TW202206813A - 藉由使用抗原抗體反應而量化固定化金屬基材上之病毒或抗體的螢光計數系統 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種系統，該系統能夠以與PCR方法相同的準確度進行與免疫層析法等效的簡單且快速的抗原檢查。一實施態樣係關於一種用於對分析物中的病毒或抗體進行定量的新型螢光計數系統，該系統包含：藉由量子晶體聚集的方法提供抗原或抗體相固化基材的單元、製備標記液及在分析物中標記病毒或抗體以藉由抗原抗體方法測量的單元、藉由表面電漿子激發方法激發螢光標記的病毒或抗體的單元、以及在激發的螢光屏中計數螢光點以定量在分析物中病毒或抗體的單元。

Description

藉由使用抗原抗體反應而量化固定化金屬基材上之病毒或抗體的螢光計數系統
[關連出願的相互參照]
本申請主張日本特願2020-80227號及日本特願2020-86846號的優先權，並在此藉由引用將整體納入。
本發明係關於一種螢光計數系統，係藉由在固定的抗體或抗原或者是相固化基材上進行抗原抗體反應，而定量來自患者的分析物中的病毒或抗體，該系統包含將病毒或抗體的相固化或固定在金屬基材上的單元、製備標記液及利用抗原抗體反應而將分析物中病毒及抗體螢光標記的單元、用以捕獲在相固化基材上的病毒及抗體之螢光激發單元、以及用以捕獲在相固化基材上的病毒及抗體之螢光計數檢測單元。
PCR基因檢測是目前病毒檢測的主流。PCR是一種高度準確的方 法，其係從鼻及喉嚨後部採集黏液及痰液並檢查檢體中包含的抗原病毒等蛋白質，擴增檢體中包含的基因，並檢查是否與特定基因序列匹配。然而，這種方法需要熟練的預處理技術及精密的檢測設備。此外，檢查所需的時間約為6小時以上。因此，需要一種簡單快速的基因擴增方法，並提出了恆溫環型核酸擴增法(LAMP,Loop-Mediated Isothermal Amplification)的方法。然而，即使有一定程度的速度，基因擴增的使用也不適合需要立即獲得結果的原位測試(in-situ testing)，如機場測試的情況。再者，PCR方法是判斷陽性或陰性的定性方法，其具有定量判斷的缺點。
因此，作為PCR方法的補充檢測係提出一種使用免疫層析法或酶抗體法(ELISA)檢測血清中病毒特異性抗體的簡單、快速的血清學診斷方法。在常見的急性病毒感染的情況下，血液中的抗體最遲在發病後1週內被誘導。因此，這種類型的血清學診斷需要在疾病的急性期及恢復期測量血液中的抗體效價並比較抗體轉變。據此，對於需要在症狀出現後即時檢測及診斷的急性病毒感染，係難以採用血清中特異性抗體檢測方法作為診斷方法。然而，血清學診斷所需的血樣採集相對簡單，並且在採集樣本時對醫護人員的繼發感染風險相對較低。此外，由於免疫層析病毒特異性抗體的檢測方法可以藉由視覺判斷進行定性分析，無需任何特殊設備即可快速輕鬆地進行外部及投注方的檢查，因此，需要盡快將檢測方法引入到臨床現場。
日本專利公開號2016-80565係關於一種伊波拉病毒抗原的拉曼(Raman)光譜測量方法，更具體地說，關於一種藉由簡化操作快速測量樣本中伊波拉病毒抗原的方法及使用於該方法的伊波拉病毒抗體固定化基材。日本專利申請案第2020-74439號係關於一種壓印設備及其製品的製造方法。
日本專利公開號JP 2016-197114(美國專利號US 9,139,907 B2)係關於一種使用金屬複合物的水溶液製備含有金屬奈米簇之量子點的金屬複合物量子晶體的方法及其用途。
目前，在許多醫療機構中，衛生專業人員在無法進行COVID-19篩檢測試的情況下不得不面對患者，並且住院患者及衛生專業人員因感染COVID-19而導致醫療服務下降(亦即，限制接受急診患者、減少手術次數、減少門診護理)。為了確保患者及衛生專業人員的安全，同時保持適當的醫療服務，需要進行大規模篩檢測試以準確地快速地識別COVID-19感染。
然而，現有的層析方法具有檢測靈敏性限制，PCR方法需要較長的測量時間、一定水準的提取RNA及使用PCR設備的技術。即使是LAMP方法也需要對單個檢體進行大約2小時的測試時間，因此正在等待一種可以識別多個檢體的診斷方法。
然而，對於COVID-19，目前直到發病後6天很難在COVID-19血清中檢測到病毒特異性抗體。此外，發病後1週的血清檢出率也只有約20%左右。再者，抗體陽性率隨時間升高，大部分患者血清中的IgG抗體呈陽性，而IgM抗體的檢出率較低，因此有很多病例僅檢測到IgG抗體，大多數患者在發病後13天的IgG抗體結果變為陽性。基於這一事實，一般認為使用試劑盒對COVID-19進行血清學診斷需要對發病後6天的血清及發病後13天的血清進行配對血清評估。此外，COVID-19中基於非基因擴增抗體的檢測可能無法消除非特異性反應，並且結果解釋不可靠。因此，需要仔細考慮多項檢查的結果及臨床表現。
在這種情況下，病毒的檢查需要與用以擴增基因的PCR方法相當的準確結果以及與免疫層析方法相當的簡單且快速的檢查。
因此，本發明人等進行了深入研究以解決如此之兩個問題：(1)與PCR方法相當的準確結果、及(2)能夠進行與免疫層析法相當的簡單且快速的檢查方法。
本發明的目的之一是開發一種系統，該系統能夠以與上述免疫層析法相當的簡單且快速的進行檢查並具有與上述PCR方法相當的準確度。
一實施態樣係關於一種用於對分析物中的病毒或抗體進行定量的新穎螢光計數系統，該系統包含：藉由聚集方法與量子晶體來提供抗原或抗體相固化基材的單元、製備標記液並在分析物中標記病毒或抗體以藉由抗原抗體方法進行測量的單元、藉由表面電漿子(plasmon)激發法激發螢光標記的病毒或抗體的單元、以及在激發的螢光屏中計數螢光點以定量在分析物中病毒或抗體的單元。本發明係關於一種系統，該系統包含：a)金屬基材，係包含電漿子金屬複合物，在該電漿子金屬複合物上固定有第一抗原或第一抗體；b)由標記螢光材料形成的螢光標記物，係被構成為標記目標以形成經標記的目標，其中該經標記的目標被構成為與該第一抗原或該第一抗體形成抗原抗體反應；c)螢光成像，係被構成為藉由對經標記的目標照射激發光，並藉由顯微鏡觀察被激發的螢光圖像以製作該經標記的目標之螢光圖像；d)計數螢光點並量化目標；其中該系統被構成為藉由螢光計數以檢測分析物中的目標。
一實施態樣係關於一種系統，係包含：a)相固化基材，係包含金屬基材、以及凝聚的電漿子金屬複合物，其中在該凝聚的電漿子金屬複合物上係固定有第一抗原或第一抗體；b)由標記螢光材料組成之螢光標記單元，係被構成 為標記目標以形成經標記的目標；c)螢光成像單元，係被構成為藉由對經標記的目標照射激發光，並藉由顯微鏡觀察被激發的螢光圖像以製作該經標記的目標之螢光圖像；d)計數單元，對螢光點進行計數並量化該目標；其中該系統被構成為藉由螢光計數檢測分析物中的該目標。
在一實施態樣中，該相固化基材被構成為由相固化單元形成，其中該相固化單元包含該第一抗原或該第一抗體的緩衝液及電漿子金屬複合物溶液，該緩衝液的pH值約為7以上，並且該金屬基材具有大於該電漿子金屬複合物溶液的電極電位。
在一實施態樣中，該金屬基材包含金屬粉末。
在一實施態樣中，該電漿子金屬複合物溶液在1000至5000ppm的範圍內。
在一實施態樣中，該相固化單元係被滴在金屬基材上以形成凝聚的電漿子金屬複合物，並且以吹氣裝置之吹氣阻止凝聚的電漿子金屬複合物在金屬基材上聚集。
在一實施態樣中，該凝聚的電漿子金屬複合物彼此實質上沒有聚集。
在一實施態樣中，該目標係被構成為與固定在該凝聚的電漿子金屬複合物上的該第一抗原或該第一抗體形成抗原抗體反應。
在一實施態樣中，該螢光標記單元係滴在金屬基材上以形成附著有凝聚的電漿子金屬複合物之經標記的目標。
在一實施態樣中，該螢光成像單元包含用以照射激發光之光源，該激發光所具有之波長範圍係適合於附著有凝聚的電漿子金屬複合物的經標記 的目標發出螢光。
在一實施態樣中，該計數單元係被構成為將螢光圖像二值化以採用螢光點並對螢光點進行定量計數。
在一實施態樣中，該螢光圖像係以分析條件進行二值化，該分析條件包含螢光圖像中的螢光點的亮度、面積及圓度中的一個以上。
在一實施態樣中，該分析條件包含螢光圖像中的亮度及面積。
在一實施態樣中，目標包含抗原或抗體。
在一實施態樣中，目標係藉由夾層法(sandwich method)、直接法(direct method)或間接法(indirect method)進行標記。
在一實施態樣中，該系統被構成為檢測多於一種類型的目標。
在一實施態樣中，目標包含病毒，該病毒包含流感病毒及/或COVID-19病毒。
在一實施態樣中，該系統包含被配置為標記螢光材料的過濾器，該標記螢光材具有取決於該目標而不同的波段(wave range)。
一實施態樣係關於一種方法，係包含下列步驟：a)使第一抗原或第一抗體的緩衝液與電漿子金屬複合物溶液凝聚；b)形成相固化基材，該相固化基材包含金屬基材、以及凝聚的電漿子金屬複合物，其中在該凝聚的電漿子金屬複合物上係具有經固定的第一抗原或第一抗體；c)使目標與在凝聚的電漿子金屬複合物上的該固定的第一抗原或該固定的第一抗體形成抗原抗體反應；d)形成附著有該凝聚電漿子金屬複合物之經標記的目標，其中該經標記的目標包含目標及標記螢光材料；d)藉由照射激發光而製作經標記的目標之螢光圖像；e)以顯微鏡觀察螢光圖像；f)計數螢光點；g)量化該目標。
一實施態樣係關於一種檢測COVID-19的方法，係包含：a)使第一 抗原或第一抗體的緩衝液與電漿子金屬複合物溶液凝聚；b)形成相固化基材，該相固化基材係包含金屬基材、以及凝聚的電漿子金屬複合物，其中在凝聚的電漿子金屬複合物上係具有經固定的第一抗原或第一抗體；c)使COVID-19目標與在凝聚的電漿子金屬複合物上的該固定的第一抗原或該固定的第一抗體形成抗原抗體反應；d)形成附著有該電漿子金屬複合物之經標記的COVID-19目標，其中該經標記的COVID-19目標包含COVID-19目標及標記螢光材料；d)藉由照射激發光而製作經標記的COVID-19目標之螢光圖像；e)以顯微鏡觀察螢光圖像；f)計數螢光點；g)量化該COVID-19目標。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，該相固化基材係被構成為由相固化單元構成，該相固化單元包含第一抗原或第一抗體的緩衝液及電漿子金屬複合物溶液，緩衝液具有約7以上的pH值，並且金屬基材具有大於電漿子金屬複合物溶液的電極電位。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，金屬基材包含金屬粉末。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，該電漿子金屬複合物溶液在1000至5000ppm的範圍內。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，相固化單元係被滴到金屬基材上，並進行凝聚以形成具有經固定的第一抗原或固定的第一抗體之凝聚的電漿子金屬複合物，並且以吹氣裝置之吹氣阻止凝聚的電漿子金屬複合物在金屬基材上聚集。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，該凝聚的電漿子金屬複合物彼此實質上沒有聚集。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，由標記螢光材料組成的螢光 標記單元係被構成為標記COVID-19目標，以形成經標記的COVID-19目標，其中該螢光標記單元係被滴在金屬基材上形成附著在凝聚的電漿子金屬複合物上的經標記的COVID-19目標。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，螢光成像單元係被構成為製作螢光圖像，其中該螢光成像單元包含用以照射激發光的光源，該激發光所具有之波長範圍係適合於附著有凝聚的電漿子金屬複合物的經標記的目標發出螢光。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，螢光計數單元係被構成為對螢光點進行計數。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，該螢光計數單元係被構成為將螢光圖像二值化以採用螢光點並對螢光點進行定量計數。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，該螢光圖像係以分析條件進行二值化，該分析條件包含螢光圖像中的螢光點的亮度、面積及圓度中的一個以上。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，該分析條件包含螢光圖像中的亮度及面積。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，該COVID-19目標包含抗原或抗體。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，該方法兼容檢測COVID-19目標及第二個目標。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，第二個目標包含病毒，該病毒包含流感病毒。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，藉由夾層法、直接法或間接法標記 COVID-19目標及/或第二目標。
在COVID-19檢測的一實施態樣中，該標記螢光材料根據COVID-19目標及第二目標具有不同的波長範圍。
一實施態樣係關於一種藉由螢光計數對待測分析物中的抗原或抗體進行定量的系統，包含：1)用以製備相固化基材的相固化單元，在該相固化基材上抗體或抗原與電漿子金屬複合物量子晶體凝聚在金屬基材上；2)螢光標記單元，係用以製備由標記螢光材料及待測分析物中的抗體或抗原組成之標記液，並將標記液滴在相固化基材上再藉由抗原抗體反應製成測量晶片；3)螢光成像單元，係藉由對作為測量目標的測量晶片上之經標記的抗體或抗原照射激發光而製造經標記的抗體或抗原的螢光圖像，並利用螢光顯微鏡觀察該激發的螢光圖像；4)計數單元，係計數在該激發的螢光圖像中某一選定區域的螢光點之數量；5)輸送工具，係將基材從第一相固化單元的第一位置輸送到最終計數單元的最終位置。
在一實施態樣中，該相固化單元包含：將預定量的滅活抗原或抗體的緩衝液與預定量的水性電漿子金屬複合物溶液混合而製備相固化液之混合器；具有大於電漿子金屬複合物的基(低)電極電位之金屬基材；用於將定量的相固化液滴到金屬基材上的壓縮注射器；以及藉由在預定時間經過後去除金屬基材上的相固化液而阻止水性電漿子金屬複合物溶液在金屬基材上聚集的吹氣裝置。
在一實施態樣中，該螢光標記單元包含：用以製備含有分析物中待標記之抗原或抗體的標記液的混合器；用以將預定量的標記液滴在相固化基材上，而使經標記的抗原或抗體與固化在基材上的抗體或抗原結合之壓縮注射 器；以及藉由洗滌器及吹氣機將未結合的標記液從基材上洗掉之洗滌及乾燥裝置。
在一實施態樣中，該螢光成像單元包含：用以照射激發光的光源，該激發光具有適合於標記該測量晶片上的病毒或抗體的螢光物質之波長範圍，並藉由該激發光激發帶有電漿子金屬量子晶體的標記螢光物質的螢光；以及藉由自動聚焦螢光圖像觀察測量晶片上的螢光圖像之螢光顯微鏡。
在一實施態樣中，螢光計數係指在螢光圖像中選擇至少一個區域，將所選區域的螢光點二值化以採用等於或大於預定閾值的一個以上螢光點，並且計數螢光點數的定量方法。
在一實施態樣中，該相固化單元係為了產生抗體或抗原固化的基材，而使用基本中性pH範圍內的相固化液、以及含有滅活病毒或抗體的中性pH或更高pH的緩衝液，並固化在金屬基材上，其中，該相固化液係由1000至5000ppm，較佳為2000至4000ppm的電漿子金屬複合物水溶液形成者，電漿子金屬複合物的量子晶體係實質上分散及聚集在該基材的測量區域中以製成合適的基材，並與待測抗原或抗體結合進行檢測。
