CN101443461A - Se(r)rs置换检测 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了利用SE(R)RS而不需要标记分析物来检测样品中的分析物(特别是核酸)的检测方法。该检测方法基于样品中的分析物将标记的替代靶探针从捕获探针置换。本发明也提供相应的检测系统、用于这种系统的一次性筒、以及替代靶探针和捕获探针的组合。

Description

SE(R)RS置换检测
技术领域
本发明涉及用于检测分析物，特别是样品中的核酸的竞争性SE(R)RS检测法，以及涉及用于实施这些方法的工具和装置。
背景技术
对样品中存在的特定生物分子进行敏感、特异和快速的检测对于分子诊断应用是非常重要的。通常将所谓的捕获探针固定在感受器表面上，通过检测被引入到靶(target)内的标记或者通过提供标记的第二探针来监测靶与捕获探针的特异性结合。这就需要将靶、探针和标记转移到表面。因为大分子的弥散是相当缓慢的，因此与表面的结合成为了分析中的限时步骤。靶与表面的结合可以是可逆的，例如在DNA杂交中，被杂交的靶分子可以从表面剥离或熔化，基材可以在洗涤后重新使用。但是，这是费时的。因此，在溶液中进行分析的所谓均质检测是有优势的。在检测中，其弥散距离非常小，因此装置可以容易地再使用。然而，使用固定捕获探针具有便利的按图案方式沉积(pattern-wise deposition)的多路处理(即同时测定不同的靶)的优点。
最近已经引入了一种技术，其容许在均质溶液内进行多路、敏感的测定，即所谓的表面增强(共振)拉曼光谱法(surface-enhanced(resonant)Ramanspectroscopy，SE(R)RS))。对于SE(R)RS测定，被检测的分子需要被吸附到纳米结构的贵金属表面上。由于激发束的光场和金属表面(SERS)的等离子体场之间的相互作用以及也由于发色团(SERRS)的共振激发都使得拉曼信号增强了数个数量级。SE(R)RS具有独特的性能，散射光是由尖锐的、分子特异性震动带组成，这使得能够区分出一个溶液内的多个分析物。当SERRS用于DNA检测时，具有双官能团的SERRS标记经例如PCR被整合到了感兴趣的核苷酸序列内。SERRS标记通过带电(正电荷)基团附着于银表面，并通过染料部分生成拉曼信号。拉曼信号被在极小的银颗粒表面生成的等离子体场猛烈扩增，这就容许进行极为敏感的检测(皮摩尔级)。
然而，上述的系统已经被观察到了一些缺陷。例如，只有当标记被整合到DNA时，对DNA的检测才是可行的，这通常需要扩增步骤。此外，染料标记的SERRS谱不依赖于其所附着的核酸的序列或结构，这意味着在测量之前必须从溶液中分别分离出未整合的引物或未杂交的探针。
US 6,750,065描述了利用SE(R)RS检测蛋白，其中依据抗原从分析物特异性抗体中置换出SE(R)RS标记的分析物样化合物的能力来检测所述抗原。在置换之后，通过SE(R)RS表面的吸附检测出与分析物样化合物结合的SE(R)RS标记。
发明内容
本发明的一个目的是利用SE(R)RS检测简化对样品中核酸的体外检测，其中不需要标记分析物。
通过提供用于本发明的竞争性SE(R)RS的方法以及这些方法所用的工具和装置实现上述目的。
本发明的一个优点是多路检测是容易可行的，因为SE(R)RS谱的尖锐的分子特异性震动带使得可以同时对多个标记进行敏感的和准确的检测。
本发明的另一个优点是可以同时测定出SE(R)RS和荧光，这提供了对方法的额外验证。
本发明的优点是对SE(R)RS和荧光之一或两者的实时测定可以为是否存在特定的分析物提供快速的答案。
此外，荧光信号的出现即意味着样品中存在着分析物。因此只通过检测荧光就可以提供快速的、定量的测定。
本发明的优点还在于能够提供内标准物，使得能够校正光学检测、银纳米颗粒聚集等中的变异。
本发明的优点还在于不需要直接将标记吸附到表面就可以使得标记接近SE(R)RS表面。不同的是，通过经寡核苷酸杂交结合替代靶探针(包括标记)和捕获探针使得标记接近表面，这是可以容易控制的过程。通过这种方式预防了对不同探针在SE(R)RS表面的表面吸附过程缺失控制的情况，而这正是现有基于SE(R)RS检测法的问题。
所附独立和从属权利要求给出了本发明的具体的和优选的方面。从属权利要求的特征可以与独立权利要求的特征以及在适当的情况下与其他从属权利要求的特征相组合，而不仅只是权利要求中直接给出的那些特征。
在本发明的第一个方面，用置换检测法确定出样品中至少一种分析物的存在和/或量，其中所述置换检测法是基于以下步骤：(a)使至少一个靶特异性捕获探针以及至少一个可置换的替代靶探针(已标记)接触样品，其中靶特异性探针与SE(R)RS表面共价结合或者步骤(a)还包括使SE(R)RS表面接触靶特异性捕获探针，以及(b)检测通过可置换的替代靶探针和靶特异性捕获探针的结合形成的替代杂交体中的标记产生的信号，其中信号与样品中的分析物的存在和/或量成比例。
在这个方法中，步骤(a)还可以包括以下步骤：(I)使可置换的替代靶探针接触靶特异性探针，以便获得替代杂交体，其中靶特异性捕获探针与SE(R)RS表面共价结合并因此得到表面吸附的替代杂交体，或者步骤(I)还包括使SE(R)RS表面接触靶特异性捕获探针，或者所述步骤(I)还包括使SE(R)RS表面接触替代杂交体，使得替代杂交体被吸附在SE(R)RS表面上，形成表面吸附的替代杂交体；和(II)使样品接触表面吸附的替代杂交体，以便容许分析物置换可置换的替代靶探针。
在这个方法中，步骤(b)还可以包括以下步骤：(III)利用SE(R)RS和荧光之一或两者在步骤(I)后检测表面吸附的替代杂交体上标记的信号；和(IV)用与步骤(III)所用的检测方法相同的检测方法在步骤(II)后检测表面吸附的替代杂交体上标记的信号。在步骤(III)和(IV)中得到的信号差异与样品中分析物的存在和/或量成比例。
上述方法中的步骤(a)也还可以包括以下步骤：(V)使可置换的替代靶探针接触靶特异性捕获探针，以便获得替代杂交体；(VI)使SE(R)RS接触替代杂交体，使得替代杂交体被吸附到表面，形成表面吸附的替代杂交体；和(VII)使样品接触表面吸附的替代杂交体，以便容许分析物置换可置换的替代靶探针。
为了能够校准或校正变异例如聚集或光学变异，上述方法还引入了标准，如通过：步骤(c)接触标准捕获探针和标准探针(已标记)，据此获得标准杂交体，使SE(R)RS表面接触标准杂交体据此获得表面吸附的标准杂交体，以及(d)检测由所述表面吸附的标准杂交体的标记产生的信号。
在本发明的第二个方面，提供了替代靶探针和捕获探针的组合，其中替代靶探针的寡核苷酸的特征是解链温度要比与捕获探针的寡核苷酸100％互补的寡核苷酸的解链温度更低，以及附着于替代靶探针上的标记还具有表面增强(共振)拉曼散射(SE(R)RS)和荧光活性之一或两者。
在本发明的第三个方面，提供了用于检测样品中至少一种分析物的存在或量的系统所用的一次性筒(cartridge)，其包括(a)一组源，包括样品源、至少一种替代靶源、至少一种靶特异性捕获探针源、和至少一种检测中所用的添加物源；(b)接触来自源的规定体积的装置；和(c)用于确保为接触装置提供源中的液体的装置。该筒还可以包括至少一种内标准试剂源，以及用于检测在所述接触装置中产生的信号的窗口。
在本发明的第四个方面，提供了用于检测样品中至少一种分析物的存在或量的系统，包括(a)用于使至少一种靶特异性捕获探针以及至少一种可置换的替代靶探针(已标记)接触样品的装置和(b)用于检测通过可置换的替代靶探针和靶特异性探针的结合形成的替代杂交体上的标记所产生的信号的装置。该系统还可以包括用于通过比较在从源向接触工具提供试剂的不同时间点在所述接触工具中检测到的检测信号而计算出分析物的量的工具。
本发明的教导容许设计出用于检测样品中分析物的改良方法和装置。
通过下面的具体实施方式以及结合附图说明(其通过举例说明的方式阐述了本发明的原理)，本发明的上述的和其他的特征、特点和优点都是显而易见的。这里的描述只是用于举例说明的，并不限制本发明的范围。下面所引用的参考图指的是附图。
附图说明
