BRPI0711844A2

BRPI0711844A2 - método e sistema para determinar os efeitos da matriz de amostra, e, cartucho descartável

Info

Publication number: BRPI0711844A2
Application number: BRPI0711844-9A
Authority: BR
Inventors: Kristiane A Schmidt; Gerhardus W Lucassen; Sieglinde Neerken
Original assignee: Koninkl Philips Electronics Nv
Priority date: 2006-05-16
Filing date: 2007-05-08
Publication date: 2011-12-13
Also published as: WO2007135591A1; RU2008149512A; CN101443459A; JP2009537816A; CN101443461A; US20090162888A1; EP2019870A1

Abstract

MéTODO E SISTEMA PARA DETERMINAR OS EFEITOS DA MATRIZ DE AMOSTRA, E, CARTUCHO DESCARTáVEL. São descritos métodos e sistemas adequados para determinar os efeitos da matriz de amostra na detecção de um rótulo, a fim de permitir correção para estes efeitos da matriz de amostra, quando usando-se o rótulo em uma técnica de detecção analítica. O método é particularmente vantajoso para uso em um cartucho de diagnóstico molecular descartável.

Description

"MÉTODO E SISTEMA PARA DETERMINAR OS EFEITOS DA MATRIZ DE AMOSTRA, E, CARTUCHO DESCARTÁVEL"

A presente invenção refere-se a um método para determinar a ocorrência de efeitos da matriz na detecção de um rótulo que permita a correção destes efeitos da matriz de amostra em uma técnica analítica envolvendo o uso deste ou de um rótulo similar, bem como a dispositivos operando de acordo com o método.

A detecção sensível e precisa, qualitativamente ou quantitativamente, de biomoléculas tais como proteínas, peptídeos, oligonucleotídeos, ácidos nucleicos, lipídeos, polissacarídeos, hormônios, neurotransmissores, metabólitos etc. provou ser um objetivo ilusório, a despeito dos usos potenciais muito difundidos em diagnósticos médicos, patologia, toxicologia, epidemiologia, guerra biológica, amostragem ambiental, forenses e numerosos outros campos, tais como estudos proteômicos comparativos e de expressão genética.

Exemplos particulares relativos à detecção do DNA são, p. ex., em diagnósticos médicos, por exemplo a detecção de agentes infecciosos como bactérias patogênicas e vírus, o diagnóstico de doenças genéticas herdadas e adquiridas etc., em testes forenses como parte de investigações criminais, em disputas de paternidade, em seqüenciamento do inteiro genoma etc.

Embora a identificação e/ou quantificação de uma amostra purificada de uma analito biológico possam às vezes ser realizadas com base nas propriedades fisicoquímicas do próprio analito, a maioria dos métodos de detecção, que são capazes de identificar e/ou quantificar um analito em uma amostra não-purificada, faz uso de uma "sonda" que é uma molécula conhecida tendo uma forte afinidade e, preferivelmente, também um alto grau de especificidade para o analito. Onde o analito for uma proteína ou peptídeo, estes ensaios são referidos como ensaios de ligação de ligando (p. ex., imunoensaios). A detecção do DNA tipicamente faz uso da hibridização de uma seqüência de nucleotídeo que é específica para o DNA alvo.

Nestes ensaios de detecção baseados em sonda, a sonda específica de analito (ou o analito) é direta ou indiretamente rotulada com uma substância traçável. A detecção da substância traçável (a seguir referida como "rótulo") ligada via a sonda ao analito, é indicativa da quantidade de analito da amostra de teste. A detecção do rótulo pode ser assegurada usando- se uma variedade de diferentes técnicas, dependendo da natureza do rótulo empregado usado.

Uma técnica analítica biotecnológica é espectroscopia Raman. Na espectroscopia Raman a dispersão inelástica da luz (chamada dispersão de Raman) pelas moléculas em uma amostra é detectada. O espectro Raman resultante é característico da composição química e estrutura das moléculas absorvendo luz na amostra, enquanto que a intensidade da dispersão Raman é dependente da concentração destas moléculas.

A observação de que os espectros de emissão são aumentados por diversas ordens de magnitude, até IO14-vezes, quando as moléculas são adsorvidas em superfícies metálicas tomadas ásperas, p. ex., nanopartículas de ouro, prata, cobre e certos outros metais, resultou em espectroscopias aumentadas em superfície altamente sensíveis (p. ex., fluorescência aumentada em superfície (SEF) e espectroscopia Raman aumentada em superfície (ressonância) (SE(R)RS)).

Em espectroscopia de ressonância Raman aumentada em superfície (SERRS), é feito uso de uma substância "ativa-SERRS" ou corante fixado ao analito (capaz de gerar um espectro SERRS quando apropriadamente iluminado) e operando na freqüência de ressonância do corante.

Etapas críticas do uso de espectroscopias aumentadas em superfície são a produção reprodutível de superfícies metálicas ásperas e a eficiente adsorção/ligação do rótulo a ser detectado nesta superfície metálica. Quando a superfície metálica áspera consistir de nanopartículas metálicas coloidais, a melhor intensificação de sinal é conseguida quando elas são agregadas de uma maneira controlada. Os colóides não-agregados são preparados, por exemplo, pela redução de um sal metálico (p.ex., nitrato de prata) com um agente redutor, tal como citrato, para formar uma suspensão microcristalina estável. Esta suspensão coloidal é então agregada imediatamente antes do uso. Idealmente os colóides agregados são formados in situ na amostra e o espectro SE(R)RS é obtido pouco após a fim de evitar precipitação.

Foi observado que em qualquer técnica de detecção fazendo uso de um rótulo que requeira detecção dentro de uma amostra, os efeitos de matriz de amostra podem influenciar os resultados de uma análise. Os efeitos da matriz de amostra são especialmente severos em meios complexos, tais como amostras biológicas, mineralógicas ou ambientais, em que a natureza e quantidades das substâncias interferentes são com freqüência desconhecidas e não prontamente controladas, porém podem também ser relevantes em amostras que são obtidas de técnicas de (semi)-purificação, devido à presença de sais e/ou outros componentes que podem influenciar aspectos diferentes da detecção. Em amostras biológicas, o efeito da matriz de amostra pode ser causado por um excesso de constituintes de fluido corporal, tais como lipemia, bilirrubinemia, hemoglobinemia, hemólise, lipídeos, proteínas, hemoglobina, imunoglobina, hormônios, medicamentos, antígenos, alérgenos, toxinas, marcadores de tumor, moléculas celulares solúveis e ácido nucleico. Nos extratos de DNA, o efeito da matriz de amostra pode ser causado pela mera presença de DNA em massa. Estes constituintes podem aumentar ou diminuir o sinal de medição, provocando um resultado impreciso. Os efeitos da matriz de amostra podem ser manifestados, p. ex., por extinção da fluorescência ou luminescência. As espectroscopias de superfície aumentada fornecem uma complexidade adicional pelo fato de que a matriz de amostra pode interferir com a agregação coloidal, bem como com a adsorção/ligação do analito ou rótulo no colóide. Diferentes graus de agregação de colóides metálicos resultam em um sinal variável. Estas variações da agregação coloidal podem ser causadas por diferentes de pH das amostras ou pela presença de íons que induzem superagregação, resultando em precipitação dos agregados. Os compostos de matriz de amostra podem também adsorver nas partículas metálicas, desse modo competindo com a superfície da nanopartícula de cuja molécula o sinal é para ser intensificado. Por exemplo, muitas proteínas que tendem a ser positivamente carregadas em pH neutro ou fisiológico são atraídas para a carga negativa líquida das partículas. Os anticorpos especialmente tendem a adsorver fortemente nas partículas de ouro colóides.

Os compostos de matriz de amostra também contribuem para adsorção não- específica do rótulo nas nanopartícuias.

A correção para fatores afetando a detecção é um problema geral no campo da química analítica. Na arte, as abordagens para eliminar os efeitos da matriz de amostra incluem diluição, remoção da matriz de amostra (p. ex., ligando covalentemente o analito a uma superfície fixa e lavando-se o fundo sem afetar o analito) e a adição de um padrão e subseqüente correção do grau de interferência.

Os métodos compensando os efeitos da matriz de amostra foram desenvolvidos para os métodos SE(R)RS, com base na detecção direta dos efeitos da matriz de amostra na amostra. Estes métodos envolvem o uso de um padrão interno que é uma quantidade predeterminada de uma molécula que é comparável com a molécula a ser detectada (p. ex., analito ou rótulo), porém geral um diferente sinal. Estas técnicas são, entretanto, limitadas pelo fato de que os efeitos são medidos em um composto que não é o mesmo e, assim, que as eficiências de sinalização espectroscópica e a interferência da matriz de amostra com a detecção poderiam ser diferentes.

Um objetivo da presente invenção é prover um método alternativo para corrigir os efeitos da matriz de amostra em técnicas analíticas, bem como sistemas operando de acordo com o método. Uma vantagem da presente invenção é que o os efeitos negativos da detecção do rótulo na amostra são reduzidos por um controle de rótulo, que permite a determinação dos efeitos da matriz de amostra.

Em um primeiro aspecto, a invenção fornece métodos para determinar os efeitos da matriz de amostra sobre a detecção de um rótulo, o método compreendendo as etapas de (a) contatar uma quantidade predeterminada do mesmo rótulo ou um diferente rótulo com uma amostra de plano de fundo compreendendo a matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra; (b) contatar uma predeterminada quantidade do mesmo rótulo ou do diferente rótulo com uma amostra livre de segundo plano não compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra ou qualquer outro composto que seja capaz de interferir com a detecção do rótulo; (c) detectar o mesmo ou diferente rótulo na amostra de plano de fundo e na amostra livre de segundo plano; e (d) determinar uma diferença entre a detecção do mesmo ou diferente rótulo na amostra de plano de fundo e na amostra livre de segundo plano, desse modo obtendo os efeitos da matriz de amostra. Em uma forma de realização preferida, todas as quantidades predeterminadas são as mesmas que tornam a correção mais fácil de realizar, somente envolvendo diferenças simples.

Um segundo aspecto da invenção provê métodos para determinar os efeitos da matriz de amostra sobre a detecção de um analito de uma amostra, o método compreendendo as etapas de (a) prover uma amostra de teste da amostra em que o analito é para ser detectado, uma amostra de plano de fundo compreendendo uma matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra, e uma amostra livre de segundo plano, não compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra; (b) detectar e/ou quantificar o analito da amostra de teste usando-se um rótulo; (c) detectar os efeitos da matriz de amostra por um método compreendendo as etapas de

contatar a amostra de plano de fundo com um rótulo de quantidade predeterminada, que pode ser o mesmo ou um diferente rótulo,

contatar a amostra livre de segundo plano com uma quantidade predeterminada do mesmo ou diferente rótulo, por meio do que o mesmo rótulo é adicionado tanto ao fundo como à amostra livre de segundo plano

detectar o mesmo ou diferente rótulo da amostra de plano de fundo e da amostra livre de segundo plano,

determinar os efeitos da matriz de amostra determinando uma diferença entre a detecção do (mesmo ou diferente) rótulo da amostra de plano de fundo e da amostra livre de segundo plano; e

(d) corrigindo a detecção e/ou quantificação do analito na amostra de teste como obtida na etapa (b) com os efeitos da matriz de amostra determinados como descrito acima.