在一實施態樣中，為了在螢光圖像的所有螢光點中採用或選擇合適的螢光點，利用選自亮度、面積及圓度中的分析條件對螢光圖像中的螢光點進行二值化。
一實施態樣係關於一種利用抗原抗體反應定量分析物中待測抗原或抗體的方法，係包含下列步驟：1)將抗體或抗原固化在金屬基材上以製成相固化基材；2)將待測抗體或抗原與螢光物質混合製成螢光標記液，藉由抗原抗體反應將待測抗原或抗體與標記液進行螢光標記；3)對經標記的抗原或抗體製作螢光圖像，並 用螢光顯微鏡觀察螢光圖像；4)計數在被觀察的螢光圖像中某一選定區域的螢光點數，其中，相固化液係由1000至5000ppm，較佳為2000至4000ppm的電漿子金屬複合物水溶液的混合物及含有滅活病毒或抗體的基本中性緩衝液組成，並被固化在金屬基材上。
在一實施態樣中，分析物中的測定對象為來自患者的分析物中的滅活病毒或其抗體，且分析物中的濃度為10μg/ml以上。
在一實施態樣中，該螢光標記係以基於選自由下列方法所構成之群組的方法所進行者：夾層法1)抗原被夾在相固化基材上的抗體及標記液中待標記的抗體之間、直接法2)病毒抗原或抗體係由標記抗體或標記抗原直接標記、以及間接法3)病毒抗原或抗體係由抗體及二級抗體標記。
在一實施態樣中，該螢光的表面電漿子激發是根據激發光照射在與抗原或抗體一起凝聚在相凝聚基材上的量子晶體上而進行。
在一實施態樣中，該螢光計數步驟係藉由螢光顯微鏡對測量圖像的一個以上視野(field)進行，並且在對螢光點進行二值化之後，進行等於或大於預定亮度值的螢光點的計數。
一實施態樣係關於一種用於鑑定及定量分析物中待測的兩種以上抗原或抗體的方法，係包含下列步驟：提供相固化基材的步驟，係藉由將兩種以上滅活抗原或抗體與水性電漿子金屬溶液混合而製成相固化液，將相固化液滴在金屬基材上，而使待固化的抗原或抗體與電漿子金屬複合物的量子晶體聚集；提供分析物中含有待測抗原或抗體的標記液的步驟；螢光標記步驟，係，將標記液滴在固化有抗體或抗原的基材上並藉由抗原抗體反應用兩種以上的螢光物質標記抗原或抗體；螢光激發及觀察一種抗原或抗體的螢光圖像之一的步驟， 係藉由選擇及照射一種以上的激發光，該激發光所具有之螢光波長係對應於一種以上用以標記待測抗原或抗體的螢光；以及螢光計數步驟，係對被觀察的螢光圖像中之每種色調的螢光點數進行計數。
在一實施態樣中，可同時區分及定量兩種以上抗原或抗體。
在一實施態樣中，1000ppm至5000ppm，較佳為2000至4000ppm的電漿子金屬複合物水溶液與含有滅活病毒或其抗體的中性或更高之緩衝液的混合物係用作固化抗體或抗原的相固化液，並且量子晶體係實質上分散及聚集以形成良好的基材之測量區域。
在一實施態樣中，兩種以上不同的病毒是流感病毒及Covid-19，標記抗體的不同螢光波長係用於檢測兩種病毒中的任一種。
本專利或申請文件至少包含至少一張彩色圖式。本專利或專利申請公開所帶有之彩色圖式的副本將由專利局根據要求及支付必要費用提供。
圖1顯示了使用量子晶體(夾層法)之抗原抗體反應及使用螢光標記之螢光測定的示意圖。當第一種方法(夾層法)被用於本發明的螢光標記步驟時，其包括步驟(1)至(4)。在固相步驟(1)中，將銀(Ag)試劑及病毒抗體混合並滴到金屬基材上，同時藉由量子晶體聚集在金屬基材上固化抗體。然後，在標記步驟(2)中，將被標記病毒的抗體與樣本混合，藉由抗原抗體反應使樣本中含有的病毒抗原與標記抗體形成複合物。然後，在步驟(3)中，上述複合物藉由抗原抗體反應與基材上的抗體結合並進行標記，而未結合的複合物、抗體等則用緩衝液等洗去。步驟(4)中，照射與抗體的標記物(螢光物質)匹配的光源光以激發標記物發 螢光，藉由螢光顯微鏡或螢光讀取器檢測螢光。
圖2A顯示了用以在液體中反應之使用量子晶體(夾層法)之抗原抗體反應及螢光測量方法的示意圖。當使用金屬粉末代替金屬基材時係包括下列步驟(1)至(3)：在步驟(1)中，將銀試劑及抗體混合到粉末狀基材中，藉由形成在金屬粉末中的量子晶體固定抗體。然後，在步驟(2)中，將標記的病毒抗體與樣本混合，藉由抗原抗體反應使樣本中含有的病毒抗原與標記抗體形成複合物。在步驟(3)中，將步驟(1)製備的溶液及步驟(2)製備的溶液混合後，藉由抗原抗體反應使複合物與金屬粉末上的抗體結合。
圖2B顯示了用以在液體中反應之使用量子晶體(夾層法)之抗原抗體反應及螢光測量方法的示意圖。當使用金屬粉末代替金屬基材時係包括步驟(4)至(5)：步驟(4)中，將步驟(3)製備的溶液藉由不織布纖維等過濾而僅取出金屬粉末，用緩衝液等洗滌金屬粉末以洗去未結合的複合物、抗體等。步驟(5)中，照射與抗體標記物(螢光物質)匹配的光源光以激發標記物發螢光，並藉由螢光讀取器檢測螢光。
圖3顯示了使用量子晶體(間接法)的抗原抗體反應的示意圖。當本發明的螢光標記步驟使用第二種方法(間接法)時包括步驟(1)至(4)。在步驟(1)中，將銀試劑及部分病毒抗原或病毒混合並滴到金屬基材上，藉由形成在金屬基材上的量子晶體的聚集使抗原固化。在步驟(2)中，當滴入含有抗病毒抗原或部分病毒的抗體的血液時，基材上的抗原與血液中的抗體藉由抗原抗體反應結合。步驟(3)中，當標記的二級抗體滴入測量晶片時，基材上的抗體與標記的二級抗體結合。未結合之標記的二級抗體使用緩衝液等洗掉。在此，與抗體結合的抗體被稱為二級抗體。步驟(4)中，照射與二級抗體標記物(螢光物質)匹配的光源光以激 發標記物發螢光。此是藉由螢光顯微鏡檢測。
圖4顯示了在磷青銅板上開溝槽(蝕刻)。保持量子晶體面積值恆定。過程圖顯示本發明量子晶體基材的製造方法，在步驟(1)中，在圓形磷青銅板的內側設置一個圓形溝槽。在厚度為0.2mm(直徑為12mm的圓)的磷青銅板內，插入直徑為8mm的圓形溝槽，使溝槽深約0.1mm，寬約0.2mm。步驟(2)中，對磷青銅板表面進行拋光以去除表面的氧化膜。就去除方法而言，有用紙拋光作為物理處理的方法，以及就另一種拋光方法而言，有藉由電解拋光或使用電極的化學試劑溶解表面的化學拋光方法。步驟(3)中，將銀試劑滴入拋光後的磷青銅板的溝槽中。當銀試劑滴入溝槽內時，試劑由於溝槽的表面張力而停留在圓圈內。在步驟(4)中，滴入的銀試劑停留在溝槽內，從而產生溝槽面積部分的量子晶體。由於可以在同一區域形成量子晶體，因此可以提供恆定的量子晶體基材。
圖5顯示藉由使用量子晶體(夾層法)的抗原抗體反應來增加螢光靈敏性的方法。示意圖顯示使用能夠相互結合的第一標記抗體及第二標記抗體檢測病毒的方法，該等抗體係如本發明的螢光標記方法的第一種及第二種方法的標記抗體，在步驟(1)中，將銀試劑及病毒抗體混合並滴在金屬基材上。抗體固化在形成於金屬基材上的量子晶體上。在步驟(2)中，當標記一級抗體、二級抗體及樣本混合時，藉由抗原抗體反應形成病毒抗原及樣本所含之標記抗體的複合物。在步驟(3)中，當標記的一級抗體、二級抗體及抗原的複合物滴在測量晶片上時，複合物藉由抗原抗體反應與基材上的抗體結合。未結合的複合物或抗體應以緩衝液或其他合適的介質洗掉。步驟(4)中，照射與一級抗體及二級抗體標記物(螢光物質)匹配的光源光以激發標記物發螢光。此是藉由螢光顯微鏡或螢光讀取器檢測。
圖6顯示流感病毒的測量圖像。本發明的螢光圖像顯示存在流感病毒時的螢光圖像(a)、及不存在流感病毒時的螢光圖像(b)。使用的儀器：Keyence螢光顯微鏡BZ-X710，光源：80W金屬鹵化物燈，螢光過濾器：BZ-X過濾器GFP(525±25)，分析軟體：BZ-X Analyzer。
圖7顯示藉由本發明的螢光計數數目進行流感病毒定量時的圖。此處，計數數目*是指從獲得的圖像藉由分析軟體“BZ-X Analyzer”將等於或大於閾值57的亮度值二值化而獲得的計數數目。空白(病毒量級0μg/ml)計算為計數0。
圖8A為本發明之螢光計數方法的過程自動化系統的說明圖，顯示過程自動化系統係由前處理自動化裝置A及螢光圖像計數自動化裝置B組成，前處理自動化裝置A係由固相過程、標記過程及洗滌過程組成，螢光圖像計數自動化裝置B由螢光激發過程及螢光圖像計數過程組成。(1)用銀試劑及抗體(或抗原)製備固相溶液。(2)用樣本抗原(樣本抗體)及標記抗體製備標記溶液。(3)將固相溶液滴到金屬基材上。(4)1分鐘後，用空氣吹掉殘留液體以停止凝聚。(5)滴加標記溶液。(6)在水中搖動並清洗尖端，用空氣吹掉剩餘的液體並乾燥。(7)裝置多個標記晶片並由裝載機輸送。分群過程(binning process)增加靈敏性。在多個視野中以物鏡全自動進行自動對焦及測量螢光圖像。(8)根據分析條件(亮度閾值、面積值、圓度等)測量螢光圖像。二值化及計數選定的螢光顆粒。
圖8B顯示本發明的自動化系統中固化過程之自動化系統概念圖，係包含：包括螢光銀試劑及抗體之第一液體製備步驟(1)、將第一液體滴到基材上之固化步驟(3)、以及一分鐘後藉由吹氣吹掉殘留液體之完成步驟(4)。
圖8B及8C顯示本發明的自動化系統中標記過程之自動化系統概念圖，係顯示：(2)包括抗原及標記抗體之第二液體製備步驟、第二液體被滴到 基材上之標記步驟(5)、以及水洗後藉由吹氣乾燥第二液體之洗滌步驟(6)。
圖8D顯示出本發明之螢光圖像計數自動化系統的示意圖，顯示該系統包括：螢光激發步驟(7)及螢光圖像計數步驟(8)。步驟(7)是獲得螢光激發圖像8D。多個晶片設置在托盤中，並由裝載機輸送，藉由分群過程(binning process)提高靈敏性及自動對焦。步驟(8)是螢光圖像中螢光點的採用(誤差分辨率)。分析條件是亮度閾值、面積值、圓度等，在物鏡的多視野下藉由螢光圖像的自動測量計數經二值化且選擇的螢光點。
圖9-1顯示各種量子晶體固相基材的25000×SEM圖，SEM圖分別為(a)含有2000ppm銀試劑(硫代硫酸銀水溶液)及磷酸鹽緩衝液的固相基材；(b)含有2000ppm銀試劑及含有流感抗體(50μg/ml)的磷酸鹽緩衝液的固相基材；(c)含有2000ppm銀試劑及含有流感病毒(50μg/ml)的磷酸鹽緩衝液的固相基材。
圖9-2顯示表示各固相基材的量子結晶狀態及成分分析結果的圖。該圖是使用4000ppm銀試劑(硫代硫酸銀水溶液)及磷酸鹽緩衝液的固相基材的SEM圖及成分分析圖。
圖9-3顯示使用4000ppm銀試劑及含有流感抗體(50μg/ml)的磷酸鹽緩衝液的固相基材的SEM圖及成分分析圖。
圖9-4顯示使用4000ppm銀試劑及含有流感病毒(50μg/ml)的磷酸鹽緩衝液的固相基材的SEM圖及成分分析圖。
圖10顯示基於流感的固相基材的製備方法圖(a)及固相基材的清晰的部分圖(b)。條件：量子晶體2000ppm，流感抗體(50μg/ml)。使用設備：儀器：Keyence Fluorescent Microscopy BZ-X710，光源：80W金屬鹵化物燈，分析軟體：BZ-X Analyzer。
圖11a顯示固相基材靈敏性的測試流程圖(a)，在第一步驟，將銀試劑及帶有FITC標記的流感病毒抗體混合，並滴在金屬基材上，抗體藉由聚集在金屬基材上的量子晶體固化；在第二步驟，照射與抗體標記物(螢光物質)匹配的光源光，藉由螢光激發標記物，並藉由螢光顯微鏡檢測螢光點。
圖11b顯示FITC流感抗體的各個濃度與螢光圖像中的螢光點的計數數目之間的相關性之圖。
圖12顯示表示流感抗體的固相與量子晶體濃度間之關係的圖。
圖13顯示了用於檢測的抗原抗體反應(直接法)。方法流程圖為藉由本發明的方法(直接法)進行滅活的流感病毒抗原之固相及螢光計數。在第一步驟中，將銀試劑及流感病毒抗原混合並滴在金屬基材上，病毒抗原藉由形成在金屬基材上的量子晶體固化以形成測量晶片；在第二步驟中，帶有FITC標記之流感病毒抗體溶液被滴在測量晶片上，病毒抗原及標記抗原結合在基材上。未結合的標記抗體用水或緩衝液洗滌。在第三步驟中，照射與抗體標記物(螢光物質)匹配的光源光，使標記物激發並發射螢光，並檢測其螢光點。
圖14顯示了用於檢測的抗原抗體反應的示意圖(夾層法)。方法流程圖顯示藉由本發明的方法(夾層法)對滅活的流感病毒抗原進行螢光計數，在第一步驟中，將銀試劑及流感病毒抗體混合並滴在金屬基材上，病毒抗體藉由形成在金屬基材上的量子晶體固化以形成測量晶片；在第二步驟中，將標記的流感病毒抗體及滅活的流感抗原混合而藉由抗原抗體反應形成複合物；在第三步驟中，將複合物滴在測量晶片上，使複合物與基材的抗體結合在基材上。未結合的複合物及抗體用水或緩衝液洗滌。在第四步驟中，照射與抗體的標記物(螢光物質)匹配的光源光，使標記物激發並發射螢光，並檢測其螢光點。
圖15顯示使用患者檢體並藉由本發明方法(夾層法)對滅活的Covid-19病毒進行螢光計數的方法流程圖，在第一步驟中，將銀試劑及Covid-19病毒試劑混合並滴在金屬基材上，病毒試劑藉由形成在金屬基材上的量子晶體固化以形成測量晶片。在第二步驟中，將標記的病毒抗體與滅活的Covid-19抗原混合，在抗原抗體反應中形成複合物。在第三步驟中，將複合物滴在測量晶片上，使複合物及基材的抗體結合在基材上。未結合的複合物及抗體用水或緩衝液洗滌。在第四步驟中，照射與抗體的標記物(螢光物質)匹配的光源光，使標記物激發並發射螢光，檢測其螢光點。
圖16顯示本發明之量子晶體固相螢光計數法的分析方法之示意圖，在第一步驟(1)中，病毒或其抗體均勻地固相於基材上，僅以一個10倍物鏡鏡頭拍攝(約3.5秒)。在第二步驟(2)中，對該圖像中的螢光點進行二值化，係將預定條件以上的螢光點進行計數的步驟。用10倍鏡頭拍攝，藉由二值化計數圖像中的光顆粒，並藉由計數量化病毒及抗體。
圖17顯示使用直接法之測量的示意圖。該圖包括使用本發明的滅活樣本之第三種方法(直接法)的步驟(1)至(7)，在第一步驟(1)中，滅活從人類收集到的樣本(唾液、痰、咽拭子、鼻咽液等)。在第二步驟(2)中，將銀試劑與樣本中的滅活抗原混合。在第三步驟(3)中，將滅活抗原及銀試劑的混合液滴在金屬基材上。在第四步驟(4)中，銀試劑的銀複合物與滅活的抗原一起聚集在基材上，而使抗原固化。在第五步驟(5)中，將標記的抗體滴下在在抗原已固化的基材上，以及在第六步驟(6)中，基材上的抗原及標記抗體藉由抗原抗體反應結合。另一方面，未結合的標記抗體用緩衝液或純水洗滌。在最後的第七步驟(7)中，顯示使用與抗體標記物(螢光物質)匹配的光源使標記物發射及激發螢光，並對其進行檢 測。
圖18顯示樣本滅活的示意圖。該圖包含使用本發明的樣本惰性採集套組的採集步驟(1)至(6)，在第一步驟(1)中，藉由含有乙醇的試管10及棒狀樣本採集部分(如紗布或不織布)20的套組採集樣本。第二步驟(2)顯示一個樣本採集示例。第三步驟(3)顯示將採集的樣本裝回到含有惰性溶液(例如乙醇)的試管中的情況。在第四步驟(4)中，將裝有樣本的樣本採集部分20插入到試管10的深處。由於試管的背面被加工成較小，樣本採集部分被壓縮，使樣本分散在滅活液體中。在第五步驟(5)中，試管內只留下採樣部分，並去除其餘部分。在第六步驟(6)中，將經滅活的檢體保存在試管中。
圖19A顯示使用本發明夾層法檢測2種病毒，其為檢測兩種病毒時，包含(1)固相過程及(2)螢光標記的製備過程之示意圖。
圖19B顯示本發明的夾層法，其為檢測2種病毒時，包含(3)螢光標記過程及(4)表面電漿子激發過程及螢光計數過程的示意圖。
圖20A顯示對比SEM圖，SEM圖係顯示使用本發明的銀試劑時量子晶體的聚集形式的pH影響，(a)是顯示在pH值為pH6(放大倍數50000×)情況下之聚集形式的SEM圖，(b)是顯示在pH值為pH7.4(放大倍數50000×)情況下之聚集形式的SEM圖。
圖20B顯示比較計數數目的表，該表顯示使用本發明的銀試劑時量子晶體的聚集形式的pH影響。
圖21顯示本發明對冠狀病毒(COVID-19)及流感病毒的檢測。