图1是SERRS置换检测的一个实施方式的示意图。A：通过带负电荷的表面和带正电荷的表面定位基团之间的电化学相互作用，包括与分析物中靶序列互补的序列的捕获探针被吸附到柠檬酸还原的银纳米颗粒的表面上。可置换的替代靶探针与捕获探针互补并因此与其杂交。通过这种方式，SERRS染料接近于银表面，并且可以检测出强烈的SERRS信号。B：在加入样品之后，包括靶序列的分析物和替代靶探针竞争与捕获探针杂交。因为可置换的替代靶探针(包括一个或多个SNP)并非与捕获探针完全互补，因此与分析物的杂交是更为有效的，分析物因此可以从银表面置换出可置换的替代靶探针。SERRS信号因此与样品中分析物的量成比例的减弱。
图2是显示作为波长函数的SERRS染料HEX的吸收光谱的图。
图3是显示含有促进在银表面发生吸附的氨基炔丙基部分的5’HEX标记的寡核苷酸的SERRS光谱的图。在寡核苷酸被吸附到精胺聚集的银纳米颗粒之后，测定出SERRS信号(没有背景校正)。
图4是阐述本发明的一个实施方式的检测方法的框图。
图5是本发明的一个实施方式的装置的示意图。
在不同的图中，相同的附图标记指的是相同的或类似的元件。
具体实施方式
参照具体的实施方式以及特定的附图描述了本发明，但是本发明并不限定于此，而只受权利要求的限定。权利要求中的任何附图标记都不构成对发明范围的限制。在此所述的附图都只是示例说明的以及非限制性的。在图中，为了举例说明的目的，一些元件的尺寸可以被放大以及不按标尺绘制。在术语“包括”用于本发明的说明书和权利要求的地方，其并不排除其他元件或步骤。当用不定冠词或定冠词表示单数名词例如“一个”、“所述”时，其包括多个名词，除非有其他特别的说明。
此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等被用于相似元件之间的区分，并不一定被用于描述前后或时间的次序。要明白所用的术语在合适的情况下是可以互换的，在此所述的本发明的实施方式能够按不同于在此所述或图解的其他次序进行操作。
在此单独地提供了下面的术语或定义，以有助于理解本发明。这些定义不应当被解释为具有比本领域人员所了解的定义更小的范围。
定义
“分析物”在此指的是用本发明的方法检测和/或定量的物质。
“靶序列(target sequence)”在此指的是分析物内的特定核苷酸序列，其用于特异性检测分析物。
“样品”在此涉及相信其包括至少一种感兴趣的分析物的组合物。
“对照样品”在此涉及与样品相同或非常相似的组合物。
“标记”在此指的是能够产生可检测的SE(R)RS或荧光信号的分子或材料。
“寡核苷酸”在此指的是5到200个核苷酸之间的序列，它可以是天然存在的DNA或RNA核苷酸，修饰的或合成的核苷酸或核苷酸类似物，被连接为DNA、RNA、PNA、或自其衍生的任何骨架变体的核苷酸。
“捕获探针”在此指的是包括表面-定位基团(surface-seeking group)的寡核苷酸序列，所述基团容许捕获探针结合至SE(R)RS表面。捕获探针的寡核苷酸序列可以与靶序列互补(“靶特异性捕获探针”)以及能够特异性与靶序列杂交或者可以与不同的预定的标准序列互补(“标准捕获探针”)，其是标准探针的一部分。
“替代靶探针(surrogate target probe)”在此指的是能够特异性结合捕获探针的合成的、标记的寡核苷酸。“可置换的替代靶探针(displaceablesurrogate target probe)”是以比未修饰的并与捕获探针100％互补的序列的结合强度更弱的强度结合捕获探针的替代靶探针。在“不可置换的替代靶探针”中，序列与捕获探针、靶特异性捕获探针或者标准捕获探针(“标准探针”)完全互补，造成了不可置换的替代靶探针和相应的捕获探针的强结合。标记例如经共价连接附着于替代靶探针，或者其可以是结合替代靶探针的分离的实体。
“替代杂交体(surrogate hybrid)”在此指的是替代靶探针和捕获探针的组合。
“靶杂交体”在此指的是分析物内的靶序列和靶特异性捕获探针的组合。
“标准杂交体”在此指的是标准探针和标准捕获探针的组合，其与SE(R)RS表面共价或非共价相连接。
“SE(R)RS表面”在此指的是能够增强SE(R)RS标记的信号的材料。
“表面吸附的替代杂交体”、“表面吸附的靶杂交体”、和“表面吸附的标准杂交体”在此指的是分别被吸附到SE(R)RS表面上的替代杂交体、靶杂交体和标准杂交体。
本发明提供了用于检测样品中一种或多种分析物的存在和/或量的方法、工具和装置。
本发明是基于如下发现，即通过基于标记探针的置换可检测出样品中的分析物，从而提供了不需要对分析物进行标记的一步式分析物特异性方法。这是一个重要的节省时间的改进，其还有助于提高检测的可靠性，因为可以用全部标准的和预制的试剂实施检测。
本发明的方法、工具和装置都是基于可置换的替代靶探针的应用，所述探针是被标记的，并且能够与可以结合SE(R)RS表面的靶特异性捕获探针杂交。当可置换的替代靶探针的标记是SE(R)RS标记时，与捕获探针的杂交以及与SE(R)RS表面的接触会造成“表面吸附的替代杂交体”的生成，这可以增强对标记的检测。在可置换的替代靶探针序列中存在至少一个与捕获探针序列的错配(非互补的核苷酸)会引起可置换的替代靶探针与捕获探针的结合减弱。在使包括与捕获探针完全互补的靶序列的分析物接触与捕获探针结合的替代靶探针(可以是这样的或者是表面吸附的替代杂交体)之后，可置换的替代靶探针被置换。
本发明的方法检测的分析物可以是核酸。更具体地，分析物是DNA例如基因、病毒DNA、细菌DNA、真菌DNA、哺乳动物DNA、质粒DNA、或DNA片段。分析物也可以是RNA例如病毒RNA、mRNA、rRNA。分析物也可以是cDNA、寡核苷酸、或合成DNA、RNA、PNA、LNA、包括一或多个合成寡核苷酸的核苷酸序列、修饰的寡核苷酸或其他核酸类似物。分析物可以是源自生物体的核酸，所述生物体包括但不限于病毒、细菌、微生物例如沙门菌、链球菌、军团菌、大肠杆菌、贾第虫、隐孢子虫、立克次体、孢子、霉菌、酵母菌、藻类、阿米巴、甲藻、单细胞生物体、病原体或多细胞生物体例如动物或人类的细胞。
其中含有本发明所针对检测的分析物的样品的性质不是关键的，它们可以是任何怀疑包括核酸的制品。样品可以是包括生物材料的样品，例如但不限于机体组织或体液例如血液、唾液、精液、粪便或尿液、以及源自或提取自这些生物材料的组合物。样品可以包括生物材料例如细胞如组织细胞、红细胞、白细胞、血小板、死细胞的组分。可以通过拭子例如口腔拭子、咽拭子、阴道拭子、尿道拭子、宫颈拭子、咽拭子、直肠拭子、伤口拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子等的方式从生物体中获得所述材料。样品可以包括体液例如淋巴液、羊水、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液、囊肿液、滑液、玻璃体液、房水、囊液、洗眼液、眼睛吸出物、血浆、血清、肺灌洗液、肺吸出物、或其部分或组分。可以从机体的任何组织的生物活检材料中获得样品。另外，组织培养细胞包括外植材料、原代细胞、次级细胞株等、以及裂解液、提取物、悬浮液或从任何细胞、组织或器官获得的材料也都被认为是在此所用的术语样品的含义之内。包括微生物或病毒的样品也是在利用本发明的方法进行的核酸检测的范围之内。从法医环境中获得的材料也是在术语“样品”的预期含义之内。样品也可以包括食品和饮料、环境样品例如水、土壤、沙子等。这些列举并非是排他性的。
在本发明的具体实施方式中，样品被预处理，以便有助于用检测方法对分析物的检测。提取核酸例如DNA或RNA是对本发明所针对的样品的常用的预处理。适用于提取核酸的方法和试剂盒是本领域可获得的，并包括基于苯酚-氯仿提取、盐析DNA提取、和硫氰酸胍提取的方法和试剂盒。