Em uma forma de realização preferida todas as quantidades predeterminadas são as mesmas que tornam a correção mais fácil de realizar, somente envolvendo diferenças simples.

Tipicamente, a detecção do analito na amostra de teste é realizada pela detecção de um rótulo capaz de ligar-se ao analito e a correção é realizada corrigindo-se o valor da detecção deste rótulo ligado com o valor obtido para os efeitos da matriz de amostra.

De acordo com uma forma de realização deste aspecto da invenção,a amostra de plano de fundo é uma fração de uma amostra em que o analito é para ser detectado. Adicional ou alternativamente, a amostra de plano de fundo compreende a matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra. Os analitos que são se pretende detectar pelos métodos da presente invenção são, em uma forma de realização, selecionados do grupo consistindo de ácido nucleico, uma proteína, um carboidrato, um lipídeo, uma substância química, um anticorpo, um microorganismo e uma célula eucariótica.

De acordo com uma forma de realização, a etapa de detecção dos métodos da presente invenção é realizada usando-se um método de detecção óptica. Muitíssimo particularmente, o método de detecção e/ou quantificação do analito é um rótulo ativo-SE(R)RS. Tipicamente, tais métodos envolvem uma etapa adicional pela qual, antes da detecção do rótulo nas diferentes amostras, o rótulo é contatado com uma superfície ativa- SE(R)RS. De acordo com uma forma de realização particular, a superfície SE(R)RS ativa é uma suspensão coloidal de nanopartículas de prata ou ouro ou seus colóides agregados.

De acordo com uma forma de realização, nos métodos envolvendo a detecção e/ou quantificação de um analito, esta detecção e/ou quantificação são realizadas usando-se uma sonda específica de analito. De acordo com uma forma de realização particular, a sonda específica de analito é provida com um rótulo sensível a ligação, isto é, um rótulo cujo sinal de detecção é modificado na ligação ao analito.

De acordo com uma forma de realização, o analito a ser detectado é uma seqüência de nucleotídeo e o uso é feito de uma sonda específica de analito rotulada, que é um nucleotídeo ou nucleotídeo tendo uma seqüência complementar a uma seqüência dentro do analito.

A detecção do analito empregando uma sonda específica de analito rotulada pode ser baseada na detecção direta da sonda específica de analito rotulada ligada ao analito ou pode ser baseada em uma ligação competitiva do analito. De acordo com uma forma de realização específica desta última forma de realização, a detecção do analito é realizada usando-se uma sonda específica de analito capaz de ligar-se a uma superfície SE(R)RS ativa e uma sonda substituta rotulada e por meio do que o analito compete com a sonda substituta rotulada para a ligação à sonda específica de analito.

Ainda outro aspecto da presente invenção fornece dispositivos ou sistemas para compensar os efeitos da matriz de amostra sobre a detecção de um analito ou um rótulo de uma amostra.

A presente invenção provê um sistema para determinar os excipientes farmaceuticamente aceitáveis de uma amostra na detecção de um rótulo, compreendendo:

(a) meio para contatar uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou um diferente rótulo, com uma amostra de plano de fundo compreendendo uma matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra,

(b) meio para contatar uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou de dito diferente rótulo com uma amostra livre de segundo plano não compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra ou qualquer outro composto que seja capaz de interferir com a detecção do rótulo,

(c) meio para detectar dito rótulo ou dito diferente rótulo em dita amostra de plano de fundo e dita amostra livre de segundo plano, e

(d) meio para determinar uma diferença entre a detecção de dito rótulo ou dito diferente rótulo em dita amostra de plano de fiando e em dita amostra livre de segundo plano, correspondendo a ditos efeitos da matriz de amostra.

A presente invenção também provê um sistema para determinar os efeitos da matriz de amostra sobre a detecção de um analito de uma amostra compreendendo:

(a) meio para prover uma amostra de teste de dita amostra em que dito analito é para ser detectado, uma amostra de plano de fundo compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra e uma amostra livre de segundo plano, não compreendendo matriz de amostra ou matriz livre de amostra,

(b) meio para detectar e/ou quantificar o analito em dita amostra de teste usando um rótulo,

(c) meio para contatar dita amostra de plano de fundo com uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou um diferente rótulo,

(d) meio para contatar dita amostra livre de segundo plano com uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou dito diferente rótulo,

(e) meio para detectar dito rótulo ou dito diferente rótulo em dita amostra de plano de fundo e em dita amostra livre de segundo plano,

(f) meio para determinar ditos efeitos da matriz de amostra determinando uma diferença entre a detecção de dito rótulo ou dito diferente rótulo em dita amostra de plano de fundo e dita amostra livre de segundo plano,

(g) meio para corrigir a detecção e/ou quantificação de dito analito em dita amostra de teste responsiva ao meio de determinar os efeitos da matriz de amostra.

Em uma forma de realização preferida, todas as quantidades predeterminadas são as mesmas que fazem a correção mais fácil de realizar, somente envolvendo diferenças simples.

O sistema pode compreender:

uma primeira fonte de uma ou mais amostras selecionadas do grupo consistindo de amostra de teste contendo o analito, amostra de plano de fundo e amostra livre de segundo plano, uma segunda fonte de um ou mais rótulos e opcionalmente uma terceira fonte de aditivos,

meio para prover as amostras, rótulos e aditivos das primeira à terceira fontes, a fim de que eles possam ser detectados.

De acordo com uma forma de realização específica, a primeira fonte (101, Fig. 3) compreende câmaras para a amostra de teste contendo o analito, a amostra de plano de fundo e a amostra livre de segundo plano, respectivamente. O meio para contatar pode compreender câmaras para contatar a amostra de teste contendo o analito, amostra de plano de fundo e amostra livre de segundo plano, respectivamente, com os rótulos pertinentes.

Em uma forma de realização mais específica, a segunda fonte (102, Fig. 3) inclui uma câmara para um rótulo específico de analito e uma câmara para pelo menos um rótulo.

A presente invenção também provê um cartucho descartável para uso em um sistema para determinar os efeitos da matriz de amostra sobre a detecção de um analito de uma amostra, compreendendo:

uma primeira fonte de uma ou mais amostras selecionadas do grupo consistindo da amostra de teste contendo o analito, amostra de plano de fundo e amostra livre de segundo plano, e uma segunda fonte de um ou mais rótulos e, opcionalmente, uma terceira fonte de aditivos, e

meio para contatar a amostra de plano de fundo com uma quantidade predeterminada do mesmo ou diferente rótulo, para contatar a amostra livre de segundo plano com uma quantidade predeterminada do mesmo ou de um diferente rótulo e para contatar a amostra de teste com uma quantidade predeterminada do mesmo ou de um diferente rótulo, e

uma janela para permitir a detecção daquele mesmo ou um diferente rótulo da amostra de teste, da amostra de plano de fundo e da amostra livre de segundo plano. A fonte da amostra a ser testada pode ser uma câmara de reação PCR.

As acima e outras características, aspectos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes pela seguinte descrição detalhada, tomada em conjunto com os desenhos anexos, que ilustram, como exemplo, os princípios da invenção. Esta descrição é dada para fins somente de exemplo, sem limitar o escopo da invenção.

A presente invenção será agora descrita com referência aos seguintes desenhos.

A Fig. 1 é um desenho esquemático de uma forma de realização do método da presente invenção, para detectar um analito em uma amostra de teste incluindo a detecção do controle de rótulo detectando-se o rótulo em uma matriz de segundo plano e em uma matriz livre de segundo plano, como aplicado à detecção de SE(R)RS do DNA em uma amostra de teste.

A Fig. 2 é um exemplo de espectros de SERRS de um rótulo SERRS ativo de uma amostra livre de segundo plano (1) e rótulo SERRS ativo de uma matriz de amostra que aumenta o efeito SERRS (2), de acordo com uma forma de realização da invenção. Uma comparação destes dois espectros dá informação sobre os efeitos da matriz de amostra que possivelmente interferem com a detecção do analito na amostra de teste.

A Fig. 3 é uma representação esquemática do sistema de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

A presente invenção será agora descrita com respeito a formas de realização particulares e com referência a certos desenhos, porém a invenção não é limitada a eles, mas somente pelas reivindicações. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não serão interpretados como limitando o escopo. Os desenhos descritos são somente esquemáticos e não são limitantes. Nos desenhos, o tamanho de alguns dos elementos pode ser exagerado e não feito em escala para fins ilustrativos. Onde o termo "compreendendo" for usado no presente relatório e reivindicações, ele não exclui outros elementos ou etapas. Onde um artigo indefinido ou definido for usado quando referindo-se a um substantivo singular, p. ex., "um" ou "uma", "o" ou "a", este inclui um plural daquele substantivo, a menos que de outra coisa seja especificamente citada.

Além disso, os termos primeiro, segundo, terceiro e similares na descrição e nas reivindicações são usados para distinguir entre elementos similares e não necessariamente para descrever uma ordem seqüencial ou cronológica. Deve ser entendido que os termos assim usados são intercambiáveis sob circunstâncias apropriadas e que as formas de realização da invenção aqui descrita são capazes de operação em outras seqüências que não as descritas ou ilustradas aqui.

Os seguintes termos ou definições são providos somente para auxiliar no entendimento da invenção. Estas definições não devem ser interpretadas como tendo um escopo que não entendidos por uma pessoa de habilidade comum na arte.

O termo "analito", como aqui usado, refere-se à substância a ser detectada e/ou quantificada nos métodos da presente invenção.

O termo "rótulo", como aqui usado, refere-se a uma molécula ou material capaz de gerar um sinal detectável. A menos que especificado, este refere-se a molécula como tal, não covalentemente ligada a uma sonda. O rótulo poderia ser ligado a uma sonda, fixado em um analito ou poderia ser uma entidade separada, que se ligue a um analito e/ou uma sonda. Uma "sonda específica de analito" como aqui usada é uma sonda compreendendo uma estrutura ou seqüência que é específica para o analito a ser detectado. Esta inclui tanto compostos que sejam capazes de especificamente ligarem-se ao analito ("sonda alvo complementar") e compostos que são pelo menos similares a uma parte específica do analito ("sonda alvo substituta"). A ligação da sonda alvo complementar ao analito pode ser baseada em qualquer tipo de interação, incluindo mas não limitada a seqüências de nucleotídeo complementares, interação antígeno/anticorpo, ligação ligando/receptor, interação enzima/substrato etc. A sonda alvo substituta é usada em ensaios competitivos, em que o analito é determinado com base na competição com a sonda alvo substituta, p. ex., na ligação competitiva a uma sonda específica de analito. Muitíssimo preferivelmente, a sonda alvo substituta liga-se a uma sonda específica de analito com uma intensidade de ligação reduzida, em comparação com a ligação do analito com a sonda específica de analito.

