物中，样品基体效应可以由仅仅主体DNA的存在而导致。这些成分可能增加或降低测量信号，导致不准确的结果。样品基体效应可以用例如荧光猝灭或发光猝灭加以证明。

表面增强光谱术带来了额外的复杂性，原因在于样品基体可以干扰胶体聚集以及干扰分析物或标记吸附/结合到胶体上。金属胶体的不同聚集度产生可变的信号。这些胶体聚集上的变化可以由样品pH的差异或由诱导导致聚集体沉淀的过度聚集的离子的存在而导致。样品基体化合物还可以吸附到金属颗粒上，从而与信号待被增强的分子竞争纳米颗粒的表面。例如，在中性或生理pH下往往带正电的许多蛋白质被吸引至颗粒的净负电荷。抗体特别易于强烈吸附至胶体金颗粒。样品基体化合物还可能促进标记非特异性吸附至纳米颗粒上。

影响检测的因素的校正是分析化学领域的一般性问题。在该领域中，消除样品基体效应的方法包括稀释、样品基体的去除(例如，通过将分析物共价结合至固定的表面并洗去背景而不影响分析物)以及加入标准物并随后校正干扰的程度。

对于SE(R)RS方法，基于直接检测样品中的样品基体效应，已经研究出补偿样品基体效应的方法。这些方法包括应用内标，所述内标是预定量的分子，其比得上待检测的分子(例如，分析物或标记)，但产生不同的信号。然而，这些技术受到所述效应是对非同一化合物进行测量从而样品基体的光谱发信号效率和对检测的干扰可能不同这一事实的限制。

本发明的一个目标是提供在分析技术中校正样品基体效应的可选方法以及根据所述方法进行操作的系统。本发明的优势是对样品中标记检测的不利效应被允许确定样品基体效应的标记对照所降低。

在第一方面，本发明提供了确定样品对标记检测的样品基体效应的方法，所述方法包括步骤(a)使预定量的相同标记或不同标记与包含样品基体或样品样基体的背景样品接触；(b)使预定量的相同标记或不同标记与无背景样品接触，所述无背景样品不含样品基体或样品样基体或能够干扰所述标记的检测的任何其它化合物；(c)检测所述背景样品和所述无背景样品中的所述相同或不同标记；和(d)确定在所述背景样品和所述无背景样品中所述相同或不同标记的检测之间的差异，从而获得样品基体效应。在优选的实施方式中，所有预定量是相同的，这使得校正更易于进行，仅包括简单的差异。

本发明的第二方面提供了确定对样品中的分析物的样品基体效应的方法，所述方法包括步骤(a)提供来自含有待检测的分析物的所述样品的试验样品、包含样品基体或样品样基体的背景样品、以及不含样品基体或样品样基体的无背景样品；(b)使用标记，检测和/或定量所述试验样品中的分析物；(c)通过包括下列步骤的方法检测所述样品基体效应：

-使所述背景样品与预定量的标记接触，其可以是相同的或不同的标记，

-使所述无背景样品与预定量的所述相同的或不同的标记接触，由此所述相同的标记被加入到所述背景样品和无背景样品中，

-检测所述背景样品和所述无背景样品中的所述相同或不同的标记，

-通过确定所述背景样品和所述无背景样品中的所述(相同或不同的)标记的检测间的差异而确定所述样品基体效应；和

(d)用如上所述确定的样品基体效应校正如步骤(b)中获得的所述试验样品中的分析物的检测和/或定量。

在优选的实施方式中，所有预定量是相同的，这使得校正更易于进行，仅包括简单的差异。

通常，在所述试验样品中的分析物的检测通过能够结合至所述分析物的标记的检测来进行，而所述校正通过采用对于样品基体效应获得的值校正该结合的标记的检测值来进行。

根据本发明的该方面的一个实施方式，背景样品是其中分析物待检测的样品的一部分。另外或可选地，所述背景样品包含样品基体或样品样基体。

在一个实施方式中，拟通过本发明的方法检测的分析物选自核酸、蛋白质、糖类、脂质、化学物质、抗体、微生物和真核细胞。

根据一个实施方式，使用光学检测方法，进行本发明的方法中的检测步骤。更具体而言，所述检测方法是SE(R)RS，而在样品基体效应的确定和分析物的检测和/或定量中所用的标记都是SE(R)RS-活性标记。通常，这类方法包括额外的步骤，由此，在不同的样品中的标记检测之前，所述标记与SE(R)RS-活性表面接触。根据具体的实施方式，SE(R)RS-活性表面是银或金纳米颗粒的胶体悬浮液、或它们的聚集胶体。

根据一个实施方式，在包括分析物的检测和/或定量的方法中，该检测和/或定量是采用标记分析物-特异性探针进行的。根据一个具体实施方式，该分析物特异性探针被提供为结合-敏感性标记，即其检测信号在结合至分析物之后得到改变的标记。

根据一个实施方式，待检测的分析物是核苷酸序列，并利用标记分析物特异性探针，该探针是核苷酸或具有与分析物中的序列互补的序列的核苷酸。

使用标记分析物特异性探针进行的分析物检测可以基于结合至所述分析物的标记分析物特异性探针的直接检测，或者可以基于所述分析物的竞争结合。根据该在后实施方式的具体实施方式，使用能够结合至SE(R)RS-活性表面的分析物特异性探针和标记的替代探针进行所述分析物的检测，从而所述分析物与标记的替代探针竞争与分析物特异性探针的结合。

本发明的又一方面提供了设备或系统，用于补偿对样品中的分析物或标记的检测的样品基体效应。

本发明提供了确定样品对标记检测的样品基体效应的系统，其包括：

(a)装置，用于使预定量的所述标记或不同标记与包含样品基体或样品样基体的背景样品接触，

(b)装置，用于使预定量的所述标记或所述不同标记与无背景样品接触，所述无背景样品不含样品基体或样品样基体或能够干扰所述标记的检测的任何其它化合物，

(c)装置，用于检测所述背景样品和所述无背景样品中的所述标记或所述不同标记，和

(d)装置，用于确定在所述背景样品和所述无背景样品中所述标记或所述不同标记的检测之间的差异，对应于所述样品基体效应。

本发明还提供了确定对样品中分析物检测的样品基体效应的系统，其包括：

(a)装置，用于提供来自含有待检测的分析物的所述样品的试验样品、包含样品基体或样品样基体的背景样品、以及不含样品基体或样品样基体的无背景样品，

(b)装置，用于使用标记检测和/或定量所述试验样品中的所述分析物，

(c)装置，用于使所述背景样品与预定量的所述标记或不同标记接触，

(d)装置，用于使所述无背景样品与预定量的所述标记或所述不同标记接触，

(e)装置，用于检测所述背景样品和所述无背景样品中的所述标记或所述不同标记，

(f)装置，用于通过确定所述背景样品和所述无背景样品中的所述标记或所述不同标记的检测之间的差异，确定所述样品基体效应，

(g)装置，用于应答于确定样品基体效应的装置而校正所述试验样品中的所述分析物的检测和/或定量。

所述系统可以包括：

-选自含有分析物的试验样品、背景样品和无背景样品的一种或多种样品的第一源，一种或多种标记的第二源，以及任选地，添加剂的第三源，

-装置，用于提供第一至第三源的样品、标记和添加剂，以便它们可以被接触。

根据具体实施方式，第一源(101，图3)包括分别用于含有分析物的试验样品、背景样品和无背景样品的室。用于接触的装置可包括用于使含有分析物的试验样品、背景样品和无背景样品分别与相关标记接触的室。