示例性的核酸分离技术包括(1)有机提取随后乙醇沉淀，例如利用苯酚/氯仿有机溶剂(例如Ausbel等编，当前分子生物学方案，包括直到2003年6月的补遗，John Wiley & Sons，纽约)，优选的利用自动化DNA提取仪，例如Applied Biosystems(Foster City，Calif.)的341型DNA提取仪；(2)固定相吸附法(例如Boom等的美国专利No.5234809；Walsh et al.，BioTechniques10(4)：506-513(1991))；和(3)盐诱导的DNA沉淀法(例如Miller et al.，(1988)Nucl.Acids Res.，16(3)：9-10)，这些沉淀法通常被称作“盐析”法。可以用商品化可获得的试剂盒加速这些方法，例如基因组DNA纯化试剂盒和总RNA分离系统(都来自Promega，Madison，Wis.)。此外，利用例如ABI PRISMTM 6700自动化核酸工作站(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)或ABI PRISMTM 6100核酸制备站以及相关的方案例如NucPrepTMChemistry：Isolation of Genomic DNA from Animal and Plant Tissue，AppliedBiosystems Protocol 4333959 Rev.A(2002)、Isolation of Total RNA fromCultured Cells，Applied Biosystems Protocol 4330254 Rev.A(2002)、以及ABI PRISMTM Cell Lysis Control Kit，Applied Biosystems Protocol 4316607Rev.C(2001)可以将这些方法自动化或半自动化。
上面预处理方法还可以包括片段化步骤，例如通过酶消化、剪切或超声处理、和/或酶扩增步骤例如经PCR包括RT-PCR的扩增。更具体地，当需要敏感的检测核酸时，可以在检测分析物之前实施对靶DNA的PCR扩增。因此，在这个实施方式中，被实施检测的样品包括扩增的PCR产物。
本发明的方法被设计用于检测单链(ss)核酸。因此，为了用本发明的方法检测双链(ds)核酸，需要将双链核酸变性，使得两条链分离成为单核苷酸链。DNA变性法包括高温孵育(在DNA解链点以上的温度，通常使用95℃温度，这可以造成样品中绝大多数酶活性的自发灭活)，随后立即将其放入到冰中，以避免链的复性。也可以用低盐浓度或高pH变性DNA。已经描述了一些用于从PCR产物的dsDNA生成ssDNA的方法。这些方法包括不对称PCR、利用化学修饰的引物的PCR，这会合成不等长的链，以及对一条经合适修饰的链进行优先的外切酶消化，之后经纯化步骤分离出ssDNA(Pragratis N.C.，1996，Nucl.Acids Res.，24：3645-3646)。
本方法提供了涉及利用标记的检测和/或定量的置换检测法。虽然本发明的方法利用了SE(R)RS标记和SE(R)RS表面的组合信号的特殊性能，但是本发明指出利用基于SE(R)RS的检测或检测标记的荧光，或者利用基于SE(R)RS和基于荧光的检测可以实施对样品中分析物的检测和/或定量。本发明的方法的这个特点是基于以下的事实：(a)绝大多数SE(R)RS标记也都是荧光标记，反之亦然；和(b)SE(R)RS表面的接近性对从标记检测到的SE(R)RS和荧光信号具有相当大的逆向的影响。
SE(R)RS标记通常从金属表面的接近性的信号强度强化作用中获益。当标记被吸附到或者邻近SE(R)RS表面(相距的距离可以增强它们的拉曼散射)时，标记的发射荧光可以被金属表面淬灭。当标记位于更远离表面的位置时，增强了荧光而不是拉曼散射。
当进一步增加距离时，对荧光的增强作用也逐渐消失。因此，当标记与SE(R)RS表面非常接近时，增强了SE(R)RS信号，并淬灭了荧光信号。另一方面，当标记离开SE(R)RS表面附近时，SE(R)RS信号逐渐消失，而荧光信号仍可被检测到。
但本发明方法中对分析物的检测法依据于SE(R)RS时，对SE(R)RS信号和/或其强度的检测与样品中分析物的量成反比例。事实上，当通过杂交的可置换的替代靶探针和捕获探针的复合物即所谓的“替代杂交体”提供信号时，样品中分析物浓度的增加会造成可置换的替代靶探针的置换增加以及SE(R)RS信号的减弱。
此外，本发明中对分析物的SE(R)RS检测需要标记，所述标记是SE(R)RS活化材料，即当被合适地照亮时其能够产生SERS或SERRS光谱，在此也被称作SE(R)RS标记或染料。SE(R)RS标记的非受限的实例包括荧光素染料例如5-(和6-)羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素和5-羧基荧光素；罗丹明染料例如5-(和6-)羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明和6-羧基罗丹明X；酞菁例如甲基酞菁、亚硝酰基酞菁、磺酰基(sulphonyl)酞菁和氨基酞菁；偶氮染料、偶氮甲碱、青色素和黄嘌呤例如甲基衍生物、亚硝酰基衍生物、磺胺基(sulphano)衍生物和氨基衍生物；和琥珀酰荧光素。可以用任何传统的方式取代每种标记，生成大量有用的标记。值得注意的是，对标记的选择受到一些因素的影响，例如标记的共振频率、样品中其他分子的共振频率等。在例如美国专利No.5306403、6002471、和6174677的领域描述了用于检测生物分子的SE(R)RS标记。
当标记检测依据于荧光时，对信号和/或其强度的检测与样品中分析物的量直接成比例。事实上，当标记没有与捕获探针结合(或者被置换掉)时，就只能检测到与可置换的替代靶探针结合的标记的荧光信号，样品中分析物浓度的增加会造成可置换的替代靶探针的置换增加以及荧光信号的增加。
当标记检测依据于荧光时，使用荧光标记。荧光标记包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素例如四甲基罗丹明(TMR)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、羧基-X-罗丹明(ROX)、磺基罗丹明(德克萨斯红TM)、荧光素红和荧光素橙、藻红蛋白、藻青蛋白和Crypto-FluorTM燃料等。
在具体实施方式中，本发明提供了检测荧光和SE(R)RS检测的方法。包括检测替代靶探针的标记的荧光和SE(R)RS信号的方法提供了对准确性的额外控制，因为它们容许直接和间接的检测样品中分析物的存在和/或量。在这些方法中，使用适用于两种检测方法的标记。更具体地，利用选自由HEX(2，5，1’，3’，7’，9’，-六氯-6-羧基荧光素)、荧光素、和TET(6-羧基-2′，4，7，7′-四氯荧光素)组成的组中的标记实施本发明的方法。
在本发明中，标记附着于替代靶探针，其可以是可置换的或者不可置换的替代靶探针。通过在现有技术(例如，美国专利6127120)中所述的方法可以实施标记与寡核苷酸的附着。例如在美国专利4962037、5405747、6136543、和6210896中描述了用于通过将标记整合到寡核苷酸内来制备标记寡核苷酸的其他方法。在本发明的一个具体实施方式中，使用了SE(R)RS标记，其直接地或者经接头化合物附着于核苷酸探针。含有被设计成与其他分子例如核苷酸或核酸共价反应的反应基团的SE(R)RS标记是商品化可获得的(例如Molecular Probes、Eugene、Oreg)。可以从标准商业来源(例如，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，Ind.；Promega Corp.，Madison，Wis.；Ambion，Inc.，Austin，Tex.；Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J.)购得共价附着于核苷酸前体的SE(R)RS标记。