Uma "superfície SE(R)RS ativa" como aqui usado, refere-se a um material que é capaz de aumentar o sinal de um rótulo SE(R)RS ativo.

Uma "sonda de captura" como aqui usado refere-se a uma molécula capaz de ligar a uma molécula ou um complexo de moléculas a um substrato. Uma sonda de captura específica de analito é uma sonda capaz de especificamente ligar um analito a um substrato.

Um "substrato" como aqui usado refere-se a um material a que moléculas ou complexos de moléculas podem ser ligados, diretamente ou por meio de uma sonda de captura e que pode ser manipulado. Exemplos típicos de substratos incluem mas não são limitados a placas de microtítulo, contas, lascas etc.

O termo "amostra" como aqui usado como tal refere-se a uma composição compreendendo uma matriz ("matriz de amostra") e ali o analito de interesse em que a detecção do analito é realizada.

O termo "amostra de teste" é entendido como significando uma amostra, ou uma fração da mesma, compreendendo uma matriz ("matriz de amostra") e nela o analito de interesse em que detecção do analito é realizada.

O termo "matriz de amostra" é entendido como significando os compostos presentes na amostra de teste que não são o analito.

A expressão "matriz semelhante a amostra" é entendida como significando uma matriz tendo aproximadamente a mesma composição total e/ou as mesmas propriedades fisicoquímicas que a matriz de amostra.

A expressão "efeitos da matriz de amostra" é entendido como significando o efeito da matriz de amostra sobre a detecção do rótulo ou rótulo substituto nos métodos da presente invenção e, assim, influenciando a detecção do analito.

A expressão "amostra de plano de fundo" é entendida como significando a composição usada para determinar os efeitos da matriz de amostra e compreende a matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra. Onde a própria amostra for usada para determinar os efeitos da matriz de amostra, é referida como uma "amostra de plano de fiindo original". Como uma amostra de plano de fundo original tem a mesma composição que a amostra de teste, ela também contém o analito. Alternativamente, a amostra de plano de fundo é uma composição compreendendo a matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra, porém sem analito, a que o analito opcionalmente foi adicionado.

A expressão "amostra livre de segundo plano" é entendida como significando uma composição não compreendendo a matriz de amostra, matriz semelhante a amostra, analito ou qualquer outro composto que seja capaz de interferir com a detecção do rótulo. Onde a influência de componentes específicos da matriz de amostra for para ser determinada, a amostra livre de segundo plano refere-se a uma composição compreendendo uma matriz, similar à matriz de amostra, exceto para estes componentes específicos.

O termo "corrigindo para efeitos da matriz de amostra" é entendido como significando (direta ou indiretamente) ajustar os valores determinados pela medição da amostra de teste com base nos valores dos efeitos da matriz de amostra.

De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma técnica analítica para a detecção e/ou quantificação de um analito de uma amostra utilizando uma sonda e um rótulo específicos de analito, por meio do que a influência da matriz de amostra sobre a detecção é determinada, permitindo-se correção dos efeitos da matriz de amostra sobre a detecção. De acordo com uma primeira forma de realização, o método da invenção inclui as etapas de:

(a) prover a amostra de teste da amostra em que o analito é para ser detectado, uma amostra de plano de fundo compreendendo a matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra e uma amostra livre de segundo plano, não compreendendo a matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra

(b) detectar e/ou quantificar o analito na amostra de teste

(c) detectar os efeitos da matriz de amostra por um método compreendendo as etapas de:

(i) contatar a amostra de plano de fundo com uma quantidade predeterminada de um rótulo

(ii) contatar a amostra livre de segundo plano com a mesma quantidade predeterminada de rótulo,

(iii) detectar o rótulo da amostra de plano de fundo e da amostra livre de segundo plano

(iv) determinar os efeitos da matriz de amostra determinando a diferença entre a detecção do rótulo na amostra de plano de fundo e na amostra livre de segundo plano

(d) corrigir a detecção e/ou quantificação do analito na amostra de teste da etapa (b) com os efeitos da matriz de amostra determinados em (iv).

Opcionalmente, as etapas (i) a (iii) podem ser realizadas com duas ou mais diferente quantidades predeterminadas de rótulo.

De acordo com uma forma de realização particular, a amostra de plano de fundo usada na detecção dos efeitos da matriz de amostra compreende a matriz de amostra e, mais particularmente, é uma fração da amostra em que o analito é para ser detectado e, assim, sua composição é idêntica àquela da amostra de teste. De acordo com esta forma de realização, o método compreende as etapas de:

(a) prover, de uma amostra compreendendo um analito, tanto uma amostra de teste como uma amostra de plano de fundo, e prover ainda uma amostra livre de segundo plano;

(b) detectar e/ou quantificar o analito da amostra de teste

(i) contatar a amostra de plano de fundo com uma quantidade predeterminada de rótulo

(ii) contatar a amostra livre de segundo plano com a mesma quantidade predeterminada de rótulo

(iv) determinar os efeitos da matriz de amostra determinando a diferença entre a detecção do rótulo da amostra de plano de fundo e da amostra livre de segundo plano

Opcionalmente, as etapas (i) a (iii) podem ser realizadas com duas ou mais diferentes quantidades predeterminadas de rótulo.

De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção fornece um método para determinar os efeitos da matriz de amostra sobre a detecção de uma amostra, o método compreendendo as etapas de:

(a) contatar uma quantidade predeterminada de rótulo, um rótulo substituto ou um diferente rótulo, com uma amostra de plano de fundo compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra,

(b) contatar a mesma quantidade predeterminada de rótulo, rótulo substituto ou rótulo diferente, com uma amostra livre de segundo plano não compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra ou qualquer outro composto que seja capaz de interferir com a detecção do rótulo. (c) detectar o rótulo, rótulo substituto ou rótulo diferente na amostra de plano de fundo e na amostra livre de segundo plano,

(d) determinar a diferença entre a detecção do rótulo, rótulo substituto ou rótulo diferente, na amostra de plano de fundo e na amostra livre de segundo plano, correspondendo aos efeitos da matriz de amostra.

Este método fornece uma medida para os efeitos da matriz de amostra sobre a detecção de um rótulo em um fundo particular, que pode ser usada para a correção dos valores obtidos na detecção e/ou quantificação dos analitos das amostras conhecidas ou que se acredita compreenderem a mesma matriz.

Opcionalmente, as etapas (a) a (d) podem ser realizadas com duas ou mais diferentes quantidades predeterminadas de rótulo.

Assim, a presente invenção fornece métodos e ferramentas, por meio do que a ocorrência dos efeitos da matriz de amostra é determinado detectando-se um rótulo tanto em uma amostra de plano de fundo como em uma amostra livre de segundo plano, e um sistema para determinar os efeitos da matriz de amostra de acordo com os métodos da presente invenção. Estes efeitos de matriz potencialmente interferem com a detecção de um analito com este rótulo na amostra.

A invenção é baseada na observação de que os componentes da matriz de amostra podem influenciar a detecção de um rótulo e que esta influência pode ser determinada comparando-se a detecção daquele mesmo rótulo ou um rótulo similar àquele, na presença de matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra e em uma amostra livre de segundo plano. A introdução de um controle de rótulo de acordo com o método da presente invenção em um método de detecção que faz uso de um rótulo assegura uma detecção mais precisa e confiável e/ou quantificação de um analito em uma amostra.

A origem dos efeitos da matriz de amostra determinados pelos métodos da presente invenção é variável e dependerá da natureza da amostra. Amostras em que a detecção de um analito é considerada de acordo com a presente invenção incluem amostras de material biológico, bem como composições derivadas ou extraídas de tal material biológico. A amostra pode ser qualquer preparação compreendendo um analito a ser detectado. A amostra pode compreender, por exemplo, todos ou numerosos dos componentes do tecido ou fluido corporal, tais como mas não limitados a sangue (incluindo frações de plasma e plaquetas), fluido espinhal, muco, catarro, saliva, sêmen, fezes ou urina ou qualquer fração deles. Amostras exemplares podem compreender material de sangue integral, células sangüíneas vermelhas, células sangüíneas brancas, camada leucocitária, cabelo, unhas e material de cutícula, chumaços, incluindo mas não limitado a chumaços bucais, chumaços de garganta, chumaços vaginais, chumaços vaginais, chumaços cervicais, chumaços retais, chumaços de lesão, chumaços de abscesso, chumaços nasofaríngeos e similares, fluido linfático, fluido aminiótico, fluido cerobroespinhal, efusões peritoneais, efusões pleurais, fluido de cistos, fluido sinovial, humor vítreo, humor aquoso, fluido de bolsa, colírios, aspirados de olho, plasma, soro, lavagem pulmonar, aspirados de pulmão, material de biópsia de qualquer tipo do corpo. O artífice hábil apreciará que lisados, extratos ou material obtido de qualquer uma das amostras biológicas exemplares acima são também considerados como amostras. As células de cultura, incluindo material explantado, células primárias, linhagens de célula secundárias e similares, bem como lisados, extratos, sobrenadantes ou materiais obtidos de quaisquer células, tecidos ou órgãos, estão também dentro do significado do termo amostra biológica como aqui usado. As amostras compreendendo microorganismos e vírus são também consideradas no contexto de detecção de analito empregando-se os métodos da invenção. Os materiais obtidos de cenários forenses estão também dentro do significado pretendido do termo "amostra". As amostras podem também compreender gêneros alimentícios e bebidas, amostras ambientais tais como água, solo, areia etc. Estas listas não são destinadas a ser exaustivas.

Em uma forma de realização particular da invenção, a amostra é pré-tratada para facilitar a detecção do analito com o método de detecção. Por exemplo, tipicamente um pré-tratamento da amostra resultante em uma fração semi-purificada compreendendo somente aqueles compostos tendo a mesma natureza total que o analito, p. ex., extração de DNA, proteína etc. Os métodos e kits adequados para o pré-tratamento de amostras são disponíveis na arte.

De acordo com uma forma de realização particular da invenção, o analito é um ácido nucleico, tal como uma seqüência de DNA genômico ou ácido nucleico de um microorganismo patogênico. Tipicamente, a fim de detectar um DNA genômico em uma amostra, a amostra é aquecida (p. ex., a 100 0C) para assegurar desnaturação do dsDNA e simultaneamente inativar a maioria da atividade enzimática presente na amostra. Adicional ou alternativamente, o DNA pode ser (parcialmente) purificado. Uma variedade de métodos são disponíveis para isolar os ácidos nucleicos das amostras.