在进一步的具体实施方式中，第二源(102，图3)包括用于分析物特异性标记的室和用于至少一种标记的室。

本发明还提供了一次性盒，其在确定对样品中分析物检测的样品基体效应的系统中使用，包括：

-选自含有分析物的试验样品、背景样品和无背景样品的一种或多种样品的第一源，一种或多种标记的第二源，以及任选地，添加剂的第三源，和

-装置，用于使背景样品和预定量的相同或不同标记接触，用于使无背景样品和预定量的相同或不同标记接触，以及用于使试验样品和预定量的相同或不同标记接触，和

-窗，以允许在试验样品、背景样品和无背景样品中该相同或不同标记的检测。待测试样品的源可以是PCR反应室。

通过下文详细的描述，连同以例子的方式阐述本发明原理的附图，本发明的上述和其它特点、特征和优势将变得明显。该描述仅以例子的方式给出，而不限制本发明的范围。

现参考下列附图描述本发明。

图1是检测试验样品中分析物的本发明方法的实施方式的示意图，所述方法包括通过检测背景基体和无背景基体中的标记而检测标记对照，如应用于试验样品中DNA的SE(R)RS检测。

图2是根据本发明的一个实施方式在无背景样品(1)中的SERRS-活性标记和在增强SERRS效应的样品基体(2)中的SERRS-活性标记的SERRS谱的例子。这两个光谱的比较给出了可能干扰试验样品中分析物检测的样品基体效应方面的信息。

图3是根据本发明的实施方式的系统的图示。

本发明就具体实施方式并参考某些附图进行了描述，但本发明不限于此，而是由权利要求书限定。权利要求书中的任何参考标记不被解释为限制范围。所描述的附图仅仅是示例性的，并且是非限制性的。在附图中，一些元件的大小可以被放大，并且为了说明的目的而不按比例绘制。在术语“包括”被用于本说明书和权利要求书的情况下，它不排除其它元件或步骤。在提到单数名词使用不定冠词或定冠词的情况下，例如“一(a)”或“一(an)”、“该(the)”，这包括多个该名词，除非特别描述其它意思。

而且，说明书和权利要求书的书术语第一、第二、第三等等被用来区分相似元件，并不必须被用来描述连续顺序或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在合适的环境下是可互换的，并且本文所描述的本发明的实施方式能够以不同于本文所描述或阐述的其它次序进行操作。

下列术语或定义只被提供来帮助理解本发明。这些定义不应当被解释成具有比本领域普通技术人员所理解的更小的范围。

如本文所使用，术语“分析物”是指将在本发明的方法中检测和/或量化的物质。

如本文所使用，术语“标记”是指能够产生可检测信号的分子或材料。除非指明，这是指这样的分子，其未共价连接于探针。标记可被连接于探针，连接于分析物，或者它可以是单独的本体，结合于分析物和/或探针。如本文所使用，“分析物特异性探针”是这样的探针，其包含特异于待检测分析物的结构或序列。这既包括能够特异性结合分析物的化合物(“互补型靶探针”)，也包括至少类似于分析物的特异性部分的化合物(“替代型靶探针”)。互补型靶探针与分析物的结合可以基于任何类型的相互作用，包括但不限于互补核苷酸序列、抗原/抗体相互作用、配体/受体结合、酶/底物相互作用等等。替代型靶探针被用在竞争性分析中，其中分析物基于与替代型探针的竞争进行确定，例如在竞争结合分析物-特异性探针中。最具体地，替代型靶探针结合分析物-特异性探针，相比于分析物与分析物-特异性探针的结合，其结合强度较小。

如本文所使用，“(SE(R)RS-活性)表面”是指能够增强SE(R)RS-活性标记的信号的材料。

如本文所使用，“捕获探针”是指能够将分子或分子的复合物结合至基底的分子。分析物-特异性捕获探针是能够特异地将分析物结合至基底的探针。

如本文所使用，“基底”是指这样的材料，分子或分子复合物可以被直接或通过捕获探针的方式结合至其上，并且其可被操作。基底的典型例子包括但不限于微量滴定板、珠、芯片等。

同样如本文所使用，术语“样品”涉及组合物，其包含基体(“样品基体”)和在其中的目标分析物。

术语“试验样品”被理解为意指样品或其一部分，包含基体(“样品基体”)和在其中的目标分析物，对该目标分析物进行分析物检测。

术语“样品基体”被理解为意指在试验样品中存在的、不是分析物的化合物。

术语“样品样基体”被理解为意指与样品基体具有大致相同的全部组成、和/或相同理化性质的基体。

术语“样品基体效应”被理解为意指样品基体对本发明的方法中比较或替代标记的检测的效应，因而影响分析物的检测。

术语“背景样品”被理解为意指用于确定样品基体效应的组合物，并包含样品基体或样品样基体。在样品本身被用于确定样品基体效应的情况下，它被称为“原始背景样品”。当原始背景样品具有与试验样品相同的组成时，它也含有分析物。可选地，原始背景样品是包含样品基体或样品样基体而不含有分析物的组合物，分析物已任选地加入到其中。

术语“无背景样品”被理解为意指不包含样品基体、样品样基体、分析物、或能够干扰标记检测的任何其它化合物的组合物。在样品基体的具体成分的影响将被确定的情况下，无背景样品是指包含基体的组合物，所述基体除了这些具体的成分之外与样品基体类似。

术语“校正样品基体效应”被理解为意指()基于样品基体效应的值(直接或间接地)调节通过试验样品的测量确定的值。

根据第一方面，本发明提供了使用分析物-特异性探针以及标记检测和/或定量样品中的分析物的分析技术，由此样品基体对所述检测的影响被确定，允许校正对所述检测的样品基体效应。

根据第一实施方式，本发明的方法包括步骤：

(a)提供来自含有待检测分析物的所述样品的试验样品、包含样品基体或样品样基体的背景样品以及不含样品基体或样品样基体的无背景样品

(b)检测和/或定量所述试验样品中的分析物

(c)通过包括下列步骤的方法检测所述样品基体效应：

(i)使所述背景样品与预定量的标记接触，

(ii)使所述无背景样品与相同预定量的标记接触，

(iii)检测所述背景样品和所述无背景样品中的所述标记，

(iv)通过确定所述背景样品和所述无背景样品中的所述标记的检测之间的差异，确定所述样品基体效应

(d)用在(iv)中确定的样品基体效应校正步骤(b)的所述试验样品中的分析物的检测和/或定量。

任选地，步骤(i)至(iii)可以用两种或更多种不同预定量的标记进行。

根据一个具体实施方式，用于样品基体效应检测的背景样品包含样品基体，更具体而言是在其中分析物将被检测的样品的一部分，从而其组成与试验样品相同。根据该实施方式，所述方法包括步骤：