圖22顯示根據本發明的病毒檢測程序。將收集的樣本與乙醇混合，藉此可使該等被滅活，從而降低醫護人員感染的風險。滅活的樣本可以安全 地移動及運輸。在步驟(1)中，將與抗體混合的銀試劑滴到金屬基材上。抗體被固定形成在金屬基材上的量子晶體。在步驟2a中，將標記的病毒抗體與樣本混合。經由抗原抗體反應，樣本中所含的病毒抗原與標記的抗體形成複合物。在步驟2b中，將標記抗體及抗體的複合物滴在測量晶片上。抗原抗體反應將複合物與基材上的抗體結合。未結合的複合物及抗體等用緩衝液等洗掉。在步驟3中，將螢光激發的圖像及晶片放置在托盤中，藉由分群過程增加靈敏性及自動對焦以實現螢光圖像的自動測量。在計數自動化的步驟4中，螢光圖像中螢光點(誤差分辨率)係以分析條件(亮度閾值、面積值、圓度等)進行二值化而選擇，並計數經二值化的螢光點。
圖23顯示流感病毒的影像及定量檢測。藉由計數螢光的數目進行定量測量。藉由觀察螢光圖像識別螢光病毒。
圖24顯示量子晶體的SEM照片。
圖25顯示(a)UV強度與滅活時間之間的關係表、及(b)UV強度與距離之間的關係圖。
圖26顯示鼻拭子陽性及唾液陽性的(a)CV測試的相對值表(b)TEM圖。
定義及一般技術
為了簡單及清楚的說明，圖式顯示構造的一般方式，並且為了避免不必要地模糊本揭示，省略眾所周知的特徵、技術的描述及細節。此外，圖式中的元件不一定按比例繪製。例如，圖中一些元件的尺寸可能相對於其他元件被誇大以幫助 提高對本揭示之實施例的理解。不同圖式中相同的標記表示相同的元件。
說明書及申請專利範圍中的術語「第一」、「第二」、「第三」、「第四」等用於區分相似元件，不一定用於描述特定的順序或時間順序，應當理解如此使用的術語在適當的情況下是可互換的，使得在此描述的實施態樣例如且能夠以除了在此示出或以其他方式描述的那些之外的順序操作。此外，術語「包括」及「具有」及其任何變化旨在涵蓋非排他性的包含，使得包括元件列表的過程、方法、系統、物品、裝置或設備是不限於此等元件，而可包括未明確列出者或此類過程、方法、系統、物品、裝置或設備固有的其他元件。
說明書及申請專利範圍中的術語「左」、「右」、「前」、「後」、「頂」、「底」、「上」、「下」等，若存在則用於描述目的，不一定用於描述永久的相對位置。應當理解，如此使用的術語在適當的情況下是可互換的，使得本文描述的設備、方法及/或物品的實施態樣例如且能夠以除了在此示出或以其他方式描述的那些之外的順序進行操作。
除非明確說明，否則此處使用的任何元件、行為或指令均不應被解釋為關鍵或必要者。此外，如本文所用，冠詞「一個(a)」及「一個(an)」旨在包括項目，並且可以與「一個以上」互換使用。此外，如這裡所使用的，術語「集合」旨在包括項目(例如，相關項目、不相關項目、相關項目的組合及不相關項目等)，並且可以與「一個以上」互換使用。如果僅打算使用一項，則使用術語「一個」或類似的語言。此外，如本文所用，術語「具有(has)」、「具有(have)」、「具有(having)」等旨在是開放式術語。此外，除非另有明確說明，否則短語「基於」旨在表示「至少部分基於」。
如本文所定義，如果兩個以上元件由同一塊材料構成，則它們是 「一體的」。如本文所定義，如果每個元件由不同塊的材料組成，則兩個以上元件是「非一體的」。
如本文所定義，在一些實施態樣中，「實時(real-time)」可定義為相對於在觸發事件發生時盡可能快地執行的操作。觸發事件可以包括接收執行任務或以其他方式處理訊息所必需的數據。由於傳輸及/或計算速度中固有的延遲，術語「實時」包括「接近」實時發生的操作或從觸發事件稍微延遲的操作。在多個實施態樣中，「實時」可以意味著實時減去用於處理(例如，確定)及/或傳輸數據的時間延遲。具體的時間延遲可以根據數據的類型及/或數量、硬體的處理速度、通訊硬體的傳輸能力、傳輸距離等而變化。然而，在許多實施態樣中，時間延遲可以是少於大約一秒、兩秒、五秒或十秒。
本發明可以在不脫離其精神或特徵的情況下以其他特定形式實施。所描述的實施態樣在所有方面都應被視為說明性而非限制性者。因此，本發明的範圍由所附申請專利範圍而不是由前述說明書指示。落入申請專利範圍的等效含義及範圍內的所有變化都應包含在其範圍內。如本文所定義，在一些實施態樣中，「大約(approximately)」或「約(about)」可表示在所述值的正負百分之十以內。在其他實施態樣中，「大約」或「約」可以表示在所述值的正負百分之五以內。在進一步的實施態樣中，「大約」或「約」可以表示在所述值的正負百分之三以內。在其他實施態樣中，「大約」或「約」可以表示在所述值的正負百分之一以內。
除非本文另有定義，否則與本發明相關的科學及技術術語應具有所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數術語應包括複數，而複數術語應包括單數。通常，與本文描述的健康監測相關使用的命 名法及技術是本領域公知及常用者。
本發明的方法及技術通常根據本領域公知的常規方法進行，並且如在本說明書通篇引用及討論的各種一般性及更具體的參考文獻中所描述，除非另有說明。與本文實施態樣以及本文描述的其他相關領域相關聯使用的命名法以及過程及技術是本領域公知的及常用者。
螢光抗體是一種使用特異性識別抗原的抗體來檢查組織及細胞中抗原分佈的方法。在該方法中，藉由依序使用一級抗體(primary antibody)及二級抗體(secondary antibody)，觀察一級抗體在組織、細胞中的分佈，亦即，經一級抗體識別的抗原的分佈係透過螢光標記的二級抗體的分佈而觀察。然而，要在組織及細胞系統外使用如此之方法，從患者身上採集的樣本中的病毒必須在組織及細胞系統外固化或固定。此外，本發明的發明人了解到，即使病毒可以在一段時間內作為樣本轉化為固相，但在轉化為固相的樣本之間往往存在偽樣本，此引起非特異性反應(測量對像以外的某些生物成分與測量試劑、採血管的添加劑等成分發生異常反應，而顯示出與病理性相距甚遠的測量值的現象)，從而降低測量準確度。
本發明人進行了廣泛的研究。結果發現，當利用電漿子金屬複合物的量子晶體聚集方法時，病毒抗原在量子晶體聚集過程中同時聚集及固化在金屬基材上。然後發現，當固相病毒被螢光標記時，藉由同時聚集的電漿子金屬複合物的表面電漿子增強作用，病毒的螢光在螢光圖像中以點或點的形式出現，並且病毒的數量可以計算為點狀螢光數(以下簡稱螢光計數法)。此外，亦發現在如此之螢光計數法中，可以消除或減輕螢光抗體法可能發生的非特異性反應，其結果如圖20B所示，顯著地提高準確度。
如本文所用，術語「凝聚(coagulation)」被定義為形成粒子的電漿子金屬複合物的集合。凝聚是由電漿子金屬複合物溶液與pH值為7以上的緩衝液混合所致。術語凝聚或聚集(aggregation)在整個說明書中可互換使用。
如本文所用，術語「聚集」被定義為顆粒的混雜集合。在聚集過程中，此等含有凝聚的電漿子金屬複合物的顆粒聚集在一起形成團塊。如圖20A(a)所示，顆粒呈現聚集，然而在圖20A(b)中，含有凝聚的電漿子金屬複合物的顆粒實質上沒有聚集。
術語「實質上沒有」定義為少於50%的凝聚的電漿子金屬複合物聚集形成團塊。在一些實施態樣中，聚集可為小於60%的凝聚的電漿子金屬複合物。在另一實施態樣中，聚集可為小於70%的凝聚的電漿子金屬複合物。又在另一實施態樣中，聚集可為小於80%的凝聚的電漿子金屬複合物。
在一實施態樣中，本發明提供了一種新穎的螢光計數系統，該系統係用於對螢光圖像中分析物的螢光點或粒子(病毒或由病毒產生之在人體或動物體內具有免疫功能的抗體)進行定量。
1)首先，可以進行固相製備過程以提供固化的基材，其中滅活的病毒或其抗體在電極電位差下與電漿子金屬複合物一起聚集在金屬基材上，並與電漿子金屬複合物一起固定在金屬基材上。
2)其次，藉由抗原抗體反應，被分析物中待測的病毒或抗體可以被固定在固化基材上的病毒或抗體捕獲，並可以藉由抗原抗體反應進行螢光標記，
3)第三，藉由激發光的照射，可以藉由量子晶體的表面電漿子激發作用激發經螢光標記的病毒或抗體，
4)第四，螢光計數過程可以藉由包括以下單元的系統來執行：將獲得的螢光 圖像中的螢光點或顆粒二值化以選擇具有預定閾值以上的螢光點或顆粒，然後對該螢光點或顆粒進行計數。
根據本發明，在第一固相過程中，病毒抗原或其抗體被固化。在凝聚過程中，量子晶體(50至150nm的電漿子金屬複合物晶體；下同)及抗原或抗體(通常用緩衝液稀釋，下同)經常發生凝聚(藉由電極電位聚集在金屬基材上，與藉由量子晶體聚集方法不同)。
在一實施態樣中，在第二螢光標記過程中藉由混合病毒抗原(通常以乙醇等滅活，在某些情況下以緩衝液稀釋，下同)及標記抗體(以磷標記，通常以緩衝液稀釋，下同)混合進行標記。此螢光標記過程由於抗原夾在要被滴在固相基材上的抗體及標記抗體之間，因此在典型的抗原抗體反應中被稱為夾層法。
在另一實施態樣中，螢光標記過程可以直接法的基礎上進行，或者抗體固化後用標記抗原(包括標記抗原的一部分的螢光材料，下同)進行標記，直接法係在病毒抗原固化後用標記抗體進行標記。
在另一實施態樣中，螢光標記過程可以按照間接法進行，亦即，固化病毒抗原，然後依序結合抗體及二級抗體，或者固化抗體然後結合病毒抗原，最後將抗體及二級抗體依序結合進行標記。
在一實施態樣中，本發明藉由有效地使經抗原抗體反應捕獲的病毒或與其抗體結合的標記螢光分子受到被同時固化的電漿子金屬複合物的表面電漿子激發，而可藉由計算螢光斑點或螢光點數量來量化如病毒之分析物。
在一實施態樣中，本發明具有藉由螢光顯微鏡觀察到螢光圖像中以點狀或顆粒狀出現的螢光訊號的特徵。因此，當點狀訊號可以二值化計數等於或大於預定閾值的螢光斑點或顆粒時，此與病毒數量及抗體數量相關聯，從而可 以準確定量病毒及抗體，如圖16所示。
在一實施態樣中，與使用金膜電極表面的傳統固相基材相比，在不需要微通道的情況下也可以消除由於非特異性反應引起的螢光訊號的偽性質。
本發明螢光計數法與傳統螢光光譜法(SPFS)的區別可能在於後者是由金薄膜上的有機分子固化，而本發明是由電漿子金屬複合物量子晶體的聚集固化。
再者，傳統方法中用於分析物的固相技術很繁雜。在傳統方法中，微通道被用作高效的反應促進技術。然而，此微通道的使用導致測量變得複雜及困難。在本發明中，藉由電漿子金屬複合物的量子晶體的聚集可以容易且快速地獲得病毒測量所需的固相。亦即，易於在反應場中固化抗體或抗原，並且可提供一種即使不使用微通道也能夠進行高度可再現的表面電漿子激發增強的螢光光譜法(SPFS)的新方法。本發明的螢光點計數法與傳統的螢光強度定量法相比，前一種方法優於後一種方法，螢光計數精度更高，過程更簡單。
本發明人等亦測試了在專利文獻1(日本專利公開號2016-80565)所示的抗體相固化基材上使用拉曼法檢測伊波拉病毒，但未能檢測到伊波拉病毒，因為伊波拉病毒無法在沒有緩衝液的情況下，藉由量子晶體的聚集而以良好的狀態被捕獲在基材上，並且藉由拉曼散射法沒有得到結果。
(與PCR相比的定量差異)
本發明的螢光計數法也是一種有價值的定量檢測，可以讓我們了解病情的發病、進展及治癒的當前狀態，而定性的PCR法僅適用於檢測病毒情況是陽性還是陰性。此外，與檢測免疫抗體的免疫層析法不同，藉由螢光計數對病毒量進行 定量，可以快速準確地判斷是否感染。
(螢光計數的意義顯著性)
本發明的螢光計數方法在病毒及抗體的檢測中具有優良的定量性。例如，當流感病毒藉由抗原抗體反應(例如夾層法)進行螢光光譜分析時，當病毒存在時，測得的圖像會發出大量顆粒狀的螢光點，如此之顆粒狀的螢光點是夾住病毒夾之標記抗體的螢光，當計數超過一定閾值的螢光粒子時與病毒數量相關(圖6(a))，且新發現無病毒時不會出現大量顆粒狀螢光點(圖6(b))。
在一實施態樣中，溶液中的電漿子金屬複合物藉由電極電位的選擇，在具有還原電位附近的電極電位的金屬基材上凝聚為金屬複合物的量子晶體(以下，稱為量子晶體凝聚法)，當抗原或抗體共存於溶液中時，抗原或抗體與金屬複合物一起凝聚在基材或顆粒上，形成凝聚的電漿子反應場。因此，不同於傳統的電漿子體金屬薄膜，本發明的約100nm左右的金屬複合物晶體規則排列，抗原或抗體在量子晶體之間以一定間隔物理性或化學性固化，從而獲得了形成類似微通道的結構，可以增強表面電漿子的激發。
在本發明的表面電漿子激發增強的螢光光譜(SPFS)方法的一實施態樣中，計數螢光顯微鏡觀察到的螢光斑點或螢光點的數量，進而藉由病毒的定量分析疾病，亦即，不僅可以根據有無病毒診斷疾病，還可根據病毒的數量診斷疾病程度。
(量子晶體凝聚的pH的影響)
在一實施態樣中，固相基材(量子晶體)的製備是由量子晶體與金屬基材的電位聚集所致，銀試劑與抗體緩衝液或抗原緩衝液混合時的pH值影響聚集現象。
此量子晶體聚集體的pH的影響與聚集態螢光圖像中的量化之間的關係如下：
使用2000ppm左右的硫代硫酸銀水溶液作為製備量子晶體的銀試劑，通常將pH調整至6。另一方面，將pH 6的銀試劑與緩衝液混合以調整至pH 7.4及8.0時，pH 6.0的螢光點計數變小，而pH 7.4及8.0的螢光點計數變大。
此是由於量子晶體試劑的pH在沒有任何緩衝劑的情況下約為6，或者當加入pH6.0的緩衝劑時，量子晶體變成非常容易聚集的狀態，如圖20A(a)的SEM圖所示，而藉由添加緩衝液將pH調整至7.4及8.0時，量子晶體變為分散且精細的晶體，如圖20A(b)的SEM圖所示。
換言之，當pH為6且不添加任何物質下在基材上形成量子晶體時，在基材上形成堆疊成六邊形結構的三維晶體(圖20A(a))。然而，當緩衝液為pH7.4及抗體混合到量子晶體試劑中，使溶液的pH值達到約pH7以上並在基材上產生量子晶體時，晶體細粒上的晶體分散在基材上(圖20A(b))。由該量子晶體的SEM圖可知，溶液的pH值對於在固相基材產生量子晶體很重要。
在一實施態樣中，本發明提供一種新穎的固定分析物的螢光計數方法，該方法在表面電漿子激發增強的螢光光譜(SPFS)中藉由螢光顯微鏡觀察到的圖像擷取中表現優異，並且能夠藉由計數螢光圖像中螢光粒子的數量、病毒的存在與否以及計數的數量來分析疾病。
在一實施態樣中，本發明的方法中，固相基材係藉由使用量子晶體聚集使電漿子金屬複合物與抗體固化在一起，而具有表面電漿子激發效應，由表面電漿子所激發之標記複合物的螢光係透過激發光照射，而在其螢光圖像中作為顆粒螢光被觀察，並且可以檢測顆粒螢光的數量作為病毒量。
量子晶體聚集法是藉由電極電位的選擇，使溶液中的電漿子金屬複合物在具有還原電位附近的金屬基材上聚集成金屬複合物的量子晶體的方法(以下，稱 為量子晶體聚集方法)，當金屬複合物溶液中共存有抗原或抗體時，抗原或抗體與金屬複合物一起聚集在基材上，形成固化的電漿子反應場，約100nm的金屬複合物晶體之間以規律間隔排列進行物理性或化學性固化。
在本發明中，在上述藉由電漿子金屬量子晶體的聚集固化抗原或抗體的步驟中，將抗原及抗體保持在緩衝液中並與電漿子金屬複合物溶液(以下，通常為銀試劑)混合，已觀察到藉由銀試劑(例如，含有硫代硫酸銀溶液的銀複合物的水溶液)與含有滅活病毒或抗體的緩衝液混合的緩衝作用，兩者的pH值從酸性區域向中性或弱鹼性區域移動，量子晶體的聚集使抗原及抗體在基材上的固化變為理想狀態(定量抗原及抗體所需的狀態)(參見以下實施例「量子晶體聚集形式的pH影響」)。簡言之，本發明藉由量子晶體聚集的固化，與上述之在欲固化的金薄膜上利用有機分子的傳統方法相比，具有可以將抗原及抗體藉由計算螢光點更為量化之優點。
在一實施態樣中，使用電漿子金屬複合物的量子晶體聚集法固化抗原，並由於抗體與量子晶體間具有間隙或微通道之抗原固化基材反應，進一步使用經標記的二級抗體來標記抗體，因此抗原固化基材被用於檢測分析物中的抗體。
在一實施態樣中，可以使用金屬粉末代替金屬基材，如圖2A及圖2B所示。此時，經洗滌後，用激發光照射留下的複合物或經標記的二級抗體，藉由量子晶體的表面電漿子激發增強複合物或經標記的二級抗體的螢光，觀察其螢光圖像，並對圖像中顆粒螢光的數量進行計數及檢測。
在一實施態樣中，根據本發明，螢光標記步驟可藉由選自由包括夾層法、直接法及間接法組成的群組中之一種進行，但其中的夾層法中，通常使 用帶有螢光標記的抗體(一級抗體)夾住抗原。如果抗原以螢光標記的一級抗體及螢光標記的二級抗體輔助，則可以獲得更清晰的螢光圖像。