Técnicas de isolamento de ácido nucleico incluem (1) extração orgânica seguida por precipitação de etanol, p. ex., utilizando-se um reagente orgânico de fenol/clorofórmio (p. ex., Ausbel e al., eds. (1995, incluindo suplementos até junho de 2003) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York), preferivelmente utilizando-se um extrator de DNA automatizado, p. ex., o Model 341 DNA Extractor disponível na Applied Biosystems (Foster City, Calif), (2) métodos de adsorção de fase estacionário (p. ex., Boom et al., U.S. Pat. No. 5234809; Walsh et al, BioTechniques (4): 506-513 (1991), e (3) métodos de precipitação de DNA induzida por sal (p. ex., Miller et al., (1988) Nucl. Acids Res., 16(3):9-10), tais métodos de precipitação sendo tipicamente referido como métodos de cristalização. Kits comercialmente disponíveis podem sr usados para acelerar tais métodos, por exemplo, Genomic DNA Purification Kit e o Total RNA Isolation System (ambos disponíveis na Promega, Madison, Wis.). Além disso, tais métodos foram automatizados ou semi-automatizados usando-se, por exemplo, a ABI PRISM™ 6700 Automated Nucleic Acid Workstation (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) ou a ABI PRISM™ 6100 Nucleic Acid PrepStation e protocolos associados, p. ex., NucPrep™ Chemistry: Isolation of Genomic DNA from Animal and Plant Tissue, Applied Biosystems Protocol 4333959 Rev. A (2002), Isolation of Total RNA from Cultured Cells, Applied Biosystems Protocol 4330254 Rev. A (2002), e ABI PRISM™ Cell Lysis Control Kit, Applied Biosystems Protocol 4316607 Rev. C (2001).

Os métodos de pré-tratamento acima podem ainda compreender uma etapa de fragmentação, p. ex., por digestão de enzima, cisalhamento ou sonicação e/ou uma etapa de amplificação enzimática, p. ex., por PCR. Muitíssimo particularmente, onde detecção sensível de um ácido nucleico for considerada, uma amplificação PCR do DNA alvo pode ser realizada antes da detecção do analito. Neste contexto, a amostra consiste do DNA extraído, incluindo o produto PCR.

Exemplos típicos de compostos e condições comumente presentes nas amostras ou frações de amostras semi-purificadas, que são capazes de causar efeitos de matriz de amostra, incluem mas não são limitados a íons, proteínas grandes ou de grande capacidade, DNA de grande capacidade, pH etc. Entretanto não é crítico para a presente invenção que o fator causativo dos efeitos da matriz de amostra sejam identificados.

O método da presente invenção pode em princípio ser aplicado a qualquer técnica de detecção analítica, por meio do que a detecção do analito é realizada com base na detecção do rótulo na presença da matriz de amostra. Muitíssimo particularmente, a invenção é de uso para métodos de detecção analítica, em que a detecção do rótulo é facilmente afetada por fatores presentes na amostra. O método da presente invenção é particularmente adequado para métodos de detecção baseados na detecção de rótulo por espectroscopia de ressonância Raman aumentada em superfície (SERRS). Em SERRS, é feito uso de um rótulo que é uma substância ou corante SERRS-ativo, que, quando iluminando na freqüência de ressonância do corante, gera um espectro Raman de ressonância. A sensibilidade para detectar este espectro é ainda aumentada adsorvendo-se o corante em uma superfície metálica áspera, p. ex., nanopartículas de ouro, prata, cobre e certos outros metais (SERRS). Um fator crítico em SERRS é a eficiente adsorção do corante nesta superfície metálica. Métodos alternativos consideram a ligação do corante direta ou indiretamente à superfície metálica. Quando a superfície metálica áspera consiste de nanopartículas metálicas coloidais, o melhor aumento de sinal é conseguido quando as nanopartículas coloidais são agregadas em uma maneira controlada. Agentes de agregação incluem ácidos (p. ex., HNO3 ou ácido ascórbico), poliaminas (p. ex., espermina) e íons inorgânicos (p. ex., Cl", I", Na ou Mg ). A presença de tais compostos na amostra podem assim afetar a agregação de colóides. Além da agregação, os componentes da matriz de amostra pode também interferir com a adsorção do corante no colóide, desse modo negativamente afetando o sinal SERRS medido.

Os métodos da presente invenção são métodos que envolvem a detecção de um analito. A natureza do analito a ser detectado não é crítica para a invenção e pode ser qualquer molécula ou agregado de moléculas de interesse para a detecção. Uma lista não-exaustiva de analitos inclui uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, amino ácido, ácido nucleico, oligonucleotídeo, nucleotídeo, nucleosídeo, carboidrato, polissacarídeo, lipopolissacarídeo, glicoproteína, lipoproteína, nucleoproteínas, lipídeo, hormônio, esteróide, fator de crescimento, citocina, neurotransmissor, receptor, enzima, antígeno, alérgeno, anticorpo, metabólito, cofator, nutriente, toxina, veneno, medicamento agente de guerra biológica, agente bioperigoso, agente infeccioso, priônio, vitamina, imunoglobulinas, albumina, hemoglobina, fator de coagulação, interleuina, interferon, citocina, um peptídeo compreendendo um epítopo específico de tumor e um anticorpo para qualquer uma das substâncias acima. Um analito pode compreender um ou mais agregados complexos, tais como mas não limitado a um vírus, bactéria, microorganismo tal como Salmonella, Streptococcus, Legionella, E. eoli, Giardia, Cryptosporidium, Rickettsia, esporo, mofo, levedura, algas, amebas, dinoflagelado, organismo unicelular, patógeno ou célula, e moléculas de superfície de célula, fragmentos, partes, componentes, produtos, moléculas orgânicas pequenas, ácidos nucleicos e oligonucleotídeos, metabólitos ou microorganismos.

De acordo com uma forma de realização particular, um analito é um DNA tal como um gene, DNA viral, DNA bacteriano, DNA fungico, DNA de mamífero, fragmentos de DNA. O analito pode também ser RNA, tal como RNA viral, mRNA, rRNA. O analito pode também ser cDNA, oligonucleotídeos ou DNA, RNA, PNA sintéticos, oligonucleotídeos sintéticos, oligonucleotídeos modificados ou outro análogo de ácido nucleico. Pode compreender ácidos nucleicos de filamento único e filamento duplo. Pode, antes da detecção, se submetido a manipulações tais como digestão com enzimas de restrição, cópia por meio de polimerases, cisalhamento ou sonicação de ácido nucleico, assim permitindo que ocorra fragmentação.

Como indicado acima, a presente invenção provê um controle de rótulo para métodos de detecção que envolvem detecção pelo uso de um rótulo. Diferentes tipos de rótulo são considerados dentro do contexto da presente invenção, tais como mas não limitado a corante fluorescente, cromogênico ou quimioluminescente, radioativo, nanopartículas metálicas e/ou magnéticas etc.

Portanto, as etapas de detecção realizadas nos métodos da invenção serão determinadas pelo rótulo usado e incluem mas não são limitadas a fluorescência, colorimetria, absorção, reflexão, polarização, refração, eletroquímica, quimioluminescência, dispersão de Rayleigh e dispersão de Raman, SE(R)RS, dispersão de luz de ressonância, ressonância de plasmônio de superfície acoplada por grade, contagem de cintilação, sensores magnéticos, detecção eletroquímica (tal como voltametria de extração de ânodo) etc.

Rótulos adequados para uso nos diferentes métodos de detecção são numerosos e extensamente descritos na arte. Os rótulos fluorescentes incluem mas não limitados a isotiocianatos de fluoresceína (FITC), carboxifluoresceínas tais como tetrametilrodamina (TMR), carbóxi tetrametil-rodamina (TAMRA), carbóxi-X-rodamina (ROX), sulforrodamina 101 (Texas red™), Atto dyes (Sigma Aldrich), corantes Fluorescent Red e Fluorescent Orange, ficocritrina, ficocianina e Crypto-Fluor™ etc. Os radioisótopos mais comuns incluem emissores-beta tais como 3H e 14C e emissores-gama, tais como iodo-125 (125I). Outros rótulos descritos usados em ensaios quantitativos e qualitativos incluem mas não são limitadas a dendrímeros, pontos quânticos, fósforos de conversão ascendente e nanopartículas.

Onde a detecção do analito nos métodos da invenção é baseada em SE(R)RS, o rótulo é um material que é SE(R)RS-ativo, isto é, que é capaz de gerar um espectro SERS ou SERRS, quando apropriadamente iluminado, também referido aqui como um rótulo ou corante SE(R)RS-ativo. Exemplos não limitantes de rótulos SE(R)RS ativos incluem corantes de fluoresceína, tais como 5- (e 6-) carbóxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetóxi fluoresceína, 5-carbóxi- 2',4',5',7'-tetraclorofluoresceína e 5-carboxifluoresceína, corantes de rodamina tais como 5-(e 6-) carbóxi rodamina, 6-carboxitetrametil rodamina e 6- carboxirrodamina X, ftalocianinas, tais como metila, nitrosila, sulfonila e amino ftalocianinas, corantes azo, azometinas, cianinas e xantinas tais como os derivativos de metila, nitro, sulfano e amino, e succinilfluoresceínas.

De acordo com uma forma de realização particular, o rótulo SE(R)RS é uma rodamina carbóxi, FAM ou ΤΕΤ. Foi demonstrado que uma cura de calibração para um oligonucleotídeo rotulado com carboxirrodamina R6G alcança um limite de detecção de 1,05 ' IO"12 M que, consiserando-se os efeitos de diluição, corresponde a uma detecção de 0,5 fentomols do oligonucleotídeo rotulado do volume da amostra de teste. Ao mesmo tempo, o gráfico de calibração de R6G (bem como para FAM e ΤΕΤ) mostrou ser linear em uma faixa de 10"-7 M a 10"-11 M (LGC "Avaliação da sensibilidade da detecção do DNA baseada em SERRS", janeiro de 2004, LGC/Mfb/2004/02, disponível em http://www.mfbprog.org.uk/themes/theme_publications_item.asp?intThemeI D=10&intPublicationID=865).

É observado que a escolha do rótulo pode ser influenciada por fatores tais como a freqüência de ressonância do rótulo, a freqüência de ressonância de outras moléculas presentes na amostra de teste etc. Os rótulos SE(R)RS-ativos de uso para detectar biomoléculas são descritos na arte, tais como nas Patentes U.S. 5306403, 6002471 e 6174677.

De acordo com a presente invenção, a determinação dos efeitos da matriz de amostra empregando-se um controle de rótulo é realizada independentemente da (porém opcionalmente simultaneamente com) a detecção do analito na amostra de teste. De acordo com uma forma de realização particular, os efeitos da matriz de amostra são determinados usando-se o mesmo rótulo que é usado para a detecção do analito da amostra. Alternativamente, entretanto, é considerado que o rótulo usado no controle de rótulo é um rótulo que não é o mesmo (isto é, um rótulo diferente) que o rótulo usado na detecção do analito. É considerado que pelo menos parte dos efeitos da matriz de amostra na detecção do rótulo, em muitos casos, será independente da natureza do rótulo usado. De acordo com uma forma de realização particular, é considerado que o rótulo usado na determinação dos efeitos da matriz de amostra, que é diferente do rótulo usado na detecção de analito, é um rótulo que é comparável em suas propriedades ao rótulo usado na detecção do analito (rótulo similar).