(a)提供来自包含分析物的样品的试验样品和背景样品，并进一步提供无背景样品；

(b)检测和/或定量所述试验样品中的分析物

(c)通过包括下列步骤的方法检测所述样品基体效应：

(i)使所述背景样品与预定量的标记接触，

(ii)使所述无背景样品与相同预定量的标记接触，

(iii)检测所述背景样品和所述无背景样品中的所述标记，

根据第二方面，本发明提供对标记检测的样品基体效应的确定方法，所述方法包括步骤：

(a)使预定量的标记、替代标记或不同标记与包含样品基体或样品样基体的背景样品接触，

(b)使相同预定量的标记、替代标记或不同标记与无背景样品接触，所述无背景样品不含样品基体或样品样基体或能够干扰所述标记的检测的任何其它化合物，

(c)检测所述背景样品和所述无背景样品中的所述标记、替代标记或不同标记，

(d)确定在所述背景样品和所述无背景样品中所述标记、替代标记或不同标记的检测之间的差异，所述差异对应于所述样品基体效应。

该方法提供了在特定背景下对标记检测的样品基体效应的测量，其可用于校正在已知或认为包含相同基体的样品中检测和/或定量分析物所获得的值。

任选地，步骤(a)至(d)可以用两种或更多种不同预定量的标记进行。

因此，本发明提供了方法和工具，由此，样品基体效应的发生通过检测背景样品和无背景样品中的标记得到确定，以及提供了用于根据本发明的方法确定样品基体效应的系统。这些基体效应潜在地干扰在样品中用该标记进行的分析物检测。

本发明是基于如下观察：样品基体的成分可影响标记的检测并且该影响可通过在样品基体或样品样基体存在下或在无背景样品中比较该同一标记或与其类似的标记来加以确定。根据本发明的方法，在利用标记的检测方法中引入标记对照确保了样品中分析物的更准确和可靠的检测和/或定量。

通过本发明的方法确定的样品基体效应的来源是可变的，并将取决于样品的特性。其中分析物的检测考虑根据本发明进行的样品包括来自生物材料的样品以及来源于或提取自这类生物材料的组合物。样品可以是包含待测分析物的任何制备物。例如，样品可包括所有或许多机体组织或体液，例如，但不限于血液(包括血浆和血小板部分)、脊髓液、粘液、痰、唾液、精液、粪便或尿液或者它们的任何一部分。示例性样品包括来自全血的材料、红细胞、白细胞、血沉棕黄层、毛发、指甲和角质层材料，拭子，包括但不限于颊拭子、咽拭子、阴道拭子、尿道拭子、子宫颈拭子、咽拭子、直肠拭子、损伤拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子等，淋巴液、羊水、脑脊液、腹水、胸腔积液、囊内液、滑液、玻璃体液、房水、囊液、洗眼液、眼吸液、血浆、血清、肺灌洗液、肺吸液、基体内任何组织的活组织检查材料。普通技术人员将理解，从上述示例性生物样品的任一种获得的裂解物、提取物或材料也被考虑作为样品。组织培养细胞，包括移植的材料、原代细胞、次生细胞系等以及从任何细胞、组织或器官获得的裂解物、提取物、上清液或材料也在如本文所使用的术语生物样品的含义之内。在使用本发明的方法进行分析物检测中，也考虑包含微生物和病毒的样品。从法医环境下获得的材料也在术语“样品”的意图含义内。样品还可包括食品和饮料、环境样品，例如水、土壤、沙等等。这些列举不意图是穷尽性的。

在本发明的具体实施方式中，样品被预处理，以帮助用所述检测方法进行分析物的检测。例如，通常，样品的预处理产生半纯化的部分，其仅包含与分析物具有相同的总特性的那些化合物，例如，DNA、蛋白质的提取等等。适合于样品的预处理的方法和试剂盒在本领域中是可得的。

根据本发明的一个具体实施方式，分析物是核酸，例如基因组DNA的序列或者来自病原体微生物的核酸。通常，为了检测样品中的基因组DNA，样品被加热(例如，加热至100℃)，以确保dsDNA的变性并同时使样品中存在的大部分酶活性失活。此外或可选地，DNA可被(部分)纯化。多种方法可用于从样品分离核酸。示例性的核酸分离技术包括(1)有机提取，随后乙醇沉淀，例如，采用苯酚/氯仿有机试剂(例如，Ausbel et al.，eds.，(1995，包括截至2003年6月的增刊)Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，New York)，优选采用自动DNA提取仪，例如Model 341 DNA提取仪，可从Applied Biosystems(Foster City，Calif.)获得，(2)固定相吸附法(例如Boom et al.，美国专利5234809；Walsh et al.，BioTechniques 10(4)：506-513(1991)，和(3)盐诱导DNA沉淀法(例如Miller et al.，(1988)Nucl.Acids Res.，16(3)：9-10)，这类沉淀法通常被称为“盐析”法。商业可得的试剂盒可用于加快这类方法，例如，基因组DNA纯化试剂盒(Genomic DNAPurification Kit)以及总DNA分离系统(Total RNA Isolation System)(都可从Promega，Madison，Wis.获得)。此外，这类方法已经被自动化或半自动化，采用诸如ABI PRISM^TM 6700 Automated Nucleic Acid Workstation(AppliedBiosystems，Foster City，Calif.)或ABI PRISM^TM 6100 Nucleic AcidPrepStation以及相关步骤，例如NucPrep^TM Chemistry：Isolation of GenomicDNA from Animal and Plant Tissue，Applied Biosystems Protocol 4333959Rev.A(2002)，Isolation of Total RNA from Cultured Cells，AppliedBiosystems Protocol 4330254 Rev.A(2002)，和ABI PRISM^TM Cell LysisControl Kit，Applied Biosystems Protocol 4316607 Rev.C(2001)。

上述预处理方法可进一步包括片段化步骤，例如通过酶消化、剪切或超声处理进行，和/或酶促扩增步骤，例如通过PCR进行。最特别地，当涉及核酸的灵敏检测时，靶DNA的PCR扩增可以在分析物的检测之前进行。在这种情况下，样品由提取的DNA组成，该提取的DNA包含PCR产物。

能够导致样品基体效应、在样品中或样品的半纯化部分中常见的化合物和条件的典型例子包括但不限于离子、大的或主体蛋白质、主体DNA、pH等等。然而，识别样品基体效应的诱发因素对于本发明并不关键。

本发明的方法原则上可被用于任何分析检测技术，经由所述分析检测技术，在样品基体的存在下基于标记的检测进行分析物的检测。最特别地，本发明可用于标记的检测容易受到样品中存在的因素影响的分析检测方法中。本发明的方法对于基于通过表面增强拉曼光谱术(SERRS)进行的标记检测的检测方法特别有用。在SERRS中，利用了标记，其是SERRS-活性物质或染料，当在染料的共振频率下照射时，其产生共振拉曼光谱。检测该光谱的灵敏度通过将染料吸附在粗糙的金属表面上而得到进一步增强，例如在金、银、铜和某些其它金属的纳米颗粒上(SERRS)。SERRS中的关键因素是染料有效吸附在该金属表面上。可选的方法涉及染料直接或间接结合至金属表面。当粗糙的金属表面由胶体金属纳米颗粒组成时，在该胶体纳米颗粒以可控的方式聚集时实现最佳的信号增强。聚集剂包括酸(例如HNO₃或抗坏血酸)、多胺(例如，精胺)和无机离子(例如，Cl^-、I^-、Na⁺或Mg²⁺)。样品中这类化合物的存在因此可影响胶体聚集。除了聚集之外，样品基体的成分还可以干扰染料吸附在胶体上，从而负面影响测量的SERRS信号。