在一實施態樣中，根據本發明，不僅可以測量病毒抗原的螢光強度，還可以測量作為病毒濃度的病毒抗原的螢光數目。此外，由於形成基材的量子晶體在量子晶體之間具有奈米大小的間隙或微通道，形成光子的電漿子金屬粒子的自由電子與由激發光所致的量子晶體之間發生相互作用，從而表面電漿子激發增強每個複合物的螢光或二級標記的螢光強度不僅可以完全檢測，還可以藉由計數螢光點來檢測。因此，螢光計數法可以在SPFS法中使用，在2至5分鐘的短時間內進行快速檢測，從而可以代替PCR檢測提供高準確度的診斷結果。PCR測試需要複雜的前處理、對引子不敏感、程序多且測試耗時。與此相比，螢光數的計數對應病毒的數量以及疾病有無的判斷，從而可以判斷疾病是輕症或重症，因而為劃時代的醫學檢查方法。
在一實施態樣中，根據本發明，可以提供一種對特定病毒有效之產生在體內的抗體，並提供一種抗體檢查方法。螢光標記類似於抗原，並可使用夾層法、直接法及間接法。
在一實施態樣中，用於量化分析物中病毒或抗體的測量目標的方法包括下列步驟：1)藉由滅活病毒或其抗體的固相步驟產生固相基材，2)標記步驟，係將抗原抗體反應所固化的病毒或抗體進行螢光標記，3)螢光激發步驟，係用激發光照射螢光標記病毒或抗體以獲得由電漿子激發螢光標記的病毒或抗體的斑點狀螢光圖像，以及4)螢光計數步驟，係將螢光圖像中的至少1個視野所測得之螢光點或粒子二值化而採用具有預定閾值以上的螢光點或粒子，並對螢光點或粒子進行計數及量化。螢光評分與檢體中的病毒相關。
在一實施態樣中，在固相過程中，將滅活的病毒或其抗體採集在緩衝液中，並與1000ppm至5000ppm，較佳為2000至4000ppm，的電漿子金屬複合物水溶液混合，不進行中和並滴在金屬基材上。在螢光圖像中檢體中的病毒均勻地分散在固相中，可藉由一個視野測量進行準確的測量，無需獲得兩個以上視野的平均值。
在一實施態樣中，分析物中的固相對象是病毒(滅活者)或其抗體，其中該分析物的濃度為10μg/ml以上。藉由增加待固化的抗體濃度來提高固化的靈敏性。本發明中的「靈敏性」定義為陽性反應率=本發明方法陽性/PCR方法陽性的百分比(%)。
在一實施態樣中，本發明的螢光標記一般為夾層法，但也可採用直接法，直接法係將病毒抗原固化後用標記抗體進行標記，或將抗體固化後進行標記，然後再使用標記抗原(包括用螢光團標記的抗原及標記的部分抗原，下同)。
在直接法中，亦即，病毒抗體或病毒抗原係先被固化再將抗體及二級抗體依序結合及標記，或者先固化抗體再結合病毒抗原，最後將抗體及二級抗體依序結合及標記。
也可使用間接法。病毒抗原通常用乙醇等滅活並用緩衝液稀釋。較佳地，標記的抗體用螢光團標記並且通常用緩衝液稀釋。
在一實施態樣中，當用激發光對於金屬基材上凝聚在一起的100nm左右的電漿子金屬複合物量子晶體凝聚塊與抗原或抗體進行照射時，量子晶體發生表面電漿子激發現象，與量子晶體一起固化的病毒或抗體的螢光標記被激發。因此，具有較少非特異性反應測量的同時，藉由表面電漿子激發可精確地獲得具有預定閾值以上亮度值的點狀螢光數目，此與病毒或抗體濃度具有相 關性，變得可以定量測量。
在一實施態樣中，根據本發明的螢光計數步驟，獲得在1個視野測量的定量值相當於2個以上個視野測量的平均值之結果。這使得快速定量測量成為可行。
在固相過程中，與兩個以上不同病毒結合的抗體係在抗原抗體反應中被固化，並在標記過程中用不同螢光波長的標記抗體進行標記，從而能夠在一次測量中對分析物中的兩個以上的病毒進行定量。
在一實施態樣中，本揭露的發明應用於流感病毒及Covid-19病毒，可以在一次測量中分別檢測病毒。
在一實施態樣中，如圖8A至圖8D所示，可以提供一種用以藉由螢光計數定量分析物中待測抗原或抗體的系統，該系統包括：1)相固化單元，係用於製作相固化基材，抗體或抗原與電漿子金屬複合物量子晶體凝聚在金屬基材上；2)螢光標記單元，係用於將螢光材料與分析物中待測的抗體或抗原製成標記液，並將標記液滴在相固化基材上，藉由抗原抗體反應製作測量晶片；3)螢光成像單元，係藉由向作為測量目標的測量晶片上的標記抗體或抗原照射激發光而製作螢光圖像，並藉由螢光顯微鏡觀察激發的螢光圖像；4)計數單元，係在激發的螢光圖像中某一選定區域計數螢光點的數目；以及5)輸送工具，係用以將基材從第一位置輸送到最終位置。
在一實施態樣中，1)相固化單元係包括：混合器，係用於將預定量的滅活抗原或抗體的緩衝液與預定量的水性電漿子金屬複合物溶液混合以製備相固化液；金屬基材，係具有高於電漿子金屬複合物的基極(低)電極電位；注射器，係用於將定量的相固化液滴到金屬基材上的壓縮；以及吹氣裝置，係用於 在預定時間經過後去除金屬基材上的相固化液來阻止水性電漿子金屬複合物溶液的聚集。
在一實施態樣中，螢光標記單元包括：混合器，係用於在分析物中製備含有待標記抗原或抗體的標記液；壓縮注射器，係用於將預定量的標記液滴在相固化基材上以使標記的抗原或抗體與固化在基材上的抗體或抗原結合；以及洗滌及乾燥裝置，係用於藉由洗滌器及吹氣機將未結合的標記液從基材上洗掉。
在一實施態樣中，螢光成像單元包括：光源，係用於照射波長範圍適合測量晶片上標記病毒或抗體的螢光物質的激發光，並藉由激發光激發帶有電漿子金屬量子晶體的標記螢光物質的螢光；螢光顯微鏡，係藉由將螢光圖像自動聚焦以觀察測量晶片上的螢光圖像，其中，4)計數單元包括：用於選擇螢光圖像中的至少一個區域的手段、用於將所選區域的螢光點二值化以採用等於或大於預定閾值的一個以上螢光點的手段、以及計數螢光點數的定量手段。
在另一實施態樣中，藉由螢光計數定量分析物中抗原或抗體的系統較佳是設置相固化單元，該相固化單元使用由1000至5000ppm，較佳為2000至4000ppm的電漿子金屬複合物水溶液形成的實質上中性pH範圍內的相固化液，以及含有欲被固化在金屬基材上的滅活病毒或其抗體的中性pH以上的緩衝液，以製備抗體或抗原相固化基材，該抗體或抗原相固化基材中，在基材的測量區域中之電漿子金屬複合物的量子晶體係實質上分散及聚集，以製備合適的基材而與待測抗原或抗體結合用於檢測。進一步地，藉由螢光計數對分析物中待測抗原或抗體進行定量的系統較佳是設置螢光計數單元，螢光圖像中的螢光點係以選自亮度、面積及圓度中的分析條件進行二值化處理，以從螢光圖像中的所有點中 採用或選擇合適的螢光點。
在本發明中，使用量子晶體聚集法，並且可以藉由使用下述的各種材料在預定的金屬基材及金屬粉末上容易地製造固相基材。
(量子晶體聚集反應)
當銀複合物量子晶體凝聚為固相基材時，較佳使用銅及銅合金基材、磷青銅基材作為凝聚基材。
本發明的方法中使用的具有電漿子金屬量子晶體區域的基材被稱為蛋白質晶片(proteo chip)。該蛋白質晶片之製造方法如下：1)在電極電位(具較大電離傾向)低於形成複合物的金屬基材上，藉由電極電位差將金屬複合物的水溶液進行化學還原，以聚集量子晶體(奈米大小的金屬複合晶體)。在銀複合物的情況中，銀複合物的量子晶體是採用電極電位差電沉積方法，藉由將硫代硫酸銀水溶液聚集在低於銀的電極電位(大電離傾向)。更具體而言，水溶液中金屬複合物的密度主要應由要形成的量子晶體的大小決定，使用散射劑時應考慮，通常在100ppm至1000ppm的範圍內。但是，為了製備應為奈米簇的50至150nm的奈米大小，其取決含有抗原的病毒或病毒在抗病毒反應中產生的抗原，較佳是使用1000ppm的水溶液，較佳為2000至10000ppm，較佳為4000ppm。此外，在本發明的抗原及抗體的固相中，由於固相物與滅活溶液及緩衝液混合，且與量子晶體水溶液聚集在一起，不像僅來自量子晶體水溶液的聚集，量子晶體傾向於分散在固相基材上(見圖9-1(a)、(b)及(c))；2)以具有與負載金屬的電極電位E相關的方程式(I)所示的複合物穩定常數(logβ)以上之方式，選擇形成量子晶體的金屬複合物。
方程式(I)：E°=(RT/|Z|F)ln(βi)
其中，E°代表標準電極電位，R代表氣體常數，T代表絕對溫度，Z代表離子 數，F代表法拉第常數。
在此，當金屬複合物是選自金(Au)、銀(Ag)、鉑(Pt)或鈀(Pd)的電漿子金屬的複合物時，它對激發光具有局域表面電漿子共振增強作用。特別地，當金屬複合物是銀複合物時，其較佳是藉由穩定常數(形成常數)(logβi)為8以上的銀複合劑與鹵化銀反應而形成，鹵化銀較佳為氯化銀，複合劑較佳是選自硫代硫酸鹽、硫氰酸鹽、亞硫酸鹽、硫脲、碘化鉀、硫代水楊酸鹽及硫氰尿酸鹽中的一種。銀複合物具有包含平均直徑為5-20nm的奈米簇的量子點，導致量子晶體尺寸為50-150nm。
(固相濃度研究，第一部分)
在使用量子晶體的固相技術中，量子晶體試劑(銀試劑)的濃度非常重要。因此，生物素(Biotin)係藉由改變要固化的量子結晶試劑的濃度來固化，並且藉由螢光顯微鏡並以抗生物素蛋白(Avidin)-生物素鍵結檢測帶有FITC標記的抗生物素蛋白。
FITC-Avidin VEC,Inc.“螢光素抗生物素蛋白FLUORESCEIN AVIDIN D”CatNo.A-2001”。
生物素Biotin Wako“(+)-生物素"CatNo.023-08711。
製備固化有生物素(5μg/ml)及量子晶體濃度為1000、2000、3000、4000及5000ppm的固相基材(1分鐘固化時間)。接著，將FITC-Avidin(5μg/ml)滴在固化有生物素的基材上，使用Keyence Co.,Ltd.製造的螢光顯微鏡“BZ-X710”並以Avidin-Biotin鍵結檢測帶有FITC標記的Avidin，並計算獲得的螢光圖像的平均亮度值(反應時間1分鐘)。最後，可以得出生物素更固相，且在1000ppm(圖像的平均亮度值54)、2000ppm(69)、3000ppm(62)、4000ppm(59)及5000ppm(59) 中，FITC-Avidin鍵結的最高平均亮度為2000ppm之結論。可能的原因為如果量子晶體的量少，則固化的生物素量少，如果量子晶體的量大，則固化的生物素被掩蔽，從而檢測到較少的FITC-Avidin。
(固相濃度檢查，第二部分)
在使用抗原抗體反應檢測流感病毒中，亦檢驗了量子晶體劑的最佳濃度。
藉由改變要固化的量子晶體的濃度來固化流感抗體，並使用抗原抗體反應藉由螢光顯微鏡測量帶有流感病毒及FITC標記的流感抗體。從獲得的螢光圖像(抗原抗體反應-夾層法)計數螢光點。
流感抗體：Hytest“單株小鼠抗A型流感血凝素H1”CatNo.3AH1”
流感病毒：HyTest“A型流感(H1N1)病毒”CatNo.IN73-3”
FITC Influenza：ARP.公司製，Anti-Influenza A virus(H1N1)FITC“CatNo.12-6250-3”
將每個量子晶體濃度為2000、4000及6000ppm的等量流感抗體(100μg/ml)與緩衝液混合並滴在金屬基材上以形成相固化基材(固化時間為1分鐘)。
接下來，將滅活的流感病毒(10μg/ml)與FITC標記的流感抗體(25μg/ml)混合形成的複合物滴在固相基材上(反應時間1分鐘)，用水或緩衝液洗去未結合的複合物或FITC抗體。
用Keyence螢光顯微鏡“BZ-X710”測量晶片，並對所獲得的螢光圖像的預定閾值以上的螢光點進行計數。
結果，在具有2000ppm量子晶體(整體為1000ppm)的固化流感的情況下，可以檢測到最多的含有流感病毒的複合物，如同在抗生物素蛋白-生物素結合的情況。
當流感抗體在量子晶體濃度下固化時，2000、4000及6000ppm各濃度的圖像如圖12所示。
(量子晶體濃度(ppm)及計數)
2000(228個計數)、4000(159個計數)、6000(47個計數)
測量條件：閾值62，無模糊過濾器×10x鏡頭的一個視野測量(在此，與JP-A-2019-234330的情況不同，一個視野測量是指僅獲取尖端一部分的方法，如圖16所示，這導致測量時間的減少)。
用於測量每個量子晶體的設備如下。儀器：Keyence螢光顯微鏡BZ-X710，光源：金屬鹵化物燈80W，螢光過濾器：BZ-X過濾器GFP(525±25)，分析軟體：BZ-X Analyzer。
(固相化基材的調整)
除了量子晶體金屬複合物的水溶液，本發明的固相基材係藉由與含有病毒的滅活溶液及含有抗原的抗體混合，而具有不同的聚集作用，以固化成量子晶體的聚集，但基本上，為了製造電漿子金屬複合物的量子晶體，抗體或抗原可以使用量子晶體聚集法(JP 2016-197114A)固化。因此，本文引用並參考了JP-A-2016-197114中描述的方法。
然而，病毒及其產生的抗體被加入滅活溶液或緩衝液中，並與電漿子金屬複合物劑(例如硫代硫酸銀的水溶液)混合進行固化，並添加到固化的基材上進行聚集。
在藉由量子晶體固化抗原及抗體的情況中，與單獨使用量子晶體的情況不同，受到與緩衝液的相互作用及pH值變化的影響。
圖9將等體積的磷酸鹽緩衝液混合到2000ppm的硫代硫酸銀(銀試 劑)水溶液中作為對照(見圖9-1(a))。
藉由將抗體(流感抗體：ARP Anti-Influenza Avirus(H1N1)FITC")CatNo.12-6250-3)及抗原(滅活流感抗原：流感病毒：HyTest"A型流感(H1N1)病毒"CatNo.IN73-3")分別添加到磷酸鹽緩衝液使其成為50μg/ml，以及混合等量至2000ppm的硫代硫酸銀水溶液(銀試劑)獲得固相基材的SEM圖，與對照的固相基材的SEM圖進行比較(圖9-1(b)、(圖9-1(c))。
可以看出，當加入緩衝液時，量子晶體擴散到各處，抗體及抗原結合在量子晶體上形成固相。
量子晶體的此種分散聚集似乎創造了螢光圖像中的螢光點計數是可能的情況，因此當固化在基材上的抗原及抗體被標記時，藉由激發光的照射，複合物的螢光被表面電漿子激發，作為顆粒螢光可觀察到的顆粒螢光的數量可以被檢測為螢光圖像中的病毒數量。
如圖9-2、圖9-3及圖9-4所示，此是由於在磷青銅基材的Cu、Sn成分以外的各量子晶體中均檢測觀察到銀成分，可以確認固相形成是由量子晶體銀複合物所進行。須注意，未檢測到抗體及抗原。
(流感抗體固相基材的製備及靈敏性)
當上述2000ppm(pH5.2)的硫酸銀溶液(銀試劑)及流感抗體(50μg/L)的0.1mol/L蛋白質緩衝液(pH7.4)等體積混合溶液(pH7.2)加入到光青銅板上，固化約一分鐘，使金屬板上剩餘的液體被空氣吹走，以得到抗體固化板(圖10(a))。
圖10B顯示了固相基材的清晰部分的圖像。
使用上述量子晶體聚集法改變濃度的帶有FITC標記的流感抗體係被固化而製成抗體固化基材，並對獲得的每個螢光圖像的螢光點進行計數。
使用FITC流感抗體(ARP Anti-Influenza Avirus(H1N1)FITC")CatNo.12-6250-3)。
將等量的上述抗體(250、125、62.5及31.25μg/ml)混合至2000ppm的硫代硫酸銀(銀試劑)水溶液中，並滴在基材上，製備不同的固相基材(圖11(a))。所需時間約為1分鐘。
如圖11(b)所示，固相基材藉由螢光顯微鏡(Keyence BZ-X710)觀察，並計數及測量超過預定閾值的螢光點。
結果發現，計數數目取決於本發明的相固化基材的濃度而增加。
亦即，本發明的相固化基材具有定量固化的抗體，如圖12所示進行定量。
因此，可看出根據本發明，抗原及抗體可被定量固化。
(病毒固相)
圖13表示直接檢測流感病毒的步驟(滅活流感病毒的固定)。
螢光斑點係從螢光圖像中計數，該螢光圖像係在使用量子晶體聚集法(此稱為使用抗原抗體反應的直接法)固化有滅活流感病毒的基材上滴下帶有FITC標記的流感抗體，而獲得者的。
流感病毒：HyTest“A型流感(H1N1)病毒”CatNo.IN73-3”
FITC Influenza：ARP.公司製，Anti-Influenza A virus(H1N1)FITC“CatNo.12-6250-3”
上述硫代硫酸銀(銀-試劑)水溶液2000ppm與上述流感病毒磷酸鹽緩衝液(50μg/ml)的等體積混合物(pH7.4)係加入磷青銅板上，製備病毒固相基材(固相約1分鐘)。為了進行比較，將不含病毒的緩衝液與量子結晶銀試劑混合以形成固化基材。然後，將帶有FITC標記的流感抗體(25μg/ml)滴加到上述兩種固化基材中 (反應時間僅1分鐘)。用水或緩衝液沖洗未結合的複合材料或FITC。用空氣吹掉金屬基材上的殘留液體以獲得抗體固相基材(圖10A)。圖10B是固相基材的螢光圖像。