Como indicado acima, a provisão de um controle de rótulo de acordo com a presente invenção é particularmente adequada para métodos em que a detecção do rótulo é sabida ser afetada por diferentes fatores. De acordo com uma forma de realização particular da invenção, a provisão de um controle de rótulo é aplicada a um método de detecção analítica baseado em espectroscopias aumentadas na superfície. A detecção por espectroscopias intensificadas na superfície, tais como espectroscopia Raman intensificada na superfície (SE(R)RS), é baseada na forte intensificação da dispersão Raman observada para analitos adsorvidos em uma superfície de metal áspera. Assim, esta requer a detecção do rótulo na presença de uma apropriada superfície SE(R)RS-ativa. Tipicamente, a superfície é uma superfície de metal nobre (Au, Ag, Cu) ou álcali (Li, Na, Κ). A superfície metálica pode, por exemplo, ser uma superfície metálica cauterizada ou de outro modo áspera, um sol metálico ou, de acordo com uma forma de realização particular, uma agregação de partículas colóides metálicas, visto que as últimas resultam em aumentos maiores do que 108 - 1014 (Nie e Emory (1997), Science, 275, Kneipp (1999), Chem Rev, 99) da dispersão Raman. As nanopartículas metálicas compondo a superfície SE(R)RS ativa nos métodos de detecção da presente invenção podem assim ser dispostas em polipeptídeo de ilhas de nanopartículas, substratos baseados em nanopartículas revestidas com metal, películas poliméricas com nanopartículas metálicas embutidas e similares. A superfície metálica pode ser um metal nu ou pode compreender uma camada de óxido de metal em uma superfície metálica. Ela pode incluir um revestimento orgânico, tal como de citrato ou de um polímero adequado, tal como polilisina ou polifenol, para aumentar sua capacidade de sorção. De acordo com uma forma de realização particular da invenção, as partículas coloidais metálicas compondo a superfície SE(R)RS ativa são nanopartículas ou nanopartículas coloidais agregadas em uma maneira controlada, tais como descrito em US 2005/013163 Al. Métodos alternativos de preparar as nanopartículas são conhecidos (p. ex., Patentes U.S. 6054495, 6127120 e 6149868). As nanopartículas podem também ser obtidas de fontes comerciais (p. ex., Nanoprobes Inc., Yafank, N.Y.; Polysciences, Inc., Warrington, Pa.). As partículas metálicas podem ser de qualquer tamanho, contanto que dêem origem a um efeito SE(R)RS. Tipicamente, elas têm um diâmetro de cerca de 4 - 50 nm, muitíssimo particularmente entre 25 - 40 nm, dependendo do tipo de metal.

Nos métodos de detecção e/ou quantificação da presente invenção fazendo uso de métodos de detecção SE(R)RS, é considerado que a ligação covalente ou não-covalente direta ou indireta ou adsorção do rótulo SE(R)RS-ativo na superfície metálica é direta ou indiretamente indicativa da presença e/ou quantidade de analito da amostra. Várias opções e modos de ligação das moléculas a superfícies SE(R)RS ativas são conhecidas na arte e descritas, p. ex., em US 6127120 e US 6971173.

Tipicamente, onde o corante SE(R)RS ativo é ligado à superfície metálica através de uma sonda de nucleotídeo, a adsorção da sonda rotulada na superfície SE(R)RS ativa é assegurada pela adição de uma poliamina monomérica ou polimérica, mais particularmente uma poliamina alifática de cadeia curta, tal como espermina. Assim, de acordo com uma forma de realização, os métodos da invenção compreenderão, antes da detecção, a adição de uma poliamina na amostra de teste a ser detectada por SE(R)RS. A poliamina deve ser introduzida em uma ocasião que permita sua interação com o analito e/ou o rótulo e/ou a sonda e/ou a sonda específica de analito rotulada e/ou a sonda alvo substituta rotulada, antes do espectro de SE(R)RS ser obtido. A poliamina é preferivelmente uma poliamina alifática de cadeia curta, tal como espermina, espermidina, 1,4-diaminopiperazina, dietilenotriamina, N-(2-aminoetil)-l,3-propanodiamina, trietilenotetramina e tetraetilenopentamina. A espermina com seus quatro grupos NH2 por unidade de repetição é particularmente adequada para uso na presente invenção. A poliamina é preferivelmente introduzida na forma de um sal ácido, tal como seu cloridreto. É de muitíssimo uso quando a superfície SE(R)RS ativa é coloidal (vide supra). A quantidade de poliamina adicionada é preferivelmente da ordem de 100 a 1000 vezes mais do que seria necessário para obter-se uma cobertura de monocamada da superfície com a poliamina. Poliamina em excesso forma um revestimento sobre a superfície, desse modo assegurando agregação e adsorção coloidais ótimas do analito e/ou rótulo e/ou rótulo específico de analito.

A adição de uma poliamina assegurará um aumento total de ligação de DNA á superfície metálica. Alternativa ou adicionalmente, uma sonda pode ser modificada a fim de promover ou facilitar a quimissorção da sonda na superfície SE(R)RS ativa. Isto pode ser assegurado reduzindo-se pelo menos parcialmente a carga negativa total da sonda específica de analito. Mais particularmente, onde a sonda específica de analito for um nucleotídeo, isto pode ser assegurado incorporando-se dentro do ácido nucleico ou unidade de ácido nucleico um ou mais grupos funcionais compreendendo uma base de Lewis, tal como amino grupos, como descrito na US 6127120.

De acordo com mais uma forma de realização, um grupo funcional (tal como, p. ex., uma base de Lewis) é provido no rótulo SE(R)RS ativo, a fim de promover ou facilitar a quimissorção na superfície SE(R)RS ativa. Opcionalmente, o rótulo ou corante SE(R)RS ativo e partículas de metal são aprisionados em uma conta de polímero como descrito em US2005/0130163, que pode opcionalmente conter ainda partículas magnéticas, tornando as contas magnéticas, o que pode ser de interesse na separação (vide abaixo). A presente invenção fornece um controle de rótulo para métodos de detecção em que a matriz de amostra pode interferir com a detecção de um analito. Tipicamente, tais métodos incluem métodos que não requerem a separação do analito rotulado do rótulo não ligado e/ou de outros componentes rotulados interferindo com a detecção e/ou quantificação do analito e/ou que não envolvem uma etapa de lavagem, separando o analito da matriz de amostra original. De acordo com uma forma de realização da invenção, a detecção do analito é assegurada com base na ligação específica de um rótulo no analito, por meio do que o sinal do rótulo é modificado na ligação ao analito. Isto pode ser conseguido, p. ex., pela provisão de uma sinalizador molecular, p. ex., uma sonda, que seja complementar à seqüência alvo, duplamente rotulada com um corante e um extintor (p. ex., Dabcyl) em cada uma de suas duas extremidades. Em seu estado fechado, o sinal do corante é extinto pelo extintor. Quando a seqüência complementar hibridiza no DNA alvo, o sinalizador abre-se completamente e um sinal pode ser detectado. Um outro exemplo de rótulos capazes de especificamente ligarem- se a um analito e desse modo provocar uma mudança no sinal é fornecido para SERRS no W02005/019812. Nele são descritas os sinalizadores SERRS que são sondas duplamente rotuladas com um diferente corante em cada uma de suas dois extremidades. O segundo corante é especificamente projetado de modo que seja capaz de imobilizar a sonda de oligonucleotídeo em uma apropriada superfície metálica. Na ausência do DNA alvo, o sinalizador é imobilizado no "estado fechado" sobre a superfície metálica, resultando na detecção de um espectro SERRS correspondendo a ambos os corantes. Quando a seqüência complementar hibridiza no DNA alvo, a sinalizador abre- se completamente e um dos corantes é removido da superfície. Isto faz com que os sinais SERRS mudem.

De acordo com outra forma de realização, é feito uso de sondas de nucleotídeo rotuladas com fluoróforo, por meio do que a polarização da fluorescência do rótulo aumenta na ligação do ácido nucleico alvo (Walker e Linn (1996), Clinicai Chemistry, Vol 42, 1604-1608).

De acordo com ainda outra forma de realização da invenção, a provisão de um controle de rótulo é aplicável a métodos SE(R)RS competitivos, em que a detecção do analito é assegurada com base na ligação competitiva do analito e uma sonda alvo substituta rotulada na sonda específica de analito, a última sendo associada com uma superfície SE(R)RS.

A sonda substituta rotulada é deslocada de sua ligação com a sonda específica de analito, como resultado de uma mais elevada afinidade da sonda específica de analito para o analito do que para a sonda substituta. Tais métodos asseguram uma detecção inversa do analito, visto que, quanto mais analito presente, mais sonda alvo substituta rotulada é deslocada da superfície, resultando em um sinal SE(R)RS decrescido.

Tipicamente, a detecção do analito dos métodos da presente invenção envolve uma sonda específica de analito rotulada, que pode ser uma sonda alvo complementar ou uma sonda alvo substituta. Estas sondas, destinadas a especificamente ligarem-se ao ou competir com o analito (para ligação a uma segunda sonda), são obtidas por ligação de um composto, capaz de especificamente ligar-se ao analito ou correspondendo a pelo menos uma (uma específica) parte do analito, a um rótulo. A natureza da sonda específica de analito será determinada pela natureza do analito a ser detectado. Muitíssimo comumente, a sonda é desenvolvida com base em uma interação específica com o analito, tal como mas não limitada a ligação de antígeno- anticorpo, seqüências de nucleotídeo, carboidrato-lectina, seqüências de peptídeo complementares, ligando-receptor, coenzima-enzima, inibidores de enzima-enzima etc.

De acordo com uma forma de realização particular da presente invenção, o analito de interesse é um nucleotídeo e os métodos da invenção envolvem o uso de pelo menos uma sonda específica de analito rotulada, que é uma sonda de nucleotídeo, cuja seqüência é complementar ou similar a pelo menos parte do analito de interesse, muitíssimo particularmente uma seqüência do analito que é específica para o analito. Esta sonda de nucleotídeo é ligada a um rótulo, para permitir detecção específica do analito.

Métodos para preparar os nucleotídeos rotulados e incorporá- los dentro dos ácidos nucleicos são descritos na arte (p. ex., Patentes U.S. 4962037, 5405747, 6136543 e 6210896).

Em uma forma de realização particular da invenção, um rótulo SE(R)RS ativo é usado, que é ligado diretamente à sonda de nucleotídeo ou via um composto ligador. Os rótulos SE(R)RS ativos, que contêm grupos reativos projetados para covalentemente reagir com outras moléculas, tais como nucleotídeos ou ácidos nucleicos, são comumente disponíveis (p. ex., Sondas Moleculares, Eugene, Oreg.). Os rótulos SE(R)RS ativos que são covalentemente ligados aos precursores de nucleotídeo podem ser comprados de fontes comerciais padrão (p. ex., Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Ind.; Promega Corp., Madison, Wis.; Ambion, Inc., Austin, Tex.; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.).