本发明的方法是包括分析物检测的方法。待检测的分析物的特性对于本发明并本关键，并且可以是任何分子或者用来检测的目标分子的聚集体。分析物的非穷尽性列举包括蛋白质、多肽、肽、氨基酸、核酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、糖类、多糖、脂多糖、糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、脂质、激素、类固醇、生长因子、细胞因子、神经递质、受体、酶、抗原、变应原、抗体、代谢物、辅因子、营养素、毒素、毒物、药物、生物战剂、生物有害剂、传染剂、阮病毒、维生素、免疫球蛋白、白蛋白、血红蛋白、凝固因子、白介素、干扰素、细胞因子、含肿瘤特异性表位的肽以及抗任何一种上述物质的抗体。分析物可包括一种或多种复合聚集体，例如但不限于病毒、细菌、微生物诸如沙门氏菌属(Salmonella)、链球菌属(Streptococcus)、军团杆菌属(Legionella)、大肠杆菌(E.coli)、贾第虫属(Giardia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、立克次氏体(Rickettsia)，孢子、霉菌、酵母菌、藻、变形虫、甲藻、单细胞生物、病原体或细胞、以及细胞表面分子、碎片、部分、成分、产物、小有机分子、核酸和寡核苷酸、微生物的代谢物。

根据具体实施方式，分析物是DNA，例如基因、病毒DNA、细菌DNA、真菌DNA、哺乳动物DNA、DNA片段。分析物还可以是RNA，例如病毒RNA、mRNA、rRNA。分析物还可以是cDNA、寡核苷酸、或合成的DNA、RNA、PNA、合成的寡核苷酸、修饰的寡核苷酸或其它核酸类似物。它可包括单链核酸和双链核酸。在检测前，它还可以经历操作，诸如用限制酶消化、利用核酸聚合物酶的复制、剪切或超声处理，从而允许片段化发生。

如上所示，本发明提供了标记对照，用于包括利用标记进行检测的检测方法。在本发明中，不同类型的标记被考虑，例如但不限于荧光染料、显色染料或化学发光染料、放射性的、金属和/或磁纳米颗粒等等。

因此，在本发明的方法中进行的检测步骤将通过所用的标记进行确定，包括但不限于荧光、比色、吸收、反射、偏振、折射、电化学、化学发光、瑞利散射和拉曼散射、SE(R)RS、共振光散射、光栅连接表面等离振子共振、闪烁计数、磁传感器、电化学检测(例如阳极溶出伏安法)等等。

用于不同检测方法的合适标记很多并且在本领域中得到广泛描述。荧光标记包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)，羧基荧光素诸如四甲基若丹明(TMR)、羧基四甲基若丹明(TAMRA)、羧基-X-若丹明(ROX)、磺化若丹明101(Texas red^TM)、Atto染料(Sigma Aldrich)、荧光红和荧光橙、藻红蛋白、藻蓝蛋白和Crypto-Fluor^TM染料等等。最常见的放射性同位素包括β射线辐射体例如³H和¹⁴C，以及γ射线辐射体例如碘-125(¹²⁵I)。在定量和定性分析中使用的其它描述的标记包括但不限于树状聚合物、量子点、上转换磷光体和纳米颗粒。

当本发明方法的分析物检测是基于SE(R)RS时，标记是SE(R)RS-活性的材料，即，当被适当照射时其能够产生SERS或SERRS谱，在本文中也称为SE(R)RS-活性标记或染料。SE(R)RS-活性标记的非限制性例子包括荧光素染料，例如5-(和6-)羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素和5-羧基荧光素，若丹明染料例如5-(和6-)羧基若丹明、6-羧基四甲基若丹明和6-羧基若丹明X，酞菁染料例如甲基、亚硝酰基、磺酰基和氨基酞菁染料，偶氮染料、偶氮甲碱、青色素和黄嘌呤例如甲基、硝基、磺基(sulphano)和氨基衍生物，以及琥珀酰荧光素。

根据具体实施方式，SE(R)RS标记是羧基若丹明、FAM或TET。已经证明，用羧基若丹明R6G标记的寡核苷酸的校准曲线达到1.05·10^-12M的检测极限，其考虑了稀释效应，对应于以试验样品体积计0.5飞摩尔的标记寡核苷酸的检测。同时，R6G的(以及FAM和TET的)校准图在从10^-7M至10^-11M的范围内表现出线性(LGC“Evaluation of the sensitivity ofSERRS-based DNA detection”，2004年1月，LGC/Mfb/2004/02，在http://www.mfbprog.org.uk/themes/theme_publications_item.asp？intThemeID＝10&intPublicationID＝865可访问)。

请注意，标记的选择可受到诸如标记的共振频率、试验样品中存在的其它分子的共振频率等因素的影响。可用于检测生物分子的SE(R)RS-活性标记在本领域中进行了描述，例如在美国专利5306403、6002471和6174677中。

根据本发明，使用标记对照确定样品基体效应独立于试验样品中分析物的检测(但任选地，与之同时)进行。根据一个具体实施方式，使用与样品中分析物的检测所用的标记相同的标记，确定样品基体效应。然而，可选地，考虑在标记对照中所用的标记是与分析物的检测所用的标记不相同的标记(即不同的标记)。在大多数情况下，标记检测的样品基体效应的至少一部分独立于所用标记的特性。例如，当在SE(R)RS检测中涉及样品基体效应——其原因例如在于对用作SE(R)RS表面的胶体的聚集的效应——的情况下，预期具有独立于所用SE(R)RS染料的特性之外的相似效应。根据一个具体实施方式，考虑在样品基体效应的确定中所用的标记——其不同于分析物检测中所用的标记，是这样的标记，其性质比得上在分析物的检测中所用的标记(相似标记)。

如上所示出，根据本发明的标记对照的供应特别适合于其中已知标记检测受不同因素影响的方法。根据本发明的具体实施方式，标记对照的供应被应用于基于表面增强光谱术的分析检测方法。通过表面增强光谱术诸如表面增强(共振)拉曼光谱术(SE(R)RS)进行的检测基于拉曼散射的强烈增强，该增强是对于吸附到粗糙金属表面上的分析物所观察到的。因此，这要求在合适的SE(R)RS-活性表面存在下进行标记的检测。通常，所述表面是贵金属(Au、Ag、Cu)表面或碱金属(Li、Na、K)表面。例如，金属表面可以被蚀刻，或者另外是粗糙的金属表面、金属溶胶，或者根据一个具体实施方式，是金属胶体颗粒的聚集体，因为后者导致拉曼散射增强108-1014以上(Nie和Emory(1997)，Science，275，Kneipp(1999)，Chem Rev，99)。在本发明的检测方法中，构成SE(R)RS-活性表面的金属纳米颗粒也可以以金属纳米颗粒岛膜、基于金属镀纳米颗粒的基底、嵌入金属纳米颗粒的聚合物膜等排列。金属表面可以是裸露金属或可以在金属表面包括金属氧化物层。它可包括有机涂层，例如柠檬酸盐的有机涂层或者合适的聚合物诸如聚赖氨酸或多酚的有机涂层，以增加其吸附能力。

根据本发明的一个具体实施方式，构成SE(R)RS-活性表面的金属胶体颗粒是纳米颗粒或以可控方式聚集的胶体纳米颗粒，如US 2005/0130163中所述。制备纳米颗粒的可选方法是已知的(例如美国专利6054495、6127120和6149868)。纳米颗粒还可从商业来源获得(例如Nanoprobes Inc.，Yaphank，N.Y.；Polysciences，Inc.，Warrington，Pa.)。金属颗粒可具有任何尺寸，只有它们引起SE(R)RS效应。通常，它们具有约4-50nm的直径，最特别地，在25-40nm之间，取决于金属的类型。