在本发明中，通过提供可置换的替代靶探针实施检测，所述可置换的替代靶探针是被标记的并包括与感兴趣的分析物内的靶序列相似的序列，使得能够与分析物竞争与捕获探针的结合。通过提供以比分析物结合捕获探针的强度更低的强度结合捕获探针的替代靶探针来确保分析物竞争并置换所述可置换的替代靶探针的能力。在一个具体实施方式中，解链温度(Tm)被定义成其中50％杂交体被变性成单链的温度，其中替代杂交体的解链温度要比靶杂交体的温度更低。通过向可置换的替代靶探针的核苷酸序列中引入一个或多个修饰通常可以确保这一点，所述修饰实现了替代靶探针与捕获探针的结合。合适的修饰包括引入一个或多个单核苷酸多态性(SNP)、插入(例如发夹结构)等。现有技术描述了多种不同的计算寡核苷酸的解链温度的方法，而因特网上可提供不同的来源基于算法的计算Tm的服务(例如Stratagene:www.stratagene.com/QPCR/tnCalc.asp)。这些方法使得评价在可置换的靶探针序列中整合一个或多个错配对Tm的影响成为可能。虽然每种方法都给出了稍微不同的结果，必须经验性地确定出最佳的Tm值，绝大多数这些方法可用于提供可置换的靶探针在本发明中的适用性的指示。
可置换的替代靶探针和靶序列的寡核苷酸序列之间的解链温度的差异对应于最佳的退火温度的差异。如果退火温度被定得太高，核苷酸序列(例如探针、分析物)将不能有效地退火，如果退火温度被定得太低，核苷酸序列(例如探针、分析物)可以非特异性退火。当在实施本发明的方法时，为了保证分析物对可置换的替代靶探针的置换，要在退火温度下实施分析物和捕获探针以及可置换的替代靶探针(其可以被任选地容许形成替代杂交体)的接触，所述退火温度和可置换的替代靶探针的解链温度相同或者优选的更高。因此，在一个实施方式中，可以在可置换的替代靶探针的解链温度下实施接触步骤，更特别的是在比可置换的替代靶探针的解链温度高0到10℃之间的最佳退火温度下实施接触步骤，最特别的是在比可置换的替代靶探针的解链温度高0到5℃之间的最佳退火温度下实施接触步骤。
要指出的是，可置换的替代靶探针和捕获探针的接触步骤包括在最佳地比替代杂交体的解链温度低2-6℃的退火温度下的退火步骤。
也要指出的是，分析物和捕获探针以及可置换的替代靶探针(其任选地可被容许形成替代杂交体)的接触步骤包括变性步骤(通常加热到约90-95℃)，以及此后的在靶序列的最佳退火温度(其比可置换的替代靶探针的最佳退火温度更高)下实施的退火步骤。当分析物是双链的分析物且需要对双链DNA变性以便容许检测时，变性步骤可以是感兴趣的步骤。当不仅需要样品中的分析物的定性信息，也需要定量信息时，变性步骤也可以是感兴趣的步骤。
在具体实施方式中，替代杂交体被设计成其Tm比靶杂交体的Tm低约15到20℃。这通过例如在替代靶探针的寡核苷酸部分中包含一些错配可能是可行的。因此，替代杂交体在其中靶杂交体保持保守即捕获探针仍退火于靶序列的温度下可以被完全解链。这个方法能够利用温和温度下的单个解链步骤。
在本发明的实施方式中，在解链和/或退火期间可以“实时”监测可置换的替代靶探针上出现的标记的信号检测。
本发明的方法所用的不同试剂的接触可以有所不同，这取决于所需的检测信号(以及从中获得的信息)的性质。在本发明的具体实施方式中，首先接触捕获探针和可置换的替代靶探针，并容许形成替代杂交体。在向该杂交体中加入SE(R)RS表面之后，该替代杂交体的信号可以被检测到并作为基线检测信号。然后使样品接触替代杂交体，样品中的分析物可以从捕获探针中置换出可置换的替代靶探针。对剩余的替代杂交体的信号的检测是样品中分析物的指示。或者，可以同时接触样品、替代靶探针、和捕获探针。在另一个实施方式中，在加入SE(R)RS表面之前，使替代杂交体接触样品。在后两个实施方式中，没有检测过基线值，只能获得存在分析物的标记信号的指示。但是，如果例如在对照样品中例如在测定大量相似的样品之前实施分离的测量，可以确定出基线值。或者，如果向样品中引入包括不同SE(R)RS标记的内标准物(如下所述)，可以确定出基线值。此外，如果只需要定性信息，可以用检测荧光(可置换的替代靶探针形成的)验证样品中靶序列的存在。在本发明的具体实施方式中，捕获探针与SE(R)RS表面共价结合，去除了对包括吸附到SE(R)RS表面的附加步骤的需要。如上所述，在绝大多数情况中，通过检测荧光信号可以互补或取代SE(R)RS信号检测。
在本发明另一个方面中，提供了其中分析物的检测是基于如上所述的竞争性SE(R)RS的方法，其中包括(内)标准杂交体，以便校正检测的聚集和光学变异。在这个方面中，方法还包括加入能够形成“标准杂交体”的作为标准探针和标准捕获探针的捕获探针及其互补的标记探针的步骤。在一个具体实施方式中，标准杂交体是内标准物，即被加入到样品中的内标准物。为了能够区分出标准杂交体和样品中替代杂交体的信号，使用了不同的SE(R)RS(和/或荧光)标记。在另一个具体实施方式中，向一部分样品中加入标准杂交体。在仍一个具体实施方式中，向对照样品中加入标准杂交体。当测量大量的相似样品时，后两个实施方式是特别有用的。
在一个实施方式中，标准捕获探针的序列与检测所用的捕获探针的序列相同，且标准探针是不可置换的替代靶探针。当不可置换的替代靶探针的Tm比可置换的替代探针的Tm更高时，分析物在替代靶探针的Tm下不会从捕获探针中置换出不可置换的替代靶探针。或者，标准捕获探针的核苷酸序列不是靶特异的而是(任意的)序列，其特异性结合相应的标准探针。这就避免了标准杂交体和分析物检测之间的任何相互作用，甚至当整合了更高的温度步骤使得可以在检测(或需要时加入SE(R)RS表面)之前的任何时间实施向样品中加入标准杂交体(杂交体或者其单个的组分)时。此外，提供不同于分析物的标准探针和标准捕获探针组合可以容许在不同的检测中使用相同的标准杂交体。
在本发明中，描述了置换监测，其利用了表面增强光谱(以及任选地其对荧光的固有的作用)的特殊性能。表面增强光谱检测例如SE(R)RS是依据于在被吸附到或非常接近于(≤±30
Figure A200780017624D0019132451QIETU
)粗糙金属表面上的分析物上所观察到的拉曼散射的强烈增强作用。在本发明中，通过加入合适的SE(R)RS表面检测出SE(R)RS标记。表面通常是贵金属(Au、Ag、Cu)或碱金属(Li、Na、K)表面。金属表面例如可以是刻蚀的或其它粗糙的金属表面、金属溶胶或者在一个具体实施方式中，金属胶体颗粒聚集成金属溶胶可以确保拉曼散射增强大于108-1014。在本发明的检测法中，制成SE(R)RS表面的金属纳米颗粒也可以被排列成金属纳米岛膜、基于金属涂层的纳米颗粒的基材、具有包埋的金属纳米颗粒的聚合物膜等。金属表面可以是裸金属或者可以包括金属表面上的金属氧化物层。这可以包括有机涂层例如柠檬酸或合适聚合物例如多赖氨酸或多酚的涂层，以便增加其吸着质能力。
在本发明的具体实施方式中，制成SE(R)RS表面的金属胶体颗粒是按可控模式聚集的纳米颗粒或胶体纳米颗粒，例如US 2005/0130163 A1所述。制备纳米颗粒的其他方法也是已知的(例如美国专利6054495、6127120、和6149868)。也可以从商业来源(例如Nanoprobes Inc.，Yaphank，N.Y.；Polysciences，Inc.，Warrington，Pa.)获得纳米颗粒。金属颗粒可以是任何形状的，只要它们能够产生SE(R)RS作用。它们的直径通常约为4到50nm，最特别是在25到40nm之间，这都取决于金属类型。
在另一个具体实施方式中，SE(R)RS表面是银或金纳米颗粒的胶体悬浮液或者其聚集的胶体。通过使用聚氨例如聚L-赖氨酸或精胺可以确保所聚集的胶体颗粒的最佳尺寸和形状，这对于检测的重复性和校准性是关键的。因为所聚集的胶体的大小可以随着时间发生改变，理想上可以在检测样品上原位形成胶体，以及之后应当立刻获得SE(R)RS光谱(优选的在聚集约15分钟内)。
在另一个具体实施方式中，SE(R)RS表面是由金纳米颗粒组成，所述金纳米颗粒通过在共价连接捕获探针和金纳米颗粒之后加入氢醌银而经银涂覆。最特别的，在这个实施方式中，SE(R)RS表面是由分别经金或银薄层(1到数纳米)涂覆的银或金纳米颗粒组成的。
在仍另一个实施方式中，SE(R)RS表面是由银或金的稳定的纳米颗粒簇组成的，所述簇是通过与双或多官能大分子(telemer)的交联形成的，所述大分子可以与所述簇化学结合。