(抗體的固相轉化(1))
圖14顯示流感病毒夾層法的測試步驟(流感抗體的固定化)。
在使用量子晶體聚集法固化的基材上，複合流感抗體與帶有FITC標記的流感抗體及滅活的流感病毒。複合流感抗體被滴加，並計算從抗原抗體反應獲得的螢光圖像中之螢光點(稱為使用抗原抗體反應的直接方法)。
流感抗體：Hytest“單株小鼠抗A型流感血凝素H1”CatNo.3AH1”
流感病毒：HyTest“A型流感(H1N1)病毒”CatNo.IN73-3”
FITC Influenza：ARP.公司製，Anti-Influenza A virus(H1N1)FITC“CatNo.12-6250-3”
將2000ppm的上述硫代硫酸銀水溶液(銀試劑)及流感抗體(50μg/ml)磷酸鹽緩衝液(pH7.2)的等體積混合物加入磷青銅板上，製備抗體固化基材(固相約1分鐘)。
接著，將帶有FITC標記的流感抗體(25μg/ml)與流感病毒混合形成複合物，將其滴加到固相基材中(反應時間僅為1分鐘)。
用水或緩衝液沖洗未結合的複合材料或FITC。
使用KEYENCE螢光顯微鏡“BZ-X710”測量量測尖端，並且對所獲得的螢光圖像中預定閾值以上的螢光點進行計數。
使用的測量條件及設備與病毒的固相形成相同。
(抗體的固相轉化(2))
圖15顯示檢查過程。
從螢光圖像計數螢光斑點，該螢光圖像係藉由在使用量子晶體而固化有COVID-19抗體的基材上，滴加滅活的COVID-19患者樣本及FITC標記的COVID-19抗體的複合物滴而獲得者。
COVID-19抗體：GeneTex“SARS-COV-2棘抗體”CatNo.GTX135356”
FITC標記的COVID-19抗體：GeneTex帶有FITC標記的“SARS-COV-2棘抗體”CatNo.GTX135356(標記率8.64)。
將COVID-19抗體(50μg/ml)等量混入至2000ppm量子結晶試劑(硫代硫酸銀)中，滴在磷青銅基材上，製備抗體固化基材。
接著，用70%乙醇滅活從COVID-19獲得的咽部擦拭物，並將藉由混合FITC標記的COVID-19抗體(34.5μg/ml)所形成的複合物滴在固相基材上。
未結合的複合物及FITC抗體用水或緩衝液沖洗掉。
使用KEYENCE螢光顯微鏡“BZ-X710”測量量測尖端，並且對所獲得的螢光圖像的預定閾值以上的螢光點進行計數。
測量條件及所用設備與病毒固相法相同。
結果，在從兩名COVID-19患者的咽拭子中收集的兩個樣本中也檢測到病毒。計數的數量代表患者的症狀。請注意，70%乙醇用作空白。結果顯示空白：計數8(相對值0)，樣本1：計數16(相對值8)，樣本2：計數51(相對值43)。相對值是空白計數設置為0時的計數值。即使樣本是唾液時，計數略低，但得到相同的結果。
(量子晶體的製作)
製備2000或4000ppm硫代硫酸銀的水溶液，將一滴溶液滴在磷青銅板上，靜置約1分鐘，吹去溶液。SEM圖顯示產生量子晶體。
在顯示實施例1中製作的奈米粒子集合體(量子晶體)的各種SEM圖的照片中，該晶體為約100nm的薄型六棱柱，表面出現幾nm級的凹凸。
無法確認金屬奈米晶體特有的晶面(facet)。
顯示了滴在磷青銅丘上的停留時間與量子晶體形狀之間的相關性。
首先，觀察到六角形量子晶體在保持其形狀的情況下形成並生長，並且在顯示量子晶體的EDS光譜(元素分析)結果的圖中，在磷青銅板上形成的晶體檢測到衍生自銀及配體的元素，但在銅板上配製1000ppm硫代硫酸銀水溶液時只檢測到銀，將1滴溶液滴在銅板上，靜置約3分鐘，吹掉溶液。
(量子晶體聚集理論)
在2000或4000ppm硫代硫酸銀複合物水溶液的情況下，滴在磷青銅板上放置1分鐘後，從SEM圖確認量子晶體形成為100nm左右的六棱柱狀，並且每個六棱柱狀量子晶體都有幾奈米量級的粗糙度，但無法確認金屬奈米晶體特有的晶面，並且藉由EDS元素分析檢測到衍生自銀及配體的元素，因此推測整個是銀複合物的奈米晶體，其表面的粗糙度藉由在複合物中形成作為銀簇的量子點而擴散。
觀察形成在磷青銅板上之本發明的銀複合物量子晶體，在銅基材上僅析出銀的奈米顆粒的現象，係因為硫代硫酸銀複合物的平衡電位為0.33，相當於銅的電極電位(0.34)，因此只有銀(0.80)沉澱在銅基材上，而在磷青銅的情況下，電極電位為略低的0.22，認為是銀複合物沉澱。
因此，此乃發現重要的是：1)為了製備量子晶體，複合物水溶液是在500-2000ppm的稀釋區間，2)負載金屬的電極電位略低於金屬複合物水溶液 的平衡電位，3)金屬複合物在電極電位差處聚集，但希望抗原抗體固相使用濃度高於2000ppm的硫代硫酸銀量子晶體試劑。
基材可以用砂紙打磨，物理性去除表面氧化塗層，在其上滴加硫代硫酸銀溶液，藉由量子晶體的聚集作用形成固相基材。
基材表面物理狀態可能會影響量子晶體的形成狀態，從而可能影響測量值。
因此，為了保持量子晶體形成區域恆定，如圖4所示，1)磷青銅板的基材滴加區域進行圓狀溝槽加工(蝕刻加工)，2)直接使用區域內部或進行砂紙拋光、電解拋光、化學拋光，3)銀試劑溶液(2000-4000ppm硫代硫酸銀溶液)藉由表面張力滴加在圓狀溝槽中，以及4)之後，去除量子晶體的凝聚狀態以確保。
作為觀察凝聚狀態及檢查測量結果的變化的結果，發現使用電解拋光、化學拋光及砂紙拋光，測量結果存在變化。
(固相對象)
固相形成的對象包括重金屬以及病毒、細菌、真菌等蛋白質，它們是會造成抗體因為人及動物的免疫功能而被製造的病毒。還包括由這些病毒產生的抗體。
抗體包括5類單株抗體，係包含大鼠、小鼠、兔、人等動物物種中的IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等；抗體包括兔、山羊、大鼠、小鼠及雞中IgA、IgD、IgG及IgM之4類；Fc區、Fab區、重鏈、抗原結合位點及鉸鏈區中的一些片段化抗體；及一些重組抗體。藉由用病毒(EBV等)感染人B淋巴細胞獲得人抗體，並選殖抗體基因。
病毒包括如冠狀病毒、流感病毒等感染植物的植物病毒，如禽流感病毒或腺病毒等動物感染病毒，如煙草鑲嵌病毒等感染細菌的細菌病毒，如病毒的表面的棘及病毒的核衣殼等一些片段化病毒，以及重組病毒及片段化部分。
在本發明中，固相對象包括從人及動物採集的樣本及含有滅活病毒及片段化部分的樣本，樣本包括從人及動物採集的體液如咽拭子、唾液、血液及尿液。
固相基材的實施例1
提出固化量子晶體及具有抗生物素蛋白結合能力的生物素的實施例。
準備用於製備量子晶體的銀試劑(1000ppm，20μl)及生物素(5μg/ml，20μl)的混合物，將其滴到磷青銅板中，生物素固化成在基材上純化的量子晶體。
接著，將與生物素具有結合能力的帶有FITC螢光標記的抗生物素蛋白滴到生物素固相基材上。
然後，生物素與帶有FITC螢光標記的抗生物素蛋白結合，藉由螢光顯微鏡觀察在顆粒上FITC的螢光。
由此可觀察到，藉由滴加量子晶體及生物素的混合物，可以得到在量子晶體上固化有生物素的固相基材。
由此可知，分子化合物等可以在量子晶體基材上形成固相。(銀試劑範圍為500ppm至10000ppm，較佳為1000至5000，更佳為2000至4000ppm，待固化生物素範圍為1pg/ml至1g/ml)。
固相基材的實施例2
將等量的銀試劑(2000ppm，12.5μl)及血凝素H1 A型流感病毒抗體(25μg/ml，12.5μl)混合以獲得用於製備量子晶體的溶液，將其滴在磷青銅板上，使血凝素H1 A型流感病毒抗體固化成在基材上純化的量子晶體。
接著，在固定有血凝素H1 A型流感抗體的基材上滴加複合物，該複合物係血凝素H1 A型流感病毒抗體、在抗原抗體反應中與血凝素H1 A型流感病毒抗體 結合的H1N1流感病毒、及添加了FITC標記的H1N1流感病毒抗體。
然後，流感病毒與FITC標記抗體的複合物與固相基材的固相抗體結合，藉由螢光顯微鏡觀察顆粒上FITC的螢光。
結果發現，藉由將量子晶體與血凝素H1 A型流感病毒抗體混合並滴加，獲得了在量子晶體上固化有血凝素H1 A型流感病毒抗體的固相基材。
由此可知，抗體等可以在量子晶體基材上形成固相的形式。(其中，銀試劑範圍為500ppm至10000ppm，較佳為1000至5000，更佳為2000至4000ppm，凝聚的血凝素H1 A型流感抗體範圍為1pg/ml至1g/ml)
固相基材的實施例3
此時，將由等量的銀試劑(4000ppm，12.5μl)及血凝素H1 A型流感抗體(100μg/ml，12.5μl)混合而獲得的量子晶體製備用溶液，滴在磷青銅板上，使血凝素H1 A型流感病毒抗體固化成在基材上純化的量子晶體。
接著，在血凝素H1 A型流感抗體的固化板上，滴加在抗原抗體反應中與血凝素H1 A型流感病毒抗體結合的H1N1流感病毒(100μg/ml，5μl)及帶有FITC標記的H1N1流感病毒抗體(50μg/ml，5μl)的複合物。
流感病毒及FITC標記抗體的複合物與固化基材的固化抗體結合，並藉由螢光顯微鏡觀察如下圖所示的顆粒上FITC的螢光。
使用的設備如下。儀器：Keyence螢光顯微鏡BZ-X710，光源：金屬鹵素燈80W，螢光過濾器：BZ-X過濾器GFP(525±25)，分析軟體：BZ-X Analyzer。
(螢光圖像分析方法)
如圖16(1)至(3)所示對螢光圖像進行分析。
步驟(1)是圖像獲取步驟，係將藉由測量獲得的螢光圖像輸入圖像分析軟體 “BZ-X Analyzer”進行分析(觀察到的螢光為圓形顆粒)。
在此，如圖16所示，只取一個物鏡10x鏡頭(一個視野測量)，藉由二值化計數(計數)，拍攝時間快至3.5秒，可拍攝多幅圖像(參照JP-A-2019-234330的螢光測量方法)。
步驟(2)為二值化步驟，係對於螢光圖像的整個範圍，提取亮度值等於或大於設定亮度值的所有螢光顆粒並二值化(提取的螢光顆粒的亮度值等於或大於設定亮度值的紅色顆粒)。
步驟(3)為計數步驟，係對提取的設定亮度值以上的螢光粒子數目進行計數(僅計算紅色(虛線)的螢光粒子數)。
螢光圖像採集過程
在此，可指的是將激發光照射到在電漿子金屬奈米晶體基材上捕獲的片段化DNA，藉由表面電漿子增強效應將捕獲的片段化DNA的自發螢光增強，並獲得螢光群落(fluorescent colony)作為螢光圖像的技術。(日本專利申請案第2019-234330號)。
實施例4
此外，將量子晶體製備用的銀試劑(2000ppm，5μl)及以同樣方式製備之帶有FITC標記的H1N1流感病毒抗體(250μg/ml，5μl)混合得到溶液，將該溶液滴到磷青銅板，帶有FITC標記的H1N1流感病毒抗體固化成在基材上純化的量子晶體。
當藉由螢光顯微鏡觀察該固相基材時，觀察到顆粒上的FITC螢光。
因此，可以將如FITC之螢光標記在量子晶體基材上置成固相。其中，銀-試劑的範圍為500ppm至10000ppm，較佳為1000至5000，更佳為2000至4000ppm，固化的帶有FITC標記的H1N1流感病毒抗體具有1pg/ml至1g/ml的範圍。
(測量示例1)
在存在病毒抗原的情況下，表面電漿子激發增強螢光光譜法(SPFS)被用於使用咽拭子、唾液、尿液及糞便檢測患者體內的病毒。
圖1是包括步驟(1)至(4)的過程。
步驟(1)中，採用量子晶體聚集法製備抗體固相基材。
更具體而言，將病毒抗體添加到緩衝液(pH7磷酸鹽緩衝液)中以生成固相抗體溶液。
在其中加入等量濃度為1000至10000，較佳2000至4000ppm的電漿子金屬複合物水溶液，調整電漿子金屬複合物與病毒抗體的複合物水溶液，將含有病毒抗體的電漿子金屬複合物溶液滴在具有接近電漿子金屬複合物還原電位的電極電位的金屬基材上，使與抗體結合的電漿子金屬複合物量子晶體聚集，從而製備固化有病毒抗體的病毒抗體固化基材。
在此，選擇鈀、鉑、金、銀及銅中的一種作為電漿子金屬，選擇電極電位在電漿子金屬複合物的氧化還原電位附近的金屬基材，以及銅或銅合金，特別是，使用硫代硫酸銀複合物的量子晶體時，選用磷青銅作為基材。
在此，抗體包括作為流感病毒抗體、由病毒抗原及融合瘤產生的大鼠、小鼠、雞、兔及人等動物物種的IgA、IgD、IgE、IgG及IgM的5類單株抗體，包括兔、天竺鼠、山羊、綿羊、大鼠、小鼠、雞等動物物種的IgA、IgD、IgE、IgG、IgM的5類多株抗體，以及免疫球蛋白、Fc區及Fab區、重鏈、輕鏈、抗原結合位點、片段化抗體例如鉸鏈區的片段化部分；以及藉由人抗體(例如EBV)的選殖所得到之人B淋巴球，該選擇係以人抗體感染而獲得者。
冠狀病毒抗體的實例包括由病毒抗原及融合瘤產生的大鼠、小 鼠、雞、兔及人等動物物種的5類IgA、IgD、IgE、IgG及IgM的單株抗體，包括天竺鼠、山羊、綿羊、大鼠、小鼠、雞等動物物種的IgA、IgD、IgE、IgG及IgM的5類多株抗體，如免疫球蛋白、Fc區及Fab區等抗體，重鍊及輕鍊等片段化抗體，抗原結合位點及鉸鏈區、重建的抗體、抗體的橫截面部分以及藉由選殖人抗體(例如EBV)獲得的人B淋巴細胞。
步驟(2)中，利用抗原抗體反應，在樣本中形成螢光物質標記的病毒抗體與病毒抗原的複合物。
在此，就樣本而言，使用咽喉擦拭物、唾液、尿液及糞便作為對象。
標記病毒抗體的螢光物質可以包括：激發光，如太平洋藍，從400nm到436nm；激發光，如FITC，從453到505nm；激發光，如TRITC，從485到566nm；激發光，如APC，從488到706nm；及激發光，如IRDye800，從732到784nm。
步驟(3)中，藉由抗原抗體反應將上述複合物滴在上述抗體相固化基材上，使複合物與基材上的抗體結合，未結合的複合物及抗體用純水、緩衝液等洗滌。
在此，使用中性範圍的磷酸鹽緩衝液作為緩衝液，並使用PBS、HEPES、TRIS、BIS-TRIS、CAPS、CAPSO、甘胺醯甘胺酸(Glycylglycine)、MES、MOPS、PIPES等。
步驟(4)中，將激發光照射到殘留在基材上的標記抗體及抗原的複合物上，藉由表面電漿子激發並用螢光顯微鏡或螢光讀取器觀察螢光圖像，從獲得的螢光圖像的任意範圍或從整個圖像中，將具有亮度等於或大於任意值的螢光顆粒的值二值化，並且對獲得的數目進行計數。
由於同一申請人的日本專利申請案第2019-234330號的螢光測量 方法可用於對螢光圖像中具有一定閾值以上的螢光顆粒進行二值化及計數，因此在此引用並參考如此之螢光測量方法。
在本發明中，圖16所示的一個視野測量(1 field measurement)條件為：10x鏡頭無模糊過濾器視野測量的閾值62無模糊過濾器視野測量(在此，如圖16所示，一個視野測量是指只獲取晶片一部分的方法，不同於日本專利申請案第2019-234330號的情況。由於使用本發明的固相基材時的一個視野測量大致與兩個以上的一個視野的平均值相當，因此發現可使用一個視野測量的結果而不採用平均值。確定抗原的固相或抗原由量子晶體大致均勻地形成)。
在上述例子中，使用固化有抗體的基材，但是可以藉由在液體中使用相同種類的金屬粉末並利用抗原抗體反應來檢測病毒抗原。
使用含有病毒抗原的咽拭子、唾液、尿液及糞便，在圖2中由步驟(1)到(5)組成。
步驟(1)中，採用量子晶體聚集法製備抗體固相金屬粉末。
具體地，將病毒抗體以500-10000ppm的濃度添加至水性電漿子金屬複合物中，並將載體金屬粉末添加至複合物中並混合。
電漿子金屬複合物與病毒抗體與具有接近電漿子金屬複合物還原電位的電極電位的金屬粉末一起聚集，形成病毒抗體固化的金屬粉末，其中病毒抗體、電漿子金屬複合物及載體金屬粉一起聚集。
另一方面，在步驟(2)中，利用第一抗原抗體反應在樣本中形成具有螢光物質標記的病毒抗體與病毒抗原的複合物。
在此，分析物及螢光材料與第一種方法相同。
然後，在步驟(3)中，將上述複合物添加到抗體固化粉末液體中，利用第二抗 原抗體反應使抗體固化粉末與上述複合物結合。