在利用SE(R)RS检测法的本发明的检测和/或定量方法中，SE(R)RS-活性标记与金属表面的直接或间接共价或非共价结合是样品中分析物的存在和/或量的直接或间接指示。分子与SE(R)RS-活性表面结合的各种选择和模式在本领域中是已知的并描述于例如US 6127120和US 6972173中。

通常，在SE(R)RS-活性染料通过核苷酸探针结合于金属表面的情况下，通过加入单体多胺或聚合多胺，更特别是短链脂肪族多胺，例如精胺，确保经标记的探针吸附于金属SE(R)RS-活性表面。因此，根据一个实施方式，本发明的方法在检测之前包括向将通过SE(R)RS检测的试验样品加入多胺。应该在获得SE(R)RS谱之前，在允许多胺与分析物和/或标记和/或经标记的分析物特异性探针和/或经标记的替代靶探针相互作用的时候，引入多胺。多胺优选是短链脂肪族多胺，例如精胺、亚精胺、1，4-二氨基哌嗪、二亚乙基三胺、N-(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺、三亚乙基四胺和四亚乙基五胺。每重复单元具有四个NH₂基团的精胺特别适合用于本发明。多胺优选以其酸式盐例如其盐酸盐的形式引入。当SE(R)RS-活性表面是胶体状时是最有用的(参见上文)。所加入多胺的量优选比获得该表面的单层多胺覆盖所需的量高100到1000倍的数量级。过量的多胺在表面上形成涂层，从而确保最优的胶体聚集以及分析物和/或标记和/或分析物-特异性标记的吸附。

多胺的加入将确保结合至金属表面的DNA的总体增加。可选地或另外地，探针可以被修饰，以便促进或帮助探针化学吸附到SE(R)RS-活性表面。通过至少部分降低分析物-特异性探针的总负电荷，这可得以保证。更具体地，在分析物-特异性探针是核苷酸的情况下，这可通过将一个或多个包含路易斯碱诸如氨基的官能团引入核酸或核酸单元而得到保证，如US6127120中所述。

根据进一步的实施方式，官能团(例如路易斯碱)被提供在SE(R)RS-活性标记上，以促进或帮助化学吸附至SE(R)RS-活性表面上。任选地，SE(R)RS-活性标记或染料和金属颗粒被包埋于如US2005/0130163中所述的聚合物珠中，其可任选地进一步包含磁性颗粒，使得所述珠具有磁性，这在分离中是令人感兴趣的(见下文)。

本发明提供了检测方法的标记对照，在所述检测方法中，样品基体可干扰分析物的检测。通常，这类方法包括不要求从未结合的标记和/或干扰分析物的检测和/或定量的其它经标记的成分分离经标记的分析物的方法，和/或不包括洗涤步骤、从原始样品基体分离分析物的方法。根据本发明的一个实施方式，基于标记与分析物的特异性结合，确保分析物的检测，由此标记的信号在结合于分析物后被改变。这可例如通过分子信标的供应加以实现，所述分子信标例如探针，其互补于靶序列，在其两端各自用染料和淬灭剂(例如Dabcyl)进行双重标记。在其闭合态，染料的信号被淬灭剂淬灭。当互补序列杂交于靶DNA时，信标打开，而信号可被检测。能够特异结合于分析物从而使信号发生改变的标记的进一步的例子在WO2005/019812中被提供用于SERRS。其中，SERRS信标被描述，其是在其两端各自用不同的染料进行双重标记的探针。第二染料被特异设计，以便它能够将寡核苷酸探针固定在合适的金属表面上。在不存在靶DNA的情况下，该信标以“闭合态”固定在金属表面上，导致对应于两种染料的SERRS谱的检测。当互补序列杂交于靶DNA时，信标打开，并且染料之一从表面除去。这导致SERRS信号改变。

根据本发明的另一实施方式，利用了荧光团标记的核苷酸探针，由此所述标记的荧光的极化在结合于靶核酸后得以增强(Walker和Linn(1996)，Clinical Chemistry，Vol 42，1604-1608)。

根据本发明的另一个实施方式，标记对照的供应可被应用于竞争性SE(R)RS法，其中基于分析物和经标记的替代靶探针与分析物-特异性探针的竞争结合确保分析物的检测，后者与SE(R)RS表面有关。作为分析物-特异性探针对于分析物的亲和性比对于特定探针更高的结果，经标记的替代探针从其与分析物-特异性探针的结合中被取代。这类方法确保了分析物的反向检测，因为存在的分析物越多，从表面被取代下来的经标记的替代靶探针越多，导致降低的SE(R)RS信号。

通常，本发明的方法的分析物检测涉及经标记的分析物-特异性探针，其可以是互补型靶探针或替代型靶探针。这些探针——意图特异性结合所述分析物(用于结合至第二探针)或与之竞争，通过将能够特异性结合至所述分析物或对应于所述分析物的至少(特异性)一部分的化合物连接至标记而获得。分析物-特异性探针的特性通过待检测的分析物的特性加以确定。最常见地，基于与分析物的特异性相互作用，例如但不限于抗原-抗体结合、互补核苷酸序列、糖-凝集素、互补肽序列、配体-受体、辅酶-酶、酶抑制剂-酶等，开发所述探针。

根据本发明的一个具体实施方式，目标分析物是核苷酸，而本发明的方法涉及使用至少一种经标记的分析物-特异性探针，其是核苷酸探针，其序列互补或类似于目标分析物的至少一部分，最特别地，是所述分析物的序列，特异于所述分析物。该核苷酸探针结合于标记，允许所述分析物的特异性检测。

制备标记的核苷酸并将它们掺入核酸的方法在本领域中进行了描述(例如美国专利4962037、5405747、6136543和6210896)。

在本发明的一个具体实施方式中，使用了SE(R)RS-活性标记，其或者直接连接于核苷酸探针，或通过接头化合物连接。含有反应基的SE(R)RS-活性标记是商购可得的(例如Molecular Probes，Eugene，Oreg.)，该反应基被设计来与其它分子诸如核苷酸或核酸共价反应。共价结合于核苷酸前体的SE(R)RS-活性标记可购自标准的商业来源(例如Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，Ind.；Promega Corp.，Madison，Wis.；Ambion，Inc.，Austin，Tex.；Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J.)。

根据本发明的一个具体实施方式，结合的标记探针的检测包括在样品内从结合于分析物、经标记的分析物-特异性探针物理分离未结合的经标记的分析物-特异性探针。未结合和结合的标记探针的分离可通过如下实现：提供所述分析物-特异性探针的标签，或者提供包含标签的二级分析物-特异性分离探针，所述标签可经受物理和/或化学力。这类标签的典型例子包括磁珠(其可经受磁力)、玻璃珠或聚苯乙烯珠(其可被光束捕获并移动；Smithet al.(1995)，Science 271：795)或带电基团(其可经受电动力；Chou et al.(1999)，PNAS 96：11)。在分析物是核苷酸序列——其在检测前使用PCR进行扩增——的情况下，所述标签可以被掺入PCR产物。分析物的标签化使得能够分离未结合的和结合的经标记的分析物-特异性探针，以允许它们的各自检测。