De acordo com uma forma de realização particular da presente invenção, a detecção da sonda rotulada ligada envolve uma separação física da sonda específica de analito rotulada não-ligada da sonda específica de analito rotulada que é ligada ao analito, dentro da amostra. A separação da sondas rotuladas não-ligada e ligada pode ser conseguida provendo-se uma etiqueta à sonda específica de analito ou provendo-se uma sonda de separação específica de analito secundária, compreendendo uma etiqueta, que pode ser submetida a forças físicas e/ou químicas. Exemplos típicos de tais etiquetas incluem contas magnéticas (que podem ser submetidas a forças magnéticas), contas de vidro ou poliestireno (que podem ser capturadas e movidas por um feixe de luz; Smith et al. (1995), Science 271 :795), ou grupos carregados (que podem ser submetidos a forças eletrocinéticas; Chou et al. (1999), PNAS 96:11). Onde o analito for uma seqüência de nucleotídeo, que antes da detecção é amplificada usando-se PCR, a etiqueta pode ser incorporada dentro do produto PCR. A etiquetação do analito torna possível separar sondas específicas de analito rotuladas não ligadas de ligadas, para permitir sua detecção individual.

Certos aspectos da presente invenção referem-se a métodos aperfeiçoados para a detecção e/ou quantificação de um analito, mais particularmente um analito de uma amostra de teste. Embora os métodos aqui descritos geralmente referir-se-ão a "um analito", é igualmente considerado que os métodos da presente invenção podem ser aplicados onde diversos analitos estão sendo detectados ou quantificados simultaneamente, usando-se diferentes rótulos específicos de analito. Mais particularmente, pode ser feito uso de diferentes sondas específica de analito, que podem ser diferencialmente detectadas utilizando-se o mesmo método de detecção, tal como mas não limitado a diferentes rótulos fluorescentes, tais como mas não limitado a isotiocianatos de fluoresceína (FITC), carboxifluoresceínas (tais como tetrametil rodamina (TMR), carbóxi tetrametil-rodamina (TAMRA), carbóxi-X-rodamina (ROX), sulforrodamina 101 (Texas red™), corantes Atto (Sigma Aldrich), Fluorescent Red e Fluorescent Orange, ficoeritrina, ficocianina, corantes Crypto-Fluor™, pontos quantum, corantes SE(R)RS- ativos, e seus isótopos. Como cada uma das sondas pode ser tornada específica para um diferente analito, é possível medir-se, para cada sonda específica de analito rotulada, seu sinal de detecção na amostra de teste. Além disso, é possível determinar os efeitos da matriz de amostra para cada um dos diferentes rótulos de um controle de rótulo (com base em uma amostra de plano de fundo e uma amostra livre de segundo plano, a que os respectivos rótulos foram adicionados), a fim de permitir a compensação pelos efeitos da matriz de amostra potencialmente interferindo com a detecção de cada um dos rótulos. Como indicado acima, os métodos da presente invenção são de particular interesse nos métodos de detecção e/ou quantificação baseados na espectroscopia Raman intensificada na superfície (ressonância) ou SE(R)RS. Embora referência seja genericamente feita a SE(R)RS aqui, deve ser entendido que os métodos de detecção baseados em outros tipos de espectroscopias aumentadas na superfície são também consideradas, por exemplo mas não limitado a fluorescência aumentada na superfície, dispersão Raman normal (Stokes ou anti-Stokes), dispersão Raman de ressonância, espectroscopia Raman coerente (Stokes ou anti-Stokes) (CSRS ou CARS), CARS aumentada na superfície (ressonância), dispersão Raman estimulada, espectroscopia Raman inversa, espectroscopia Raman de ganho estimulado, dispersão hiper-Raman, dispersão-hiper aumentada na superfície, examinador de laser óptico molecular (MOLE) ou microssonda Raman ou microscopia Raman ou microespectrometria Raman confocal, Raman tridimensional ou de varredura, espectroscopia de saturação Raman, Raman de ressonância resolvida no tempo, espectroscopia de desacoplamento Raman ou microscopia UV-Raman.

Em uma forma de realização particular da invenção, o método de detecção da invenção envolve SERRS, uma vez que operando na freqüência ressonante do rótulo fornece aumentada sensibilidade. Neste caso, a fonte de luz usada para gerar o espectro Raman é uma fonte de luz coerente, p. ex., um laser sintonizado substancialmente na freqüência de máxima absorção do rótulo sendo usado. Esta freqüência pode mudar ligeiramente na associação do rótulo com a superfície SE(R)RS ativa e o analito e/ou espécie de ligação de analito, porém a pessoa hábil será bem capaz de sintonizar a fonte de luz para acomodar esta. A fonte de luz pode ser sintonizada a uma freqüência próxima da máxima absorção do rótulo ou em uma freqüência no ou próxima daquela de um pico secundário do espectro de absorção de rótulo. O SE(R)RS pode alternativamente envolver operar na freqüência ressonante dos plasmônios da superfície ativa ou colóides (agregados).

Nos métodos da invenção baseados na detecção SE(R)RS, tipicamente um pico, correspondendo, p. ex., ao máximo de absorção do rótulo, é selecionado e a excitação é realizada somente no comprimento de onda daquele pico. Alternativamente, onde, p. ex., diferentes analitos estão sendo detectados ao mesmo tempo usando-se diferentes rótulos SERRS, pode ser necessário detectar a inteiro espectro de "impressão digital", a fim de identificar cada rótulo. Em geral, métodos de análise multi-variados (tais como regressão parcial dos quadrados mínimos, regressão de componentes principais etc.) podem ser usados para realizar identificação qualitativa e/ou quantitativa de cada um dos rótulos presentes, usando-se o inteiro espectro de impressão digital, uma faixa espectral com mais do que uma faixa Raman, ou utilizando-se uma única faixa Raman.

Tipicamente, a etapa de detecção de um método de detecção baseado em SE(R)RS será realizada usando-se luz incidente de um laser, tendo uma freqüência no espectro visível. A exata freqüência escolhida dependerá do rótulo, superfície e analito. As freqüências da área verde ou vermelha do espectro visível tendem, no todo, a dar origem a melhores efeitos de intensificação de superfície para as superfícies de metal nobre, tais como prata e ouro. Entretanto, é possível considerar situações em que outras freqüências, por exemplo, nas faixas ultravioleta ou próxima do infravermelho, poderiam ser usadas. A seleção e, se necessário, a sintonização de uma apropriada fonte de luz, com uma apropriada freqüência e potência, ficará bem dentro da capacidade de uma pessoa comum na arte, particularmente, ao referir-se à literatura SE(R)RS disponível.

Fontes de excitação para uso nos métodos de detecção baseados em SE(R)RS incluem mas não são limitados a laseres de nitrogênio, laseres de hélio-cádmio, laseres de íon argônio, laseres de íon de criptônio etc. Múltiplos laseres podem prover uma larga escolha de linhas de excitação, o que é crítico para espectroscopia Raman de ressonância. De acordo com uma forma de realização específica, um laser de íon de argônio é usado em um instrumento integrado LabRam (Jobin Yvon) em um comprimento de onda de excitação de 514,5 nm.

O feixe de excitação pode ser espectralmente purificado com um filtro de baixa passagem e pode ser focalizado em um substrato usando-se uma lente objetiva de 6 vezes. A lente objetiva pode ser usada tanto para excitar a amostra como para coletar o sinal Raman, utilizando-se um divisor de feixe holográfico, para produzir uma geometria de ângulo reto para o feixe de excitação e o sinal Raman emitido. A intensidade dos sinais Raman precisa ser medido em relação a um intenso segundo plano do feixe de excitação. O segundo plano é principalmente luz dispersa Rayleigh e reflexão especular, que podem ser seletivamente removidas com filtros ópticos de alta eficiência. Por exemplo, um filtro de nó holográfico pode ser usado para reduzir radiação dispersa Rayleigh.

O sinal de emissão Raman intensificado na superfície pode ser detectado por um detector Raman. Uma variedade de unidades de detecção de uso potencial na espectroscopia Raman é conhecida na arte e qualquer unidade de detecção Raman conhecida pode ser usada. Um exemplo de uma unidade de detecção Raman é descrito, p. ex., na Patente U.S. No. 6002471. Outros tipos de detectores podem ser usados, tais como dispositivo acoplado por carga (CCD), com um dispositivo acoplado por carga intensificado de vermelho (RE-ICCD), um fotodiodo de silício ou tubos fotomultiplicadores dispostos individualmente ou em série para amplificação em cascata do sinal. Eletrônica de contagem de fóton pode ser usada para detecção sensível. A escolha do detector dependerá largamente da sensibilidade de detecção requerida para realizar um ensaio particular. Diversos dispositivos são adequados para coletar os sinais SE(R)RS, incluindo espelhos seletivos de comprimento de onda, elementos ópticos holográficos para detecção de luz dispersa e guias de onda de fibra-óptica.

Aparelho para obter e/ou analisar um espectro de SE(R)RS pode incluir alguma forma de processador de dados, tal como um computador. Uma vez o sinal SE(R)RS tenha sido capturado por um apropriado detector, seus dados de freqüência e intensidade tipicamente serão passados para um computador para análise. O espectro Raman de impressão digital será comparado com os espectros de referência para identificação do composto ativo Raman detectado ou a intensidade do sinal nas freqüências medidas serão usada para calcular a quantidade de composto ativo Raman detectada.

A presente invenção fornece um método para melhorar a detecção e/ou quantificação de um analito de uma amostra, pela permissão da correção dos efeitos da matriz de amostra. Será entendido pela pessoa hábil na arte que esta pode ser aplicada a métodos de detecção em combinação com provisões que assegurem compensação por variações de excitação/captação óptica, p. ex., usando-se um padrão interno, tal como um rótulo editado por isótopo, administrado para a amostra de teste. Um exemplo de tal padrão interno é provido na arte anterior (Zhang et al. (2005), Anal. Chem. 77(11): 3563-3569).

A presente invenção provê métodos aperfeiçoados para detecção baseada em rótulo de um analito. E considerado que podem ser desenvolvidos kits e reagentes que são adaptados para a aplicação dos métodos da presente invenção.

De acordo com mais um aspecto, a presente invenção provê um sistema em que os métodos descritos aqui podem ser executados, o sistema compreendendo:

(a) meio para prover uma amostra de teste da amostra, em que o analito é para ser detectado, uma amostra de plano de fundo compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra e uma amostra livre de segundo plano, não compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra.

(b) meio para apropriadamente contatar as amostras com uma quantidade predeterminada de rótulo,

(c) meio para detectar e/ou quantificar o rótulo (na amostra de teste, na amostra de plano de fundo e na amostra livre de segundo plano)

(d) meio para determinar os efeitos da matriz de amostra, pela determinação da diferença entre a detecção do rótulo, na amostra de plano de fundo e na amostra livre de segundo plano, e para corrigir a detecção e/ou quantificação do rótulo na amostra de teste conseqüentemente.