步驟(4)中，將抗體固化粉末與複合物的凝聚物過濾，未結合的複合物與抗體用純水、緩衝液等洗滌。
最後，在步驟(5)中，用激發光照射殘留在基材上的標記抗體-抗原複合物，藉由表面電漿子激發並用螢光顯微鏡或螢光讀取器觀察其螢光圖像，從獲得的螢光圖像的任意範圍或從整個圖像中，將具有亮度等於或高於任意值的螢光顆粒的值二值化，並且對獲得的數目進行計數。
本發明的第二種方法是一種將病毒抗原或其部分(非感染性抗原的一部分，例如病毒表面棘或病毒核衣殼的片段部分)固化成固相，並且捕獲產生在體內的抗體的方法；如圖3所示，一種利用電漿子金屬複合物的量子晶體聚集法固化抗原或其部分的方法，然後使抗原或其部分與抗體反應以形成在量子晶體之間具有間隙或微通道的抗原或其部分固相基材，並且將使用螢光物質標記的抗體滴到抗原或部分固相基材上以結合該抗原，洗滌未結合的標記抗體，然後用激發光照射殘留在基材上的標記抗體以激發量子晶體，增強標記抗體的螢光，從而檢測標記抗體的螢光。
抗原或其部分係使用電漿子金屬複合物的量子晶體聚集方法固化，然後抗原或其部分與抗體相互反應以形成在量子晶體之間具有間隙或微通道的抗原或部分相固化基材，將螢光物質標記的標記抗體滴在抗原或部分相固化基材上使其結合，洗滌未結合的標記抗體，然後用激發光照射殘留在基材上的標記抗體藉由表面電漿子激發激發量子晶體，用螢光顯微鏡或螢光讀取器觀察螢光圖像，從獲得的螢光圖像的任意範圍或從整個圖像中，將具有亮度等於或高於任意值的螢光顆粒的值二值化，並且對獲得的數目進行計數。
換言之，在步驟(1)中，使用量子晶體聚集法製備抗原及其部分相固化基材。
更具體地，將病毒抗原及此等之一些以500-10000ppm的濃度加到水性電漿子金屬複合物中。
使用一些病毒抗原及例如咽拭子、唾液、尿液、糞便及非感染性抗原中的一些。
病毒抗原及此等之一些可高壓滅菌(121℃高壓滅菌15分鐘以上)、浸泡在0.01%或以上的次氯酸鈉1小時以上、浸泡在4%甲醛溶液浸泡或浸泡在70%乙醇等。
製備電漿子金屬複合物與病毒抗原或其部分的複合物水溶液，將含有病毒抗原或其部分的電漿子金屬複合物溶液滴在電極電位在電漿子金屬複合物的還原電位附近的金屬基材上，將結合有抗原或其部分的電漿子金屬複合物量子晶體聚集，以製備被製成固相或部分固相基材之病毒抗原或其部分。
然後，在步驟(2)中，利用第一抗原抗體反應，形成固相抗原及其部分與血液中的病毒抗體的複合物。
在此，血液、血清及血漿被用作含有病毒抗體的樣本。
步驟(3)中，製備標記抗體，將標記抗體滴在抗原抗體相固化基材上進行第二抗原抗體反應，使複合物與基材上的抗體結合，用純水、緩衝液等洗滌未結合的標記抗體。
然而，也可以預先將步驟(2)的樣本與步驟(3)的標記抗體混合。
步驟(4)中，將激發光照射到殘留在基材上的標記抗體及抗原的複合物上，藉由表面電漿子激發並用螢光顯微鏡或螢光讀取器觀察螢光圖像，從獲得的螢 光圖像的任意範圍或從整個圖像中，將具有亮度等於或高於任意值的螢光顆粒的值二值化，並且對獲得的數目進行計數。
在上述夾層法中，同時使用能夠相互結合的一級標記抗體及二級標記抗體作為標記抗體來增強螢光強度。
圖4的方法同時使用能夠相互結合的一級標記抗體及二級標記抗體在本發明的第一方法步驟(1)至(4)中。
步驟(1)中，採用量子晶體聚集法製備抗體固相基材。此與圖17的步驟(1)相同。
步驟(2)中，同時使用第一標記抗體及第二標記抗體作為具有螢光物質標記的病毒抗體，並藉由抗原抗體反應與樣本中的病毒抗原形成複合物，或者可以在結合一級標記抗體後綴合二級標記抗體。
在此，就樣本而言，使用咽喉擦拭物、唾液、尿液及糞便作為對象。
標記病毒抗體的螢光物質可以包括激發光，如太平洋藍，從400nm到436nm；激發光，如FITC，從453到505nm；激發光，如TRITC，從485到566nm；激發光，如APC，從488到706nm；及激發光，如IRDye800，從732到784nm。
作為標記一級及二級標記抗體的組合，將識別一級標記抗體來源物種的二標記抗體組合在一起。
例如，當使用來自小鼠的一級標記抗體時，使用識別小鼠抗體的二級標記抗體，並在其他動物物種中類似地組合。
步驟(3)中，將上述複合物滴到使用抗原抗體反應之上述抗體相固化基材上，使複合物與基材上的抗體結合，用純水、緩衝液等洗滌未結合的複合物及抗體。
此處，PBS、HEPES、TRIS、BIS-TRIS、CAPS、CAPSO、甘胺醯甘胺酸、MES、MOPS、PIPES等用作緩衝液。
步驟(4)中，將激發光照射到殘留在基材上的標記抗體及抗原的複合物上，藉由表面電漿子激發並用螢光顯微鏡或螢光讀取器觀察螢光圖像，從獲得的螢光圖像的任意範圍或從整個圖像中，將具有亮度等於或高於任意值的螢光顆粒的值二值化，並且對獲得的數目進行計數。
(藉由流感病毒的抗原抗體反應之實測)
將作為量子晶體來源的等量銀試劑(500-10000ppm)及流感抗體(5-1000μg/ml)混合，將混合液滴在磷青銅板上，使量子晶體及抗體固化在磷青銅板上。
將流感病毒(5-1000μg/ml)及FITC標記的流感抗體(5-1000μg/ml)等量混合並滴在未折疊的量子晶體基材上。
試劑的實例：使用流感HyTest的單株小鼠抗A型流感血凝素H1、流感病毒HyTest的A型流感(H1N1)病毒、FITC流感抗體IBL抗A型流感病毒(H1N1)FITC。
用純水等洗滌具有過量FITC標記的流感抗體，照射來自光源(金屬鹵化物燈80W)的光並使用螢光顯微鏡(Keyence的螢光顯微鏡BZ-X710)測量。
藉由螢光顯微鏡觀察圖像並藉由BZ-X分析儀進行分析。如圖6(a)所示。相對地，不包括流感抗原的情況如圖6(b)所示。
激發表面電漿子，用螢光顯微鏡或螢光讀取器觀察螢光圖像，從獲得的螢光圖像的任意範圍或從整個圖像中，將具有亮度等於或高於任意值的螢光顆粒的值二值化，並且對獲得的數目進行計數。
當病毒存在時，病毒被夾在量子晶體上的固相抗體及標記的抗體之間，以顆粒形式發射出大量螢光，觀察到此種顆粒螢光的螢光為夾在標記抗體之間的病毒的螢光(圖6(a))，而在沒有病毒的情況中，沒有出現大量顆粒形式的螢光(圖6(b))。
在螢光圖像中，病毒(Virus)濃度及亮度值57以上的螢光顆粒以流感抗體(25μg/ml)及FITC流感抗體(25μg/ml)在Keyence BZ-X710物鏡×10處使用分析軟體(BZ-X)進行二值化並計數，獲得如圖7的表所示的結果。
此在圖7的曲線圖中線性化。
從得到的圖像可以看出，計數數目與病毒濃度存在相關關係。
(現場(on-site)樣本檢驗)
本發明係適用於出入境檢查及醫院診斷時當場快速進行病毒檢查的方法，其特徵在於將從人體採集的樣本(咽拭子、唾液、痰、鼻咽液、尿液等)中的抗原滅活，藉由量子晶體聚集法將滅活的抗原固化在基材上，標記抗體係藉由抗原抗體反應結合並標記在固化抗原上結合，然後用緩衝液或純水洗滌未結合的標記抗體，用光源照射標記抗體(螢光物質)的激發光，用螢光顯微鏡對基材上的螢光顆粒進行計數。
在此，量子晶體聚集法是指在申請專利第2016-197114號中所示的產生電漿子金屬複合物量子晶體的聚集方法，從而使溶液中的電漿子金屬複合物作為金屬複合物的量子晶體聚集在金屬基材上，其電位接近還原電位，這取決於電沉積板電位的選擇。
此時，在基材上係藉由量子晶體聚集法預先固化有抗體，採集樣本中的抗原被滅活並藉由抗原抗體反應結合到基材，並且藉由利用抗原抗體反應所標記之 抗體結合標記，然後用緩衝液或純水洗滌未結合的標記抗體，從光源照射與抗體(螢光物質)標記符合的激發光，用螢光顯微鏡計數在基材的螢光粒子。
(樣本滅活)
在本發明中，樣本中待滅活的病毒實質上由核酸DNA或RNA以及保護它們的殼蛋白(衣殼)組成，分為沒有包膜(envelope)的小球狀病毒、以及被膜包裹之病毒的情況，該膜被稱為包含脂質的包膜。
因此，雖然藥物滅活靈敏性的差異取決於病毒是否有包膜，但通常包膜病毒對消毒劑敏感，因此較佳為使用藥物。
其他對大多數病毒有效的滅活方法包括煮沸(98℃以上)15-20分鐘、2% w/v戊二醛、0.05-0.5% w/v(500-5000ppm)次氯酸鈉，76.9-81.4% w/v消毒乙醇、70% w/v異丙醇、2.5% w/v優碘、55% w/v鄰苯二甲酸及0.3% w/v過乙酸。
許多病毒藉由在56℃下30分鐘衣殼蛋白(capsid protien)的改變而被滅活，包膜病毒容易被如乙醚、氯仿及碳氟化合物等脂類溶劑滅活。
此外，藉由使用識別存在於病毒內部的核苷、核苷酸或核衣殼的抗體，可以檢測藉由破壞膜或殼而細碎的滅活病毒抗原。
因此，就本發明的滅活而言，從不影響或幾乎不影響抗原抗體反應的角度來看，可使用乙醇、福馬林或AVL緩衝液的藥物方法及諸如熱處理、SD處理(化學處理)、酸處理、鹼處理或發射處理的滅活方法。
在本發明中，可以使用金屬粉末代替基材。
另外，在上述方法中，當同時使用具有螢光標記的一級抗體及具有螢光標記的抗體作為標記抗體進行成像及分析時，可以適當且準確地獲取更多螢光圖像。
本發明較佳是採用適用於現場採集、現場檢查之檢體滅活採集套 組，以及可以使用藥劑滅活。
如圖18所示，設置含有諸如乙醇等化學試劑L的管10及棒狀樣本採集單元20，並且樣本採集單元係如不織布或紗布等被配置為具有吸收性能。(2)然後，樣本被採集在棒狀樣本採集單元20。唾液、痰、咽拭子、鼻咽液等被作為樣本S。(3)樣本S採集後，棒狀樣本採集單元20置於管10中。圖18(4)中，管10的內部變成狹窄的部分，當插入棒狀樣本採集單元20時，樣本採集單元20被壓縮在狹窄的壁面上，樣本S(唾液)分散在如乙醇的化學試劑L中。(5)當除了樣本採集單元20以外的部分被移除時，樣本採集單元20保留在管10中。(6)樣本S被化學試劑L滅活並保留在管10中。
根據本發明，病毒抗原在現場採集及滅活，並藉由量子晶體聚集法固定在基材上而與標記抗體結合，或者藉由抗原抗體反應將滅活的病毒抗原與標記抗體結合在預先固定有抗體的基材，並計數病毒抗原的螢光數而不是其螢光強度，而可以測定病毒濃度。
此外，由於量子晶體形成抗體或抗原的相固化基材，在激發光入射的光子與形成量子晶體的電漿子金屬粒子的自由電子之間相互作用，表面電漿子被激發而增強標記抗體的螢光，並且對粒子的螢光可以良好的再重現性計數及檢測，而不是整體螢光強度。
因此，表面電漿子增強螢光光譜法(surface-plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy,SPFS)可用於在短短2-5分鐘內快速測試，提供準確的診斷結果，取代PCR測試，PCR係預處理繁瑣，對引子的靈敏性較低，程序更多，而且測試更耗時。
此外，由於計數與病毒的數量以及有無疾病的判斷相對應，因此 可以判斷疾病的輕重程度，具有劃時代的意義。
根據本發明的樣本滅活採集套組，由於可以將採集到的病毒滅活並固定在管中，因此可以將其送到必要的檢查地點，並可以隨時取出檢查。
在本發明中，藉由量子晶體聚集法直接固化滅活抗原等，但預先固化抗體，藉由抗原抗體反應標記滅活抗原而獲得的抗體可以被結合及檢測，並且在螢光抗體方法中可以採用直接法、夾層法及間接法。
(從滅活動檢體中檢測病毒)
準備用於製備量子晶體的等體積的銀試劑(2000ppm，12.5μl)及血凝素H1 A型流感抗體(25μg/ml，12.5μl)，滴在磷青銅板上並在基材上聚集。
血凝素H1 A型流感抗體與量子晶體一起固化。
接著，將滅活分析物(25μg/ml，5μl)及使用FITC標記的H1N1流感病毒抗體(25μg/ml，5μl)的複合物滴到血凝素H1 A型流感病毒抗體的固相基材上。
當滅活樣本中存在H1N1流感病毒時，流感病毒與FITC標記抗體的複合物與固相基材上的固相抗體結合，藉由螢光顯微鏡觀察顆粒上FITC的螢光。
此外，當樣本中不存在流感病毒時，觀察不到在顆粒上FITC的螢光。
將藉由螢光顯微鏡獲得的測量圖像以“Keyence分析軟體：BZ-X Analyzer”，設置閾值為57並進行分析時，顆粒的FITC的螢光計數獲得了很大的差異。
結果，從螢光圖像中計算螢光粒子的數量時，在沒有病毒的情況下為4個，而在有病毒的情況下為145個。
使用的設備如下。儀器：Keyence螢光顯微鏡BZ-Z710，光源：金屬鹵素燈80W，螢光過濾器：BZ-X過濾器GFP(525±25)，分析軟體：BZ-X Analyzer。
(患者病毒的測量實施例1)
本發明的螢光計數方法應用於患者病毒的檢測，使用存在病毒抗原的咽拭子、唾液、痰、鼻咽液、尿液或糞便。
圖17為包括步驟(1)至(7)的方法。
在步驟(1)中，使用圖18中所示的樣本滅活收集套組產生滅活樣本。
在步驟(2)中，在樣本中混合滅活抗原與銀試劑(硫代硫酸銀複合物溶液)混合。
在步驟(3)中，採用量子晶體聚集法製備滅活抗原的固相基材。
具體地，在濃度為2000至6000ppm的電漿子金屬複合物水溶液中添加滅活抗原，調整電漿子金屬複合物與滅活抗原的複合物水溶液，得到含有滅活抗原的電漿子金屬複合物溶液，將其滴到具有接近電漿子金屬複合物還原電位的電極電位的金屬基材上，使電漿子金屬複合物量子晶體聚集，以使滅活抗原固化(步驟(4))。
在此，選擇鈀、鉑、金、銀及銅中的一種作為電漿子金屬，選擇電極電位在電漿子金屬複合物的氧化還原電位附近的金屬基材，並且使用硫代硫酸銀複合物的量子晶體時，選用銅或銅合金，特別是磷青銅作為基材。
引用及參考了JP-A-2016-197114中描述的量子晶體方法的製備方法。
在步驟(5)中，以螢光物質標記的病毒抗體係利用抗原抗體反應對固相樣本中的病毒抗原進行標記。
在此，就樣本而言，咽拭子、唾液、痰、鼻咽液、尿液及糞便作為目標。
標記病毒抗體的螢光物質可以包括激發光，如太平洋藍，從400nm到436nm；激發光，如FITC，從453到505nm；激發光，如TRITC，從485到566nm；激發光，如APC，從488到706nm；及激發光，如IRDye800，從732到784nm。
在步驟(6)中，未結合的複合物及抗體用純水、緩衝液等從基材上洗掉。
在此，除了作為緩衝液的中性磷酸鹽緩衝液之外，還可以使用PBS、HEPES、TRIS、BIS-TRIS、CAPS、CAPSO、甘胺醯甘胺酸、MES、MOPS、PIPES等。
在步驟(7)中，對殘留在基材上的標記抗體及抗原的複合物照射激發光，藉由表面電漿子激發並用螢光顯微鏡或螢光讀取器觀察螢光圖像，從獲得的螢光圖像的任意範圍或從整個圖像中，將螢光顆粒亮度等於或高於任意值的值二值化，並且對獲得的數量進行計數。
螢光圖像中高於特定閾值的螢光顆粒被二值化及計數。
根據本發明的方法，能夠容易且快速地進行與PCR法相當的高準確度的病毒檢測。
因此，可以在現場進行移民檢查、醫院的快速檢查等。
(兩種病毒的檢測)
以下的方法為描述藉由一測量晶片檢測兩種病毒的測量方法。
1)將流感抗體(含有多種抗體作為流感抗體)緩衝液及冠狀病毒(Covid-19)抗體緩衝液的混合物等量混合到銀試劑(3000ppm硫代硫酸銀水溶液)中，最後調整為含1000ppm銀試劑的固相樣本。
或者是，將三者等量混合以進行調整。
將混合液滴在金屬基材上以形成固化的基材(參見圖19A(1))。
2)接著，將從人身上採集並以乙醇等滅活的樣本(例如，咽拭子或唾液)與綠色標記的冠狀病毒抗體及紅色標記的流感病毒抗體的混合物混合。
如果樣本中存在任何一種病毒，病毒與標記的抗體形成複合物。然後，將複合物滴在相固化基材上。3)複合物與藉由抗原抗體反應固化在基材上的抗體結合(參見圖19A(2))。
未結合的複合物或標記抗體以水或緩衝液洗掉(參見圖19B(3))。
在此，冠狀病毒抗體的標記是用FITC及Cy2等綠色區域的標記進行，流感抗體的標記是用Cy5及APCs等紅色區域的標記進行，選擇各自的螢光區域以使其不彼此重疊。光源分別採用綠色波長激發光及紅色波長激發光照射。
當樣本中存在流感病毒時，在綠光激發下觀察不到螢光，但在紅光激發下觀察到紅色標記流感病毒抗體的螢光。