本发明的某些方面涉及分析物更尤其是试验样品中的分析物的改良的检测和/或定量方法。尽管本文描述的方法一般提及“一种分析物”，但同样考虑的是，在使用不同的分析物-特异性标记同时检测或定量若干种分析物的情况下，本发明的方法也适用。最特别地，可利用不同的分析物-特异性探针，其可使用同一检测方法进行区分检测，所述检测方法包括但不限于荧光素异硫氰酸酯(FITC)、羧基荧光素(例如四甲基若丹明(TMR)、羧基四甲基-若丹明(TAMRA)、羧基-X-若丹明(ROX)、磺化若丹明101(Texasred^TM)、Atto染料(Sigma Aldrich)、荧光红和荧光橙、藻红蛋白、藻蓝蛋白、Crypto-Fluor^TM染料、量子点、SE(R)RS-活性染料、和它们的同位素。由于可使每一种探针特异于不同的分析物，对于每一种经标记的分析物-特异性探针，测量其在试验样品中的检测信号是可能的。而且，对于不同标记的每一种，在一种标记对照下确定样品基体效应(基于一种背景样品和一种无背景样品，它们已被加入各自的标记)是可能的，以便允许补偿潜在干扰每一种标记的检测的样品基体效应。

如上所示，本发明的方法在基于表面增强(共振)拉曼光谱术或SE(R)RS的检测和/或定量方法方面是特别令人感兴趣的。虽然本文一般提及SE(R)RS，但可理解，基于其它类型的表面增强光谱术的检测方法也被考虑在内，例如但不限于，表面增强荧光、普通(斯托克斯或反斯托克斯)拉曼散射、共振拉曼散射、相干(斯托克斯或反斯托克斯)拉曼光谱术(CSRS或CARS)、表面增强(共振)CARS、受激拉曼散射、反拉曼光谱术、受激增益拉曼光谱术、超拉曼散射、表面增强超拉曼散射、分子光学激光检验器(molecular optical laser examiner(MOLE))或拉曼微探针或拉曼显微术或共焦拉曼显微光谱术、三维或扫描拉曼、拉曼饱和光谱术、时间分辨共振拉曼、拉曼去耦光谱术或UV-拉曼显微术。

在本发明的具体实施方式中，本发明的检测方法包括SERRS，因为在标记的共振频率下操作得到增强的灵敏度。在这种情况下，用于产生拉曼光谱的光源是相干光源，例如，激光，基本上调整至所用标记的最大吸收频率。该频率针对标记与SE(R)RS-活性表面和分析物和/或分析物结合物质之间的关系，可发生轻微变化，但普通技术人员将完全能够调整光源适应这种情况。所述光源可被调整至所述标记的吸收最大值附加的频率，或调整至在所述标记的吸收光谱中次级峰的频率或附近的频率。可选地，SE(R)RS可包括在活性表面或(聚集的)胶体上于等离子体的共振频率下操作。

在基于SE(R)RS检测的本发明方法中，通常选择一个峰，例如对应于所述标记的吸收最大值，并仅在该峰的波长下进行激发。可选地，在例如使用不同的SERRS标记同时检测不同的分析物的情况下，检测完整的“指纹”光谱以鉴定每一标记可能是必需的。一般而言，多元分析法(例如，偏最小二乘回归、主成分回归等等)可被用于使用完整的指纹光谱——具有一个以上拉曼带的光谱范围或使用单一拉曼带进行定性和/或定量识别所存在标记的每一个。

典型地，基于SE(R)RS的检测方法中的检测步骤将使用来自激光的入射光进行，其具有可见光谱内的频率。所选择的确切频率将取决于标记、表面和分析物。对于贵金属表面例如银和金，在可见光谱的绿色区域或红色区域中的频率总体上易于产生更好的表面增强效应。然而，考虑这样的情况也是可能的，其中其它频率例如紫外区或近红外区中的频率能被使用。具有合适的频率和功率的合适光源的选择以及——如果有必要——调整完全在本领域普通技术人员的能力之内，特别在参考可获得的SE(R)RS文献的时候。

在基于SE(R)RS的检测方法中使用的激发源包括但不限于氮激光器、氦镉激光器、氩离子激光器、氪离子激光器等等。多脉冲激光器可提供激发线的多种选择，这对于共振拉曼光谱是关键的。根据一个具体实施方式，氩离子激光器被用于LabRam集成仪器(Jobin Yvon)，激发波长为514.5nm。

激发光束可以用带通滤光片进行光谱纯化，并可使用6倍物镜聚焦于基底。通过使用全息分束器以产生激发光束和发射的拉曼信号的直角几何形状，该物镜可用于激发样品和收集拉曼信号。拉曼信号的强度需要对照激发光束的强背景进行测量。该背景主要是瑞利散射光和镜反射，其可用高效滤光器选择性地除去。例如，全息陷波滤波器可用于降低瑞利散射辐射。

表面增强拉曼发射信号可以通过拉曼检测器检测。在拉曼光谱术中具有潜在应用的各种检测单元在本领域中是已知的并且任何已知的拉曼检测单元可被使用。拉曼检测单元的例子被公开在例如美国专利US 6002471中。其它类型的检测器可被使用，例如电荷耦合器件(CCD)，其中红增强电荷耦合器件(red-enhanced intensified charge-coupled device(RE-ICCD))、硅光电二极管或光电倍增管单独排列或连续排列，用于信号的级联放大。光子计数电子器件可用于灵敏检测。检测器的选择将主要取决于进行特定分析所要求的灵敏度。几种设备适于收集SE(R)RS信号，包括波长选择镜、用于散射光检测的全息光学元件、以及光纤波导。

用于获得和/或分析SE(R)RS光谱的装置可包括某些形式的数据处理器，例如计算机。一旦SE(R)RS信号被合适的检测器捕获，其频率和强度数据将通常被传送到计算机，用于分析。指纹拉曼光谱将与参考光谱进行比较来鉴别所检测的拉曼活性化合物，或者在所测量的频率下的信号强度被用来计数所检测的拉曼活性化合物的含量。

本发明提供了通过允许校正样品基体效应改善样品中分析物的检测和/或定量的方法。普通技术人员将理解，这可被应用于结合供给的检测方法，所述供给例如使用内标(诸如施加至试验样品的同位素改良的标记)，确保补偿光激发/收集变化。这类内标的例子在现有技术(Zhang et al.(2005)，Anal.Chem.77(11)：3563-3569)中被提供。

本发明提供了基于标记的分析物检测的改良方法。考虑开发适于本发明方法的应用的试剂盒和试剂。

根据进一方面，本发明提供了系统，其中本文所述方法可被实行，所述系统包括：

(a)装置，用于提供来自含有待检测分析物的所述样品的试验样品、包含样品基体或样品样基体的背景样品、以及不含样品基体或样品样基体的无背景样品，

(b)装置，用于使所述样品与预定量的标记合适地接触，

(c)装置，用于检测和/或定量所述标记(在所述试验样品、所述背景样品和所述无背景样品中)