Por exemplo, a presente invenção inclui um dispositivo integrado para detecção patogênica, p. ex., para detecção de MRSA, meningite, HIV, influenza de ave, malária etc.

A Fig. 3 é uma representação esquemática do sistema 100 de acordo com uma forma de realização da presente invenção. O sistema 100 é adequado para detectar e opcionalmente quantificar a presença de um analito em uma amostra, por meio do que os efeitos da matriz de amostra da amostra na detecção de um rótulo são determinados. Ele compreende uma fonte 101 para prover uma ou mais amostras, que podem ser providas como uma ou mais fontes, tais como fonte especializada 105 da amostra de teste suspeita de conter um analito, fonte 106 de uma amostra de plano de fundo compreendendo a matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra, fonte 107 de uma amostra livre de segundo plano, não compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra. Adicionalmente, o sistema pode compreender uma fonte 102 contendo o rótulo, que pode ser uma fonte ou pode ser provida como uma fonte separada 108 de um rótulo específico de analito (p. ex., uma sonda específica de analito rotulada) e fonte 109 do rótulo. Opcionalmente, o dispositivo compreende pelo menos uma fonte adicional 110 de aditivos servindo na detecção. O dispositivo compreende ainda um meio 103 em que o teste e as amostras de segundo plano são contatadas com os respectivos rótulos e apresentadas para detecção. Opcionalmente, este meio pode ser provido como um meio 103 ou como câmaras separadas para o contato da amostra de teste 111, amostra de plano de fundo 112 e amostra livre de segundo plano 113, com os rótulos e detecção pertinentes. O dispositivo ainda compreende meio 104 para:

a) prover amostra compreendendo o analito da fonte 101 (ou 105) e uma quantidade predeterminada do rótulo da fonte 102 (ou 108) para o meio 103, para contatar as amostras com o rótulo ou meio especializado em que a amostra de teste é contatada com o rótulo específico de analito 111,

b) prover amostra de plano de fundo da fonte 101 (ou 106) e uma quantidade predeterminada de rótulo da fonte 102 (ou 109) para o meio 103, para contatar as amostras com o respectivo rótulo ou com o meio especializado (112), em que a amostra de plano de fundo é contatada com uma quantidade predeterminada de rótulo,

c) prover amostra livre de segundo plano da fonte 101 (ou 107) e uma quantidade predeterminada de rótulo da fonte 102 (ou 109) para o meio 103, para contatar as amostras com o respectivo rótulo ou com o meio especializado 113, em que a amostra de plano de fundo é contatada com a mesma quantidade predeterminada de rótulo.

O meio 104 pode incluir campos gravimétricos da amostra e/ou analito e/ou segundo plano e/ou material livre de segundo plano e pode também incluir um arranjo de tubos/condutos e válvulas, p. ex., válvulas selecionáveis e controláveis, para permitir a provisão dos fluidos das fontes 105, 106, 107, 108, 109 e 110 (ou das fontes 101 e 102) para o dispositivo de contatar 111, 112 e 113 (ou 103). Alternativamente, os fluidos podem ser bombeados das fontes 105 - 110 (ou IOle 102) para o dispositivo de contatar 111 - 113 (ou 103).

De acordo com uma forma de realização particular, a amostra de plano de fundo compreende a matriz de amostra e mais particularmente é uma fração da amostra em que o analito é para ser detectado e, assim, sua composição é idêntica àquela da amostra de teste.

O arranjo de componentes acima pode ser localizado em um cartucho 117, p. ex., um cartucho descartável 117, para uso em diagnósticos moleculares.

Circuitos de controle e análise 115, que podem estar pelo menos parcialmente no cartucho 117 ou podem opcionalmente ser externos ao cartucho 117 e podem ser providos opcionalmente para controlar a operação do meio 104. O circuito de controle e análise 115 pode ser conectado ao meio 104 por contatos adequados na superfície do cartucho, p. ex., terminais.

Além disso, meio 114 para detectar o rótulo ligado ao analito e também detectar os rótulos pertinentes da amostra de plano de fiindo e da amostra livre de segundo plano é provido. O meio 114 pode ser integrante com o cartucho 117 ou pode ser externo ao cartucho e podem ser providas janelas no cartucho 117, a fim de que o meio de detecção 114 possa detectar a amostra etc. O meio 114 pode estar sob controle do circuito de controle e análise 115. O meio de detecção 114 pode ser um detector capaz de utilizar um ou mais ou qualquer um dos métodos de detecção mencionados acima. Sinais representativos das detecções podem ser supridos ao circuito de controle e análise 115, que pode ser adaptado para realizar qualquer um dos algoritmos de análise da presente invenção descritos acima. Em particular, o circuito de controle e análise 115 pode ser adaptado para determinar os efeitos da matriz de amostra determinando a diferença entre a detecção do rótulo na amostra de plano de fundo da detecção do rótulo da amostra livre de segundo plano e para corrigir a detecção do rótulo na amostra de teste, desse modo corrigindo a detecção e/ou quantificação do analito na amostra de teste com os efeitos da matriz de amostra determinados. Os resultados podem ser exibidos em qualquer meio de exibição adequado 116, tal como uma unidade de exibição visual, plotador, impressora etc. O circuito de controle e análise 115 pode ter uma conexão com uma área local ou rede de área larga para transmissão dos resultados a um local remoto. O circuito de controle e análise 115 pode ser implementado em qualquer maneira adequada, p. ex., hardware dedicado ou um computador, microcontrolador ou processador embutido adequadamente programado, tal como um microprocessador, sistema de portões programável, tal como um PAL, PLA ou FPGA ou similar.

De acordo com uma forma de realização específica da presente invenção, a amostra da fonte 105 pode ser uma solução contendo biomoléculas, tais como qualquer uma das biomoléculas mencionadas acima e, em particular, uma mistura de moléculas de DNA. Em particular, as biomoléculas podem ser DNA obtido de uma reação PCR. Esta forma de realização é particularmente útil pra uso em um cartucho descartável de diagnóstico molecular, que pode incluir uma estação de Iise de célula e uma estação de reação PCR, em particular uma estação de reação de PCR multiplexada. A saída da estação de reação PCR então forma a fonte 105. Neste caso, o rótulo da fonte 108 será uma sonda de oligonucleotídeo específica de analito, a que um rótulo é ligado que é adequado para qualquer um dos métodos de detecção aplicados acima. A seqüência de nucleotídeo da sonda é escolhida de modo a poder hibridizar com o analito, p. ex., é complementar à seqüência do analito. Uma segunda fonte 108 pode conter uma quantidade predeterminada do mesmo ou de um diferente rótulo que não é ligado a uma sonda de nucleotídeo e não é, portanto, capaz de ligar-se ao analito. A fonte 106 contém uma amostra de plano de fundo, tal como um tampão PCR (p. ex., tampão PCR Taq, 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% gelatina). A fonte 107 contém uma amostra livre de segundo plano, tal como água ou uma solução tampão adequada para detecção não perturbada do rótulo. Quando um método de espectroscopia intensificada na superfície é usado para detecção do rótulo, uma fonte adicional 110 pode conter uma superfície metálica adequada, tal como partículas ou contas colóides revestidas com superfície metálica, especialmente partículas colóides especialmente agregáveis ou contas revestidas com superfície metálica. Uma segunda fonte adicional 110 pode conter um agente de agregação, tal como espermina.

Nesta forma de realização específica, apropriadamente prover e contatar os reagentes das fontes 105 a 110 pode resultar na câmara 111 conter produção de reação PCR e uma quantidade predeterminada de sonda de oligonucleotídeo rotulada, câmara 112, conter produção de reação PCR e uma quantidade predeterminada de rótulo, câmara 113 conter água e uma quantidade predeterminada de rótulo e além de todas três câmaras 111 - 113 conterem partículas colóides agregadas, para possibilitar detecção espectroscópica intensificada na superfície pelo meio de detecção 114.

Deve ser entendido que, embora formas de realização, construções específicas e configurações preferidas, bem como materiais, tenham sido examinados aqui para os dispositivos de acordo com a presente invenção, várias mudanças ou modificações na forma e detalhe podem ser feitos sem desvio do escopo e espírito desta invenção.

EXEMPLO

Exemplo 1: Determinação do efeito da composição tampão sobre a detecção SERRS de um rótulo SERRS ativo

Um oligonucleotídeo sintético (19 pb, TGCTTCTACACAGTCTCCT) rotulado em sua extremidade 5' com rodaminaóG foi usado para estudar o efeito da composição tampão na intensidade de SERRS detectada. O oligonucleotídeo foi dissolvido em uma amostra livre de segundo plano, isto é, água, em uma concentração de 2 - 10"9. Para investigar o efeito da composição tampão na medição SERRS, a mesma quantidade de oligonucleotídeo foi dissolvida em uma amostra de plano de fundo, isto é, água contendo 10 mM NaCl. Para medições SERRS 10 μl de cada amostra foram misturados com 10 μl de tetracloreto de espermina (100 mM em água, recentemente preparado). A estas soluções 250 μl de água e 250 μl de prata foram adicionadas nanopartícuias (preparadas como descrito por Munro e al. (1995), Langmuir, 11: 3712 - 3720). Imediatamente após misturar, espectros de SERRS foram retirados de ambas as amostras usando- se um sistema LabRam (Jobin Yvon) com um laser de Argônio provendo excitação a 514,5 nm. Uma comparação dos dois espectros mostrou uma significativa diferença na intensidade SERRS. Esta foi muitíssimo provavelmente causada por um aumento na quantidade de agregados e/ou uma mudança do tamanho do agregado pela adição de NaCl.

Exemplo 2: Detecção e quantificação de um gene específico em uma amostra, utilizando-se SERRS competitivo e correção para os efeitos da matriz de amostra

Influenza aviária altamente patogênica, causada por certos subtipos de vírus influenza A em populações de animais, particularmente galinhas, apresentam um contínuo risco para a saúde pública humana global. Infecção humana direta pelo vírus influenza A aviário subtipo H5N1 tem sido responsável por considerável mortalidade humana recentemente, salientando a necessidade de diagnóstico rápido e preciso. Os vírus influenza tipo A são subtipados com base nas diferenças antigênicas das glicoproteínas externas, das hemaglutininas (HA) e das neuraminidases (NA). A presente invenção oferece uma nova, rápida e precisa abordagem da subtipagem viral utilizando RT-PCR e SERRS de ácidos nucleicos virais.

O RNA viral é extraído de amostras clínicas e o cDNA complementar para o RNA viral é gerado usando-se transcriptase inversa viral e iniciadores aleatórios de acordo com Wright et al. (1995), J. Clin. Microbiol, 33:1180-1184. A PCR Multiplex é realizada com dois jogos de iniciadores específicos para os genes de HA e NA do vírus influenza subtipo H5N1, como descrito nos "Recommended laboratory tests to identify avian influenza A virus in specimens from humans", WHO Geneva, junho de 2005), projetado para produzir produtos PCR de 219 e 616 pb, respectivamente. Os produtos amplificados são subseqüentemente detectados por SERRS competitivo. Portanto, duas sondas específicas de analito são projetadas para serem complementares a uma região dentro dos genes HA e NA, respectivamente, e tendo o grupo de procura de superfície propargilamina para ligação a uma nanopartícula de prata. Dois oligonucleotídeos sintéticos adicionais, chamadas sonda alvo substitutas, rotuladas com os corantes SERRS HEX e ΤΕΤ, respectivamente, são projetados para serem complementares a uma parte das sondas específicas de HA e NA, respectivamente, exceto para uma desigualdade (SNP).