在本发明利用SE(R)RS检测和荧光检测之一或两者的检测和/或定量方法中，通过结合替代靶探针和捕获探针(后者与SE(R)RS表面相连)可以使得替代靶探针的标记非常接近于SE(R)RS表面。可以通过共价键或非共价键结合捕获探针和SE(R)RS表面。用于结合寡核苷酸与SE(R)RS表面的各种方案和方式是本领域已知的(美国专利612712和6972173)，并且都可以被应用于结合捕获探针或替代杂交体和SE(R)RS表面。
在一个实施方式中，捕获探针对SE(R)RS表面的附着是通过共价键进行的。捕获探针与表面定位基团相吻合，以便促进或有助于探针化学吸附于SE(R)RS表面。表面定位基团可溶于溶液，但是优选地与SE(R)RS表面相互作用。通过将一个或多个官能团整合到捕获探针的寡核苷酸部分内可以确保这一点。合适的官能团包括Lewis碱例如硫醇和胺类，其容易被加到核酸内。表面定位基团的其他实例包括络合基团例如氮、氧、硫和磷供体、螯合基团、桥接配体和多聚体形成配体。对于金表面而言，含磷和硫的基团是特别优选的。
在一个具体实施方式中，捕获探针的表面定位基团是能够使得捕获探针与SE(R)RS表面共价相连的苯并三唑。
在另一个具体实施方式中，捕获探针的表面定位基团是由至少一个能够使得捕获探针与SE(R)RS表面共价相连的巯基组成。
优选的官能团是能够提供附加的阳离子位点(在所用的条件之下)的基团，例如包括氨基的基团，优选的是伯胺基团。在一个优选的实施方式中，捕获探针的表面定位基团包括带正电荷的炔丙胺部分。在另一个实施方式中，通过加入单体的或多聚体的多胺，更特别的加入短链脂肪族多胺例如精胺可以确保捕获探针对金属SE(R)RS表面的吸附。因此，在一个实施方式中，本发明的方法包括在检测之前向样品中加入多胺。应当在获得SE(R)RS光谱之前，容许所述多胺与替代杂交体相互作用的时候引入多胺。多胺优选地是短链脂肪族多胺例如精胺、精脒、1，4-二氨基哌嗪、二乙撑三胺、N-(2-氨乙基)-1，3-丙二胺、三乙四胺和四乙撑戊胺。具有每重复单位四个NH2基团的精胺特别适用于本发明。优选地引入酸盐形式例如氢氯化物盐的多胺。当SE(R)RS表面是胶体(见上)时，这是最为常用的。所加入的多胺的量优选地比获得多胺对表面的单层覆盖所需的量多100到1000倍数量级。过量的多胺在表面上形成涂层，确保了捕获探针和/或替代杂交体的最佳的胶体聚集和吸附。
如上所述，本发明的方法特别涉及基于表面增强(共振)的拉曼光谱学或SE(R)RS的检测和/或定量方法。虽然在此通常指的都是SE(R)RS，要明白基于其他类型的表面增强光谱学的检测方法也是本发明所针对的，例如但不限于表面增强荧光、正常(Stokes或抗Stokes)拉曼散射、共振拉曼散射、同相(Stokes或抗Stokes)拉曼光谱(CSRS或CARS)、表面增强(共振)CARS、受激拉曼散射、反向拉曼光谱、受激增益拉曼光谱、高拉曼散射、表面增强高拉曼散射、分子光学激光检测仪(MOLE)或拉曼微探针或拉曼显微镜或共聚焦拉曼显微光谱仪、三维或扫描拉曼、拉曼饱和光谱、时间分辨共振拉曼、拉曼去耦合光谱或UV-拉曼显微镜。
在本发明的一个特别的实施方式中，本发明的检测方法涉及SERRS，因为在标记的共振频率时的操作得到了增加的敏感性。在这种情况中，被用于生成拉曼光谱的光源是相干光源例如激光，其基本上被调频到所用标记的最大吸收频率。当标记和SE(R)RS表面和替代靶探针的寡核苷酸相连时，该频率可能会轻微偏移，但是熟练人员能够很好地调频光源，以适应这一点。光源可以被调频到接近标记的最大吸收的频率或调频到标记的吸收光谱的次级峰处或其附近的频率。SERRS还可以包括在活性表面或(聚集)胶体上的等离子体的共振频率实施的操作。
在本发明的基于SE(R)RS检测的方法中，通常选出对应于例如标记的最大吸收的一个峰，只在该峰的波长处实施激发。或者，当例如利用不同的标记同时检测不同的分析物时，必须要检测出整个“指纹”光谱，以便鉴定出不同的标记。利用整个指纹光谱(具有超过一个拉曼带的光谱范围)或者利用一个独特的拉曼带，通常可以用多因素分析方法(例如部分最小二乘法回归、主成份回归分析等)实施对所含每种标记的定性和/或定量的鉴定。
在本发明的一个特别的实施方式中，本发明的方法涉及用表面增强(共振)拉曼和荧光光谱(见上)同时实施的检测。
通常利用来自激光的具有可见光光谱频率的入射光实施基于SE(R)RS检测法中的检测步骤。所选的实际频率取决于标记、表面和分析物。对于贵金属表面例如银和金而言，可见光光谱中的绿光或红光区的频率大体上易于得到更好的表面增强作用。但是，也可以使用其他频率例如紫外线或近红外线范围内的频率的状态。对具有合适频率和功率的合适光源的选择以及必要时的调频都是在本领域人员的能力范围之内，特别是在参照可获得的SE(R)RS文献的情况下。
用于基于SE(R)RS检测法的激发源包括但不限于氮激光、氦镉激光、氩离子激光、氪例子激光等。多个激光可以提供较广的激发光线的选择，这对于共振拉曼光谱是重要的。在一个具体的实施方式中，氩离子激光被用于LabRam集成装置(Jobin Yvon)，其激发波长为514.5nm。
利用带通滤波器光谱方法纯化出激发束，并且用6倍接物镜可以将其聚焦于基材。通过使用全息分光镜生成激发束和发射的拉曼信号的直角几何学可以将接物镜用于激发样品以及收集拉曼信号。需要测定出拉曼信号相对于激发束的强背景的强度。背景主要是Rayleigh散射光和镜面反射，通过高效滤光片可以将其选择性地去除。例如，可以用全息陷波滤波器减少Rayleigh散射线。
用拉曼检测仪检测出表面增强拉曼发射信号。各种可能用于拉曼光谱的检测单元是本领域已知的，可以使用任何已知的拉曼检测单元。例如在美国专利US 6002471中参数了拉曼检测单元的实例。可以使用其他类型的检测仪例如电荷耦合装置(CCD)、具有红光增强强化的电荷耦合装置(RE-ICCD)、硅光电二极管、或单个或系列排列的用于级联扩增信号的光倍增管。光子计数电子学可以用于敏感检测。对检测仪的选择主要取决于实施特殊检测所需的检测敏感度。一些装置适用于收集SE(R)RS信号，包括波长选择镜、用于散射光检测的全息光学元件以及导光纤维波导仪。例如WO 97/05280讨论了各种方案。
用于获得和/或分析SE(R)RS光谱的装置可以包括一些形式的数据处理器例如计算机。SE(R)RS信号一旦被合适的检测仪捕获，其频率和强度信号通常被传输到计算机进行分析。比较指纹拉曼光谱和参照光谱以便鉴定出所检测的拉曼活性化合物或者用测定频率的信号强度计算出所检测的拉曼活性化合物的量。
本发明的具体实施方式提供了用于检测样品中的两个PCR产物基因A和基因B的SE(R)RS置换检测法。方法基本如下所示。分别接触基因A和基因B的捕获探针以及它们相应的携带标记HEX和TET的替代靶探针，并容许其杂交。捕获探针含有促进吸附到银表面上的表面定位基团。替代靶探针和捕获探针的杂交生成了基因A和基因B的每个靶序列的替代杂交体。替代杂交体随后被吸附到银纳米胶体上。实施第一个SE(R)RS测量。加入含有所扩增的基因A和B的样品。在95℃变性以解离替代靶和双链PCR产物之后，将温度降低到退火温度，所述退火温度对于退火分析DNA(即变性的基因A和B)和它们相应的捕获探针是最佳的温度，以及对于退火替代靶探针和这些探针是次最佳的温度。通过这种方式发生了分析DNA和替代靶探针之间的竞争，这将造成从表面吸附的替代杂交体中有效地置换出替代靶探针。如上讨论所示，置换情况在比替代杂交体的Tm更高的退火温度时是最佳的。第二个SE(R)RS测量将生成比在加入分析物之前更低的SE(R)RS信号，因为附着于所置换的替代靶探针的SE(R)RS标记不再足够接近于SE(R)RS表面。任选地，同时或者取代SE(R)RS测定荧光。由于淬灭的原因，替代杂交体中标记的荧光接近为零。如果样品中存在分析物，信号将因此增加，因为替代靶探针的置换去除了淬灭的来源。每个基因所置换的替代靶探针的量是样品中存在的基因A和B的量的指示。
图5是本发明的一个实施方式的系统100的示意图。系统100适用于利用基于SE(R)RS和荧光的置换检测法检测以及任选地定量样品中至少一种分析物的存在。它包括用于提供样品的源101、至少一个用于提供替代靶探针的源102、至少一个用于提供捕获探针的源103、以及任选的至少一个用于提供作为内标准物的试剂的源104以及至少一个作为检测中的添加剂的源105。装置还包括工具107，其中接触并呈递用于检测的替代靶探针、捕获探针和分析物。接触工具107也包括用于确保接触工具内的合适温度的加热设备。