(d)装置，用于通过确定所述背景样品和所述无背景样品中的所述标记的检测之间的差异，确定样品基体效应，并且用于相应校正所述试验样品中所述标记的检测和/或定量。

例如，本发明包括用于病原体检测例如MRSA检测、脑膜炎、HIV、鸟流感、疟疾等的集成设备。

图3是根据本发明的实施方式的系统100的示意图。系统100适于检测并任选地定量样品中分析物的存在，由此所述样品对标记检测的样品基体效应得以确定。它包括用于提供一种或多种样品的源101，其可以被提供为一个或多个源，例如疑似含有分析物的试验样品的专门源105、含背景基体或背景样基体的背景样品的源106、不含背景基体或背景样基体的无背景样品的源107。此外，该系统可包括含有标记的源102，其可以是一个源或者可被提供为分开的分析物-特异性标记(例如经标记的分析物-特异性探针)的源108以及标记的源109。任选地，该设备包括至少一个额外的在检测中起作用的添加剂的源110。该设备进一步包括装置103，其中试验样品和背景样品与各自的标记接触，并用于检测。任选地，该装置可被提供为一个装置103，或用于试验样品与相关标记的接触和检测的分开的室111、用于背景样品与相关标记的接触和检测的分开的室112、和用于无背景样品与相关标记的接触和检测的分开的室113。该设备进一步包括装置104，用于：

a)将来自源101(或105)的包含分析物的样品以及来自源102(或108)的预定量的标记提供至使所述样品与所述标记接触的装置103或提供至其中试验样品与分析物-特异性标记接触的专门装置111，

b)将来自源101(或106)的背景样品以及来自源102(或109)的预定量的标记提供至使所述样品与各自的标记接触的装置103或提供至其中所述背景样品与预定量的标记接触的专门装置(112)，

c)将来自源101(或107)的无背景样品以及来自源102(或109)的预定量的标记提供至使所述样品与各自的标记接触的装置103或提供至其中所述无背景样品与相同预定量的标记接触的专门装置113。

装置104可包括所述样品和/或分析物和/或背景材料和/或无背景材料的称重式进料，并还可包括管/管道和阀(诸如可选和可控阀)的排列，以允许流体从源105、106、107、108、109和110(或从源101和102)的供给至接触装置111、112和113(或103)。可选地，流体可从源105-110(或101和102)泵送至接触装置111-113(或103)。

根据一个具体实施方式，背景样品包含样品基体，更特别地是其中分析物待检测从而其组成与试验样品相同的样品的一部分。

上述的组件排列可定位于盒117中，例如分子诊断学中使用的一次性盒117。

控制和分析电路115，其可以至少部分在盒117中或可以任选地在盒117的外部，并可以被任选地提供来控制装置104的操作。该控制和分析电路115可通过盒表面的合适接触件被连接至装置104，例如接线柱。

此外，用于检测结合至分析物的标记并且还检测背景样品和无背景样品中的相关标记的装置114被提供。装置114可以与盒117整合在一起，或可以在盒外部，并且可在盒117中提供窗，以便检测装置114可检测样品等。装置114可以处于控制和分析电路115的控制之下。检测装置114可以是能够利用上述检测方法的一种或多种或任何一种的检测器。代表检测的信号可被提供至控制和分析电路115，该控制和分析电路115可适于进行上文描述的本发明的分析算法的任何一种。具体而言，控制和分析电路115可适于通过确定背景样品中标记检测与无背景样品中标记检测之间的差异来确定样品基体效应，并用于校正试验样品中标记的检测，从而利用所确定的样品基体效应校正所述试验样品中分析物的检测和/或定量。结果可被显示在任何合适的显示装置116上，例如可视显示单元、绘图仪、打印机等等。控制和分析电路115可连接至局域网或广域网，用于将结果传输至远程。控制和分析电路115可以以任何合适的方式实现，例如专用硬件或者合适程控的计算机、微控制器或嵌入式处理器诸如微处理器、可编程门阵列例如PAL、PLA或FPGA，或类似物。

根据本发明的一个具体实施方式，在源105中的样品可以是含有生物分子(例如上述生物分子的任何一种、特别是DNA分子的混合物)的溶液，。具体而言，生物分子可以是从PCR反应得到的DNA。该实施方式对于在分子诊断一次性盒中的应用是特别有用的，该分子诊断一次性盒可包括细胞裂解站和PCR反应站，具体而言是多重PCR反应站。然后，PCR反应站的输出形成源105。在这种情况下，源108中的标记将是分析物-特异性寡核苷酸探针，适合于上文所述任何应用的检测方法的标记被连接于该探针上。选择该探针的核苷酸序列，使得它可与分析物杂交，例如与分析物的序列互补。第二源108可含有预定量的同一标记或不同标记，其未结合至核苷酸探针从而不能结合分析物。源106含有背景样品例如PCR缓冲液(例如Taq PCR缓冲液，50mM KCl、10mM Tris HCl、1.5mM MgCl₂、0.1％明胶)。源107含有无背景样品，例如水或适于不受干扰地检测所述标记的缓冲溶液。当表面增强光谱法被用于所述标记的检测时，额外的源110可含有合适的金属表面，例如用金属表面涂覆的胶体颗粒或珠。第二额外的源110可包含聚集剂，例如精胺。

在该具体实施方式中，从源105至110合适地提供试剂并使之接触可使得室111含有PCR反应输出和预定量的经标记的寡核苷酸探针、使得室112含有PCR反应输出和预定量的标记、使得室113含有水和预定量的标记，此外使得所有三个室111-113含有聚集的胶体颗粒，以能够通过检测装置114进行表面增强光谱检测。

应当理解，尽管本文已经就本发明的设备讨论了优选的实施方式、具体的结构和构造以及材料，但是可以进行形式和细节上的各种变化或改变而不背离本发明的范围和精神。

实施例

实施例1：确定缓冲液组成对SERRS-活性标记的SERRS检测的效应

在其5’末端用若丹明6G标记的合成寡核苷酸(19bp，TGCTTCTACACAGTCTCCT)被用于研究缓冲液组成对所检测的SERRS强度的效应。该寡核苷酸以2·10^-9M的浓度溶解在无背景样品即水中。为研究该缓冲液组成对SERRS测量的效应，相同量的寡核苷酸被溶解在背景样品中，即含有10mM NaCl的水。对于SERRS测量，10μl的每一样品与10μl精胺四氯化物(100mM水溶液，新制备)混合。向这些溶液加入250μl水和250μl银纳米颗粒(如Munro et al.(1995)，Langmuir，11：3712-3720所述进行制备)。在混合后立刻使用LabRam系统(Jobin Yvon)从两种样品中采集SERRS光谱，所述LabRam系统具有提供514.5nm的激发的氩激光器。两个光谱的比较表明SERRS强度的显著差异。这最可能是由于通过加入NaCl聚集体量增加和/或聚集体大小改变所致。

实施例2：使用竞争性SERRS检测和定量样品中的特异基因并校正样品基体效应

由动物种群特别是鸡中的流感A病毒的某些亚型产生的高致病性禽流感持续威胁全球公共健康。人直接感染禽流感A亚型H5N1病毒已经成为最近相当大的人死亡率的原因，加大了对快速和准确诊断的需求。A型流感病毒是基于外部糖蛋白、血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原差异进行亚型分类的。本发明提供了通过使用病毒核酸的RT-PCR和SERRS进行病毒亚型分类的新的、快速和准确的方法。

病毒RNA从临床样品中提取出来，并根据Wright et al.(1995)，J.Clin.Microbiol.，33：1180-1184使用病毒反转录酶和随机引物产生与病毒RNA互补的cDNA。用特异于流感病毒亚型H5N1的HA和NA基因的两套引物进行多重PCR，如在“Recommended laboratory tests to identify avian influenza Avirus in specimens from humans”，WHO Geneva，June 2005)中所描述，设计来分别产生219和616bp的PCR产物。随后通过竞争SERRS检测扩增产物。因此，两种分析物-特异性探针被设计成分别与HA和NA基因内的区域互补，并具有寻表面基团炔丙胺，用于结合至银纳米颗粒。两种另外的合成寡核苷酸——所谓的替代靶探针，分别用SERRS染料HEX和TET标记，被设计成分别与HA-和NA-特异性探针的一部分互补，除了一个错配(SNP)之外。