Duas soluções de rótulo são preparadas. A primeira solução de rótulo contém quantidades predeterminadas de sondas específicas de Ha e NA e correspondendo a sondas alvo substitutas para detecção de genes HA e NA virais H5N1 amplificados. Devido à presença de SNP as sondas específicas de HA e NA e suas correspondentes sondas alvo substitutas são frouxamente recozidas na solução de primeiro rótulo. A solução de segundo rótulo, preparada em duplicata, contém unicamente uma quantidade predeterminada dos corantes SERRS HEX e ΤΕΤ.

Para determinar um ponto de referência para as medições SERRS de HEX e TET nas várias amostras, 10 μl de cada solução de rótulo é misturada com 10 μl de tetracloreto de espermina (100 mM em água, recentemente preparado). A estas soluções são adicionados 250 μl de nanopartícuias de água e 250 μl de prata (preparados como descrito por Munro e al. (1995), Langmuir, 11: 3712 - 3720). Imediatamente após misturar SERRS, espectros são retirados das soluções preparadas usando-se um sistema LabRam (Jobin Yvon) com um laser de Argônio provendo excitação a 514,5 nm.

A produção da reação PCR é então dividida em duas porções iguais, para prover uma amostra de teste e uma amostra de plano de fundo. Água é fornecida como uma amostra livre de segundo plano. Para detecção de genes HA e Na virais H5N1 amplificados, a amostra de teste é adicionada à solução do primeiro rótulo contendo quantidades predeterminadas de sondas específicas de HA e NA, sondas alvo substitutas e colóides de prata agregados. Para determinação dos efeitos da matriz de amostra, o segundo plano e as amostras livres de segundo plano são adicionados a uma solução de segundo rótulo, contendo uma quantidade predeterminada de corante SERRS e colóides de prata agregados.

A incubação em uma apropriada temperatura permite que os DNAs do analito da amostra de teste compitam com as sondas alvo substitutas para hibridização nas sondas específicas de HA e NA, a última sendo fixada aos colóides de prata agregados. Uma vez que as sondas alvo substitutas não são perfeitamente complementares às sondas específicas de HA e NA, a hibridização dos DNA's do analito nas sondas específicas de HA e NA é mais estável e as sondas alvo substitutas são deslocadas da superfície metálica, resultando em uma diminuição da intensidade de SERRS dos corantes HEX e ΤΕΤ.

As amostras de segundo plano e livres do segundo plano são também incubadas e seus espectros de SERRS comparados para quantificar os efeitos da matriz de amostra gerados pelos compostos tampão de PCR, DNA's residuais etc.

Compensando-se pelos efeitos da matriz de amostra, uma detecção precisa dos genes do HA e NA virais amplificados é assim conseguida usando-se SERRS competitivos.

Claims

1. Método para determinar os efeitos da matriz de amostra de uma amostra na detecção de um rótulo, dito método caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) contatar uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou um diferente rótulo com uma amostra de plano de fundo compreendendo a matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra; (b) contatar uma predeterminada quantidade de dito rótulo ou de dito diferente rótulo com uma amostra livre de segundo plano não compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra ou qualquer outro composto que seja capaz de interferir com a detecção do rótulo; (c) detectar dito rótulo ou dito diferente rótulo na amostra de plano de fundo e na amostra livre de segundo plano; e (d) determinar uma diferença entre a detecção de dito rótulo ou de dito diferente rótulo na dita amostra de plano de fundo e na dita amostra livre de segundo plano, correspondendo a ditos efeitos da matriz de amostra.

2. Método para determinar os efeitos da matriz de amostra sobre a detecção de um analito em uma amostra, dito método caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) prover uma amostra de teste de dita amostra em que dito analito é para ser detectado, uma amostra de plano de fundo compreendendo uma matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra, e uma amostra livre de segundo plano, não compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra; (b) detectar e/ou quantificar o analito de dita amostra de teste usando-se um rótulo; (c) detectar ditos efeitos da matriz de amostra por um método compreendendo as etapas de (i) contatar dita amostra de plano de fundo com uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou um diferente rótulo, (ii) contatar dita amostra livre de segundo plano com uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou dito diferente rótulo, (iii) detectar dito rótulo ou dito diferente rótulo de dita amostra de plano de fundo e de dita amostra livre de segundo plano, (iv) determinar ditos efeitos da matriz de amostra determinando uma diferença entre a detecção de dito rótulo ou dito diferente rótulo em dita amostra de plano de fundo e dita amostra livre de segundo plano, (d) corrigir a detecção e/ou quantificação do dito analito na amostra de teste como obtida na etapa (b) com os efeitos da matriz de amostra determinados em (vi).

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de dita amostra de plano de fundo ser uma fração de dita amostra em que o analito é para ser detectado.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de dita amostra de plano de fundo compreender matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de a correção para os efeitos da matriz de amostra ser realizada usando-se duas ou mais quantidades predeterminadas de rótulo.

6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de dito analito ser selecionado do grupo consistindo de um ácido nucleico, uma proteína, um carboidrato, um lipídeo, uma substância química, um anticorpo, um microorganismo e uma célula eucariótica.

7. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de dita detecção da etapa (c) ou das etapas (b) e (c), respectivamente, ser realizada usando-se um método de detecção óptica.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de dito método de detecção óptica ser SE(R)RS e em que dito rótulo ou dito rótulo diferente ser um rótulo SE(R)RS ativo.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender ainda, antes da detecção, contatar dito rótulo ou dito diferente rótulo com uma superfície SE(R)RS ativa.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de dita superfície SE(R)RS ativa ser uma suspensão coloidal de nanopartículas de prata ou ouro ou seus colóides agregados.

11. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de dita detecção de dito analito ser realizada usando-se uma sonda específica de analito rotulada.

12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de dita sonda específica de analito ser provida com um rótulo sensível a ligação.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de dito analito ser uma seqüência de nucleotídeo e dita sonda específica de analito rotulada ser uma seqüência de análogo de nucleotídeo ou nucleosídeo, tendo uma seqüência complementar a uma seqüência dentro de dito analito.

14. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de dita detecção de dito analito ser realizada usando-se uma sonda específica de analito capaz de ligar-se a uma superfície SE(R)RS ativa e uma sonda substituta rotulada, por meio do que dito analito compete com dita sonda substituta rotulada para a ligação a dita sonda específica de analito.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 14, caracterizado pelo fato de dita detecção e/ou quantificação de dito analito da etapa (b) serem baseadas na detecção de uma sonda específica de analito rotulada ou sonda substituta rotulada e dita etapa de correção (d) ser realizada corrigindo-se dita detecção de dita sonda específica de analito rotulada ou sonda substituta rotulada com ditos efeitos da matriz de amostra determinados em (iv).

16. Sistema para determinar os efeitos da matriz de amostra de uma amostra na detecção de um rótulo, dito sistema caracterizado pelo fato de compreender: (a) meio para contatar uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou um diferente rótulo, com uma amostra de plano de fundo compreendendo a matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra, (b) meio para contatar uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou de dito diferente rótulo com uma amostra livre de segundo plano não compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra ou qualquer outro composto que seja capaz de interferir com a detecção do rótulo, (c) meio para detectar dito rótulo ou dito diferente rótulo em dita amostra de plano de fundo e dita amostra livre de segundo plano, e (d) meio para determinar uma diferença entre a detecção de dito rótulo ou dito diferente rótulo em dita amostra de plano de fundo e em dita amostra livre de segundo plano, correspondendo a ditos efeitos da matriz de amostra.

17. Sistema para determinar os efeitos da matriz de amostra na detecção de um analito em uma amostra, dito sistema caracterizado pelo fato de compreender: (a) meio para prover uma amostra de teste de dita amostra em que dito analito é para ser detectado, uma amostra de plano de fundo compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra e uma amostra livre de segundo plano, não compreendendo matriz de amostra ou matriz semelhante a amostra, (b) meio para detectar e/ou quantificar o analito em dita amostra de teste empregando-se um rótulo, (c) meio para contatar dita amostra de plano de fundo com uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou um diferente rótulo, (d) meio para contatar dita amostra livre de segundo plano com uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou dito diferente rótulo, (e) meio para detectar dito rótulo ou dito diferente rótulo em dita amostra de plano de fundo e em dita amostra livre de segundo plano, (f) meio para determinar ditos efeitos da matriz de amostra, determinando uma diferença entre a detecção de dito rótulo ou dito diferente rótulo em dita amostra de plano de fundo e dita amostra livre de segundo plano, (g) meio para corrigir a detecção e/ou quantificação de dito analito em dita amostra de teste responsiva ao meio, para determinar os efeitos da matriz de amostra.

18. Sistema de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma primeira fonte (101) de uma ou mais amostras selecionadas do grupo consistindo da amostra de teste contendo dito analito, amostra de plano de fundo e amostra livre de segundo plano e uma segunda fonte (102) de um ou mais rótulos e, opcionalmente, uma terceira fonte de aditivos (110).

19. Sistema de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de dita primeira fonte (101) compreender câmaras especializadas para dita amostra de teste contendo dito analito, amostra de plano de fundo e amostra livre de segundo plano, respectivamente.

20. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações -16 a 19, caracterizado pelo fato de compreender ainda câmaras para contatar dita amostra de teste contendo dito analito, amostra de plano de fundo e amostra livre de segundo plano com ditos rótulos.

21. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações -18 a 20, caracterizado pelo fato de dita segunda fonte (102) de dito um ou mais rótulos compreender uma câmara (108) para um rótulo específico de analito e uma câmara (109) para um rótulo.

22. Cartucho descartável (117) para uso em um sistema para determinar os efeitos da matriz de amostra na detecção de um analito em uma amostra, caracterizado pelo fato de compreender: uma primeira fonte (101) de uma ou mais amostras selecionadas do grupo consistindo da amostra de teste contendo dito analito, amostra de plano de fundo e amostra livre de segundo plano, e uma segunda fonte (102) de um ou mais rótulos e, opcionalmente, uma terceira fonte de aditivos (110) e meio para contatar dita amostra de plano de fundo com uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou um diferente rótulo, para contatar dita amostra de plano de fundo com uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou um diferente rótulo e para contatar a amostra de teste com uma quantidade predeterminada de dito rótulo ou um diferente rótulo, e uma janela para permitir a detecção de dito rótulo ou dito diferente rótulo em dita amostra de teste, dita amostra de plano de fundo e dita amostra livre de segundo plano.