另一方面，當樣本中存在冠狀病毒時，在紅光激發下觀察不到螢光，但在綠光激發下觀察到來自綠色標記的冠狀病毒抗體的螢光(參見圖19B(4))。
以此方式，藉由螢光顯微鏡獲取由兩種激發光獲得的兩幅螢光圖像，並對圖像上的螢光點或顆粒進行計數及量化。綠色區域過濾器：激發波長為470±20nm，螢光波長為525±25nm。紅色區域過濾器被構成為激發波長為620±20nm，螢光波長為700±37.5nm。
(量子晶體聚集的pH影響：實施例)
然後，將以pH6.0、7.4及8.0三種緩衝液(PBS)調整的抗體與量子結晶劑混合，藉由改變產生量子晶體的pH值來固化抗體。
對藉由抗原抗體反應結合的螢光標記抗體的顆粒的螢光進行計數，測定各 pH值下形成的量子晶體的狀態(固相基材的狀態)及計數值。
使用量子晶體劑，在固化有以PBS緩衝液(pH6.0、pH7.4、pH8.0)稀釋的流感病毒抗體及量子晶體的基材上，將滅活的流感病毒滴加，並從獲得的螢光圖像計數螢光點。
向2000ppm硫代硫酸銀水溶液(銀-試劑)，混合等量的流感病毒抗體(以50μg/ml、0.1mol/L磷酸鹽緩衝液pH6.0、7.4及8.0稀釋)，並滴加到磷青銅基材上以製備抗體相固化基材。
將滅活的流感病毒(10μg/ml)與FITC標記的流感病毒抗體(10μg/ml)混合形成的複合物滴在固相基材上(反應時間1分鐘)。
未結合的複合物或FITC用水或緩衝液沖洗掉。
以Keyence螢光顯微鏡“BZ-X710”測量晶片，並對所獲得的螢光圖像的預定閾值以上的螢光點進行計數。
結果，顯示在pH6.0的緩衝液中產生的量子晶體的抗原抗體反應的標記抗體的計數值。Buffer(空白)：計數數目為3(相對值為0)，流感病毒：計數數目為31(相對值為28)(參見圖20B)。
接著，顯示在pH7.4的緩衝液中產生的量子晶體的抗原抗體反應的標記抗體的計數值。Buffer(空白)：計數數目為4(相對值為0)，流感病毒：計數數目為64(相對值為60)
此外，顯示在pH8.0的緩衝液中產生的量子晶體的抗原抗體反應的標記抗體的計數值。Buffer(空白)：計數數目為4(相對值為0)，流感病毒：計數數目為57(相對值為53)(參見圖20B)。相對值為當空白計數數目設置為0時的計數數目。
由於在基材上產生三維堆疊的量子晶體，抗體在基材上聚集固化，藉由抗原抗體反應產生的螢光標記計數數目小，由此可認為由pH6.4的緩衝液產生的固化有抗體的量子晶體係與不加任何東西由pH6產生的量子晶體一樣(圖20A(a))。
認為由多邊形的緩衝液固化的多邊形量子晶體係顯示pH7.4及8.0(圖20A(b))，在基材上形成分散在基材上的細粒晶體，抗體也分散固化在基材上，藉由抗原抗體反應標記的螢光之計數值增加。
當以量子晶體為基礎的抗體相固化基材作為檢測病毒的檢查方法時，如果抗體係以量子晶體劑固定，該量子晶體劑係藉由添加緩衝液將其pH值調至7至8，則晶體顆粒係在分散在基材表面的細晶粒上生成，抗體固定在精細分散的量子晶體上，從而可以檢測到更大的計數值，並且可使用具有靈敏性高的病毒檢測方法。
試劑：流感病毒抗體：Hytest“Monoclonal Mouse anti-influenza A haemogglutinin H1”CatNo.3AH1”，FITC Influenza：ARP.公司製，Anti-Influenza A virus(H1N1)FITC“CatNo.12-6250-3”，流感病毒：HyTest "A型H1N1流感病毒"CatNo.IN73-3"
設備：Keyence“BZ-X71”
(用於執行本發明的螢光計數測定的自動化系統)
本發明的自動化系統包含預處理自動化裝置(A)及螢光圖像計數自動化裝置(B)，如圖8A所示。
預處理自動化裝置(A)包括由以下(1)、(3)及(4)步驟組成的固相或固定化過程，由(2)及(5)步驟組成的標記過程，以及包括(6)步驟的清潔過程。
另一方面，螢光圖像計數自動化裝置(B)包括(7)的螢光激發步驟 及(8)的螢光圖像計數步驟。
在此，在第一步驟(1)中，將本發明所指的固相對象(病毒抗原或抗體)與銀試劑(通常為1000至5000ppm的硫代硫酸銀水溶液)混合，製備相固化液或固定液。
在第二步驟(2)中，將用於標記待測病毒或抗體的標記液與螢光物質混合。
在第三步驟(3)中，將第一步驟製備的相固化液滴在金屬基材上，藉由銀試劑中的銀複合物的聚集，使相固化液中的抗體或抗原固化在金屬基材上。
在第四步驟(4)中，滴在金屬基材上的相固化液藉由相對於金屬基材的電極電位差繼續凝聚，此凝聚反應藉由吹氣從而停止在適用於測量基材的相固化或固定層狀態。
在第五步驟(5)中，將第二步驟製備的標記液滴到第四步驟製備的固相層中，藉由抗原抗體反應標記待測病毒或抗體。
可以採用本領域的一般方法進行標記，當然可以使用上述的夾層法、直接法、間接法，但每種方法都包括敏化法(sensitization method)，例如傳統的敏化法(ABC法)，該敏化法中，一級抗體(或二級抗體)被生物素化而形成生物素-抗生物素蛋白複合物並被檢測。在本發明的情況中，考慮量子晶體的表面電漿子增強效應來確定標記率。
在第六步驟(6)中，將殘留在標記固相層上的未反應標記液沖洗掉，以減少測量誤差的原因。
在第七步驟(7)中，激發光照射到測量晶片上的標記物(病毒或抗體)以發出螢光，螢光物質也被激發，可以藉由螢光顯微鏡觀察具有激發螢光點的螢光圖像。
在第八步驟(8)中，由於螢光圖像中觀察到與標記物對應的螢光點及一些成為測量誤差的螢光點，為了區分待測螢光點，在預定的分析條件(亮度、面積、 圓度)下螢光點被二值化，並選擇與測量對象的定量相對應的螢光點，並進行計數。
更具體地，固相形成步驟如圖8B所示，在第一步驟(1)中，製備用於在金屬基材上固化抗體或抗原的固相形成溶液(相固化溶液)，等量(例如5μl)的銀試劑(2000ppm硫代硫酸銀水溶液：pH6)及含有抗體的緩衝液(25μg抗體添加至1ml pH7.4的磷酸鹽緩衝液中：濃度為25μg/ml)以注射器壓縮而測量，並藉由渦旋進行混合而製備固相形成溶液。第三步驟(3)中，收集該固相形成液10μl，滴在以圓形磷質板作為測量區域的金屬基材上，在金屬基材上靜置1分鐘，然後在第四步驟(4)，將基材上殘留的溶液以吹氣製備固相形成基材(測量晶片)。
樣本包括鼻咽拭子、喉拭子、唾液、尿液及糞便。
用於標記病毒抗體的螢光物質的實例包括由例如太平洋藍(Pacific Blue)，400nm至436nm激發光激發的螢光物質，由例如FITC，453nm至505nm激發光激發的物質，由例如TRITC，485nm至566nm激發光激發的物質，由例如APCs，488nm至706nm激發光激發的物質，以及由例如IRDye800，732nm至784nm激發光激發的螢光物質。
接著，在本發明的自動化系統的標記步驟中，如圖8C所示，標記液製備步驟(2)包括抗原和標記抗體，標記步驟(5)係將第二液體滴到基材上，以及步驟(6)係洗滌未反應的標記液，並在水洗後以吹氣風乾。
將適量的以注射器壓縮的標記液體滴到已固化測量目標的測量晶片上。標記液是根據固相測定目標為抗體、抗原，或者是標記步驟是以夾層法、直接法或間接法進行而不同。
最後，如圖8D所示，本發明的螢光圖像計數自動化系統包括螢光 激發步驟(7)及螢光圖像計數步驟(8)。
在第七步驟(7)中，激發光源係用於在適合激發螢光物質的波長範圍內照射激發光，其中，待測抗原或其抗體係被螢光標記，測量晶片係藉由激發光激發具有電漿子金屬量子晶體的標記螢光物質的螢光，以及螢光顯微鏡係用以觀察測量晶片上的螢光圖像。
作為激發光的實施例，太平洋藍的激發光為400nm至436nm，FITC的激發光為453nm至505nm，TRITC的激發光為485nm至566nm，APC的激發光為488nm至706nm，IRDye800等的激發光為732nm至784nm。
在第八步驟(8)中，在預定的分析條件下(從亮度、面積及圓度中選擇)，使用Olympus Co.Ltd.製造的圖像識別軟體Cell Sense對螢光圖像中的螢光點進行二值化及選擇，合適的螢光點係被選擇並計數以及用於定量測量對象，包括選擇螢光圖像中的至少一個區域的裝置、將所選區域中的螢光點二值化以採用等於或大於預定閾值的裝置，以及用於計數螢光點的量化的裝置。
實施例：根據PCR方法與本發明方法，比較Covid-19陽性/陰性的測試結果。
樣本：由琉球大學醫學中心提供的50份陽性樣本及20份陰性樣本。
測試過程：該比較測試由琉球大學醫學中心及Mytech Co.Ltd(申請人公司)的神戶實驗室進行。
琉球大學醫學中心(Kinjou教授)對70個樣本進行PCR測試，而本發明CV方法由Mytech Co.Ltd對相同樣本進行，如圖1所示，本申請人比較PCR與本發明測定的陽性/陰性結果。
PCR試驗中，將140μl採集的樣本與260μl滅活緩衝液混合，在自動提取器中 得到50μl提取液。PCR測試係使用國立傳染病研究所建議的試劑以每個檢體2孔檢測進行。
在本發明測試中，將140μl採集的樣本與140μl之99.5%乙醇混合並滅活，5μl滅活樣本係被使用在從抗原抗體反應(本發明的夾層法)獲得的螢光圖像中計數螢光顆粒。
試劑：Covid-19抗體：由Gene Tex公司製造的SARS-CoV-2棘抗體[CatNo.GTX135356]，FITC標記的Covid-19抗體：由Gene Tex公司製造的SARS-CoV-2棘抗體[FITC-labeled CatNo.GTX135356]。
方法如圖1所示。
首先，將Covid-19抗體(50μg/ml)與2000ppm的量子晶體劑溶液(等體積)混合，滴在磷青銅基材上製備相固化基材。
接著，鼻咽擦拭液(檢體)係藉由添加等體積的99.5%乙醇而被滅活，並將檢體與FITC標記的Covid-19抗體(約30.0μg/ml)混合，將所得之複合物滴在相固化基材上。
第三，用水或緩衝液洗去未結合的複合物及FITC抗體。
最後，用Olympus BX63系統生物顯微鏡測量量測晶片上得到的複合物，並對獲得的螢光圖像中高於任意閾值的螢光顆粒進行計數。(參見圖1抗原抗體反應-夾層法。)
分析方法：使用Olympus“Cell Sence”分析軟體藉由以下兩種模式(1)及(2)分析獲得的螢光圖像。
分析條件(1)：(計算圖像中強發光螢光顆粒的條件)對圖像中具有確定亮度以上的螢光顆粒進行計數，忽略圖像中確定面積為200μm2以上的螢光 顆粒。
(原因：將引起強螢光比病毒顆粒大得多的灰塵及污垢忽略，應該忽略如此大面積的螢光以避免計算錯誤)
分析條件(2)：對圖像中具有確定亮度以上亮度的螢光顆粒進行計數(與分析條件(1)相同)。從計算中忽略面積值為200μm2以上的大顆粒螢光(與分析條件(1)相同)。從計算中忽略面積值為10μm2以下的螢光小顆粒。(由緩衝液製成的空白(背景)中，出現了相當小的螢光顆粒，因此在計算中應忽略面積為10μm2以下的螢光顆粒。)
結果：
本發明中的“相對值”是指從總螢光顆粒數中減去空白或緩衝液引起的螢光顆粒數，因為用於檢體的緩衝液也有與病毒數量基本對應的一定的小螢光顆粒數。
本發明中的“靈敏性”定義為陽性反應率=本發明方法(Mytech方法)陽性/PCR方法陽性(%)的百分比。
靈敏性=本發明陽性/PCR陽性×100(%)
本發明中的“特異性”定義為陰性反應率的百分比(%)=方法(Mytech方法)陰性/PCR方法陰性(%)。特異性=Mytech陰性/PCR陰性×100(%)
基於記載於表1至3中之使用分析條件(1)獲得的相對值，如果1以上的相對值被認為是陽性，則PCR測試結果獲得98%的靈敏性及45%的特異性。
當2以上的相對值被認為是陽性時，靈敏性及特異性分別為94%及65%。
接著，基於表1至3中使用分析條件(2)獲得的相對值，當1以上的相 對值被認為是陽性時，PCR檢測結果的靈敏性為98%，特異性為80%。再者，當2以上的相對值被認為是陽性時，靈敏性及特異性分別為94%及100%。
CV測試方法(本發明方法)分析的考量
在本研究中，螢光圖像(原始數據)係藉由在以下兩種模式使用分析軟體(Olympus製造)進行分析。各分析均以上述條件進行。
在分析條件(1)下，陰性反應不佳，因此可認為晶片上的灰塵及污垢產生強烈的螢光，但它們比病毒顆粒大得多。
在分析條件(2)下，相對值為1以上的陽性反應優於相對值為2以上的陽性反應。
PCR方法的缺點及CV測試方法的優點
如以上考量所示，PCR方法的缺點如下。
通常PCR需要5-6小時，即使是全自動PCR，檢測也需要大約75分鐘。
由於也檢測到死病毒，因此PCR陽性不一定意味著COVID-19陽性。(它也檢測不再具有傳染性的病毒，所以不能確認感染的存在。由於PCR擴增核酸，即使病毒核酸的輕微污染也可能導致偽陽性結果。並且，由於PCR擴增核酸，其無法估計檢體中的病毒量)
CV測試方法的優點如下。
CV測試方法整個過程大約需要2分鐘(測量時間：4秒)。滅活係藉由乙醇處理而容易，並且由於乙醇處理不會破壞病毒形狀，因此只能檢測到感染性病毒顆粒。
(只有感染性病毒顆粒被檢測，因此可以確認實際感染狀態。由於採集的樣本未 經放大使用，即使有少量污染，也很少出現偽陽性。此與PCR有很大不同。由於標記抗體被可視化以檢測感染性病毒顆粒，因此可以估計病毒的存在量)
表1：Covid-19 PCR數據
Figure 110115771-A0202-12-0069-1
表2：Covid-19 PCR數據
Figure 110115771-A0202-12-0069-2
表3：Covid-19 PCR數據
Figure 110115771-A0202-12-0070-3
表4：PCR值與本發明的Covid-19比較
Figure 110115771-A0202-12-0070-4
本發明可用於在COVID-19早期以高準確度快速地檢測抗原，也可用於檢測獲得的抗體。(使用Keyence螢光顯微鏡BZ-710對純化的流感病毒進行測試，日本醫科大學正在使用COVID-19咽拭子進行臨床測試。)
本發明的應用、特點及優點
本發明在測量時間方面方面已知是最快。本發明有簡單的工作程 序。本發明具有批量處理能力。本發明是1分鐘內產生的固相抗體。傳統的PCR方法通常需要12小時以上。本發明使用合成的新型物質“量子晶體”。本發明具有廣泛的應用包括：抗原及抗體測試的變化、多種病毒的測試以及治療效果的監測。表5顯示本發明與已知的COVID-19方法(Roche及Abbott)的比較。
表5：本發明與已知的COVID-19方法(Roche及Abbott)的比較。
Figure 110115771-A0202-12-0071-5
本發明具有很高的靈敏性(約94%)及特異性(約100%)。抗原的檢測及定量的整個檢查過程大約在2分鐘內完成(測量時間4秒)。冠狀病毒的可視化是可能的。量化病毒載量，可以確認治療的有效性。
本發明的一種實施方式還可用於藥物發現的評估。
本發明從檢體採集到測量均無感染風險。
本發明具有迄今為止已知最快的病毒檢測測量時間。病毒可以被可視化及量化。它的靈敏性及特異性亦非常高。
在本發明中，抗體在一分鐘內固化。然而，現有技術通常需要12個小時以上。
在此引用的所有參考文獻，包括授權專利及專利申請出版物，均藉由引用整體併入本文中。
用於檢測SARS-CoV-2變異體
棘蛋白存在於SARS-CoV-2病毒的表面，棘蛋白在進入宿主細胞中扮演關鍵角色。
棘蛋白由1273個胺基酸組成，一個稱為S1的區域(685個胺基酸)及一個稱為S2的區域(588個胺基酸)。
棘蛋白S1負責與宿主細胞結合，S2包含膜融合所需的元素。
S1負責與人體細胞中的ACE2(血管緊張素轉換酶2)受體結合進入細胞。
已發現S1的約320至約540個胺基酸殘基(RBD區)與ACE2結合。
在SARS-CoV-2變異體的1273個棘蛋白胺基酸中，英國型棘蛋白中發現8個突變，南非型中也發現了8個突變，巴西型突變中發現了11個突變.