制备两种标记溶液。第一标记溶液含有用于检测扩增的H5N1病毒HA和NA基因的、预定量的HA-和NA-特异性探针以及相应替代靶探针。由于SNP的存在，HA-和NA-特异性探针和它们的相应替代靶探针在第一标记溶液中被松散退火。第二标记溶液，一式两份制备，仅含有预定量的SERRS染料HEX和TET。

为确定各种样品中HEX和TET的SERRS测量的参比点，10μl的每一标记溶液与10μl精胺四氯化物(100mM水溶液，新制备)混合。向这些溶液加入250μl水和250μl银纳米颗粒(如Munro et al.(1995)，Langmuir，11：3712-3720所述进行制备)。在混合后立刻使用LabRam系统(Jobin Yvon)从所制备的溶液中采集SERRS光谱，所述LabRam系统具有提供514.5nm的激发的氩激光器。

然后，PCR反应的输出被分成两个相同的部分，以提供试验样品和背景样品。水被提供为无背景样品。为了检测扩增的H5N1病毒HA和NA基因，试验样品被加入到含有预定量的HA-和NA-特异性探针、替代靶探针和聚集的银胶体的第一标记溶液。为了确定样品基体效应，所述背景样品和无背景样品被各自加入到第二标记溶液，其含有预定量的SERRS染料和聚集的银胶体。

在合适的温度下温育允许试验样品中的分析物DNA与替代靶探针竞争杂交至HA-和NA-特异性探针，后者已经结合至聚集的银胶体。由于替代靶探针并非与HA-和NA-特异性探针完全互补，分析物DNA与HA-和NA-特异性探针的杂交更加稳定，替代靶探针从金属表面被替换出来，导致HEX和TET染料的SERRS强度的降低。

背景样品和无背景样品也被温育，并且它们的SERRS光谱被比较，以定量由PCR缓冲化合物、残留DNA等产生的样品基体效应。

通过补偿样品基体效应，使用竞争SERRS，补偿扩增的病毒HA和NA基因的准确检测因此得以实现。

Claims

1.确定样品对标记检测的样品基体效应的方法，所述方法包括步骤：

(a)使预定量的所述标记或不同标记与包含样品基体或样品样基体的背景样品接触，

(b)使预定量的所述标记或所述不同标记与无背景样品接触，所述无背景样品不含样品基体或样品样基体或能够干扰所述标记的检测的任何其它化合物，

(c)检测所述背景样品和所述无背景样品中的所述标记或所述不同标记，和

(d)确定在所述背景样品和所述无背景样品中所述标记或所述不同标记的检测之间的差异，所述差异对应于所述样品基体效应。

2.确定对样品中的分析物的样品基体效应的方法，所述方法包括步骤：

(a)提供来自含有待检测分析物的所述样品的试验样品、包含样品基体或样品样基体的背景样品、以及不含样品基体或样品样基体的无背景样品，

(b)使用标记来检测和/或定量所述试验样品中的分析物，

(c)通过包括下列步骤的方法检测所述样品基体效应：

(i)使所述背景样品与预定量的所述标记或不同标记接触，

(ii)使所述无背景样品与预定量的标记或所述不同标记接触，

(iii)检测所述背景样品和所述无背景样品中的所述标记或所述不同标记，

(iv)通过确定所述背景样品和所述无背景样品中的所述标记或所述不同标记的检测之间的差异来确定所述样品基体效应，

(d)用在(iv)中确定的所述样品基体效应校正步骤(b)的所述试验样品中的所述分析物的检测和/或定量。

3.权利要求2所述的方法，其中所述背景样品是其中所述分析物待检测的所述样品的一部分。

4.权利要求2所述的方法，其中所述背景样品包含样品基体或样品样基体。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用两种或更多种预定量的标记进行所述样品基体效应的校正。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述分析物选自核酸、蛋白质、糖类、脂质、化学物质、抗体、微生物和真核细胞。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(c)中的所述检测步骤或者步骤(b)和(c)中的所述检测步骤分别是使用光学检测法进行的。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述光学检测法是SE(R)RS，并且其中所述标记或所述不同标记是SE(R)RS-活性标记。

9.根据权利要求8所述的方法，在检测之前进一步包括使所述标记或所述不同标记与SE(R)RS-活性表面接触。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述SE(R)RS-活性表面是银或金纳米颗粒的胶体悬浮液，或它们的聚集胶体。

11.根据权利要求2所述的方法，其中所述分析物的所述检测是使用经标记的分析物-特异性探针进行的。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述分析物-特异性探针具有结合-敏感性探针。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述分析物是核苷酸序列，而所述经标记的分析物-特异性探针是核苷酸或核苷酸类似物序列，其具有与所述分析物内的序列互补的序列。

14.根据权利要求2所述的方法，其中所述分析物的所述检测是使用能够结合至SE(R)RS-活性表面的分析物特异性探针以及经标记的替代探针进行的，并且由此所述分析物与所述经标记的替代探针竞争结合所述分析物-特异性探针。

15.根据权利要求2至14任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述分析物的所述检测和/或定量基于经标记的分析物-特异性探针或经标记的替代探针的检测，并且其中所述校正步骤(d)通过用在(iv)中确定的所述样品基体效应校正所述经标记的分析物-特异性探针或经标记的替代探针的所述检测进行。

16.确定样品对标记检测的样品基体效应的系统，其包括：

(d)装置，用于确定在所述背景样品和所述无背景样品中所述标记或所述不同标记的检测之间的差异，所述差异对应于所述样品基体效应。

17.确定对样品中分析物检测的样品基体效应的系统，其包括：

(f)装置，用于通过确定所述背景样品和所述无背景样品中的所述标记或所述不同标记的检测之间的差异而确定所述样品基体效应，

(g)装置，用于应答于确定所述样品基体效应的装置而校正所述试验样品中的所述分析物的检测和/或定量。

18.根据权利要求16所述的系统，进一步包括一种或多种样品的第一源(101)，和一种或多种标记的第二源(102)，以及任选地，添加剂的第三源(110)，所述一种或多种样品选自含有所述分析物的试验样品、背景样品和无背景样品。

19.根据权利要求18所述的系统，其中所述第一源(101)包括分别用于含有所述分析物的所述试验样品、背景样品和无背景样品的专门室。

20.根据权利要求16-19任一项所述的系统，进一步包括用于使所述含有所述分析物的所述试验样品、背景样品和无背景样品与所述标记接触的室。

21.根据权利要求18至20任一项所述的系统，其中所述一种或多种标记的所述第二源(102)包括用于分析物-特异性标记的室(108)和用于标记的室(109)。

22.一次性盒(117)，其在确定对样品中分析物检测的样品基体效应的系统中使用，包括：

-选自含有分析物的试验样品、背景样品和无背景样品的一种或多种样品的第一源(101)，和

-一种或多种标记的第二源(102)，以及任选地，添加剂的第三源(110)，和

-装置，用于使所述背景样品和预定量的所述标记或不同标记接触，用于使所述无背景样品和预定量的所述标记或不同标记接触，以及用于使所述试验样品和预定量的所述标记或不同标记接触，和

-窗，以允许在所述试验样品、所述背景样品和所述无背景样品中检测所述标记或所述不同标记。