装置还包括工具106，其用于：
a)为工具107提供用于接触替代靶探针和捕获探针以生成替代杂交体的分别来自源102和103的替代靶探针和捕获探针；
b)为工具107提供用于接触替代杂交体和SE(R)RS表面使得能够检测附着于替代靶探针上的SE(R)RS标记的来自源105的添加物；
c)为工具107提供包括用于接触样品和替代杂交体使得能够置换替代靶探针的来自源101的分析物的样品；
d)为工具103提供用于校准检测的聚合物形成的变异以及光学变异的来自至少一种源104的至少一种内标准物试剂。
工具106可以包括样品和/或分析物的重量分析进料，也可以包括管道/管路和阀门例如可选择及可控的阀门的排列，以容许给接触工具107提供来自源101、102、103、104和105的液体。或者，也可以将来自源101到105的液体泵入到接触工具107内。
组分的上述排列都可以位于筒111例如用于分子诊断的一次性筒111内。
控制和分析电路109可以至少部分位于筒111内或者可以任选地位于筒111外，其可以被任选地提供用于控制工具106的操作。通过与筒表面合适的接触例如通过终端可以将控制和分析电路109与工具106相连接。
此外，提供了用于检测标记的工具108。工具108可以与筒111整合，或者可以位于筒的外面，筒111提供了视窗，使得检测工具108可以检测样品等。工具108可以处于控制和分析电路109的控制之下。检测工具108可以是能够使用如上提及的SE(R)RS和荧光检测法的检测仪。工具108可以包括激发光源、滤波器和检测仪。用于检测的工具通常包括分光光度仪。检测的代表性信号可以提供给控制和分析电路109，其可以被采用实施如上所述的本发明的任一分析算法。可以在任何合适的展示工具110例如视觉展示单元、绘图仪、打印机等上展示结果。控制和分析电路109可以与局域网或广域网连接，以便将结果传输到远距离的地方。可以用任何合适的方式应用控制和分析电路109，例如专用硬件或合理编程的计算机、微控制器或包埋处理器例如微处理器、程序控制的门阵列例如PAL、PLA或FPGA等。
在本发明的一个具体的实施方式中，源101中的样品可以是含有从PCR反应中获得的DNA的溶液。这个实施方式特别适用于分子诊断的一次性筒，其可以包括细胞裂解站和PCR反应站，特别是多路PCR反应站。然后PCR反应站的输出形成了源101。用于检测扩增寡核苷酸的源103中的捕获探针是分析物特异性寡核苷酸探针。源102中的替代靶探针是附着有SE(R)RS标记的适用于SE(R)RS和荧光检测的寡核苷酸探针。在一个具体实施方式中，替代靶探针的核苷酸序列含有SNP，使得替代靶探针与捕获探针的结合是次最佳的。源104可以含有预定量的形成(不可置换的)标准杂交体的内标准物。第一源105含有合适的金属表面例如经金属表面涂覆的胶体颗粒或珠，特别是经金属表面涂覆的可聚集的胶体颗粒或珠。第二源105可以含有聚集剂例如精胺。
在这个具体实施方式中，适当提供及接触来自源101到105中的试剂形成了含有表面吸附的替代杂交体和表面吸附的标准杂交体的接触工具107。在该点实施的第一次测量作为参照。随后，加入样品。在从捕获探针置换出替代靶探针之后，观察到SE(R)RS信号的减弱和/或荧光的增强。
具体表达本发明的系统和方法的其他设置对于本领域人员是显而易见的。
本发明的另一个方面提供了本发明的系统、一次性筒、组合和方法在应用例如但不限于医学诊断例如感染性疾病的分子诊断、病理学、毒理学、流行病学、生物战、环境取样、法医学等中对样品中分析物的检测和/或定量中的用途。
要明白尽管在此已经讨论了本发明的装置的具体构造和配置以及材料，只要不脱离本发明的范围和精神就可以进行形式和细节方面的各种变更或修饰。
实施例1：利用竞争性SERRS和内校准来检测并定量样品中的特异基因
由流感病毒A的某些亚型在动物种群特别是鸡中引起的高致病性禽流感是持续的全球性人类公共卫生的危险。禽流感A亚型H5N1病毒引起的直接人类感染最近已经造成了相当高的病死率，这使得快速和准确诊断的需要更为迫切。依据外在糖蛋白、血凝素(HA)和神经酰胺酶(NA)的抗原差异将A型流感病毒分成不同的亚型。本发明提供了一种通过用病毒核酸的RT-PCR和SERRS对病毒进行亚型分类的新的、快速和准确的方法。
从临床样品中提取出病毒RNA，利用病毒逆转录酶和Wright et al.(1995)，J.Clin.Microbiol.，33：1180-1184中的随机引物生成与病毒RNA互补的cDNA。用如WHO 2005年6月在日内瓦发表的“鉴定人体样品中的禽流感A病毒的推荐实验室检查”中所述的两组被分别设计成生成219和616bpPCR产物的特异于流感病毒亚型H5N1的HA和NA基因的引物实施多路PCR。随后用竞争性SERRS检测出所扩增的产物。
分别设计出两个与HA和NA内的区域互补的分析物特异性探针即捕获探针，其具有由带正电荷的炔丙胺部分组成的用于附着于银纳米颗粒上的表面定位基团。分别经SERRS染料HEX和TET标记的两个附加的合成寡核苷酸即替代靶被设计成分别与HA-和NA-捕获探针的一部分互补，除了一个错配(SNP)外。
在使相应的捕获探针接触替代靶探针之后，形成了替代杂交体。但是，由于替代靶探针序列中错配的存在，替代靶探针及其相应的HA-和NA-捕获探针被松散地退火。
向上述混合物中加入预定量的携带有不同于用于检测的标记的标记的作为不可置换替代杂交体的内标准物，进行校准并校正聚合物形成和激发强度方面的可能变异。
第一步确定出HEX和TET的SERRS测量的参照点以及内校准的参照点。此后，混合上面制备的溶液和10μl四氯精胺(100mM水溶液，新鲜制备)，以及随后混合250μl水和250μl经柠檬酸还原的银纳米颗粒(如Munroet al.(1995)，Langmuir，11：3712-3720所述的那样制备)。替代杂交体在银胶体上的吸附使得HEX和TET染料非常接近于金属表面，这样就能够进行SERRS检测，同时淬灭荧光。同样，内标准物在银胶体上的吸附使得能够进行内标准物染料的SERRS检测。在混合后即刻，利用带有提供514.5nm激发波长的氩激光的LabRam系统(Jobin Yvon)从所制备的溶液中获得SERRS光谱。
为了检测出所扩增的H5N1病毒的HA和NA基因，加入PCR反应的输出物。在95℃下的变性之后，在合适退火温度下的孵育形成了分析物DNA和HA-及NA-捕获探针的结合，后者(捕获探针)附着于所聚集的银胶体上。因为分析物的序列优选地互补于HA-和NA-特异性捕获探针，分析物DNA与HA-及NA-捕获探针的杂交形成了在替代杂交体的解链温度下不可置换的靶杂交体。只要标准杂交体的Tm比替代杂交体的Tm更高，那么上面的孵育步骤就不会影响标准杂交体。
在分析物DNA和捕获探针结合后的即刻以及在第一次测量后的15分钟内，得到第二个SERRS光谱。现在由于染料所附着的替代靶探针从金属表面的置换就降低了HEX和TET染料的SERRS信号的强度。现在就可以计算出PCR输出中HA或NA基因的量，因为它对应于所置换的替代靶探针的量。因此，需要比较第一次和第二次SERRS测量值。
为了校准的需要，比较了内在标准物的第一次和第二次SERRS光谱，并校正了强度变异。
本实施例表明利用竞争性SERRS可以实现对所扩增的病毒HA和NA基因的准确检测，且不需要标记所扩增的基因。

Claims (27)

1.用于检测样品中至少一种分析物的存在和/或量的方法，包括以下步骤：
(a)使所述样品接触：
(i)至少一种靶特异性捕获探针，其包括：
-能够特异性结合所述分析物内的靶序列的寡核苷酸，和
(ii)至少一种可置换的替代靶探针，其包括：
-能够特异性结合所述捕获探针的寡核苷酸，
-具有表面增强(共振)拉曼散射(SE(R)RS)和荧光活性之一或两者的标记，