特別是，由於RBD區的突變與人體細胞的ACE2受體有關，因而受到關注。
另一方面，用於抗原抗體反應的抗體也可以識別除了棘蛋白的RBD區域以外的各種位點。
在1273個胺基酸的棘蛋白中，突變僅佔總數的百分之幾，而棘蛋白的抗體識別位點(表位)通常是幾個到幾十個胺基酸。因此，即使表位中有少量突變也不 會干擾抗體識別並且可能是可檢測的。
這使得使用抗體的此檢測可以很好地響應突變病毒的發生。
此外，測試樣本的滅活通常需要添加滅活溶液，導致測試樣本的稀釋。
然而，用紫外光滅活可以使測試樣本直接滅活，無需稀釋即可進行檢查。
這允許藉由均勻稱重及混合來測量多個檢體(例如唾液及鼻拭子)，亦即所謂的混合樣本。
(實施例)使用紫外線照度計在15、20、25及30公分的距離測量紫外線(FL254-SD)。
根據這個紫外線輻照度值，可以計算出達到滅活物品所需的每平方公分1048mJ照射劑量以及滅活病毒及細菌所需的時間。
此外，藉由UV照度與距離的關係建立校準曲線，可以計算出距離樣本5公分及10公分處的UV照度，距離越近則越強的UV-C可以在更短的時間內滅活病毒及細菌。
(實施例)
對從Covid-19陽性及陰性個體實際採集的檢體(唾液及鼻拭子)進行紫外線照射，距離為5公分，照射時間為4分鐘，檢體被滅活。
藉由該測定法(以下方法)測量滅活樣本，並計算計數值及相對值(減去空白計數值)。
此外，還對紫外線照射的檢體進行了TEM測量，以確認標本中的病毒形狀沒有被紫外線照射破壞。
(試劑)Covid-19 Ab GeneTex“SARS-CoV-2棘抗體”
FITC labeled Covid-19 Ab GeneTex Inc.用FITC標記的“SARS-CoV-2棘抗體”
(方法)在2000ppm量子晶體試劑中混合Covid-19抗體(50μg/ml)，滴加到基材中，製備固相基材。
接著，藉由將FITC標記的Covid-19抗體(約30.0μg/ml)與唾液及經紫外線照射滅活的鼻拭子(樣本)混合形成的複合物滴在固相基材上。
(未結合的複合物及FITC抗體用水或緩衝液洗掉)。
量測尖端由Olympus系統生物顯微鏡“BX63”測量，並且對獲得的螢光圖像的任何閾值以上的螢光顆粒進行計數。
用於檢測SARS-CoV-2變異體
棘蛋白存在於SARS-CoV-2病毒的表面，棘蛋白在進入宿主細胞中扮演關鍵角色。
棘蛋白由1273個胺基酸組成，一個稱為S1的區域(685個胺基酸)及一個稱為S2的區域(588個胺基酸)。
棘蛋白S1負責與宿主細胞結合，S2包含膜融合所需的元素。
S1負責與人體細胞中的ACE2(血管緊張素轉換酶2)受體結合進入細胞。
已發現S1的約320至約540個胺基酸殘基(RBD區)與ACE2結合。
在SARS-CoV-2變異體的1273個棘蛋白胺基酸中，英國型棘蛋白中發現8個突變，南非型中也發現8個突變，巴西型突變中發現11個突變。
特別是，由於RBD區的突變與人體細胞的ACE2受體有關，因而受到關注。
另一方面，用於抗原抗體反應的抗體也可以識別除除了棘蛋白的RBD區域 以外的各種位點。
在1273個胺基酸的棘蛋白中，突變僅佔總數的百分之幾，而棘蛋白的抗體識別位點(表位)通常是幾個到幾十個胺基酸。因此，即使表位中有少量突變也不會干擾抗體識別並且可能是可檢測的。
這使得使用抗體的這種檢測可以很好地響應突變病毒的發生。

Claims (51)

  1. 一種系統，係包括：
    a)相固化基材，係包含金屬基材、以及凝聚的電漿子金屬複合物，其中在該凝聚的電漿子金屬複合物上係固定有第一抗原或第一抗體；
    b)螢光標記單元，係由標記螢光材料組成，該標記螢光材料係構成為標記目標以形成經標記的目標；
    c)螢光成像單元，係構成為藉由對經標記的目標照射激發光以製作經標記的目標的螢光圖像，並藉由顯微鏡觀察激發的螢光圖像；以及
    d)計數單元，係對螢光點進行計數並量化該目標；其中，
    該系統被構成為藉由螢光計數檢測分析物中的該目標。
  2. 如請求項1所述之系統，其中，該相固化基材被構成為由相固化單元形成，該相固化單元包含該第一抗原或該第一抗體的緩衝液及電漿子金屬複合物溶液，該緩衝液具有約7以上的pH，並且該金屬基材的電極電位高於電漿子金屬複合物溶液的電極電位。
  3. 如請求項1所述之系統，其中，該金屬基材包含金屬粉末。
  4. 如請求項2所述之系統，其中，該電漿子金屬複合物溶液的範圍為1000至5000ppm。
  5. 如請求項4所述之系統，其中，該相固化單元係被滴到該金屬基材上以形成該凝聚的電漿子金屬複合物，並且以吹氣裝置之吹氣阻止凝聚的電漿子金屬複合物在該金屬基材上聚集。
  6. 如請求項5所述之系統，其中，該凝聚的電漿子金屬複合物彼此實質上沒有聚集。
  7. 如請求項1所述之系統，其中，該目標被構成為與固定在凝聚的電漿子金屬複合物上的該第一抗原或該第一抗體形成抗原抗體反應。
  8. 如請求項1所述之系統，其中，該螢光標記單元係被滴在該金屬基材上以形成附著有凝聚的電漿子金屬複合物之經標記的目標。
  9. 如請求項8所述之系統，其中，該螢光成像單元包含用以照射激發光之光源，該激發光所具有之波長範圍係適合於附著有凝聚的電漿子金屬複合物之經標記的目標發出螢光。
  10. 如請求項1所述之系統，其中，該計數單元被構成為將該螢光圖像二值化以採用該螢光點，並對該螢光點進行定量計數。
  11. 如請求項1所述之系統，其中，該螢光圖像以分析條件二值化，該分析條件包含該螢光圖像中的螢光點的亮度、面積及圓度中的一個以上。
  12. 如請求項11所述之系統，其中，該分析條件包含該螢光圖像中的亮度及面積。
  13. 如請求項1所述之系統，其中，該目標包含抗原或抗體。
  14. 如請求項13所述之系統，其中，該目標係藉由夾層法、直接法或間接法而被標記。
  15. 如請求項1所述之系統，其中，該系統被構成為檢測多於一種類型的目標。
  16. 如請求項13所述之系統，其中，該目標包含病毒，該病毒包含流感病毒及/或COVID-19病毒。
  17. 如請求項15所述之系統，其中，該系統包含用於該標記螢光材料的過濾器，該標記螢光材料具有取決於該目標的不同波段。
  18. 一種方法，係包含下列步驟：
    a)使電漿子金屬複合物溶液與第一抗原或第一抗體的緩衝液凝聚；
    b)形成相固化基材，該相固化基材包含金屬基材、以及凝聚的電漿子金屬複合物，其中該凝聚的電漿子金屬複合物上係具有經固定的第一抗原或第一抗體；
    c)使目標與在該凝聚的電漿子金屬複合物上的該固定的第一抗原或該固定的第一抗體形成抗原抗體反應；
    d)形成附著有該凝聚的電漿子金屬複合物之經標記的目標，其中該經標記的目標包含該目標及標記螢光材料；
    d)藉由照射激發光而製作該經標記的目標之螢光圖像；
    e)藉由顯微鏡觀察該螢光圖像；
    f)計數螢光點；以及
    g)定量該目標。
  19. 如請求項18所述之方法，其中，該相固化基材被構成為由相固化單元形成，該相固化單元包含該第一抗原或該第一抗體的緩衝液及該電漿子金屬複合物溶液，其中該緩衝液具有約7以上的pH，並且該金屬基材的電極電位高於該電漿子金屬複合物溶液的電極電位。
  20. 如請求項18所述之方法，其中，該金屬基材包含金屬粉末。
  21. 如請求項19所述之方法，其中，該電漿子金屬複合物溶液的範圍為1000至5000ppm。
  22. 如請求項21所述之方法，其中，該相固化單元係被滴到該金屬基材上並進行凝聚以形成具有經固定的第一抗原或固定的第一抗體的凝聚的電漿子金屬複合物，並且以吹氣裝置之吹氣阻止凝聚的電漿子金屬複合物在金屬 基材上聚集。
  23. 如請求項22所述之方法，其中，該凝聚的電漿子金屬複合物彼此實質上沒有聚集。
  24. 如請求項18所述之方法，其中，由標記螢光材料組成的螢光標記單元係被構成為標記該目標以形成經標記的目標，該螢光標記單元係被滴在金屬基材上以形成附著在該凝聚的電漿子金屬複合物之經標記的目標。
  25. 如請求項18所述之方法，其中，螢光成像單元係被構成為製作螢光圖像，該螢光成像單元包含用以照射激發光之光源，該激發光所具有之波長範圍係適合於該經標記的目標之螢光物質發出螢光。
  26. 如請求項18所述之方法，其中，螢光計數單元係被構成為對該螢光點進行計數。
  27. 如請求項26所述之方法，其中，該螢光計數單元被構成為將該螢光圖像二值化以採用該螢光點，並對該螢光點進行定量計數。
  28. 如請求項18所述之方法，其中，該螢光圖像以分析條件被二值化，該分析條件包含該螢光圖像中的螢光點的亮度、面積及圓度中的一個以上。
  29. 如請求項28所述之方法，其中，該分析條件包含該螢光圖像中的亮度及面積。
  30. 如請求項18所述之方法，其中，該目標包含抗原或抗體。
  31. 如請求項18所述之方法，其中，該方法兼容同時檢測多於一種類型的目標。
  32. 如請求項31所述之方法，其中，該目標包含病毒，該病毒包含流感病毒及/或COVID-19病毒。
  33. 如請求項18所述之方法，其中，該目標係藉由夾層法或直接法或間接法進行標記。
  34. 如請求項31所述之方法，其中，該標記螢光材料具有取決於該目標的不同波段。
  35. 一種檢測COVID-19的方法，係包含下列步驟：
    a)使電漿子金屬複合物溶液與第一抗原或第一抗體的緩衝液凝聚；
    b)形成相固化基材，該相固化基材包含金屬基材、以及凝聚的電漿子金屬複合物，其中該凝聚的電漿子金屬複合物上係具有經固定的第一抗原或第一抗體；
    c)使COVID-19目標與在該凝聚的電漿子金屬複合物上的該固定的第一抗原或該固定的第一抗體形成抗原抗體反應；
    d)形成附著有該凝聚的電漿子金屬複合物之經標記的COVID-19目標，其中該經標記的COVID-19目標包含該COVID-19目標及標記螢光材料；
    d)藉由照射激發光而製作該經標記的COVID-19目標的螢光圖像；
    e)藉由顯微鏡觀察該螢光圖像；
    f)計數螢光點；以及
    g)定量該COVID-19目標。
  36. 如請求項35所述之檢測COVID-19的方法，其中，該固相基材被構成為由固相化單元構成，該相固化單元包含該第一抗原或該第一抗體的緩衝液及該電漿子金屬複合物溶液，該緩衝液具有約7以上的pH，並且該金屬基材的電極電位高於該電漿子金屬複合物溶液的電極電位。
  37. 如請求項35所述之檢測COVID-19的方法，其中，該金屬基材包含金屬粉末。
  38. 如請求項36所述之檢測COVID-19的方法，其中，該電漿子金屬複合物溶液的範圍為1000至5000ppm。
  39. 如請求項38所述之檢測COVID-19的方法，其中，該相固化單元係被滴到該金屬基材上並進行凝聚以形成具有經固定的第一抗原或固定的第一抗體之凝聚的電漿子金屬複合物，並且以吹氣裝置之吹氣阻止凝聚的電漿子金屬複合物在金屬基材上聚集。
  40. 如請求項39所述之檢測COVID-19的方法，其中，該凝聚的電漿子金屬複合物彼此實質上沒有聚集。
  41. 如請求項35所述之檢測COVID-19的方法，其中，由標記螢光材料組成的螢光標記單元係被構成為標記該COVID-19目標以形成經標記的COVID-19目標，該螢光標記單元係被滴在金屬基材上以形成附著在該凝聚的電漿子金屬複合物之經標記的COVID-19目標。
  42. 如請求項35所述之檢測COVID-19的方法，其中，螢光成像單元係被構成為製造螢光圖像，該螢光成像單元包含用以照射激發光之光源，該激發光所具有之波長範圍係適合於該經標記的COVID-19目標之螢光物質發出螢光。
  43. 如請求項35所述之檢測COVID-19的方法，其中，螢光計數單元被構成為對該螢光點進行計數。
  44. 如請求項43所述之檢測COVID-19的方法，其中，該螢光計數單元係被構成為將該螢光圖像二值化以採用該螢光點，並對該螢光點進行定量計數。
  45. 如請求項35所述之檢測COVID-19的方法，其中，該螢光圖像 以分析條件被二值化，該分析條件包含該螢光圖像中的螢光點的亮度、面積及圓度中的一個以上。
  46. 如請求項45所述之檢測COVID-19的方法，其中，該分析條件包含該螢光圖像的亮度及面積。
  47. 如請求項35所述之檢測COVID-19的方法，其中，該COVID-19目標包含抗原或抗體。
  48. 如請求項35所述之檢測COVID-19的方法，其中，該方法兼容檢測該COVID-19目標及第二目標。
  49. 如請求項48所述之檢測COVID-19的方法，其中，該第二目標包含病毒，該病毒包含流感病毒。
  50. 如請求項48所述之檢測COVID-19的方法，其中，該COVID-19目標及/或該第二目標係藉由夾層法或直接法或間接法進行標記。
  51. 如請求項48所述之檢測COVID-19的方法，其中，該標記螢光材料具有取決於該COVID-19目標及第二目標的不同波段。
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