其中所述至少一种靶特异性捕获探针与SE(R)RS表面共价结合或者所述步骤(a)还包括使所述至少一种靶特异性捕获探针接触SE(R)RS表面；和
(b)检测由至少一种替代杂交体中的所述标记产生的信号，所述替代杂交体由所述至少一种可置换的替代靶探针和所述至少一种靶特异性捕获探针结合而形成，所述信号与所述样品中所述至少一种分析物的存在和/或量成比例。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)包括以下步骤：
(I)使所述至少一种靶特异性捕获探针接触所述至少一种可置换的替代靶探针，以便获得至少一种替代杂交体；
其中所述至少一种靶特异性捕获探针与SE(R)RS表面共价结合并因此获得至少一种表面吸附的替代杂交体；或者所述步骤(I)还包括使所述至少一种靶特异性捕获探针接触SE(R)RS表面或者所述步骤(I)还包括使所述至少一种替代杂交体接触所述SE(R)RS表面，使得所述至少一种替代杂交体吸附于所述表面上形成至少一种表面吸附的替代杂交体；
(II)使所述至少一种表面吸附的替代杂交体接触所述样品，以便容许所述至少一种分析物置换所述至少一种可置换的替代靶探针；
且其中步骤(b)包括以下步骤：
(III)利用SE(R)RS和荧光之一或两者在步骤(I)之后检测所述至少一种表面吸附的替代杂交体上的所述标记的信号；和
(IV)利用与步骤(III)相同的检测方法在步骤(II)之后检测所述至少一种表面吸附的替代杂交体的信号；
其中在步骤(III)和(IV)中获得的信号的差异被认为与所述样品中所述至少一种分析物的存在和/或量成比例。
3.权利要求2的方法，其中步骤(a)包括以下步骤：
(V)使所述至少一种靶特异性捕获探针接触所述至少一种可置换的替代靶探针，以便获得至少一种替代杂交体；
(VI)使所述至少一种替代杂交体接触所述SE(R)RS表面，使得所述至少一种替代杂交体吸附于所述表面上，形成至少一种表面吸附的替代杂交体；和
(VII)使所述至少一种表面吸附的替代杂交体接触所述样品，以便容许所述至少一种分析物置换所述至少一种可置换的替代靶探针。
4.权利要求2的方法，其中步骤II包括确保合适的退火条件，以容许所述样品中所述至少一种分析物与所述至少一种捕获探针的杂交。
5.权利要求1的方法，其中所述至少一种可置换的替代靶探针包括与所述至少一种捕获探针的所述核苷酸序列并非100％互补的寡核苷酸序列。
6.权利要求1的方法，其中所述至少一种靶特异性捕获探针还包括表面定位基团以及所述至少一种靶特异性捕获探针通过所述表面定位基团结合所述SE(R)RS表面。
7.权利要求1的方法，还包括步骤：
(c)使
(iii)标准捕获探针，其包括：
-寡核苷酸，和
-表面定位基团；
接触
(iv)标准探针，其包括：
-与所述标准捕获探针的序列100％互补的寡核苷酸，和
-具有表面增强(共振)拉曼散射(SE(R)RS)和荧光活性之一或
两者的标记；
据此获得标准杂交体；并接触
(v)SE(R)RS表面；
据此获得表面吸附的标准杂交体；和
(d)检测由所述表面吸附的标准杂交体中的所述标记产生的信号。
8.权利要求7的方法，其中将在步骤(c)中获得的所述标准杂交体加入到所述样品中，且其中所述标准探针包括不同于所述至少一种替代靶探针所具有的标记的标记。
9.权利要求7的方法，其中所述标准捕获探针包括不与所述靶序列杂交的寡核苷酸序列。
10.权利要求7的方法，其中在不同于步骤(a)和(b)的容器中实施所述步骤(c)和(d)。
11.权利要求10的方法，其中步骤(a)和(b)中的所述样品是对照样品。
12.权利要求1的方法，其中所述至少一种捕获探针包括表面定位基团。
13.权利要求12的方法，其中所述表面定位基团是苯并三唑。
14.权利要求1的方法，其中所述SE(R)RS表面是由金纳米颗粒组成的，所述金纳米颗粒通过在所述捕获探针和所述金纳米颗粒的共价连接之后加入氢醌银而由银涂覆。
15.权利要求1的方法，其中SE(R)RS表面是银或金纳米颗粒的胶体悬浮液或其聚集的胶体。
16.权利要求1的方法，其中所述SE(R)RS表面是由分别涂覆有一薄层(1到数纳米)金或银的银或金纳米颗粒组成的。
17.权利要求1的方法，其中所述SE(R)RS表面是由银或金的稳定的纳米颗粒簇组成的。
18.权利要求17的方法，其中通过与能化学结合所述簇的双官能或多官能的大分子(telemer)的交联形成所述簇。
19.替代靶探针和捕获探针的组合，其包括：
(i)捕获探针，其包括：
-寡核苷酸；
(ii)替代靶探针，其包括：
-能够结合所述捕获探针的寡核苷酸，
其中所述寡核苷酸的特征是解链温度低于与所述捕获探针的寡核苷酸100％互补的寡核苷酸的解链温度，
-具有表面增强(共振)拉曼散射(SE(R)RS)和荧光活性之一或两者的附着于所述替代靶探针上的标记。
20.权利要求19的组合，其中所述捕获探针与SE(R)RS表面共价结合。
21.权利要求19的组合，其中所述捕获探针包括能够结合SE(R)RS表面的表面定位基团。
22.在检测样品中至少一种分析物的存在和/或量的系统中使用的一次性筒(111)，其包括：
(a)一组源，包括：
-样品源(101)；
-至少一个替代靶源(102)；
-至少一个靶特异性捕获探针源(103)；
-至少一个检测中所用的添加物源(105)；
(b)用于接触来自所述源的规定体积的工具(107)；和
(c)用于确保给接触工具(107)提供来自所述源的液体的工具(106)。
23.权利要求22的筒，还包括至少一个内标准试剂源(104)。
24.权利要求22的筒，还包括用于检测所述接触工具中产生的信号的视窗。
25.用于检测样品中至少一种分析物的存在或量的系统(100)，其包括：
(a)工具(107)，用于使所述样品接触
(i)至少一种靶特异性捕获探针，其包括：
-能够特异性结合所述分析物内的靶序列的寡核苷酸，和
(ii)至少一种可置换的替代靶探针，其包括：
-能够特异性结合所述捕获探针的寡核苷酸，
-具有表面增强(共振)拉曼散射(SE(R)RS)和荧光活性之一或两者的标记；和
(b)工具(108)，用于检测通过所述至少一种可置换的替代靶探针与所述至少一种靶特异性捕获探针结合而形成的至少一种替代杂交体中的所述标记产生的信号。
26.权利要求25的系统，还包括用于计算所述至少一种分析物的量的工具(109)，所述计算通过比较在从所述源给所述接触工具(107)提供试剂的不同时间点上在所述接触工具(107)中检测到的检测信号而进行。
27.权利要求25的系统，其中用于检测的所述工具(108)包括光源、滤波器和检测工具。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104969060A (zh) * 2013-01-30 2015-10-07 惠普发展公司，有限责任合伙企业 表面增强荧光光谱仪器
CN108474778A (zh) * 2015-12-09 2018-08-31 印度理工学院 利用集成方法来进行基于逆转录聚合酶链式反应（rt-pcr）和/或dna/蛋白质阵列的分析的装置

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005066613A1 (en) 2003-12-31 2005-07-21 President And Fellows Of Harvard College Assay device and method
US8108943B2 (en) * 2007-11-30 2012-01-31 California Institute Of Technology Method and system for near-field spectroscopy using targeted deposition of nanoparticles
DE102013224412A1 (de) * 2013-11-28 2015-05-28 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren zur Untersuchung einer Probe durch CARS-Mikroskopie
US10229168B2 (en) * 2015-11-20 2019-03-12 International Business Machines Corporation Single-pass distributed sampling from block-partitioned matrices
EP3625551A4 (en) 2017-07-17 2021-01-13 Hewlett-Packard Development Company, L.P. RADIATION OF PLASMONIC SURFACES BEFORE THE ANALYTE EXPOSURE
CN108266166B (zh) * 2018-02-08 2020-07-31 中国石油大学(华东) 一种裂缝性油藏波动采油微观射流增渗机制评价实验装置与方法
JP7190277B2 (ja) * 2018-07-31 2022-12-15 浜松ホトニクス株式会社 被検体分析方法
CN110987903B (zh) * 2019-12-11 2021-06-11 华中科技大学 一种libs基体效应校正方法及其应用
CN113655226B (zh) * 2021-10-20 2021-12-31 首都医科大学附属北京朝阳医院 用于房水检测的校准物基质及其制备方法和应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4962037A (en) * 1987-10-07 1990-10-09 United States Of America Method for rapid base sequencing in DNA and RNA
US5234809A (en) * 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
US5405747A (en) * 1991-09-25 1995-04-11 The Regents Of The University Of California Office Of Technology Transfer Method for rapid base sequencing in DNA and RNA with two base labeling
US5306403A (en) * 1992-08-24 1994-04-26 Martin Marietta Energy Systems, Inc. Raman-based system for DNA sequencing-mapping and other separations
GB9517955D0 (en) * 1995-07-25 1995-11-08 Univ Strathclyde Nucleotide sequence detection and analysis
US6174677B1 (en) * 1995-10-13 2001-01-16 Ut-Battelle, Llc Advanced surface-enhanced Raman gene probe systems and methods thereof
US5876480A (en) * 1996-02-20 1999-03-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Synthesis of unagglomerated metal nano-particles at membrane interfaces
US6002471A (en) * 1996-11-04 1999-12-14 California Institute Of Technology High resolution scanning raman microscope
US6136543A (en) * 1997-01-31 2000-10-24 Hitachi, Ltd. Method for determining nucleic acids base sequence and apparatus therefor
AU8261098A (en) * 1997-06-24 1999-01-04 University Of Wyoming Method and apparatus for detection of a controlled substance
US6149868A (en) * 1997-10-28 2000-11-21 The Penn State Research Foundation Surface enhanced raman scattering from metal nanoparticle-analyte-noble metal substrate sandwiches
US6210896B1 (en) * 1998-08-13 2001-04-03 Us Genomics Molecular motors
US6972173B2 (en) * 2002-03-14 2005-12-06 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by raman scattering
CA2470477A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-10 Donald P. Tuchman Systems and methods for automated quantitative analyses of digitized spectra
GB0216197D0 (en) * 2002-07-12 2002-08-21 Univ Strathclyde Serrs active particles
CA3122193A1 (en) * 2002-12-26 2004-07-22 Meso Scale Technologies, Llc. Assay cartridges and methods of using the same

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104969060A (zh) * 2013-01-30 2015-10-07 惠普发展公司，有限责任合伙企业 表面增强荧光光谱仪器
CN104969060B (zh) * 2013-01-30 2017-03-08 惠普发展公司，有限责任合伙企业 表面增强荧光光谱仪器
US9702821B2 (en) 2013-01-30 2017-07-11 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Surface enhanced fluorescence spectroscopy apparatus
US10393662B2 (en) 2013-01-30 2019-08-27 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Surface enhanced fluorescence spectroscopy apparatus
CN108474778A (zh) * 2015-12-09 2018-08-31 印度理工学院 利用集成方法来进行基于逆转录聚合酶链式反应（rt-pcr）和/或dna/蛋白质阵列的分析的装置
CN108474778B (zh) * 2015-12-09 2020-07-24 印度理工学院 利用集成方法来进行基于逆转录聚合酶链式反应和/或dna/蛋白质阵列的分析的装置

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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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